JPH0326961A - アフィニティークロマトグラフィー用のポリエチレンイミンマトリックス - Google Patents
アフィニティークロマトグラフィー用のポリエチレンイミンマトリックスInfo
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- JPH0326961A JPH0326961A JP1160559A JP16055989A JPH0326961A JP H0326961 A JPH0326961 A JP H0326961A JP 1160559 A JP1160559 A JP 1160559A JP 16055989 A JP16055989 A JP 16055989A JP H0326961 A JPH0326961 A JP H0326961A
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- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 and B01D15/30 - B01D15/36, e.g. affinity, ligand exchange or chiral chromatography
- B01D15/3804—Affinity chromatography
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- Organic Chemistry (AREA)
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- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
- Compositions Of Macromolecular Compounds (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明はアフィニティーク口マトグラフィー固定された
酵素、そしてアフィニティーク口マトグラフィーで使用
するアフィニティーマトリックスの分野に関する． アフィニティーク口マトグラフィーは生物分子の独特か
つ基本的な生物学的性質、即ち、それらの他の分子との
可逆的な分子相互作用の選択的、特異的高７フィニティ
ー認識に基づいている、分離及び精製技術である．多く
の生物分子は特定のノーガンド又はエフエクター分子に
約する基買又は官能的結合位置を有し、特定のリーカン
ド又はエフエクター自身別の蛋白質である。
酵素、そしてアフィニティーク口マトグラフィーで使用
するアフィニティーマトリックスの分野に関する． アフィニティーク口マトグラフィーは生物分子の独特か
つ基本的な生物学的性質、即ち、それらの他の分子との
可逆的な分子相互作用の選択的、特異的高７フィニティ
ー認識に基づいている、分離及び精製技術である．多く
の生物分子は特定のノーガンド又はエフエクター分子に
約する基買又は官能的結合位置を有し、特定のリーカン
ド又はエフエクター自身別の蛋白質である。
一般に特異的なリーガンドは固体の支持マトリックスに
共有結合されている。固定ざれたリーガンドに特異的に
結合（吸収）されている生物的分子を含有する試料は固
定リーカントと接触される．吸収されていない、汚染分
子が除去ざれた後、特異的に結合した分子は、幾つかの
手順の一つ、例えばイオン強度の変更又は溶離緩衝液の
ｐＨの変更によって特異的に結合した分子−リーガンド
相互作用を攪乱させることによって、固体支持体から濱
超される。
共有結合されている。固定ざれたリーガンドに特異的に
結合（吸収）されている生物的分子を含有する試料は固
定リーカントと接触される．吸収されていない、汚染分
子が除去ざれた後、特異的に結合した分子は、幾つかの
手順の一つ、例えばイオン強度の変更又は溶離緩衝液の
ｐＨの変更によって特異的に結合した分子−リーガンド
相互作用を攪乱させることによって、固体支持体から濱
超される。
この手１１１１１によって固定された医薬、ビタミン類
、ペブチド類、ホルモン類等が対応ずるレセブター又は
運搬蛋白質を単離するために使用することが出来る。
、ペブチド類、ホルモン類等が対応ずるレセブター又は
運搬蛋白質を単離するために使用することが出来る。
固定された蛋白質は他の相浦又は相互作用をする蛋白質
を単離する為に役立てることが出来る。
を単離する為に役立てることが出来る。
同様にそのような手順は微粒状の生物試料、例えば■胞
膜及び特定のレセブターを有している無傷の１４ １１
１さえも分離するのに使用することが出来る．そのよう
な手順の使用は又ボリヌクレオチト類、抗原、抗体、ウ
ィルス、酵素等をｍ製するのにもｆＩ川である。更にそ
のような固体に基づいたアフィニテ７一支持マトリック
スは触媒などとして反゛コ：コこ於て使用する為に酵素
を固定する為に使用され′Ｃきた。
膜及び特定のレセブターを有している無傷の１４ １１
１さえも分離するのに使用することが出来る．そのよう
な手順の使用は又ボリヌクレオチト類、抗原、抗体、ウ
ィルス、酵素等をｍ製するのにもｆＩ川である。更にそ
のような固体に基づいたアフィニテ７一支持マトリック
スは触媒などとして反゛コ：コこ於て使用する為に酵素
を固定する為に使用され′Ｃきた。
〔１ζ来の技術〕
これまで７フィニティーク口マトグラフィーに対する殆
との広く使用ざれてきた固体マトリックスは多塘類に基
づいたマトリックスであり、例えばアガロース、セルロ
ース及び架橋デキストリンであった．架橋されたポリア
クリルアミド及びシリ力又は多孔質ガラスビーズ等も使
用されてきた。
との広く使用ざれてきた固体マトリックスは多塘類に基
づいたマトリックスであり、例えばアガロース、セルロ
ース及び架橋デキストリンであった．架橋されたポリア
クリルアミド及びシリ力又は多孔質ガラスビーズ等も使
用されてきた。
しかし殆どのそのような固体マトリックス、特にシリカ
に基づいた固体マトリックスでは、固体の基剤マトリッ
クスは問題となる生物試料中で分子から充分に遮蔽され
ておらず、結果として固定されたリーガンドの特異的な
結合パートナー以外の物質の吸収という性質に於ける非
特異的結合が生じた．これまで使用ざれてきたシリカに
基づいた固体マトリックスの場合には、シラノール基に
於て強い水素結合及び吸収が生し、この工程を攪乱した
．更に問題となる蛋白質又は他の生物物質と共に使用さ
れなければならない水溶液は、シリカマトリックスの望
ましくない加水分解を生し、マトリックスから望ましく
ない物質を浸出させ、１々′尤なマトリックスを生した
。
に基づいた固体マトリックスでは、固体の基剤マトリッ
クスは問題となる生物試料中で分子から充分に遮蔽され
ておらず、結果として固定されたリーガンドの特異的な
結合パートナー以外の物質の吸収という性質に於ける非
特異的結合が生じた．これまで使用ざれてきたシリカに
基づいた固体マトリックスの場合には、シラノール基に
於て強い水素結合及び吸収が生し、この工程を攪乱した
．更に問題となる蛋白質又は他の生物物質と共に使用さ
れなければならない水溶液は、シリカマトリックスの望
ましくない加水分解を生し、マトリックスから望ましく
ない物質を浸出させ、１々′尤なマトリックスを生した
。
アフィニティーク口マトグラフィーでこれまで′ゑ用さ
れた固体の支持マトリックスの場合、水溶．，２中てそ
のようなシリカは約２００〜３００時間しか一ク）：こ
１史用できず、酸性又はアルカリ性のｐＨ環墳下コ；マ
もつと短い。更にそのような先行技術のマト；ソクスは
Ｏ．ｌＮ ＮａＯＨに対して露出させること！ノ５出
来ない。
れた固体の支持マトリックスの場合、水溶．，２中てそ
のようなシリカは約２００〜３００時間しか一ク）：こ
１史用できず、酸性又はアルカリ性のｐＨ環墳下コ；マ
もつと短い。更にそのような先行技術のマト；ソクスは
Ｏ．ｌＮ ＮａＯＨに対して露出させること！ノ５出
来ない。
二のように現在使用されている固体支持マトリノクスの
欠点により、特に非特異的な物質の吸収■Σびマトリッ
クスの不安定性の為に、アフイニティーク口マトグラフ
ィーの開発が非常に妨げられてきた。
欠点により、特に非特異的な物質の吸収■Σびマトリッ
クスの不安定性の為に、アフイニティーク口マトグラフ
ィーの開発が非常に妨げられてきた。
従って非特異的な結合の危険を実質的に減少させるか又
はなくし、そして種々のｐＨ条件下で、そして水溶液中
で安定なアフイニテイーク口マトグラフィー用の固体支
持マトリックスを提供することが望まれる． 〔課題を解決する手段〕 本発明において、共有結合した非架橋ポリエチレンイミ
ンシｑカ基盤の１．！ｉＪ招支持体は、水性の，攻性及
びアルカリ環境中で、非常に改良ざれた安定性を有し、
そして非特異的分子吸収を実質的に減少又は事実上除去
したアフィニティーク口マトグラフィーマトリックスを
提供することが発見された。本発明のアフィニティーク
口マトグラフィーマトリックスを提供する為に使用ざれ
る共有結合ざれた非架橋ポリエチレンイミンシリ力基盤
の固体支持体は、ポリエチレンイミノブロビルトリメト
キシシランと微粒状のシリカゲル又は微粒状の抑制され
た孔のガラスとの反応生成物であって、式 シリカ
−ＰｒＳｉ−ＰＥ として命名される。
はなくし、そして種々のｐＨ条件下で、そして水溶液中
で安定なアフイニテイーク口マトグラフィー用の固体支
持マトリックスを提供することが望まれる． 〔課題を解決する手段〕 本発明において、共有結合した非架橋ポリエチレンイミ
ンシｑカ基盤の１．！ｉＪ招支持体は、水性の，攻性及
びアルカリ環境中で、非常に改良ざれた安定性を有し、
そして非特異的分子吸収を実質的に減少又は事実上除去
したアフィニティーク口マトグラフィーマトリックスを
提供することが発見された。本発明のアフィニティーク
口マトグラフィーマトリックスを提供する為に使用ざれ
る共有結合ざれた非架橋ポリエチレンイミンシリ力基盤
の固体支持体は、ポリエチレンイミノブロビルトリメト
キシシランと微粒状のシリカゲル又は微粒状の抑制され
た孔のガラスとの反応生成物であって、式 シリカ
−ＰｒＳｉ−ＰＥ として命名される。
本明細書で使用するシリカ−ＰｒＳｉ−ＰＥｌという用
詔は、 （１）ａ）平均粒径約１〜約２００、好ましくは３〜７
０ミクロン、平均孔寸法約０〜＋０００，好ましくは約
５０〜ｌＯ００オングストローム単位を有する微粒状シ
リカゲル、又は ｂ）平均粒径約１〜約２００ミクロン及び平均孔寸法約
０１好ましくは約４０〜約１０００オングストローム単
位を有する微粒状の抑制された孔のガラス、と （２）約４００〜約１８００の平均分子量を有するボリ
エチレンイミノブ口ビルトリメトキシシラン、との反応
生成物、 又は グラム当たり約０．３〜約１．２カルボキシルミリ当量
を含有する、二塩基酸無水物によるその弱酸性カルボキ
シル化生成物、 である共有結合した架橋されていないポリエチレンイミ
ン結合相固体支持体を意味する．そのようなシリカ−Ｐ
ｒＳｉ−ＰＥｌ生成物、それらのカルボキシル化誘導体
、及びそれらの製法はハグラムスデン、１９８５年９月
１０日発行の米国特許４，５４０，４８６中に開示され
、特許請求されている。そのような製品は、ベーカーボ
ンド（登録商標）クＢＡ Ｋ Ｅ Ｒ Ｂ Ｏ Ｎ Ｄ
）カラムクロマトグラフィーマトリックスとしてジェ
イティーベーカーインコーボレーテッドから現在人手で
きる． 本発明のアフィニティーク口マトグラフィーマトリック
スはポリエチレンイミン部分の第１級及び第２級アミノ
基が非変性条件下でリーガンドと共有結合を形成するこ
との出来る、そして水性の加水分解条件下で安定な反応
性の部分と反応されている誘導化されたシリカ−ＰｒＳ
ｉ−ＰＥｌマトリックスである． このように本発明のアフィニティーク口マトグラフィー
マトリックスは一般式 シリカ−ＤｒＳｉ −ＰＥｌ ＋ Ｒ ＞ｘで表わされ
うる． 式中、弱酸性カルボキシル化支持体でないときは、 Ｒは、Ｒがそれの二つの別々の場所の一つに於てＰＥｌ
の第１級及び第２級のアミノ基に共有結合されるように
なる、そして水性の加水分解１ａｔｉｉ条件下で安定な
第二の共有結合を形成するためにそれのもう一方の位置
を７フィニテイークロマトグラフィーリーガンドによる
非変性条件下での後の親核置換に利用出来、反応性であ
るようにしている、Ｅ記二つの別々の位置て親核置換を
受けることの出来る任意の化学的に反応性の部分の残基
を表わし、 ＸはＰＥｌ部分の第１級又は第２級アミノ基の合計数よ
りも小さいか又は等しい整数であり、弱酸性カルボキシ
ル化支持体である場合に於ては、 Ｒは、アフィニティークロマトグラフイーリーガント上
で銭核官能基によりカルボキシル炭素に於て容易にＩｔ
換されるように、カルボニル炭素に共有結合を形成し、
それによって充分に親核性の１［％’を造るために、カ
ルボキシルのヒＦ ａキシルの親核ｉ！１′換を促進す
ることの出来る任意の化学的に反応性の部分の残基であ
り、 Ｘはカルボキシル化Ｐε１部分のカルボニル基の合計数
よりも小さいか又は等しい整数である．他の前記の条件
を満たしている、ＰＥｌ部分の第１級及び第２級アミノ
又はカルボキシル基と反応性である部分のＲ残基の例と
して次の残基が挙げられる． これらはそれぞれ、グルタルアルデヒド、塩化シアヌル
、エビクロルヒドリン、１．４−ブタンジオールジグリ
シジルエーテル、ｐ−ニトロフエニルク口口ホルメート
、エチルクロロアセテート、１．１一カルポニルジイミ
ダゾール、ジアゾ化ρ−ニトロベンズアルデヒドフルオ
ロポレート塩、及びジアゾ化ｐ−ニトロヘンソイルク口
ライトフルオロボレート塩から誘導される． 本発明のアフィニティーマトリックスはアフィニティー
マトリックスに共有結合する任意のり−カントに結合す
る為に使用することが出来る．アフィニティーマトリッ
クスは反応性のアミノ基を有するリーガントと反応する
為に特に有用であるが、他の反応性の基、例えば反応性
のヒドロキシル、スルフヒドリルのような基を含有する
リーガンドと反応するのにも全く同様に有用である．本
発明のアフィニティーマトリックスは蛋白質、酵素、又
はアフィニティーマトリックス上に固定ざれたリーガン
ドを生しるための他のリーガンドの、反応性の基と容易
に反応する．本発明の７フィニティーマトリックスと共
有結合によって固定ざれ得るそのような反応性の基を含
有するリーガンドの例として、例えば、この技術で知ら
れ、例えばバーキン アイ．等、「アフィニティーク口
マトグラフィー， Ｃ ＆ Ｅ Ｎ Ｊ １７−２４．
３２． １９８５年８月２６日に間示されているような
、抗体、抗原、酵素、阻害剤、共同因子、ホルモン、ビ
タミン、毒素、成長因子、グリココンジュゲート類、レ
シチン、核酸、及び蛋白質が挙げられる． 〔本発明の効果〕 本発明のリーガントが結合したアフィニテ７一マトリッ
クスはアフィニティーマトリックスに共有結合したリー
ガンドを有する本発明のアフィニティーマトリックスに
、ｉ１１液中の蛋白質等の物質を結合又は吸収すること
によって、そのような物質を含有している溶液から、そ
の物質を精製又は分離するのに使用される．分離又は精
製されるべきそのような物質のうち、例えば、酵素、受
容器、抗体、抗原、核酸等が挙げられる．更に本発明の
アフィニティーマトリックスは前に述べたアフイニティ
ーク口マトグラフィーの為のリーガンド又は反応触媒と
して使用する為の固定された酵素としての何れかで酵素
を固定するのに使用することが出来る．そのような固定
された酵素、即ち本発明のアフィニティーマトリックス
に固定された酵素は、非常に活性であり、安定な触媒で
それらの適当な特異性を保有している．そのような固定
された酵素触媒は再使用でき、連続反応を可能とし、よ
りよく反応を制御できるようにし、そしてより高い純度
及び生成物収率を生じる．更にそのような固定された触
媒は一般に酵素触媒の損失の減少又は除去の為、汚染を
生じることが少ない．そのような固定された酵素の使用
は、種々の酵素触媒反応、例えばＬ−アミノ酸の製造方
法に於て広い用途を見出している． 〔実施例〕 実施例ｌ 反応容器中の２５．０ｇのシリカ−ＰｒＳｉ−ＰＥｌ（
４０μ、２．８１ Ｎ． ０．０５ｍｅｇ）に、１３．
０ｇ （ ０．１２８モル）のトリエチルアミンを、ｌ
００ｍｌのクロロホルム、２７．６ｇ（０．１１５ａ＋
ｌ）の塩化シアヌルと共に約２０℃で加えた。反応は非
常に発熱的であった。逼加の２００モルのクロロホルム
を加え、混合物を２０℃で約５．５時間攪拌し、濾過し
、３ｘｌＯＯｍｌのクロロホルムで洗摩し、８０℃で約
４時間乾燥した。収量＝ ２６．２ｇ．分析：Ｃ＝ Ｉ
Ｏ．７４Ｘ， Ｈ ＝ ２．ｌｌＬ Ｎ ＝ ６．３２
Ｌ Ｃ ｌ＝ ５．５２Ｌ実施例２ 温度計、攪拌機、及び冷却器を供えた反応容情中に３０
０ａ＋Ｉのクロロホルムを入れ、約０〜５℃に氷一塩に
よって冷却した。２７．６ｇ（０． １５モル）の塩化
シアヌルを２０分間かけて加え、一方温度を約０〜５℃
に保った．次に１５．０ｇ（０．１５モル）のトリエチ
ルアミンを一度に加え、懸濁液は黄色に変化し温度は約
２５℃に上昇した．ｉＷ液を次に再度０〜５℃に冷却し
、２５．０ｇのシリカ−ＰｒＳｉ−ＰＥｌ（４０μ、２
．８Ｘ Ｎ， ０．０５ｍｅｇ）を約２０分間の間隔の
間に小ロットに加え、一方温度を約０〜５℃に保った。
詔は、 （１）ａ）平均粒径約１〜約２００、好ましくは３〜７
０ミクロン、平均孔寸法約０〜＋０００，好ましくは約
５０〜ｌＯ００オングストローム単位を有する微粒状シ
リカゲル、又は ｂ）平均粒径約１〜約２００ミクロン及び平均孔寸法約
０１好ましくは約４０〜約１０００オングストローム単
位を有する微粒状の抑制された孔のガラス、と （２）約４００〜約１８００の平均分子量を有するボリ
エチレンイミノブ口ビルトリメトキシシラン、との反応
生成物、 又は グラム当たり約０．３〜約１．２カルボキシルミリ当量
を含有する、二塩基酸無水物によるその弱酸性カルボキ
シル化生成物、 である共有結合した架橋されていないポリエチレンイミ
ン結合相固体支持体を意味する．そのようなシリカ−Ｐ
ｒＳｉ−ＰＥｌ生成物、それらのカルボキシル化誘導体
、及びそれらの製法はハグラムスデン、１９８５年９月
１０日発行の米国特許４，５４０，４８６中に開示され
、特許請求されている。そのような製品は、ベーカーボ
ンド（登録商標）クＢＡ Ｋ Ｅ Ｒ Ｂ Ｏ Ｎ Ｄ
）カラムクロマトグラフィーマトリックスとしてジェ
イティーベーカーインコーボレーテッドから現在人手で
きる． 本発明のアフィニティーク口マトグラフィーマトリック
スはポリエチレンイミン部分の第１級及び第２級アミノ
基が非変性条件下でリーガンドと共有結合を形成するこ
との出来る、そして水性の加水分解条件下で安定な反応
性の部分と反応されている誘導化されたシリカ−ＰｒＳ
ｉ−ＰＥｌマトリックスである． このように本発明のアフィニティーク口マトグラフィー
マトリックスは一般式 シリカ−ＤｒＳｉ −ＰＥｌ ＋ Ｒ ＞ｘで表わされ
うる． 式中、弱酸性カルボキシル化支持体でないときは、 Ｒは、Ｒがそれの二つの別々の場所の一つに於てＰＥｌ
の第１級及び第２級のアミノ基に共有結合されるように
なる、そして水性の加水分解１ａｔｉｉ条件下で安定な
第二の共有結合を形成するためにそれのもう一方の位置
を７フィニテイークロマトグラフィーリーガンドによる
非変性条件下での後の親核置換に利用出来、反応性であ
るようにしている、Ｅ記二つの別々の位置て親核置換を
受けることの出来る任意の化学的に反応性の部分の残基
を表わし、 ＸはＰＥｌ部分の第１級又は第２級アミノ基の合計数よ
りも小さいか又は等しい整数であり、弱酸性カルボキシ
ル化支持体である場合に於ては、 Ｒは、アフィニティークロマトグラフイーリーガント上
で銭核官能基によりカルボキシル炭素に於て容易にＩｔ
換されるように、カルボニル炭素に共有結合を形成し、
それによって充分に親核性の１［％’を造るために、カ
ルボキシルのヒＦ ａキシルの親核ｉ！１′換を促進す
ることの出来る任意の化学的に反応性の部分の残基であ
り、 Ｘはカルボキシル化Ｐε１部分のカルボニル基の合計数
よりも小さいか又は等しい整数である．他の前記の条件
を満たしている、ＰＥｌ部分の第１級及び第２級アミノ
又はカルボキシル基と反応性である部分のＲ残基の例と
して次の残基が挙げられる． これらはそれぞれ、グルタルアルデヒド、塩化シアヌル
、エビクロルヒドリン、１．４−ブタンジオールジグリ
シジルエーテル、ｐ−ニトロフエニルク口口ホルメート
、エチルクロロアセテート、１．１一カルポニルジイミ
ダゾール、ジアゾ化ρ−ニトロベンズアルデヒドフルオ
ロポレート塩、及びジアゾ化ｐ−ニトロヘンソイルク口
ライトフルオロボレート塩から誘導される． 本発明のアフィニティーマトリックスはアフィニティー
マトリックスに共有結合する任意のり−カントに結合す
る為に使用することが出来る．アフィニティーマトリッ
クスは反応性のアミノ基を有するリーガントと反応する
為に特に有用であるが、他の反応性の基、例えば反応性
のヒドロキシル、スルフヒドリルのような基を含有する
リーガンドと反応するのにも全く同様に有用である．本
発明のアフィニティーマトリックスは蛋白質、酵素、又
はアフィニティーマトリックス上に固定ざれたリーガン
ドを生しるための他のリーガンドの、反応性の基と容易
に反応する．本発明の７フィニティーマトリックスと共
有結合によって固定ざれ得るそのような反応性の基を含
有するリーガンドの例として、例えば、この技術で知ら
れ、例えばバーキン アイ．等、「アフィニティーク口
マトグラフィー， Ｃ ＆ Ｅ Ｎ Ｊ １７−２４．
３２． １９８５年８月２６日に間示されているような
、抗体、抗原、酵素、阻害剤、共同因子、ホルモン、ビ
タミン、毒素、成長因子、グリココンジュゲート類、レ
シチン、核酸、及び蛋白質が挙げられる． 〔本発明の効果〕 本発明のリーガントが結合したアフィニテ７一マトリッ
クスはアフィニティーマトリックスに共有結合したリー
ガンドを有する本発明のアフィニティーマトリックスに
、ｉ１１液中の蛋白質等の物質を結合又は吸収すること
によって、そのような物質を含有している溶液から、そ
の物質を精製又は分離するのに使用される．分離又は精
製されるべきそのような物質のうち、例えば、酵素、受
容器、抗体、抗原、核酸等が挙げられる．更に本発明の
アフィニティーマトリックスは前に述べたアフイニティ
ーク口マトグラフィーの為のリーガンド又は反応触媒と
して使用する為の固定された酵素としての何れかで酵素
を固定するのに使用することが出来る．そのような固定
された酵素、即ち本発明のアフィニティーマトリックス
に固定された酵素は、非常に活性であり、安定な触媒で
それらの適当な特異性を保有している．そのような固定
された酵素触媒は再使用でき、連続反応を可能とし、よ
りよく反応を制御できるようにし、そしてより高い純度
及び生成物収率を生じる．更にそのような固定された触
媒は一般に酵素触媒の損失の減少又は除去の為、汚染を
生じることが少ない．そのような固定された酵素の使用
は、種々の酵素触媒反応、例えばＬ−アミノ酸の製造方
法に於て広い用途を見出している． 〔実施例〕 実施例ｌ 反応容器中の２５．０ｇのシリカ−ＰｒＳｉ−ＰＥｌ（
４０μ、２．８１ Ｎ． ０．０５ｍｅｇ）に、１３．
０ｇ （ ０．１２８モル）のトリエチルアミンを、ｌ
００ｍｌのクロロホルム、２７．６ｇ（０．１１５ａ＋
ｌ）の塩化シアヌルと共に約２０℃で加えた。反応は非
常に発熱的であった。逼加の２００モルのクロロホルム
を加え、混合物を２０℃で約５．５時間攪拌し、濾過し
、３ｘｌＯＯｍｌのクロロホルムで洗摩し、８０℃で約
４時間乾燥した。収量＝ ２６．２ｇ．分析：Ｃ＝ Ｉ
Ｏ．７４Ｘ， Ｈ ＝ ２．ｌｌＬ Ｎ ＝ ６．３２
Ｌ Ｃ ｌ＝ ５．５２Ｌ実施例２ 温度計、攪拌機、及び冷却器を供えた反応容情中に３０
０ａ＋Ｉのクロロホルムを入れ、約０〜５℃に氷一塩に
よって冷却した。２７．６ｇ（０． １５モル）の塩化
シアヌルを２０分間かけて加え、一方温度を約０〜５℃
に保った．次に１５．０ｇ（０．１５モル）のトリエチ
ルアミンを一度に加え、懸濁液は黄色に変化し温度は約
２５℃に上昇した．ｉＷ液を次に再度０〜５℃に冷却し
、２５．０ｇのシリカ−ＰｒＳｉ−ＰＥｌ（４０μ、２
．８Ｘ Ｎ， ０．０５ｍｅｇ）を約２０分間の間隔の
間に小ロットに加え、一方温度を約０〜５℃に保った。
反応混合物をその）二度で約３０分間攪拌し、その後水
浴を除去し、混合物を約２２時間攪拌し、濾過し、３ｘ
ｌＯＯｍｌのクロロホルムで洗浄し、０℃で約４時間乾
燥した．収量： ２５．４ｇｏ分析： Ｃ ＝ Ｉ０．
２２Ｘ， Ｈ ＝ ２．ｌ２Ｌ Ｎ ＝ ５．７８％、
Ｃ Ｉ ＝ ５．５９Ｌ 実施例３ ２５ｇのシリカ−ＰｒＳｉ−ＰＥｌ（４０μ、２．８＄
Ｎ． ０．０５ｍｅｇ）をＩ００ｍｌのクロロボルム
に懸濁し、これに１ ５ ． ０ ｇ （０．１５モル
）の！・リエチルアミンを加えた， ２８．０ｇのトノ
アジンを２００ｍｌのクロロホルムでスラリーにし、反
応容器に移し、非常に発熱的な反応が生じた．混合物を
約５．５時間約２０℃で攪拌し、濾過し、３ｘｌ００ｍ
１のクロロホルムで洗浄し、約８０゛Ｃで約４時間乾燥
した．収量＝ ２６ｇ．分析： Ｃ ＝ １０．９５χ
、Ｈ＝２．１２１、Ｎ ＝ ５．９６Ｌ Ｃ Ｉ＝ ５
．６３工。
浴を除去し、混合物を約２２時間攪拌し、濾過し、３ｘ
ｌＯＯｍｌのクロロホルムで洗浄し、０℃で約４時間乾
燥した．収量： ２５．４ｇｏ分析： Ｃ ＝ Ｉ０．
２２Ｘ， Ｈ ＝ ２．ｌ２Ｌ Ｎ ＝ ５．７８％、
Ｃ Ｉ ＝ ５．５９Ｌ 実施例３ ２５ｇのシリカ−ＰｒＳｉ−ＰＥｌ（４０μ、２．８＄
Ｎ． ０．０５ｍｅｇ）をＩ００ｍｌのクロロボルム
に懸濁し、これに１ ５ ． ０ ｇ （０．１５モル
）の！・リエチルアミンを加えた， ２８．０ｇのトノ
アジンを２００ｍｌのクロロホルムでスラリーにし、反
応容器に移し、非常に発熱的な反応が生じた．混合物を
約５．５時間約２０℃で攪拌し、濾過し、３ｘｌ００ｍ
１のクロロホルムで洗浄し、約８０゛Ｃで約４時間乾燥
した．収量＝ ２６ｇ．分析： Ｃ ＝ １０．９５χ
、Ｈ＝２．１２１、Ｎ ＝ ５．９６Ｌ Ｃ Ｉ＝ ５
．６３工。
実施例４
反応容器中で、５０ｇのシリカ−ＰｒＳｉ−ＰＥｌ（４
０μ、２．８″ＬＮ， ０．０５ｍｅｇ）を２００１の
クロロホノレムに懸濁し、これに２９．０ｇのトリエチ
ルアミンを加えた， ２０．０ｇの塩化シアヌルを徐々
に加え、残りの塩化シアヌルを２０（ｌｓｌのクロロホ
ルムでスラリーにし、反応容器に移し、非常に発熱的な
反応が生した．混合物を約５．ｉ時間約２０℃で攪拌し
、濾過し、３ｘ２００ｍｌのクロロホルムで洗浄し、約
８０℃で約４時間乾燥した．収量＝ ５１ｇ．分析：
Ｃ ＝ ｌ０．７１Ｘ、Ｈ＝２．１４Ｘ，Ｎ ＝ ５．
８８Ｌ Ｃ ｌ＝ ５．３３Ｌ実施例タ 冷却器、攪拌機、及び温度計を供えた反応容器中で３０
０ｍｌのクロロホルムを懸濁し、約０〜５℃に氷一塩に
よって冷却した。５６ｇ（０．２９モル〉の塩化シアヌ
ルを約１５〜２０分間の閏に冷却したクロロホルム溶液
に加え、一方温度を約０〜５℃に保った。クロロホルム
中の３６ｇ（０．３５モル）のｌ・リエチルアミンを約
３０分間滴下し、ｌ−度を約１０℃に保った。溶液はト
リエチルアミン添加完了後黄色に変化した。
０μ、２．８″ＬＮ， ０．０５ｍｅｇ）を２００１の
クロロホノレムに懸濁し、これに２９．０ｇのトリエチ
ルアミンを加えた， ２０．０ｇの塩化シアヌルを徐々
に加え、残りの塩化シアヌルを２０（ｌｓｌのクロロホ
ルムでスラリーにし、反応容器に移し、非常に発熱的な
反応が生した．混合物を約５．ｉ時間約２０℃で攪拌し
、濾過し、３ｘ２００ｍｌのクロロホルムで洗浄し、約
８０℃で約４時間乾燥した．収量＝ ５１ｇ．分析：
Ｃ ＝ ｌ０．７１Ｘ、Ｈ＝２．１４Ｘ，Ｎ ＝ ５．
８８Ｌ Ｃ ｌ＝ ５．３３Ｌ実施例タ 冷却器、攪拌機、及び温度計を供えた反応容器中で３０
０ｍｌのクロロホルムを懸濁し、約０〜５℃に氷一塩に
よって冷却した。５６ｇ（０．２９モル〉の塩化シアヌ
ルを約１５〜２０分間の閏に冷却したクロロホルム溶液
に加え、一方温度を約０〜５℃に保った。クロロホルム
中の３６ｇ（０．３５モル）のｌ・リエチルアミンを約
３０分間滴下し、ｌ−度を約１０℃に保った。溶液はト
リエチルアミン添加完了後黄色に変化した。
混合物を約０〜５℃に冷却し、実施ｌ＋Ｉ１４に従って
造った５０．０ｇのシリカ−ＰｒＳｉ−ＰＥｌ−トリア
ジンを加え、一方温度を約１０℃以下に保った．シリカ
の添加が約１０分間で完了した．反応混合物をその４度
で約ＩＯ分間撹＋’ｔ’ シ、その後水浴を除去し、７
１ｚ合物を約２ＰＣで１８．５時間攪拌し、濾過し、４
Ｘ２５０＋１１１のクロロホルムで洗浄し、８０℃で約
４時間乾燥した。収改＝４４３ｇ．分析：Ｃ ＝ Ｉｌ
．３Ｌ Ｈ ＝ ２．２５Ｘ． Ｎ ＝ ６．３１て、
Ｃ Ｉ ＝ ４ ． ８ ｆ．ｉ Ｚ ，実施ｆ９１１
６ 反応容器中で、２５０ｇのシリカ−ＰｒＳｉ−ＰＥｌ（
４０μ、２．８＄ Ｎ， ０．０５ｌｗｅｇ）及び！０
０ｍｌの２５Ｉグルタルアルデヒ］・溶液を混合した．
混合物を約４時間シェーカー−１二で約２０℃で保った
。混合物は明るい茶色に変化し、これを約４時間後濾過
し、３ＸＩＯＯＩＩ＋の脱イオン水、３ｘｌＯＯｍｌメ
タノール及び３ｘｌ００ｍｌのアセトンで洗浄し、２０
゜Ｃで真空オープン中で一夜乾燥し、一定ｍ ｆｌ ニ
Ｌ／ タ。収ｔ ＝ ２６ｇ，分析： ｃ ＝ １５．
４３Ｘ、Ｈ ＝ ２．４８１． Ｎ ＝ ２．３４Ｌ実
施例７ ２５ｇのシリカ−ＰｒＳｉ−ＰＥｌ（４０μ， ２．８
＄ Ｎ， ０．０５ｍｅｇ）を５００ｍｌの丸底フラス
コ中に入れｌ００ｖｌのテトラヒド口フラン中の５．
Ｉｇ（０．０５ｍｌ）のトリエチルアミンを加え、続い
て１０． １５ｇ（０．０５モル）のｐ−ニトロフエニ
ルクロ『コホルメート及び追加的な１５０ｍｌのテトラ
ヒド口フランを加えたｅ ｊｆ？合物な約１６時間シェ
ーカー上で約２０℃で保ち、次に濾過し、４ｘｌ２５ｍ
のクロロホルムで洗浄し、約８０℃で約４時間乾燥した
．収量＝ ２６ｇ．分析： Ｃ ＝ ９．７３１， Ｈ
＝ ２．５１χ、Ｎ ＝ ３．２６１． 実施例日 ２５ｇのシリカ−ＰｒＳｉ−ＰＥｌ（４０ｌｌ， ２．
８１Ｎ， ０．０５ｍｅｇ）を２５０ｍ ｌのテトラヒ
ドロフラン中に！！！濁し、１０．１２１Ｂ（０．１モ
ル）のトリエチルアミンを加え、続いて９．３２ｇ（０
．０１モル〉のエビグロルヒトリンを加えた。
造った５０．０ｇのシリカ−ＰｒＳｉ−ＰＥｌ−トリア
ジンを加え、一方温度を約１０℃以下に保った．シリカ
の添加が約１０分間で完了した．反応混合物をその４度
で約ＩＯ分間撹＋’ｔ’ シ、その後水浴を除去し、７
１ｚ合物を約２ＰＣで１８．５時間攪拌し、濾過し、４
Ｘ２５０＋１１１のクロロホルムで洗浄し、８０℃で約
４時間乾燥した。収改＝４４３ｇ．分析：Ｃ ＝ Ｉｌ
．３Ｌ Ｈ ＝ ２．２５Ｘ． Ｎ ＝ ６．３１て、
Ｃ Ｉ ＝ ４ ． ８ ｆ．ｉ Ｚ ，実施ｆ９１１
６ 反応容器中で、２５０ｇのシリカ−ＰｒＳｉ−ＰＥｌ（
４０μ、２．８＄ Ｎ， ０．０５ｌｗｅｇ）及び！０
０ｍｌの２５Ｉグルタルアルデヒ］・溶液を混合した．
混合物を約４時間シェーカー−１二で約２０℃で保った
。混合物は明るい茶色に変化し、これを約４時間後濾過
し、３ＸＩＯＯＩＩ＋の脱イオン水、３ｘｌＯＯｍｌメ
タノール及び３ｘｌ００ｍｌのアセトンで洗浄し、２０
゜Ｃで真空オープン中で一夜乾燥し、一定ｍ ｆｌ ニ
Ｌ／ タ。収ｔ ＝ ２６ｇ，分析： ｃ ＝ １５．
４３Ｘ、Ｈ ＝ ２．４８１． Ｎ ＝ ２．３４Ｌ実
施例７ ２５ｇのシリカ−ＰｒＳｉ−ＰＥｌ（４０μ， ２．８
＄ Ｎ， ０．０５ｍｅｇ）を５００ｍｌの丸底フラス
コ中に入れｌ００ｖｌのテトラヒド口フラン中の５．
Ｉｇ（０．０５ｍｌ）のトリエチルアミンを加え、続い
て１０． １５ｇ（０．０５モル）のｐ−ニトロフエニ
ルクロ『コホルメート及び追加的な１５０ｍｌのテトラ
ヒド口フランを加えたｅ ｊｆ？合物な約１６時間シェ
ーカー上で約２０℃で保ち、次に濾過し、４ｘｌ２５ｍ
のクロロホルムで洗浄し、約８０℃で約４時間乾燥した
．収量＝ ２６ｇ．分析： Ｃ ＝ ９．７３１， Ｈ
＝ ２．５１χ、Ｎ ＝ ３．２６１． 実施例日 ２５ｇのシリカ−ＰｒＳｉ−ＰＥｌ（４０ｌｌ， ２．
８１Ｎ， ０．０５ｍｅｇ）を２５０ｍ ｌのテトラヒ
ドロフラン中に！！！濁し、１０．１２１Ｂ（０．１モ
ル）のトリエチルアミンを加え、続いて９．３２ｇ（０
．０１モル〉のエビグロルヒトリンを加えた。
混合物を約１９時間シェーカーヒで約２０℃で保ち、次
に濾過し、２ｘ２５０ａ＋ｌのテトラヒト口フラン、２
ｘ２５０〜１のクロロホルム及び２ｘ２５０ｍ ｌのア
七トンで洗浄し、約８０℃で約４時間乾燥した。収量＝
２５．５ｇａ分析： Ｃ ＝ ７．８４１、Ｈ ＝ １
．６１Ｌ Ｎ ＝ ２．６：３Ｘ．実施例９ 反応容器中で２５ｇのシリカ−ＰｒＳｉ−ＰＥｌ（４０
μ、２．８６％ Ｎ， ０．０５ｍｅｇ）を２５０ｍｌ
のテトラヒド口フラン中に懸濁し、１１．２５ｇ（０．
０５５モル）の１．４−ブタンジオ−ルグリシジルエー
テルを加えた．混合物を約２０℃で約８時間シェーカー
上に置き、次に濾過し、３ｘｌｏｏ慣１のメタノールで
洗浄し、約８０℃で約４時間乾燥シタ。分析： Ｃ
＝ ７．０９Ｌ Ｈ ＝ １．６２Ｘ， Ｎ ＝２．３
６Ｌ 実施ＩＮＩＯ 実ｌｉｖ例９を繰り点したが、但し生成物を３Ｘ１００
１１１のアセトン及び３ｘｌ００ｍｌのジエチルエーテ
ルで洗浄した．分析：Ｃ＝７。１３Ｌ Ｈ ＝ ｌ．６
１Ｌ Ｎ ＝ ２．７５ｔ． 実施例１１ ＋Ｏｇ（０．０６１ｍｌ ）の１．１’一カノレボニノ
レジイミダゾールを１５０ｍｌのアセトンに懸濁し、懸
濁液を反応容器中で２５ｇのシリカ−ＰｒＳｉ−ＰＥｌ
（４０μ、２．８Ｘ Ｎ，０．０５ｔａｅｇ）にくわえ
た．追加の１００ｍｌのアセトンを反応溶液に加え、こ
れをロータリーフイルム蒸発器上で約１８時間約３０℃
で保った．生成物を濾遇し、３ｘ２５０ｍ ｌのアセト
ン、ｌｘ２５０ｍｌジエチノレエーテノレで洗浄し、約
８０℃で約４時問乾燥した．収量＝ ２６ｇ．分析：
Ｃ ＝ ８．９９Ｘ， Ｈ ＝ １．７２Ｌ Ｎ ＝
３．９８Ｌ実施例１２ ２５ｇ（７） シリカ−ＰｒＳｉ−ＰＥｌ（Ｃ ＝ ５
．９２１， Ｈ ＝ ２．８２ＬＯ．０５ｍｅｇ）を１
２５ｍｌのテトラヒド口フラン中に悲濁し、５．０５ｇ
（０．０５モル）のトリエチルアミンを加え、反応混合
物を約２０℃で約１０分間攪拌し、その後、６．１２ｇ
（０．０５モル）のエチルクロロアセテートを加え、次
に１２５ｍｌのテトラヒド口フランを加えた。
に濾過し、２ｘ２５０ａ＋ｌのテトラヒト口フラン、２
ｘ２５０〜１のクロロホルム及び２ｘ２５０ｍ ｌのア
七トンで洗浄し、約８０℃で約４時間乾燥した。収量＝
２５．５ｇａ分析： Ｃ ＝ ７．８４１、Ｈ ＝ １
．６１Ｌ Ｎ ＝ ２．６：３Ｘ．実施例９ 反応容器中で２５ｇのシリカ−ＰｒＳｉ−ＰＥｌ（４０
μ、２．８６％ Ｎ， ０．０５ｍｅｇ）を２５０ｍｌ
のテトラヒド口フラン中に懸濁し、１１．２５ｇ（０．
０５５モル）の１．４−ブタンジオ−ルグリシジルエー
テルを加えた．混合物を約２０℃で約８時間シェーカー
上に置き、次に濾過し、３ｘｌｏｏ慣１のメタノールで
洗浄し、約８０℃で約４時間乾燥シタ。分析： Ｃ
＝ ７．０９Ｌ Ｈ ＝ １．６２Ｘ， Ｎ ＝２．３
６Ｌ 実施ＩＮＩＯ 実ｌｉｖ例９を繰り点したが、但し生成物を３Ｘ１００
１１１のアセトン及び３ｘｌ００ｍｌのジエチルエーテ
ルで洗浄した．分析：Ｃ＝７。１３Ｌ Ｈ ＝ ｌ．６
１Ｌ Ｎ ＝ ２．７５ｔ． 実施例１１ ＋Ｏｇ（０．０６１ｍｌ ）の１．１’一カノレボニノ
レジイミダゾールを１５０ｍｌのアセトンに懸濁し、懸
濁液を反応容器中で２５ｇのシリカ−ＰｒＳｉ−ＰＥｌ
（４０μ、２．８Ｘ Ｎ，０．０５ｔａｅｇ）にくわえ
た．追加の１００ｍｌのアセトンを反応溶液に加え、こ
れをロータリーフイルム蒸発器上で約１８時間約３０℃
で保った．生成物を濾遇し、３ｘ２５０ｍ ｌのアセト
ン、ｌｘ２５０ｍｌジエチノレエーテノレで洗浄し、約
８０℃で約４時問乾燥した．収量＝ ２６ｇ．分析：
Ｃ ＝ ８．９９Ｘ， Ｈ ＝ １．７２Ｌ Ｎ ＝
３．９８Ｌ実施例１２ ２５ｇ（７） シリカ−ＰｒＳｉ−ＰＥｌ（Ｃ ＝ ５
．９２１， Ｈ ＝ ２．８２ＬＯ．０５ｍｅｇ）を１
２５ｍｌのテトラヒド口フラン中に悲濁し、５．０５ｇ
（０．０５モル）のトリエチルアミンを加え、反応混合
物を約２０℃で約１０分間攪拌し、その後、６．１２ｇ
（０．０５モル）のエチルクロロアセテートを加え、次
に１２５ｍｌのテトラヒド口フランを加えた。
反応混合物を約２０℃でシェーカー」二で約２４時間攪
拌し、次に濾過し、２Ｘ２５０１１１ ｌのクロロホル
ム、２Ｘ２５０ｍ ｌのアセトンで洗浄し、約８０℃で
約４時間乾燥シタ．分析： Ｃ ＝ ６．６１Ｌ Ｈ
＝ １．６７Ｌ Ｎ ＝ ２．８０＄．実施例ｌ３ ２．５ｇ（０．０１３術１）の１−（３−ジメチルアミ
ノプロビル）−３−エチル力ルポジイミド塩酸塩を５０
ｍ１のアセ！・ン二２−プロバノール（１：ｌ）中に溶
解した． １．３ｇ（０．０１１モル）のＮ−ヒドロキ
シコハク酸イミドをｌ００ｎ＋ｌのアセトン中に懸肩し
、シェーカー上で保った．（これは完全には溶液になら
なかった． ） ２５ｇのサクシノイル化シリカ−Ｐｒ
Ｓｉ−ＰＥｌ （ Ｃ ＝ ｌｌ．８９Ｘ，Ｈ ＝ １
．８８Ｘ， Ｎ ＝ ０．６９Ｘ、カルボキシル基＝
０．９５ｍｅｇａｇ＞を反応容器中に入れ、アセトン−
２−プロバノール中の１−（３−ジメチルアミノブロビ
ル）−３−エチル力ルポジイミド塩酸塩の溶液を加えた
．反応容器を約５分間振とうじ、次にア七トン中のＮ−
ヒドロキシコハク酸イミドの溶液を加え、続いて２５■
１の２−プロバノールを加えた．反応容器をシェーカー
」二で約２２時間保ち、次に生成物を濾過し、２ｘ２５
０ｍｌのイソブロバノール、２ｘ２５０ａ＋Ｉのアセト
ンで洗浄し、約８０℃で約４時間乾燥した．収Ｉｔ ２
６．４ｇ．分析： Ｃ＝１３．６０Ｘ，Ｈ＝２．１４
Ｘ，Ｎ＝３．３８Ｋ．実施例ｌ４ 本発明に従うジアゾアフィニティークロロホルムマトリ
ックスのＦＡＩ！物は次の手順で製造できる．Ａ）シリ
カ−ＰｒＳｉ−ＰＥｌをメタノール中でｐ−ニトロペン
ズアルデヒトと反応させ、生しる生成物をメタノール中
で水素化ホウ素ナトリウムと反応させる．生成物を約６
０℃でナトリウムジチオナイトｉｌ液中に懸濁させる．
生じる生成物を、氷冷したＨＢＦ４と反応させ、生成物
を濾遇し、氷水で洗浄し、真空下で乾燥して、所望のジ
アゾニウムフルオロボレート生成物を生しろ。
拌し、次に濾過し、２Ｘ２５０１１１ ｌのクロロホル
ム、２Ｘ２５０ｍ ｌのアセトンで洗浄し、約８０℃で
約４時間乾燥シタ．分析： Ｃ ＝ ６．６１Ｌ Ｈ
＝ １．６７Ｌ Ｎ ＝ ２．８０＄．実施例ｌ３ ２．５ｇ（０．０１３術１）の１−（３−ジメチルアミ
ノプロビル）−３−エチル力ルポジイミド塩酸塩を５０
ｍ１のアセ！・ン二２−プロバノール（１：ｌ）中に溶
解した． １．３ｇ（０．０１１モル）のＮ−ヒドロキ
シコハク酸イミドをｌ００ｎ＋ｌのアセトン中に懸肩し
、シェーカー上で保った．（これは完全には溶液になら
なかった． ） ２５ｇのサクシノイル化シリカ−Ｐｒ
Ｓｉ−ＰＥｌ （ Ｃ ＝ ｌｌ．８９Ｘ，Ｈ ＝ １
．８８Ｘ， Ｎ ＝ ０．６９Ｘ、カルボキシル基＝
０．９５ｍｅｇａｇ＞を反応容器中に入れ、アセトン−
２−プロバノール中の１−（３−ジメチルアミノブロビ
ル）−３−エチル力ルポジイミド塩酸塩の溶液を加えた
．反応容器を約５分間振とうじ、次にア七トン中のＮ−
ヒドロキシコハク酸イミドの溶液を加え、続いて２５■
１の２−プロバノールを加えた．反応容器をシェーカー
」二で約２２時間保ち、次に生成物を濾過し、２ｘ２５
０ｍｌのイソブロバノール、２ｘ２５０ａ＋Ｉのアセト
ンで洗浄し、約８０℃で約４時間乾燥した．収Ｉｔ ２
６．４ｇ．分析： Ｃ＝１３．６０Ｘ，Ｈ＝２．１４
Ｘ，Ｎ＝３．３８Ｋ．実施例ｌ４ 本発明に従うジアゾアフィニティークロロホルムマトリ
ックスのＦＡＩ！物は次の手順で製造できる．Ａ）シリ
カ−ＰｒＳｉ−ＰＥｌをメタノール中でｐ−ニトロペン
ズアルデヒトと反応させ、生しる生成物をメタノール中
で水素化ホウ素ナトリウムと反応させる．生成物を約６
０℃でナトリウムジチオナイトｉｌ液中に懸濁させる．
生じる生成物を、氷冷したＨＢＦ４と反応させ、生成物
を濾遇し、氷水で洗浄し、真空下で乾燥して、所望のジ
アゾニウムフルオロボレート生成物を生しろ。
Ｂ）シリカ−ＰｒＳｉ−ＰＥｌをｐ−ニトロベンゾイル
クロライドとテトラヒド口フラン及びトリエチルアミン
中で反応させ、生じる生成物をナトリウムジチオナイト
溶液中に懸渭し、続いて反応生成物を水冷ＨＢＦ’．で
処理し、濾過し、氷水で洗浄し、生成物を真空下で乾燥
して所望のジアソニウムフルオロボレート生成物を生し
る。
クロライドとテトラヒド口フラン及びトリエチルアミン
中で反応させ、生じる生成物をナトリウムジチオナイト
溶液中に懸渭し、続いて反応生成物を水冷ＨＢＦ’．で
処理し、濾過し、氷水で洗浄し、生成物を真空下で乾燥
して所望のジアソニウムフルオロボレート生成物を生し
る。
ｎ
実施例１５
実施例６に従って！！遺したｌＯｇのクルクルアルデヒ
ドＰＥｌ−シリカゲルアフィニティーマトリックスな溶
離液のｐＨが洗浄用緩衝液のｐｉと等しくなる（平衡）
まで０．１Ｍ燐酸塩（ｐＨ８．０）で洗浄した。
ドＰＥｌ−シリカゲルアフィニティーマトリックスな溶
離液のｐＨが洗浄用緩衝液のｐｉと等しくなる（平衡）
まで０．１Ｍ燐酸塩（ｐＨ８．０）で洗浄した。
２０．０＋ｇｌの２５＋＋ｇ／ｍｌ人１ｇＧ溶液（０．
１Ｍ燐酸緩衝液、ｐｌｌ８．０中）をアフィニティーマ
トリックスに加えた．ＩＡ縮した蛋白質溶液を反応容量
を小さく保つ為に使用し、反応を一夜４℃で進行させた
。アフィニティーマトリックスを共有結合していない物
質を除去する為に次の緩衝液の順番で洗浄した．０．１
Ｍ燐酸塩、０．１Ｍ燐酸塩＋Ｉ．ＯＭＮａＣＩ、０．
１Ｍ燐酸塩．全ての緩衝液のｐＮは８．０に調整した。
１Ｍ燐酸緩衝液、ｐｌｌ８．０中）をアフィニティーマ
トリックスに加えた．ＩＡ縮した蛋白質溶液を反応容量
を小さく保つ為に使用し、反応を一夜４℃で進行させた
。アフィニティーマトリックスを共有結合していない物
質を除去する為に次の緩衝液の順番で洗浄した．０．１
Ｍ燐酸塩、０．１Ｍ燐酸塩＋Ｉ．ＯＭＮａＣＩ、０．
１Ｍ燐酸塩．全ての緩衝液のｐＮは８．０に調整した。
未反応位置をキャップするためにアブィニティーマトノ
ックスを次に０．２Ｍエタノールアミン、ｐＨ８．０で
４℃で１〜３時間洗浄した。アフィニティーマトリック
スを０．１Ｍ燐酸塩でｐＨ７．０で平衡にした。マトリ
ックスを４℃で貯蔵した， ０．１％ナトリウムアミド
を防腐剤としてｔｍえた．９６ｚの免疫グロブリン蛋白
質を分析によって、モして逆相ＨＰＬＣで測定されるよ
うに固定し、その免疫グロブリン蛋白質の量は溶液に残
った．固定した抗体はこの溶液中のべブチドが抗体アフ
ィニテイーマトリックスの充填力ラム上を通過させられ
たときに、その特異的な抗体ソマトロトロビンの保持に
よって決定されるように、免疫的に活性であった．構造
的に関連したベプチドはカラムにより保持ざれなかった
。
ックスを次に０．２Ｍエタノールアミン、ｐＨ８．０で
４℃で１〜３時間洗浄した。アフィニティーマトリック
スを０．１Ｍ燐酸塩でｐＨ７．０で平衡にした。マトリ
ックスを４℃で貯蔵した， ０．１％ナトリウムアミド
を防腐剤としてｔｍえた．９６ｚの免疫グロブリン蛋白
質を分析によって、モして逆相ＨＰＬＣで測定されるよ
うに固定し、その免疫グロブリン蛋白質の量は溶液に残
った．固定した抗体はこの溶液中のべブチドが抗体アフ
ィニテイーマトリックスの充填力ラム上を通過させられ
たときに、その特異的な抗体ソマトロトロビンの保持に
よって決定されるように、免疫的に活性であった．構造
的に関連したベプチドはカラムにより保持ざれなかった
。
実施例１６
実施例６に従って製造した５８のグルタルアルデヒトＰ
Ｅｌ−シリカゲルアフィニティーマトリックスを溶離液
のρＨが洗浄用ａｔ術液のρ｝１と等しくなる（平衡）
まで０，ＩＭアセテート（ｐＨ８．７）で洗浄した。
Ｅｌ−シリカゲルアフィニティーマトリックスを溶離液
のρＨが洗浄用ａｔ術液のρ｝１と等しくなる（平衡）
まで０，ＩＭアセテート（ｐＨ８．７）で洗浄した。
１０ｍｌの３０Ｂ／ｍｌキモトリブシン溶液（０．１Ｍ
酢酸緩衝液、ｐＨ８．７中）をアフィニティーマトリッ
クスに加えた。濃縮した蛋白質溶液を反応容１を小さく
保つ為に使用し、反応を一夜５℃で進行させた．アフィ
ニティーマトリックスを０． ＩＮ酢ＰＩ緩衝液、ｐｌ
１７．０で、共有結合していない物質を除去する為に洗
浄した．アフィニティーマトリックスを４℃で乾燥のま
ま、又は酢酸塩緩衝液（ｐｌｌ７．０） ：２−プロバ
ノール（９：ｌ）中で貯蔵した。００％の酵素が分析に
より、モして逆相ＨＰＬＣで測定されるように固定ざれ
、その量の酵素が溶漬に残った。固定した酵素をガラス
力ラム中に充填し、アミノ酸及びアミノ酸誘導体をクロ
マトグラフィーにかけるためにクロマトグラフィーマ１
・り・ノクスとして使用した。
酢酸緩衝液、ｐＨ８．７中）をアフィニティーマトリッ
クスに加えた。濃縮した蛋白質溶液を反応容１を小さく
保つ為に使用し、反応を一夜５℃で進行させた．アフィ
ニティーマトリックスを０． ＩＮ酢ＰＩ緩衝液、ｐｌ
１７．０で、共有結合していない物質を除去する為に洗
浄した．アフィニティーマトリックスを４℃で乾燥のま
ま、又は酢酸塩緩衝液（ｐｌｌ７．０） ：２−プロバ
ノール（９：ｌ）中で貯蔵した。００％の酵素が分析に
より、モして逆相ＨＰＬＣで測定されるように固定ざれ
、その量の酵素が溶漬に残った。固定した酵素をガラス
力ラム中に充填し、アミノ酸及びアミノ酸誘導体をクロ
マトグラフィーにかけるためにクロマトグラフィーマ１
・り・ノクスとして使用した。
実施例１７
実施例６に従って製造した５０ｍｇのグルタルアルデヒ
ドＰＥｌ−シリカゲル アフィニティーマトリックスを
溶離液のｐＨが洗浄用緩衝液のｐ｝Ｉと等しくなる（平
衡）まで、０．０５〜０．１Ｍ燐酸塩（ｐＨ７．５〜８
．５）で洗浄したｓ ２．Ｏｍｌの０．５Ｂ／ｍｌガラ
クトースオキシダーゼ溶液（ ０．０５〜０．１Ｍ燐酸
塩又はホウ酸塩緩１ｊ液、ｐ Ｈ ７ ． ５〜８．５
中）をアフィニティーマトリックスに加えた．濃縮した
蛋白質溶液を反応１！量を最小に保つ為に使用し、反応
を一夜４℃で進行させた．アフィニティーマトリックス
を共有結合していない物質を除去する為に、次の順番の
緩（！ｊ液で洗浄した。０．１Ｍ燐酸塩、０．１Ｍ燐酸
塩＋ｌ．ＯＭＮａＣｌ、Ｏ．ｌＭ燐酸塩。全ての緩衝液
の１１８は８．０５に調整した．アフィニティーマトリ
ックスを次に０．２Ｍエタノールアミン叉はトリス（ρ
｝１８．０）で洗浄し、未反応位置を１〜３時間４℃で
キャップした．アフィニティーマトリックスを次に０．
１Ｍ燐酸塩、ｐＨ７．０で平衡にした。アフィニディー
マｌ・リックスを４℃で貯蔵した．分析により、そして
逆相１１ＰＬＣで測定されるように９８ｚの酵素が固定
ざれ、その量の酵素蛋白質が溶液に残った，固定された
酵素を０〜ジアニシジンを用いる比色酸価還元反応によ
って測定されるように活性であった。
ドＰＥｌ−シリカゲル アフィニティーマトリックスを
溶離液のｐＨが洗浄用緩衝液のｐ｝Ｉと等しくなる（平
衡）まで、０．０５〜０．１Ｍ燐酸塩（ｐＨ７．５〜８
．５）で洗浄したｓ ２．Ｏｍｌの０．５Ｂ／ｍｌガラ
クトースオキシダーゼ溶液（ ０．０５〜０．１Ｍ燐酸
塩又はホウ酸塩緩１ｊ液、ｐ Ｈ ７ ． ５〜８．５
中）をアフィニティーマトリックスに加えた．濃縮した
蛋白質溶液を反応１！量を最小に保つ為に使用し、反応
を一夜４℃で進行させた．アフィニティーマトリックス
を共有結合していない物質を除去する為に、次の順番の
緩（！ｊ液で洗浄した。０．１Ｍ燐酸塩、０．１Ｍ燐酸
塩＋ｌ．ＯＭＮａＣｌ、Ｏ．ｌＭ燐酸塩。全ての緩衝液
の１１８は８．０５に調整した．アフィニティーマトリ
ックスを次に０．２Ｍエタノールアミン叉はトリス（ρ
｝１８．０）で洗浄し、未反応位置を１〜３時間４℃で
キャップした．アフィニティーマトリックスを次に０．
１Ｍ燐酸塩、ｐＨ７．０で平衡にした。アフィニディー
マｌ・リックスを４℃で貯蔵した．分析により、そして
逆相１１ＰＬＣで測定されるように９８ｚの酵素が固定
ざれ、その量の酵素蛋白質が溶液に残った，固定された
酵素を０〜ジアニシジンを用いる比色酸価還元反応によ
って測定されるように活性であった。
実施例ｌ８
実施例３に従って製造したドリアシンＰＥｌ−シリカゲ
ルアフィニティーマトリックスをｉ３ ｆＪｔ ｉ｛Ｉ
ｆのｐＨが洗浄用緩衝液のｐＨと平衡になるまで、Ｏ．
ＩＭ燐酸塩（ｐＨ ７ ． ５ ）で洗浄したｅ２−
５ｍｌのＩＢ／Ｉｌ＋Ｉバーオキシダーゼ溶液（０．１
Ｍ燐酸塩、ｐＨ７．５中）をアフィニティーマトリック
スに加え、反応を室温で４時間進行させた。アフィニテ
ィーマトリックスを次の緩衝液の順番で共有結合してい
ない物質を除去する為に洗浄した。Ｏ．ｌＭ燐酸塩、０
． １Ｍ燐酸塩＋１ ． ＯＭＮａＣｌ、０．１Ｍ燐酸
塩．全ての緩衝ｉｆのρ｝１はｌ’１．０を使用した。
ルアフィニティーマトリックスをｉ３ ｆＪｔ ｉ｛Ｉ
ｆのｐＨが洗浄用緩衝液のｐＨと平衡になるまで、Ｏ．
ＩＭ燐酸塩（ｐＨ ７ ． ５ ）で洗浄したｅ２−
５ｍｌのＩＢ／Ｉｌ＋Ｉバーオキシダーゼ溶液（０．１
Ｍ燐酸塩、ｐＨ７．５中）をアフィニティーマトリック
スに加え、反応を室温で４時間進行させた。アフィニテ
ィーマトリックスを次の緩衝液の順番で共有結合してい
ない物質を除去する為に洗浄した。Ｏ．ｌＭ燐酸塩、０
． １Ｍ燐酸塩＋１ ． ＯＭＮａＣｌ、０．１Ｍ燐酸
塩．全ての緩衝ｉｆのρ｝１はｌ’１．０を使用した。
アフィニティーマトリックスを次に０．２Ｍエタノール
アミン（ ｒ＋Ｈ８．ｏ）で、１〜３時間室温で洗浄し
、未反応位置をキャップした。次にアフィニティーマト
リックスを次に０，ＩＭ燐酸塩、ｐ１１７．０で平船に
した。アフィニティーマトリックスを４’Ｃで貯蔵した
。固定方法は反応懸濁液からの上澄み液の２８０ｎｍに
於ける吸光度をモニターすることによって追跡した。溶
液中の５４％の酵素が吸収された。固定された酵素は可
浦性酵素の当量の５５１の活性を示した． 実施例１９ ５０ＢのグルタルアルデヒＩ” ＰＥｌ シリカゲル
アフィニティーマトリックスを、Ｏ．ＩＭ燐酸塩緩衝Ｚ
夜、ｐ１１８で充分洗摩し、ｌ，′１１じ緩衝液で平衡
Ｚこした。
アミン（ ｒ＋Ｈ８．ｏ）で、１〜３時間室温で洗浄し
、未反応位置をキャップした。次にアフィニティーマト
リックスを次に０，ＩＭ燐酸塩、ｐ１１７．０で平船に
した。アフィニティーマトリックスを４’Ｃで貯蔵した
。固定方法は反応懸濁液からの上澄み液の２８０ｎｍに
於ける吸光度をモニターすることによって追跡した。溶
液中の５４％の酵素が吸収された。固定された酵素は可
浦性酵素の当量の５５１の活性を示した． 実施例１９ ５０ＢのグルタルアルデヒＩ” ＰＥｌ シリカゲル
アフィニティーマトリックスを、Ｏ．ＩＭ燐酸塩緩衝Ｚ
夜、ｐ１１８で充分洗摩し、ｌ，′１１じ緩衝液で平衡
Ｚこした。
２．５ｍｌのβ一カラク゜トシダ〜ゼ０．８ａ＋ｇ／ｉ
ｌｒｉ 液をアフィニティーマトリックスＭ，ｉｉ液に
加え、固定速度はヒ；０み１αの２８０ｎｍに於ける吸
光度をモニターずろことによって追跡した。
ｌｒｉ 液をアフィニティーマトリックスＭ，ｉｉ液に
加え、固定速度はヒ；０み１αの２８０ｎｍに於ける吸
光度をモニターずろことによって追跡した。
４Ｃて２０時間後、７３％の酵素がマトリックスに結合
し、可溶性酵素の特異的活性の４０１を示した。
し、可溶性酵素の特異的活性の４０１を示した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、（ａ）一般式 シリカ−ＰｒＳｉ−ＰＥｌ■Ｒ）ｘ 〔式中シリカ−ＰｒＳｉ−ＰＥｌは（１）ａ）平均粒径
約１〜約２００ミクロン、平均孔寸法約０〜１０００オ
ングストローム単位を有する微粒状シリカゲル、又は ｂ）平均粒径約１〜約２００ミクロン及び平均孔寸法約
０〜約１０００オングストローム単位を有する微粒状の
抑制された孔のガラス、 と （２）約４００〜約１８００の平均分子量を有するポリ
エチレンイミノプロピルトリメトキシシラン、 との反応生成物である、共有結合した架橋されていない
ポリエチレンイミン結合相固体支持体である〕の支持体
、 又は （ｂ）グラム当たり約０．３〜約１．２カルボキシルミ
リ当量を含有する、シリカ−ＰｒＳｉ−ＰＥｌ固体支持
体（一般式 シリカ−ＰｒＳｉ−ＰＥｌ■Ｒ）ｘの二塩基酸無水物に
よる弱酸性カルボキシル化生成物、 からなる群から選ばれる固相支持体 〔但し、弱酸性カルボキシル化支持体でないときは、 Ｒは、Ｒがそれの二つの別々の場所の一つに於てＰＥｌ
の第１級及び第２級のアミノ基に共有結合されるように
なる、そして水性の加水分解緩衝条件下で安定な第二の
共有結合を形成するためにそれのもう一方の位置をアフ
ィニティークロマトグラフィーリーガンドによる非変性
条件下での後の親核置換に利用出来、反応性であるよう
にしている、上記二つの別々の位置で親核置換を受ける
ことの出来る任意の化学的に反応性の部分の残基を表わ
し、 ｘはＰＥｌ部分の第１級又は第２級アミノ基の合計数よ
りも小さいか又は等しい整数であり、 弱酸性カルボキシル化支持体である場合に於ては、 Ｒは、アフィニティークロマトグラフィーリーガンド上
で親核官能基によりカルボキシル炭素に於て容易に置換
されるように、カルボニル炭素に共有結合を形成し、そ
れによって充分に親核性の位置を造るために、カルボキ
シルのヒドロキシルの親核置換を促進することの出来る
任意の化学的に反応性の部分の残基であり、 ｘはカルボキシル化ＰＥｌ部分のカルボニル基の合計数
よりも小さいか又は等しい整数である〕。 ２、シリカゲルが平均粒径約３〜約７０ミクロンを有し
、平均孔寸法約５０〜約１０００オングストローム単位
を有する特許請求の範囲第１項に記載の固相支持体。 ３、Ｒが ▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、
表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼、 ▲数式、化学式、表等があります▼、 ▲数式、化学式、表等があります▼、 ▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、
表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼、 ▲数式、化学式、表等があります▼、 からなる群から選ばれる特許請求の範囲１又は２の何れ
かに記載の固相支持体。 ４、固相支持体が特許請求の範囲第１、２又は３の何れ
か一の固相である、酵素がアフィニティークロマトグラ
フィーマトリックス固相支持体上に固定されている固定
固相酵素。５、（ａ）式 シリカ−ＰｒＳｉ−ＰＥｌ■Ｒ）ｘ 〔式中シリカ−ＰｒＳｉ−ＰＥｌは （１）ａ）平均粒径約１〜約２００ミクロン、平均孔寸
法約０〜１０００オングストローム単位を有する微粒状
シリカゲル、又は ｂ）平均粒径約１〜約２００ミクロン及び平均孔寸法約
０〜約１０００オングストローム単位を有する微粒状の
抑制された孔のガラス、 と （２）約４００〜約１８００の平均分子量を有するポリ
エチレンイミノプロピルトリメトキシシラン、 との反応生成物である、共有結合した架橋されていない
ポリエチレンイミン結合相固体支持体である〕のマトリ
ックス、 又は （ｂ）グラム当たり約０．３〜約１．２カルボキシルミ
リ当量を含有する、シリカ−ＰｒＳｉ−ＰＥｌ固体支持
体（一般式シリカ−ＰｒＳｉ−ＰＥｌ■Ｒ）ｘの二塩基
酸無水物による弱酸性カルボキシル化生成物、 からなる群から選ばれるアフィニティーマトリックスに
共有結合されたリーガンドを含んでいる、リーガンドの
結合されたクロマトグラフィーアフィニティーマトリッ
クス。 〔但し、弱酸性カルボキシル化支持体でないときは、 Ｒは、Ｒがそれの二つの別々の場所の一つに於てＰＥｌ
の第１級及び第２級のアミノ基に共有結合されるように
なる、そして水性の加水分解緩衝条件下で安定な第二の
共有結合を形成するためにそれのもう一方の位置をアフ
ィニティークロマトグラフィーリーガンドによる非変性
条件下での後の親核置換に利用出来、反応性であるよう
にしている、上記二つの別々の位置で親核置換を受ける
ことの出来る任意の化学的に反応性の部分の残基を表わ
し、 ｘはＰＥｌ部分の第１級又は第２級アミノ基の合計数よ
りも小さいか又は等しい整数であり、 弱酸性カルボキシル化支持体である場合に於ては、 Ｒは、アフィニティークロマトグラフィーリーガンド上
で親核官能基によりカルボキシル炭素に於て容易に置換
されるように、カルボニル炭素に共有結合を形成し、そ
れによって充分に親核性の位置を造るために、カルボキ
シルのヒドロキシルの親核置換を促進することの出来る
任意の化学的に反応性の部分の残基であり、 ｘはカルボキシル化ＰＥｌ部分のカルボニル基の合計数
よりも小さいか又は等しい整数である〕。 ６、シリカゲルが平均粒径約３〜約７０ミクロンを有し
、平均孔寸法約５０〜約１０００オングストローム単位
を有する特許請求の範囲第５項に記載のりガンドの結合
されたクロマトグラフィーアフィニティーマトリックス
。 ７、Ｒが ▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、
表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼、 ▲数式、化学式、表等があります▼、 ▲数式、化学式、表等があります▼、 ▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、
表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼、 ▲数式、化学式、表等があります▼及び▲数式、化学式
、表等があります▼ からなる群から選ばれる特許請求の範囲第５又は６の何
れかに記載のリーガンドの結合されたクロマトグラフィ
ーアフィニティーマトリックス。 ８、溶液中のある物質を、その物質に対するアフィニテ
ィーマトリックス共有結合リーガンドを有するアフィニ
ティーマトリックスと結合させることによって、溶液か
らその物質を分離又は精製する方法に於て、アフィニテ
ィーマトリックスとして特許請求の範囲第１、２、３又
は４の何れか一の固相支持体を使用することからなる方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP89306229A EP0403700B1 (en) | 1989-06-20 | 1989-06-20 | Polyethyleneimine matrixes for affinity chromatography |
| CA000603459A CA1332598C (en) | 1989-06-20 | 1989-06-20 | Polyethyleneimine matrixes for affinity chromatography |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0326961A true JPH0326961A (ja) | 1991-02-05 |
| JPH0797108B2 JPH0797108B2 (ja) | 1995-10-18 |
Family
ID=25672826
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1160559A Expired - Lifetime JPH0797108B2 (ja) | 1989-06-20 | 1989-06-22 | アフィニティークロマトグラフィー用のポリエチレンイミンマトリックス |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0403700B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0797108B2 (ja) |
| AU (1) | AU610734B2 (ja) |
| CA (1) | CA1332598C (ja) |
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| JP2018517559A (ja) * | 2015-06-05 | 2018-07-05 | ダブリュー・アール・グレース・アンド・カンパニー−コーンＷ Ｒ Ｇｒａｃｅ ＆ Ｃｏ−Ｃｏｎｎ | 吸着性バイオプロセス清澄化剤並びにその製造及び使用方法 |
| US11389783B2 (en) | 2014-05-02 | 2022-07-19 | W.R. Grace & Co.-Conn. | Functionalized support material and methods of making and using functionalized support material |
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| CN1265049A (zh) * | 1997-07-22 | 2000-08-30 | 拉普吉恩公司 | 基于聚乙烯亚胺的生物分子阵列 |
| NZ501776A (en) | 1997-07-22 | 2001-10-26 | Qiagen Genomics Inc | Spring probe and methods for arraying oligonucleotide and thickening agent to a solid support |
| ATE323885T1 (de) * | 2001-07-16 | 2006-05-15 | Dr Chip Biotechnology Inc | Immobilisierung von oligonukleotiden durch kovalente bindung |
| US6995248B2 (en) | 2001-07-16 | 2006-02-07 | Dr. Chip Biotechnology, Inc. | Immobilization of nucleic acids |
| MY178616A (en) | 2012-09-17 | 2020-10-19 | Grace W R & Co | Chromatography media and devices |
| CN119799411A (zh) * | 2025-01-21 | 2025-04-11 | 苏州城市学院 | 一种利用枇杷花生产高纯度精油的方法 |
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| JPS62235207A (ja) * | 1986-03-06 | 1987-10-15 | ジェイ ティー ベイカー インコーポレーテッド | アシル化ポリエチレンイミン結合相シリカ生成物のスルホン酸誘導体類 |
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-
1989
- 1989-06-20 CA CA000603459A patent/CA1332598C/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-06-20 EP EP89306229A patent/EP0403700B1/en not_active Expired
- 1989-06-22 JP JP1160559A patent/JPH0797108B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-06-28 AU AU37125/89A patent/AU610734B2/en not_active Expired
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| AU3712589A (en) | 1991-02-07 |
| EP0403700A1 (en) | 1990-12-27 |
| EP0403700B1 (en) | 1992-08-05 |
| JPH0797108B2 (ja) | 1995-10-18 |
| AU610734B2 (en) | 1991-05-23 |
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