JPH0797357A

JPH0797357A - マロン酸（ｐ−ニトロベンジルアルコール）エステルーアミド及びその製造方法

Info

Publication number: JPH0797357A
Application number: JP27118693A
Authority: JP
Inventors: Katsuhisa Fukunaga; 克久福永; Naoyuki Harada; 直幸原田; Ryoichi Hasegawa; 良一長谷川; Kenji Kunikata; 賢治国方
Original assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Current assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Priority date: 1993-08-06
Filing date: 1993-10-05
Publication date: 1995-04-11

Abstract

(57)【要約】【目的】新規化合物及びその製造方法を提供する。【構成】マロン酸（Ｐ−ニトロベンジルアルコ−ル）エ
ステル−アミド、及びＰ−ニトロベンジルアルコールシ
アノ酢酸エステルにシュードモナス属又はロドコッカス
属に属する細菌を作用させることによる上記アミドの製
造方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は，新規な化合物である，
マロン酸（Ｐ−ニトロベンジルアルコ−ル）エステル−
アミド及びその製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】本化合物は文献に未記載の化合物であ
り、またその製造法も知られていない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】医薬品等の中間体とし
て有用な，新規化合物及びその効率的な製造方法を提供
する。

【０００４】

【課題を解決するための手段】マロン酸（Ｐ−ニトロベ
ンジルアルコ−ル）エステル−アミド及びＰ−ニトロベ
ンジルアルコールシアノ酢酸エステルに微生物を作用さ
せてシアノ基を加水分解することによるマロン酸（Ｐ−
ニトロベンジルアルコール）エステル−アミドの製造方
法を提供する。

【０００５】本化合物を得るためには，Ｐ−ニトロベン
ジルアルコ−ルマロン酸半エステルを塩化チオニル，３
塩化リン，オキシ塩化リン，等の塩素化剤と反応させて
酸クロライドとし，ここにアンモニアガスやアンモニア
水を反応させる方法がある。また，Ｐ−ニトロベンジル
アルコ−ルシアノ酢酸エステルを，酵素加水分解反応に
かけることにより得ることが出来る。

【０００６】化学反応による方法は，まずＰ−ニトロベ
ンジルアルコ−ルマロン酸半エステルを，ベンゼン，ト
ルエン，キシレン，ジクロロメタン，ジクロロエタン等
の塩素化剤に対して安定な溶媒に，溶解または分散し，
必要に応じてジメチルフォルムアミド，を初めとする触
媒を添加し，前記の塩素化剤を滴下して反応させる。反
応温度は室温〜１５０℃がよい。反応時間は１〜５時間
で充分である。この様にして得られたＰ−ニトロベンジ
ルアルコ−ルマロン酸半エステルの酸クロライドを含む
溶液に，０℃〜８０℃にてアンモニアガスを吹き込む
か，過剰のアンモニア水を加える事により合成すること
が出来る。

【０００７】生成した目的物は，沈澱となるので濾別し
てメタノ−ル，エタノ−ル等で，洗浄して高純度品を得
ることが出来る。

【０００８】マロン酸（Ｐ−ニトロベンジルアルコ−
ル）エステル−アミドは，更に酵素加水分解をさせるこ
とにより，Ｐ−ニトロベンジルアルコ−ルマロン酸半エ
ステルに導くことが出来る。

【０００９】本発明の微生物を用いる製造方法について
詳細に説明する。反応は，培養した微生物の菌体，また
は菌体処理物（菌体の破砕物、粗・精製酵素、固定化菌
体・酵素等）を溶媒中で，原料であるＰ−ニトロベンジ
ルアルコ−ルシアノ酢酸エステルに接触させることによ
りおこなわれる。それらの使用量や反応条件等について
以下に詳細に説明する。

【００１０】反応の溶媒は水が好ましいが，生理食塩
水，溶媒のｐＨを安定に保つために緩衝液が使用でき
る。緩衝液の種類は燐酸塩，トリスアミノメタン−ＨＣ
ｌ，クエン酸塩，グリシン・ソ−ダなどが使用できるが
特に限定はされない。緩衝液の濃度は１Ｍ〜０．００１
Ｍが使用できるが緩衝液としての効果が発揮される範囲
であればよい。水を使用する場合にはＥＤＴＡなどの金
属キレ−ト剤を添加すると反応が促進される。また上記
の菌体処理物を用いる場合にジチオスレイト−ル，メル
カプトエタノールなどの酸化防止剤の添加は反応効率を
高める。その他，水とメタノ−ル，エタノ−ル，アセト
ン，アセトニトリル等の混合溶媒も使用することが出来
る。ｐＨはｐＨ５〜８に保つのがよい。反応の温度は，
０℃〜８０℃，好ましくは５℃〜４０℃の範囲で行うの
がよい。反応時間は，酵素の種類や原料の濃度によって
３０分〜２日くらいを要する。原料であるｐ−ニトロベ
ンジルアルコ−ルシアノ酢酸エステルは中性〜アルカリ
側の水中で不安定であるため反応は短時間で完結するこ
とが望ましい。原料であるＰ−ニトロベンジルアルコ−
ルシアノ酢酸エステルの濃度は溶媒に対し０．１％〜３
０％（重量％），好ましくは０．３％〜１０％とすると
よい結果がえられる。反応終了後，単離した酵素を用い
る時は濾過をすることによって取り出す事ができる。微
生物の菌体をそのまま用いた時は，有機溶媒を加えて目
的物を溶解し，濾過や遠心分離により菌体を取り除いた
後に溶媒を留去して析出した沈澱を濾別するのがよい。
本発明で使用する微生物の培養は，公知の培養方法に準
じて行う事が出来る。培地は，資化し得るグルコ−ス，
グリセリンなどの炭素源，硫酸アンモニウムなどの窒素
源，無機態リン，生育に必須の無機栄養素などを含有し
た通常の培地が利用できる。またこれらの培地に酵母エ
キス，肉エキスなどの天然培地を添加したものも使用す
ることが出来る。培養初期から中期に生育を大きく阻害
しない濃度のイソバレロニトリル，ベンゾニトリル，ｐ
−ニトロベンゾニトリル，シアノ酢酸などのニトリル
類，ε−カプロラクタム，ジメチルアセトアミド，ニコ
チンアミドなどのアミド類及び鉄，コバルト，マンガ
ン，亜鉛等の金属を酵素誘導物質として添加することに
より，高い酵素活性がえられることがある。使用する培
地のｐＨは５〜９，培養温度は５〜４０℃の範囲で選べ
ばよく，好ましくは２５〜３５℃である。培養は１〜７
日程度好気的に行い，目的の酵素活性が最大となるまで
継続すればよい。

【００１１】本発明に用いられる微生物は例えば新規シ
ュウドモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）細菌ＮＫＮ
００３菌（微工研寄託番号ＦＥＲＭＰ−１３８５０
号）および新規ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕ
ｓ）細菌ＮＫＮ１１３菌（微工研寄託番号ＦＥＲＭ
Ｐ−１３８６５号）が挙げられる。これらはいずれも工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。これ
ら２細菌の特徴を次項以降表１に示す。

【００１２】

【表１】

【００１３】上述の菌学的性質をＢＥＲＧＥＹ’ＳＭ
ＡＮＵＡＬｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙＶｏｌｕｍｅ１及び２に従い公知の
菌株とその異同を検討した結果，上記２菌株は以下の通
りであった。

【００１４】ＮＫＮ００３菌（微工研寄託番号ＦＥＲＭ
Ｐ−１３８５０号）はグラム染色陰性，運動性を示し
べん毛として極毛を有するカタラ−ゼプラスの好気的で
栄養要求性のない桿菌であり，蛍光性色素を生成する
等，表１記載の特徴から本菌はシュウドモナス属（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に属し，本菌株の菌体細胞の大き
さが少し小さくＤ−ガラクト−スから酸を発生するとい
う点を除けば前記文献中のシュウドモナス・プチダ
（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）種とほぼ一致する。以上の点から
本菌はシュウドモナス・プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）種
に近縁の種と推定された。なお、本発明のマロン酸（Ｐ
−ニトロベンジルアルコール）エステル−アミドはカル
バペネム系抗菌剤などを製造する際の保護基として有用
である。

【００１５】ＮＫＮ１１３菌（微工研寄託番号ＦＥＲＭ
Ｐ−１３８６５号）はグラム染色陽性，運動性なく，
多形性を有し，好気性，カタラ−ゼプラスの桿菌，さら
にＤＮＡ中のＧＣ含量が６９．１％，細胞壁成分にジア
ミノピメリン酸，ミコ−ル酸を有することからロドコッ
カス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）に属する。また硝酸
還元プラス，糖から酸を発生しない，および前記記載の
試験結果は前記文献中のロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅ
ｑｕｉ）種の記載内容と一致する。以上の点から本菌は
ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）種に類縁の種と
推定された。

【００１６】次に実施例によって詳しく説明する。

【実施例１】１００ｍｌのフラスコにＰ−ニトロベンジ
ルアルコ−ルマロン酸半エステルを１０ｇ，トルエンを
６０ｍｌ仕込み，ジメチルフォルムアミド０．５ｇを添
加した。７５℃に昇温し，塩化チオニル６ｇをトルエン
５ｍｌに溶解した物を０．５時間で滴下した。１時間同
温で反応させた後，反応混合物を，室温で撹はんしてい
る２８％アンモニア水２５ｍｌ中に徐々に滴下した。沈
澱が生成したので濾過した。乾燥後，マロン酸（Ｐ−ニ
トロベンジルアルコ−ル）エステル−アミドの収量は
３．９ｇであった。液体クロマトグラフによる純度は，
９０％であった。これをメタノ−ル中に分散し室温で１
時間撹はんした後，濾別し乾燥した。液体クロマトグラ
フによる純度は，９７，２％に向上した。融点は１２７
〜１２９℃であった。ＩＲスペクトルは，第一アミドの
Ｎ−Ｈに基ずく吸収が，波数３４００，３１９０に，第
一アミドのカルボニル基に基ずく吸収が，波数１６６０
に，エステル結合のカルボニルに基ずく吸収が，波数１
７３０に特徴的吸収として観測された。１Ｈ−ＮＭＲス
ペクトルにおいては，３．４５ｐｐｍにマロン酸のメチ
レン水素に基ずく吸収，５．３０ｐｐｍにはベンジルメ
チレンの水素に基ずく吸収，７．５〜７．６にニトロ基
のオルソ位の芳香族水素のダブレット，８．３〜８．４
にニトロ基のメタ位の芳香族水素のダブレットの吸収が
観測された。また，イソブタンを用いたＣＩ−マススペ
クトルにおいては，分子量＋１の質量数２３９ピ−クが
観測された。

【００１７】

【実施例２】グリセリン１％、ポリペプトン０．５％、
マルト・エキストラクト０．３％、イ−スト・エキスト
ラクト０．３％を含んだ井戸水をオ−トクレ−ブで殺菌
した培地に０．１％のイソバレロニトリルを添加して，
ＮＫＮ００３菌を植菌して３０℃で培養を開始した。培
養１日目に０．１％のイソバレロニトリルを添加し培養
２日目に４ｍｌの培養液を得た。細菌を遠心分離により
分離し１０ｍＭのＥＤＴＡを含む生理食塩水２０ｍｌに
分散した。ここに，１２５７ｍｇのＰ−ニトロベンジル
アルコ−ルシアノ酢酸エステルを添加してシアノ基加水
分解を行った。１０％の水酸化ナトリウムでｐＨを７．
５〜８．０に保ちながら室温で４時間撹はんした。反応
終了後液体クロマトグラフにより分析した結果，生成し
たマロン酸（Ｐ−ニトロベンジルアルコ−ル）エステル
−アミドは８３．３％，Ｐ−ニトロベンジルアルコ−ル
マロン酸半エステルは２．１％，Ｐ−ニトロベンジルア
ルコ−ルは２．７％，未反応のＰ−ニトロベンジルアル
コ−ルシアノ酢酸エステルは１２％であった。反応終了
後２０ｍｌのアセトニトリルを加え目的物を溶解させた
後，細菌を遠心分離し，その濾液からアセトニトリルの
一部を留去した。析出した沈澱を濾別し乾燥してマロン
酸（Ｐ−ニトロベンジルアルコ−ル）エステル−アミド
８００ｍｇを得た。液体クロマトグラフによる純度は９
７．０％であった。融点は１２７℃〜１２９℃であり，
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル，ＩＲスペクトルは実施例１で
得たものと一致した。

【００１８】

【参考例】実施例２において，反応時間を１５時間に延
長したとき，更に酵素加水分解された，Ｐ−ニトロベン
ジルアルコ−ルマロン酸半エステルが主生成物として生
成していることが液体クロマトグラフで確認された。

【００１９】

【実施例４】ＮＫＮ１１３菌を実施例２と同様の培地
で、培養を同様に開始して培養２日目に０．１％のイソ
バレロニトリルを添加した。培養３日目に５ｍｌの培養
液を得た。細菌を遠心分離により分離して５ｍｌの０．
１Ｍの燐酸バッファ−（ｐＨ＝７．０）に分散した。こ
こにＰ−ニトロベンジルアルコ−ルシアノ酢酸エステル
２５ｍｇを添加して４時間撹はんした。反応終了後液体
クロマトグラフにより分析した結果，生成したマロン酸
（Ｐ−ニトロベンジルアルコ−ル）エステル−アミドは
１７．１ｍｇであった。Ｐ−ニトロベンジルアルコ−ル
マロン酸半エステルは５．３ｍｇ，Ｐ−ニトロベンジル
アルコ−ルは，３．９ｍｇ生成した。

【００２０】

【発明の効果】新規化合物，マロン酸（Ｐ−ニトロベン
ジルアルコ−ル）エステル−アミドが微生物による，Ｐ
−ニトロベンジルアルコ−ルシアノ酢酸エステルの加水
分解反応により効率的に得られるようになった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記化学式１で示されるマロン酸（Ｐ−ニ
トロベンジルアルコ−ル）エステル−アミド【化１】
【請求項２】Ｐ−ニトロベンジルアルコールシアノ酢
酸エステルにシュウドモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ）又はロドコッカス属（Ｐｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）に
属する細菌を作用させることにより加水分解することを
特徴とするマロン酸（Ｐ−ニトロベンジルアルコ−ル）
エステルアミドの製造方法
【請求項３】シュウドモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ）に属する細菌がＮＫＮ００３菌であり、ロドコッ
カス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）に属する細菌がＮＫ
Ｎ１１３菌である特許請求項２に記載の方法