JPH0799983A - 微生物によるｐ−ニトロベンジルアルコールマロン酸モノエステルの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ｐ−ニトロベンジルアルコールマロン酸モノ
エステルを効率よく合成する。 【構成】 ｐ−ニトロベンジルアルコールシアノ酢酸エ
ステルにシュドモナス属又はロドコッカス属に属する細
菌を作用させて加水分解することにより、ジエステルを
全く生成せずにｐ−ニトロベンジルアルコールマロン酸
モノエステルを合成する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、微生物によるｐ−ニト
ロベンジルアルコールマロン酸モノエステルの製造法に
関する。

【０００２】

【従来の技術】医薬品の製造原料であるｐ−ニトロベン
ジルアルコールマロン酸モノエステルの製造は、ｐ−ニ
トロベンジルアルコールとマロン酸を酸触媒の存在下加
熱脱水反応させる化学的手法により、目的とするモノエ
ステルが製造できる事が知られている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしそのような方法
ではモノエステルと同時にジエステルが副生する。副生
するジエステルは、目的とするモノエステルの製品純度
を低下させるため完全に除去する必要があった。またマ
ロン酸は比較的高価であること、さらに、多量にジエス
テルが副生すると工業的に不利であるため、加水分解し
てモノエステルにする必要があり効率が悪かった。

【０００４】

【課題を解決するための手段】これらの状況から、より
効率的なｐ−ニトロベンジルアルコールマロン酸モノエ
ステルの製造方法につき鋭意研究を重ねた結果、本発明
者らはこの目的に対してｐ−ニトロベンジルアルコール
シアノ酢酸エステルを原料として微生物を作用させ、シ
アノ基を加水分解することにより、ジエステルを全く副
生せずに目的とするｐ−ニトロベンジルアルコールマロ
ン酸モノエステルを、高純度で製造できる事を見いだし
た。

【０００５】即ち、本発明は、（１）ｐ−ニトロベンジ
ルアルコールシアノ酢酸エステルを原料として微生物を
作用させることを特徴とするｐ−ニトロベンジルアルコ
ールマロン酸モノエステルの製造方法、及び（２）
（１）に記載の微生物がシュウドモナス属（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃ
ｕｓ）の細菌である（１）に記載の方法を提供する。

【０００６】本発明の製造方法について詳細に説明す
る。反応は、培養した微生物の菌体、または菌体処理物
（菌体の破砕物、粗・精製酵素、固定化菌体・酵素等）
を溶媒中で、原料であるｐ−ニトロベンジルアルコール
シアノ酢酸エステルに接触させることによりおこなわれ
る。それらの使用量や反応条件等について以下に詳細に
説明する。反応の溶媒は水が好ましいが、生理食塩水、
溶媒のｐＨを安定に保つために緩衝液が使用できる。緩
衝液の種類は燐酸塩、トリスアミノメタン−ＨＣｌ、ク
エン酸塩、グリシン・ソーダなどが使用できるが特に限
定はされない。緩衝液の濃度は１Ｍ〜０．００１Ｍが使
用できるが緩衝液としての効果が発揮される範囲であれ
ばよい。水を使用する場合にはＥＤＴＡなどの金属キレ
ート剤を添加すると反応が促進される。また上記の菌体
処理物を用いる場合にジチオスレイトール、メルカプト
エタノールなどの酸化防止剤の添加は反応効率を高め
る。その他、水とメタノール、エタノール、アセトン、
アセトニトリル等の混合溶媒も使用することが出来る。
ｐＨはｐＨ５〜８に保つのがよい。反応の温度は、０℃
〜８０℃、好ましくは５℃〜４０℃の範囲で行うのがよ
い。反応時間は、原料の濃度によって３０分〜３日くら
いを要する。原料であるｐ−ニトロベンジルアルコール
シアノ酢酸エステルは中性〜アルカリ側の水中で不安定
であるため反応は短時間で完結することが望ましい。原
料であるｐ−ニトロベンジルアルコールシアノ酢酸エス
テルの濃度は溶媒に対し０．１％〜１０％（重量％）、
好ましくは０．３％〜２％とするとよい結果がえられ
る。反応終了後は塩として水に溶解しているｐ−ニトロ
ベンジルアルコールマロン酸モノエステルを酸析また
は、ヘキサン、トルエン、ベンゼン、酢酸エチル、ジエ
チルエーテル、クロロホルム等の有機溶媒で抽出する事
によって取り出すことができる。本発明で使用する微生
物の培養は、公知の培養方法に準じて行う事が出来る。
培地は、資化し得るグルコース、グリセリンなどの炭素
源、硫酸アンモニウムなどの窒素源、無機態リン、生育
に必須の無機栄養素などを含有した通常の培地が利用で
きる。またこれらの培地に酵母エキス、肉エキスなどの
天然培地を添加したものも使用することが出来る。培養
初期から中期に生育を大きく阻害しない濃度のイソバレ
ロニトリル、ベンゾニトリル、ｐ−ニトロベンゾニトリ
ル、シアノ酢酸などのニトリル類、ε−カプロラクタ
ム、ジメチルアセトアミド、ニコチンアミドなどのアミ
ド類及び鉄、コバルト、マンガン、亜鉛等の金属を酵素
誘導物質として添加することにより、高い酵素活性がえ
られることがある。使用する培地のｐＨは５〜９、培養
温度は５〜４０℃の範囲で選べばよく、好ましくは２５
〜３５℃である。培養は１〜７日程度好気的に行い、目
的の酵素活性が最大となるまで継続すればよい。

【０００７】本発明に用いられる微生物は例えば新規シ
ュウドモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）細菌ＮＫＮ
００３菌（微工研寄託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１３８５０
号）および新規ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕ
ｓ）細菌ＮＫＮ１１３菌（微工研寄託番号 ＦＥＲＭ
Ｐ−１３８６５号）が挙げられる。これらはいずれも工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。これ
ら２細菌の特徴を次項以降表１に示す。

【０００８】

【表１】

【０００９】上述の菌学的性質をＢＥＲＧＥＹ’Ｓ Ｍ
ＡＮＵＡＬ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ １及び２に従い公知の
菌株とその異同を検討した結果、上記２菌株は以下の通
りであった。

【００１０】ＮＫＮ００３菌（微工研寄託番号 ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１３８５０号）はグラム染色陰性、運動性を示
しべん毛として極毛を有するカタラーゼプラスの好気的
で栄養要求性のない桿菌であり、蛍光性色素を生成する
等、表１記載の特徴から本菌はシュウドモナス属（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に属し、本菌株の菌体細胞の大き
さが少し小さく、Ｄ−ガラクトースから酸を発生すると
いう点を除けば前記文献中のシュウドモナス・プチダ
（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）種とほぼ一致する。以上の点から
本菌はシュウドモナス・プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）種
に近縁の種と推定された。

【００１１】ＮＫＮ１１３菌（微工研寄託番号 ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１３８６５号）はグラム染色陽性、運動性な
く、多形性を有し、好気性、カタラーゼプラスの桿菌、
さらにＤＮＡ中のＧＣ含量が６９．１％、細胞壁成分に
ジアミノピメリン酸、ミコール酸を有することからロド
コッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）に属する。また
硝酸還元プラス、糖から酸を発生しない、および前記記
載の試験結果は前記文献中のロドコッカス・エクイ
（Ｒ．ｅｑｕｉ）種の記載内容と一致する。以上の点か
ら本菌はロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）種に類
縁の種と推定された。なお、本発明で製造されるｐ−ニ
トロベンジルアルコールマロン酸モノエステルはカルバ
ペネム系抗菌剤をはじめとする医薬を製造する際の保護
基として使用される。

【００１２】

【実施例】以下実施例により本発明を説明する。％は特
に記載のないものは全て重量％である。またｐ−ニトロ
ベンジルアルコールシアノ酢酸エステルを原料、ｐ−ニ
トロベンジルアルコールマロン酸モノエステルを目的物
と略する。尚全ての実施例を通してジエステルは全く生
成されなっかった。 実施例１ グリセリン１％、ポリペプトン０．５％、マルト・エキ
ストラクト０．３％、イースト・エキストラクト０．３
％を含んだ井戸水をオートクレーブで殺菌した培地２０
ｍｌに０．１％のイソバレロニトリルを添加しＮＫＮ０
０３菌を植菌して３０℃で培養を開始した。培養２日目
に０．２％のイソバレロニトリルを添加し、培養３日目
に菌体を遠心分離にて得た。この菌体をｐＨ６．５、
０．０１Ｍの燐酸カリウム緩衝液で洗い、ｐＨ６．０、
０．１Ｍの燐酸カリウム緩衝液３ｍｌに懸濁し、６ｍｇ
の原料を添加して室温にて２．５時間振とうした。液体
クロマトグラフィーにて分析したところ、生成した目的
物は６．２ｍｇであった。原料であるｐ−ニトロベンジ
ルアルコールシアノ酢酸エステルの分解によって生じた
ｐ−ニトロベンジルアルコールは０．０２ｍｇとわずか
であった。さらに未反応の原料は残っていなかった。液
体クロマトグラフィーによる純度は９９．７％であり、
融点は１０７〜１１０℃であった。１Ｈ−ＮＭＲスペク
トルにおいては、３．５５ｐｐｍにマロン酸のメチレン
水素に基づく吸収、５．３０ｐｐｍにはベンジルメチレ
ンの水素に基づく吸収、７．５〜７．６にニトロ基のオ
ルソ位の芳香族水素のダブレット、８．２〜８．３にニ
トロ基のメタ位の芳香族水素のダブレット吸収が観測さ
れた。

【００１３】実施例２ 実施例１と同様の培地２０ｍｌに０．１％のイソバレロ
ニトリルを添加し、ＮＫＮ１１３菌を３０℃で培養し、
培養３日目に０．２％のイソバレロニトリルを添加して
培養４日目に菌体を遠心分離により得た。実施例１と同
様に反応させ、分析したところ生成した目的物は５．３
ｍｇであった。原料であるｐ−ニトロベンジルアルコー
ルシアノ酢酸エステルの分解によって生じたｐ−ニトロ
ベンジルアルコールは１．１ｍｇとわずかであった。さ
らに溶媒中には未反応の原料は残っていなかった。

【００１４】実施例３ 実施例１と同様の培地２０ｍｌに０．１５％のイソバレ
ロニトリルを添加し、ＮＫＮ００３菌を３０℃で培養し
培養１日目に０．１５％のイソバレロニトリルを添加し
て培養２日目に菌体を遠心分離により得た。この菌体を
ｐＨ６．５、０．１Ｍの燐酸カリウム緩衝液３ｍｌに懸
濁し、２９．６ｍｇの原料を添加して２７℃で４．５時
間振とうした。実施例１と同様に分析したところ生成し
た目的物は２７．２ｍｇであった。ｐ−ニトロベンジル
アルコールは１．４ｍｇと僅かであり、その他の生成物
及び原料は微量しか含まれなかった。これを活性炭処理
をして遠心分離し、上澄み液に濃塩酸を加えてｐＨ１．
６とすると白沈が生成した。これを濾過、乾燥して２
６．０ｍｇのｐ−ニトロベンジルアルコールマロン酸モ
ノエステルを得た。

【００１５】実施例４ 実施例１と同様の殺菌培地２０ｍｌに０．１％のイソバ
レロニトリルを添加してＮＫＮ００３菌を３０℃で培養
し、培養１日目に０．１％のイソバレロニトリルを添加
した。培養２日目にこの培養液１０ｍｌから遠心分離に
より菌体をえた。この菌体を１０ｍＭのＥＤＴＡを加え
たｐＨ７．５、０．２Ｍの燐酸緩衝液２０ｍｌに懸濁
し、原料４１９ｍｇを添加して室温にて１時間振とうさ
せ、その後室温に静置した。３日後に実施例１と同様に
分析したところ、生成した目的物は２３７ｍｇであっ
た。また原料の分解によって生成したｐ−ニトロベンジ
ルアルコールは５３ｍｇ、中間生成物であるマロン酸
（ｐ−ニトロベンジルアルコール）エステル−アミドは
７５ｍｇ、未反応の原料は５５ｍｇであった。遠心分離
により不溶物を分離し、濾液に塩酸を加えてＰＨを約２
とし沈澱を生成させた。沈澱を濾過により採取し，水洗
乾燥して２２５ｍｇのＰ−ニトロベンジルアルコ−ルマ
ロン酸モノエステルを得た。液体クロマトグラフによる
純度は９６．３％であった。粗製物を水に懸濁し、アン
モニア水を徐々に加え中性付近で溶解させ、活性炭処理
をした後再び塩酸にてＰＨを約２．０として酸析して精
製することにより純度９９．７％の高純度品を得ること
が出来た。

【００１６】実施例５ グルコース２％、ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．１％、Ｋ₂ ＨＰＯ₄
０．４％、（ＮＨ₄ ）₂ ＳＯ₄ ０．２６％、イーストエ
キストラクト０．０３％を含む井戸水に各々１００μＭ
のＺｎＣｌ₂ 、ＦｅＳＯ₄ 、ＭｎＳＯ₄ を添加した殺菌
培地２０ｍｌに０．１％のイソバレロニトリルを添加し
て、ＮＫＮ００３菌を３０℃で培養し培養１日目に０．
１％のイソバレロニトリルを添加した。培養２日目にこ
の培養液１０ｍｌから遠心分離により菌体をえた。実施
例４と同様の緩衝液２０ｍｌに懸濁し、７９３ｍｇの原
料を添加して室温で３日間撹はんしたところ４９３ｍｇ
の目的物が生成した。またｐ−ニトロベンジルアルコー
ルは１０９．８ｍｇ、マロン酸（ｐ−ニトロベンジルア
ルコール）エステル−アミドは１８６．４ｍｇ、未反応
の原料は９．３ｍｇであった。実施例２〜５で得られた
目的物も実施例１で得られた目的物と同一の物理化学的
データを示した。

【００１７】

【発明の効果】ｐ−ニトロベンジルアルコールシアノ酢
酸にジュウドモナス属又はロドコッカス属に属する細菌
を作用させることにより、ｐ−ニトロベンジルアルコー
ルマロン酸モノエステルが効率よく合成できるようにな
った。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ｐ−ニトロベンジルアルコールシアノ酢
   酸エステルにシュウドモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
   ｓ）又はロドコッカス属（Ｐｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）に
   属する細菌を作用させることにより加水分解することを
   特徴とするｐ−ニトロベンジルアルコールマロン酸モノ
   エステルの製造方法
2. 【請求項２】 シュウドモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
   ａｓ）の細菌がＮＫＮ００３菌であり、ロドコッカス属
   （Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）の細菌がＮＫＮ１１３菌で
   ある特許請求項１に記載の方法