JPH0799997A - α−アミラーゼ活性測定用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 １試薬系における試薬ブランクの上昇を回避
し、かつαーアミラーゼの作用様式をより純粋に反映す
る高感度のアミラーゼ活性測定試薬を提供する。 【構成】 【化１】 （式中、Ｒ₁ およびＲ₂ は互いに異なる水素またはβ−
ガラクトピラノシル基を、Ｒ₃ は遊離後、発色する測定
可能な物質を示し、ｎは０〜２の整数を示す。）で表さ
れるマルトオリゴ糖誘導体を基質とし、追随酵素として
βーグルコシダーゼを用いることを特徴とするα−アミ
ラーゼ活性測定用試薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はα−アミラーゼ活性測定
用試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】膵液や尿などの体液に含有されるα−ア
ミラーゼの活性を測定することにより、膵臓病などの各
種疾患の診断が行われている。従来から、α−アミラー
ゼの活性測定法には、次のようなものがある。 （１）マルトオリゴ糖（マルトテトラオース、マルトペ
ンタオース、マルトヘキサオースなど）を基質とする方
法。 この方法では、α−アミラーゼ含有試料に該マルトオリ
ゴ糖とα−グルコシダーゼ等の追随酵素とを作用させて
基質からグルコースを遊離させ、グルコースの量を測定
することにより、α−アミラーゼの活性値を知る。生成
したグルコースは、例えばグルコースオキシダーゼ／パ
ーオキシダーゼ／色素系を利用する定量法：ヘキソキナ
ーゼ／ホスフォグルコムターゼ／グルコース−６−ホス
フェートデヒドロゲナーゼ／ＮＡＤＨ系を利用する測定
法などにより測定される。

【０００３】（２）マルトオリゴ糖の還元性末端にフェ
ニル基、ナフチル基、またはそれらの誘導体をアグリコ
ンとして結合させた誘導体を基質とする方法。 この方法では、α−アミラーゼ含有試料に該マルトオリ
ゴ糖誘導体と必要に応じα−グルコシターゼ等の追随酵
素を作用させて基質からアグリコンを遊離させ、遊離し
たアグリコンの量を光学的に測定することにより、α−
アミラーゼの活性を測定することができる。例えば、基
質としてｐ−ニトロフェニルマルトペンタオシド、ｐ−
ニトロフェニルマルトヘキサオシド、ｐ−ニトロフェニ
ルマルトヘプタオシド、２，４−ジクロロフェニルマル
トペンタオシド、２−クロロ−４−ニトロフェニルマル
トペンタオシドなどを用いる測定法がある。

【０００４】しかしながら、上記（１）、（２）の基質
を用いる場合、いずれの場合も１試薬系にすると、α−
グルコシターゼがわずかではあるが基質に作用し、ブラ
ンク値が上昇するという欠点がある。α−グルコシター
ゼの基質分解作用のため、α−グルコシターゼと基質と
を１液化することは、試薬としての安定性が損なわれる
ため好ましくない。

【０００５】（３）マルトオリゴ糖の還元性末端にフェ
ニル基、ナフチル基、またはそれらの誘導体をアグリコ
ンとして結合させた誘導体の、非還元性末端のグルコー
スのヒドロキシル基が何らかの手段で修飾された誘導体
を基質とする方法。 この方法も、（２）と同じく、α−アミラーゼ含有試料
に該マルトオリゴ糖誘導体と必要に応じ、α−グルコシ
ターゼ等の追随酵素を作用させて基質からアグリコンを
遊離させ、遊離したアグリコンの量を光学的に測定する
ことにより、α−アミラーゼの活性を測定するものであ
る。具体例としては、非還元性末端グルコースの６位の
ヒドロキシル基が修飾されたタイプの基質（例えば、特
開昭６０−２３７９９８号公報）、あるいは４位および
６位のヒドロキシル基をアルキル基、アルコイル基また
はフェニル基で置換したタイプの基質（例えば、特開昭
６０−５４３９５号公報、特開昭１−１５７９９６号公
報）また非還元性末端のグルコースのヒドロキシル基
が、天然糖のガラクトシル基で修飾された誘導体を基質
とする方法（特開平３−２６４５９６号公報）などがあ
る。

【０００６】これらの方法においては、マルトオリゴ糖
の非還元性末端のグルコ−スのヒドロキシル基が修飾さ
れているため、上記（１）、（２）の方法にみられるよ
うな、α−グルコシターゼがわずかではあるが基質に作
用しブランク値が上昇するという欠点は回避された。し
かし、上記基質においては修飾基が天然にない構造のも
のであるため、澱粉やアミロースなどのグルコース鎖を
認識してその結合を切断する、αーアミラーゼの作用様
式を純粋に反映していないことが考えられ、アミラーゼ
に対する親和性に劣り、感度が相対的に小さいという欠
点がある。

【０００７】（４）マルトオリゴ糖の還元性末端にフェ
ニル基、ナフチル基、またはそれらの誘導体をアグリコ
ンとして結合させた誘導体を基質とし、追随酵素を用い
ない方法。 α−グルコシダーゼなどの追随酵素を用いずに、α−ア
ミラーゼが直接グリコシド結合に働き、アグリコンを遊
離させることにより、ブランク値の上昇を回避すること
ができる。例えば基質として２−クロロ−４−ニトロフ
ェニルマルトトリオシドを用いる方法（特願平４−３０
０１０３号）がある。この方法は、非還元末端を修飾し
ないので、αーアミラーゼの作用様式をほぼ純粋に反映
していると考えられる。しかし、この方法はアミラーゼ
との反応性が小さいため測定感度が低いという問題点を
もつ。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記従来のα
−アミラーゼ活性測定基質の欠点および従来のα−アミ
ラーゼ活性測定試薬の欠点を解消しようとするものであ
り、その目的とするところは、１試薬系における試薬ブ
ランクの上昇を回避し、かつ、αーアミラーゼの作用様
式をより純粋に反映する、高感度のアミラーゼ活性測定
試薬を提供することにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、一般式
（Ｉ）

【００１０】

【化２】

【００１１】（式中、Ｒ₁ およびＲ₂ は互いに異なる水
素またはβ−ガラクトピラノシル基を示し、Ｒ₃ は遊離
後、発色する測定可能な物質を示す。ｎは０または１を
示す。）で表されるマルトオリゴ糖誘導体を基質とし、
追随酵素としてβ−グルコシダーゼを用いることを特徴
とする、α−アミラーゼ活性測定用試薬である。

【００１２】本発明におけるマルトオリゴ糖誘導体
（Ｉ）の骨格となるマルトオリゴ糖は、２または３個の
糖から形成される。

【００１３】マルトオリゴ糖の非還元性末端グルコース
の修飾基であるガラクトースは、非還元性末端グルコー
スの４位または６位の水酸基にβ型で結合している。従
来、マルトオリゴ糖の非還元性末端グルコースの修飾形
態としては、非還元性末端グルコースの６位のヒドロキ
シル基がアルキル基、アルコイル基またはフェニル基で
修飾されたタイプの基質、あるいは４位および６位のヒ
ドロキシル基をアルキル基、アルコイル基またはフェニ
ル基で置換したタイプ、あるいは４位および６位の水酸
基がメチレン架橋されたタイプの基質などがあるが、こ
れらの修飾基は天然の基質にはない構造のものであり、
アミラーゼとの親和性を考慮した場合、本発明のβ−ガ
ラクトシル基は前述の修飾基より優れている。

【００１４】マルトオリゴ糖の還元性末端には、追随酵
素（β−グルコシダーゼ）により遊離した後、発色する
測定可能な物質がアグリコンとして結合する。該物質の
グリコシド結合はβ型に限定される。遊離後、発色する
測定可能な物質には、次の置換フェノール：

【００１５】

【化３】

【００１６】式中、Ｒ₄ または Ｒ ₅はいずれか一方が
ハロゲン原子またはニトロ基を意味し、他方は水素原
子、ヒドロキシル基、低級アルキル基、ハロゲン原子ま
たはニトロ基を意味する。置換フェノールとしては具体
的には、ｐ−ニトロフェノールをはじめ、２−クロロ−
４−ニトロフェノール、２，４−ジクロロフェノールな
ど種々のものがあるが、アミラーゼの至適ｐＨであるｐ
Ｈ７付近における測定感度を考慮した場合、２−クロロ
−４−ニトロフェノールが優れている。

【００１７】本発明のマルトオリゴ糖誘導体（Ｉ）は、
例えば２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−
Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシド、２−クロロ
−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシル−α−マルトトリオシド、ｐ−ニトロフェニル
４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシ
ド、ｐ−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシル−α−マルトトリオシドなどが挙げられる。

【００１８】本発明のマルトオリゴ糖誘導体（Ｉ）は種
々の公知の方法で製造することができる。例えばマルト
ースまたはマルトトリオースをアセチル化し、２−クロ
ロ−４−ニトロフェノールなどの置換フェノールを還流
芳香族炭化水素、例えばトルエンの存在下で反応させ
て、還元性末端にアグリコンを結合するマルトオリゴ糖
誘導体とする。次いで該オリゴ糖誘導体にラクトースを
β−ガラクトシダーゼ共存下に反応させてマルトオリゴ
糖誘導体（Ｉ）を製造する。

【００１９】また別法ではマルトースまたはマルトトリ
オースをおよびラクトースをβ−ガラクトシダーゼの存
在下に反応させて得られたガラクトシルマルトオリゴ糖
を有機媒体の存在下、もしくは無溶媒の下に、アルカリ
および無水酢酸とともに加熱してアセチル化し、さらに
アセチル化ガラクトシルマルトオリゴ糖と置換フェノー
ルを有機媒体中、酸触媒とともに加熱し、次いで得られ
た反応生成物のアセチル基を脱離する方法がある。

【００２０】本発明のα−アミラーゼ活性測定用試薬
は、上記マルトオリゴ糖誘導体（Ｉ）を基質として、ま
たβ−グルコシダーゼを追随酵素としてそれぞれ含有す
るものであり、α−グルコシダーゼを含有しないことを
特徴とする。しかし必要に応じてその他の添加剤、例え
ば界面活性剤、防腐剤、キレート剤、安定化剤などを含
有する。β−グルコシダーゼは１〜１００単位／ｍｌ含
有させる。本発明の基質は追随酵素（β−グルコシダー
ゼ）による分解を受けず、従来のアミラーゼ測定系に比
べて安定である。

【００２１】本発明方法によりα−アミラーゼの活性を
測定するには、上記基質、β−グルコシダーゼおよび必
要に応じてその他の添加物、例えば塩化カルシウムなど
を含有する試薬に、α−アミラーゼを含む試料を作用さ
せる。α−アミラーゼが基質に作用し、β−グルコシダ
ーゼが加水分解した発色可能な物質を結合したグルコシ
ドに作用して、発色可能な物質が遊離する。次いで遊離
し発色した測定可能な物質を直接に光学的に測定する
か、または遊離した物質に他の化合物を作用させて発色
させ、光学的に測定することにより試料中のα−アミラ
ーゼの量を知る。

【００２２】本発明のα−アミラーゼ活性測定用試薬を
使用する測定方法における基質分解の反応式を２−クロ
ロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシル−β−マルトトリオシドを基質とする場合を例
にあげて説明する。

【００２３】

【化４】

【００２４】α−アミラーゼが基質（２−クロロ−４−
ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル
−β−マルトトリオシド）に作用し、β−グルコシダー
ゼが加水分解した発色可能な物質を結合したグルコシド
（２−クロロ−４−ニトロフェニル β−グルコシド）
に作用して、発色可能な物質（２−クロロ−４−ニトロ
フェノール）が遊離する。次いで２−クロロ−４−ニト
ロフェノールのスペクトルを直接に光学的に測定する。
また２−クロロ−４−ニトロフェノールの測定方法とし
ては、α−アミラーゼの反応を連続的に追跡するレート
法および一定時間反応させた後、反応を止めて測定する
エンドポイント法のいずれもが使用されうる。

【００２５】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳細に説明
する。 実施例・比較例 本発明のマルトオリゴ糖誘導体２種（表１に記載）を基
質として用い、下記組成からなるα−アミラーゼ活性測
定試薬をそれぞれ調製した。 試薬組成： ５０ｍＭグッドバッファー（ｐＨ７．０） ＣａＣｌ₂ １ｍＭ 基質 ２ｍＭ β−グルコシダーゼ １０単位 なお、比較例として後記表１に示した基質４種を用い
て、上記と同様の試薬を調製した。表１に示された各試
薬３mlに三種類の血清１、２および３をそれぞれ0.25ml
添加し、３７℃にて３分間放置したのち、４１５ｎｍに
おける吸光度の変化を測定し、１分間当りの吸光度の変
化を算出した。その結果を表２に示した。なお、表２に
は試薬ブランクの１分間当りの吸光度の変化も伴せて記
載した。

【００２６】

【表１】

【００２７】

【表２】

【００２８】表２に示した実施例Ａと比較例Ａ−１の比
較および実施例Ｂと比較例Ｂ−１の比較より、非還元末
端に３−ケトブチリデン基を有する基質よりも、β−ガ
ラクトシル基を有する本発明の基質では１分間当たりの
吸光度変化が大きく、試薬ブランクが小さい。すなわち
本発明の基質では非還元末端のガラクトシル基が試料中
のα−アミラーゼとの親和性に優れ、非還元末端の修飾
基として好ましいことがわかる。また実施例Ａと比較例
Ａ−１、Ａ−２の比較および実施例Ｂと比較例Ｂ−１、
Ｂ−２の比較より、非還元末端に修飾基を有しない基質
よりも本発明の基質は測定感度が高いことがわかる。さ
らにＡ群とＢ群の比較により、アグリコンとして２−ク
ロロ−４−ニトロフェノールがｐ−ニトロフェノールよ
りも感度が優れていることがわかる。

【００２９】

【発明の効果】本発明の試薬では非還元末端にβ−ガラ
クトシル基を有するグルコース数が２または３であり、
還元末端に遊離後、発色する測定可能な物質を有するマ
ルトオリゴ糖を基質とし、β−グルコシダーゼのみを使
用することにより、１試薬系における試薬ブランクの上
昇を回避し、かつαーアミラーゼの作用様式をより純粋
に反映する、高感度のアミラーゼ活性測定試薬を得るこ
とができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一般式 （Ｉ） 【化１】 （式中、Ｒ₁ およびＲ₂ は互いに異なる水素またはβ−
   ガラクトピラノシル基を示し、Ｒ₃ は遊離後、発色する
   測定可能な物質を示す。ｎは０または１を示す。）で表
   されるマルトオリゴ糖誘導体を基質とし、追随酵素とし
   てβ−グルコシダーゼを用いることを特徴とするα−ア
   ミラーゼ活性測定用試薬。