JPH0250426B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は非Ａ非Ｂ型肝炎関連抗原および診断薬
に関する。さらに詳しくは、非Ａ非Ｂ型肝炎関連
抗原および当該抗原の結合体並びにこれらを主要
な構成成分として含有する非Ａ非Ｂ型肝炎診断薬
に関する。 ウイルス肝炎については従来よりＡ型およびＢ
型の存在が知られており、すでに関連抗原抗体系
も明らかにされ、これを利用した免疫血清学的な
診断が可能となり、さらにワクチンの開発、導入
にまで至つている。 しかしながら、これに伴つて非Ａ非Ｂ型肝炎、
すなわち、従来から知られているＡ型肝炎および
Ｂ型肝炎のいずれにも属さないウイルス肝炎の存
在が知られるようになり、しかもその発生頻度が
予想以上に高いことが明らかとなつて来た。例え
ば、輸血後肝炎の80〜90％あるいはさらにこれ以
上のものが非Ａ非Ｂ型肝炎であり、散発的に発生
する急性肝炎についても約50％は非Ａ非Ｂ型肝炎
であることが報告されるに至つている。また正常
供血者の中にさえ非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの保有
者がかなりの数存在することが明らかとなつて来
た。以下に記載する文献は非Ａ非Ｂ型肝炎に関す
る上述の状況を報告するものであり、参考のため
に列挙する。 (1) Prince、A.M.et al.：Long−incubation
post−transfusion hepatitis without
serological evidence of exposure to
hepatitis−Ｂ virus.Lancet.：241−246、
1974. (2) Alter、H.J.et al.：Clinical and
serological analysis of transfusion−
associated hepatitis.Lancet.：838−841、
1975. (3) Feinstons、S.M.et al.：Transfusion−
associated hepatitis not due to viral
hepatitis type Ａ or B.N.Engl.J.Med.292：
767−770、1975. (4) Meyers、J.D.et al.：Parenterally
transmitted non−Ａ、non−Ｂ hepatitis.
Ann.Intern.Med.87：57−59、1977. (5) Villarejos、V.M.et al.：Evidence for
viral hepatitis other than type Ａ or type
Ｂ among persons in Costa Rica.N.Engl.J.
Med.293：1350−1352.1975. (6) Dienstag、J.L.et al.：Etiology of
sporadic hepatitis Ｂ surface antigen−
negative he−patitis.Ann.Intern.Med.87：１
−６、1977. さて、ここで非Ａ非Ｂ型肝炎とはＡ型肝炎ウイ
ルス、Ｂ型肝炎ウイルス、サイトメガロウイル
ス、エプスタインバーウイルスなど従来知られた
ウイルス以外のウイルスが病原体として関与する
ことにより発生すると考えられる肝炎であつて、
HA抗体、HBs抗体、HBc抗体、HBe抗体につ
いて有意の上昇が認められないものを言う。従つ
て、非Ａ非Ｂ型肝炎患者とは、肝炎ウイルスに起
因する肝炎患者であつてＡ型肝炎診断およびＢ型
肝炎診断において陰性を示し、Ａ型肝炎からもＢ
型肝炎からも除外された患者であると定義され
る。一般に非Ａ非Ｂ型肝炎では、Ｂ型肝炎に比較
すると輸血から発症までの平均潜伏期が短く、ま
たGPTの最大値も低いという傾向がある。しか
しその反面、持続性があり、例えばGPT異常は
慢性化してかなりの長期間に及ぶという特徴があ
る。しかし、いずれにせよ、非Ａ非Ｂ型肝炎は輸
血後肝炎の大部分を占めており、かつ非Ａ非Ｂ型
肝炎ウイルスが原因となる肝疾患は肝硬変、肝癌
など広範囲に及んでおり、適切なる対応策が早急
に開発されることが望まれているのである。しか
るに、非Ａ非Ｂ型肝炎については、未だそのウイ
ルス本態あるいはそれに関連した抗原抗体系が確
立されておらず、従つて適切なる診断およびワク
チンの製造がなされていないのが現状である。 非Ａ非Ｂ型肝炎関連抗原に関する先行技術とし
ては特開昭55−122156公報に記載された発明があ
り、HC抗原と命名される物質の提供が開示され
ている。しかし、このHC抗原はもつぱらＣ型肝
炎回復期患者の血漿または血清との間において抗
原抗体反応を生ずる点に特徴があり、非Ａ非Ｂ型
肝炎における広く一般化した反応性を示すに至つ
ていない。また当該HC抗原を分離精製するため
の出発物質としてはHBs抗原陰性血液を輸血し
たのちに肝炎を発症し、GPTの上昇が二峰性ま
たはそれ以上の多峰性を示し、かつ潜伏期の比較
的長い患者群の急性期血漿または血清を選択して
使用する必要があり、出発物質としての限定条件
がかなり多いという欠点がある。 かかる実情にかんがみ、本発明者は非Ａ非Ｂ型
肝炎について一般的であり、かつ非Ａ非Ｂ型肝炎
に特異的である関連抗原を物質として単離するこ
とを試み、その結果、非Ａ非Ｂ型肝炎剖検肝から
の分離精製により所期の物質を収得することに成
功し、本発明を完成するに至つた。 本発明物質は非Ａ非Ｂ型肝炎剖検肝から分離精
製され、その理化学的性状は以下のごとくであ
る。分子量はゲル過法により求めると150万以
上である。沈降定数（10^-13）はBeckmann
Model Ｅで測定すると51.5Sを示す。塩化セシウ
ムまたは臭化カリウム溶液中の浮上密度（ｇ／
cm³）はアツベの屈折計によつて求めると1.15〜
1.25である。粒子直径（ｎｍ）は電子顕微鏡観察
によると26〜37（平均31.5）である。電気的移動
度は免疫電気泳動法により求めるとα₂−α₁グロブ
リンの領域である。 以上より明らかなごとく、本発明物質は出発物
質並びに理化学的性状において特開昭55−122156
公報に記載のHC抗原とは異なる物質であること
が知られる。 また本発明物質は後記実験例に示されるごとく
非Ａ非Ｂ型肝炎回復期患者血清および頻回輸血歴
のある患者の血清との間に寒天ゲル内の沈降反応
を示す。また本発明物質を感作した羊赤血球は非
Ａ非Ｂ型肝炎患者の回復期血清との間に特異的に
しかも高感度で受身赤血球凝集反応を示す。その
反面、本発明物質はHA抗体、HBs抗体、HBe抗
体、HBc抗体、δ抗体、HC抗体、EB抗体、
Arai抗体、Ｆ抗体、正常ヒト肝上清抗体、およ
び各種の正常ヒト血漿抗体のいずれとも反応を示
さなかつた。従つて、本発明物質は非Ａ非Ｂ型肝
炎について一般的であり、かつ非Ａ非Ｂ型肝炎に
特異的な関連抗原として有用な物質であることが
判明する。例えば実験例４に示すごとく非Ａ非Ｂ
型肝炎症状の経過診断において正確な情報を提供
する上で有用である。 また本発明物質を適当なるアジユバント、例え
ばフロイント完全アジユバントと共に家兎に頻回
投与することにより本発明物質に対する免疫抗体
を産生せしめることが可能であり、従つて、本発
明物質は非Ａ非Ｂ型肝炎ワクチンの製造の素材と
してもその有用性が期待されるものである。 次に本発明物質は非Ａ非Ｂ型肝炎剖検肝を出発
物質として通常のタンパク分劃精製法、例えば密
度勾配遠心分離法、塩析法、電気泳動法、ゲル
過法、アフイニテイークロマトグラフイー法、等
電点分劃法、限外過法、コーンの分劃法を適宜
組合わせて収得することができる。好ましい実施
例の概要をもつて説明すれば、まず剖検肝ホモジ
ネート上清について例えばセフアクリルＳ−200
を用いてカラムクロマトグラフイー分劃を行い、
得られた抗原陽性フラクシヨンを限外過して加
圧濃縮し、最後に超遠心分離と透析を繰返す。こ
こで超遠心分離には蔗糖濃度勾配遠心および塩化
セシウム密度勾配遠心を組合わせて一回ないし数
回行うのが好ましい。得られた精製物は寒天ゲル
内反応により非Ａ非Ｂ型肝炎回復期血清との間に
明瞭な一本の沈降線を示し、精製前の剖検肝ホモ
ジネート上清における沈降線と完全に融合するこ
とが確認される。つまり、本発明物質は、本発明
に係る分離精製法によつて免疫学的性状を損うこ
となく単離されることが確認されるのである。 次に本発明物質を主要な構成成分として含有す
る診断薬は採用する免疫学的検出方法に応じて適
宜調製すればよい。例えば検出方法としてオクタ
ロニー法（MO）、免疫電気泳動法（IES、IEP）、
補体結合反応法（CF）、免疫粘着血球凝集反応法
（IAHA）、一元平板免疫拡散法（SRID）を利用
する場合には本発明物質をそのまま使用して適当
な形態に調製すればよい。一例として一元平板免
疫拡散法を利用する場合を示せば、支持体として
寒天、アガロース、デンプン、ポリアクリルアミ
ドゲル等の中から適当なものを選び、これを緩衝
液に加熱溶解し、次に本発明物質を添加混合し、
得られる溶液をガラス板上あるいはプラスチツク
容器内に流し冷却固化し、固化したゲル平板に被
検血清注入用の孔をあければよい。 しかるに、検出方法として血球凝集反応法
（PHA）、放射性免疫測定法（RIA）、酵素抗体法
（ELISA）等を利用する場合には本発明物質に適
当なる加工処理を施す必要がある。すなわち血球
凝集反応法（PHA）を利用する場合には本発明
物質を微小粒子に結合させる必要がある。微小粒
子としては哺乳類および鳥類の血球が好ましい
が、その他、ポリスチレンラテツクス、ポリエス
テルラテツクス、塩化ビニル、ベントナイト、ガ
ラスビーズ等の約１〜10μの粒子も使用すること
ができる。本発明物質と微小粒子を結合させるに
は、例えばグルタールアルデヒド、ホルムアルデ
ヒド、タンニン酸、ビスジアゾダイズベンチジ
ン、塩化クロム、カルボジイミドなどを使用すれ
ばよい。 放射性免疫測定法（RIA）を利用する場合には
本発明物質をアイソトープでラベル化する必要が
ある。アイソトープとしては ¹²⁵I、 ¹³¹Iを使用
することができ、クロラミンＴ法により結合させ
ればよい。 酵素抗体法（ELISA）を利用する場合には、
本発明物質を酵素と結合させる必要がある。酵素
としては、例えばグルコースオキシダーゼ、アル
カリホスフアターゼ、ペルオキシダーゼ、ベータ
ーガラクトシダーゼ等を使用することができる。
結合剤としてはグルタールアルデヒドを使用すれ
ばよい。 本発明診断薬は非Ａ非Ｂ型肝炎の診断のために
使用されるが、そのほかに非Ａ非Ｂ型肝炎抗体の
試験的な検出用試薬あるいは定量用試薬としても
使用することができることはもちろんである。従
つて、本発明の診断薬はその用語を狭義に解釈し
たものに限定されるものではない。 本発明物質および診断薬の有用性を以下に記載
する実験例をもつて説明する。 実験例 １ 試 料 Ａ 本発明物質 Ｂ 非Ａ非Ｂ型肝炎回復期患者の血清その一 Ｃ 非Ａ非Ｂ型肝炎回復期患者の血清その二 Ｄ 頻回輸血歴のある患者の血清 Ｅ 正常ヒト血清 Ｆ 正常ヒト肝ホモジネート上清 方 法 アガロースＡ−45（半井化学）0.8％（ｗ／ｖ）、
EDTA・3Na0.02M、塩化ナトリウム0.1M、
NaN₃0.1％をトリス塩酸緩衝液（0.01M、PH7.5）
に溶解し、厚さ1.5mmの寒天ゲル平板を作製し、
試料についてマイクロオクタロニー法による検出
テストをおこなつた。 結 果 結果を図１に示す。図１より明らかなごとく本
発明物質は非Ａ非Ｂ型肝炎回復期患者の血清およ
び頻回輸血歴のある患者の血清と沈降線を生成
し、それらは完全に融合していることが確認され
る。従つて、これらは免疫学的に同一の特異性を
有する抗原抗体系であることが判明する。またこ
の抗原抗体系は正常ヒト血清および正常ヒト肝ホ
モジネート上清との交差反応をまつたく示してい
ない。 実験例 ２ 試 料 羊赤血球をグルタールアルデヒド溶液で固定
し、タンニン酸溶液で処理したのち、本発明物質
を感作せしめ、これを本発明物質の感作血球とし
て試料に供した。 方 法 アクリル製のマイクロタイトレーシヨンプレー
ト（Ｖ−タイプ）に２％正常家兎血清を含有する
リン酸緩衝生理食塩液（0.15M、PH7.2）25μを
添加し、血清を二系列ずつ2ⁿ倍希釈した。次に一
方の系列には２％正常家兎血清を含有するリン酸
緩衝生理食塩液（0.15M、PH7.2）25μを、他方
の系列には本発明物質25μを添加し、37℃で30
分間インキユベートした。その後感作血球を添加
し、室温で２時間放置し、凝集の有無を確認し
た。緩衝液側の凝集価が３管（８倍希釈）以上を
示し、本発明物質添加による凝集抑制が２管以上
確認された場合に陽性と判定し、凝集を認めた最
終希釈倍数を抗体価とした。 結 果 作製した抗原感作血球による凝集反応の感度は
実験例１における寒天ゲル内反応のそれに比べ
100〜200倍以上であつた。また凝集抗体の特異性
は本抗原および正常ヒト肝上清による凝集抑制の
有無から明瞭に確認することができた。 実験例 ３ 試 料 １ 実験例２試料の項記載の感作血球 ２ 下記ａ〜ｄの四種類の対象検体 ａ 急性ウイルス性肝炎症例としてＡ型である
14例の患者の血清 ｂ 急性ウイルス性肝炎症例としてＢ型である
12例の患者の血清 ｃ 急性ウイルス性肝炎症例として非Ａ非Ｂ型
である15例の患者の血清 ｄ 正常供血者129例の血清 方 法 受身赤血球凝集反応法を利用して、各対象検体
における検出頻度を確認した。すなわち各血清に
おいて2ⁿ倍希釈を二列作製し、一方の系列に本発
明物質（50倍希釈液）を添加し、37℃で30分間イ
ンキユベートしたのち、感作血球を添加し、２〜
３時間後に凝集像を観察した。３管（８倍希釈）
以上の凝集価を示し、本発明物質による抑制が２
管以上確認された場合に、当該血清について抗体
陽性と判定した。 結 果 結果を表１に示す。

【表】 表１より以下の点が判明する。 １ 非Ａ非Ｂ型肝炎例においては陽性例は73.3％
という高率であり、正常供血者、Ａ型肝炎例、
Ｂ型肝炎例のいずれとも有意な差を示した。 ２ Ａ型肝炎例およびＢ型肝炎例においては陽性
例はそれぞれ14.3％、16.7％であるが、正常供
血者の陽性例との間には有意な差が認められな
い。 ３ 非Ａ非Ｂ型肝炎抗体は正常供血者の約７％に
その存在が認められる。 ４ 平均凝集価においても、正常供血者血清、Ａ
型肝炎例血清、Ｂ型肝炎例血清の間には有意な
差が認められないが、非Ａ非Ｂ型肝炎例血清は
正常供血者血清に比較して有意（ｐ＜0.001）
に高い値を示した。 以上１乃至４より、本発明物質が非Ａ非Ｂ型肝
炎抗体について一般的であり、かつ非Ａ非Ｂ型肝
炎抗体に特異的な抗原であることが知られる。 実験例 ４ 試 料 非Ａ非Ｂ型肝炎患者４例の経過血清 方 法 経過血清につき非Ａ非Ｂ型肝炎抗体および
GPTを測定した。非Ａ非Ｂ型肝炎抗体は本発明
物質を用いて受身赤血球凝集反応法により測定し
た。 結 果 結果を図２乃至図５に示す。各図より明らかな
ごとく、非Ａ非Ｂ型肝炎抗体は発症直後（GPT
の極期）においては血清中に検出されないかまた
はごく僅かであるが、肝機能の正常化（GPTの
減少）に伴い血清中に出現し、その抗体価は１〜
２年以上維持されたのが確認される。かくのごと
く非Ａ非Ｂ型肝炎抗体は非Ａ非Ｂ型肝炎の診断お
よび予後の経過観察に有用な血中マーカーとなる
ので、当該抗体について一般的であり、かつ当該
抗体に特異的である本発明物質は非Ａ非Ｂ型肝炎
についての正確な診断薬を提供するものであるこ
とが知られる。 以下に記載する実施例をもつて本発明をさらに
詳細に説明する 実施例 １ 非Ａ非Ｂ型肝炎患者の剖検肝約５ｇを細切し、
トリス塩酸緩衝生理食塩液（0.01M、PH7.5）20
mlを加え、ホモジナイズした。次に10000rpmで
20分間遠心して、その上清をとり、分離精製前の
肝ホモジネート上清とした。 あらかじめトリス塩酸緩衝生理食塩液
（0.01M、PH7.5）で平衡化したセフアクリルＳ−
200（フアルマシア製）の充填カラム（2.6×90cm）
に肝ホモジネート上清10mlを添加し、トリス塩酸
緩衝生理食塩液（0.01M、PH7.5）で溶出し、
280nｍの紫外部吸収で連続モニターしながら、
抗原活性を有する第一ピークの相当劃分をプール
した。なお、抗原活性は寒天ゲル内反応により検
索した。プールした劃分は限外過法（アミコン
製PM−10）によつて加圧濃縮した。 次に得られた濃縮液について、支持体としてセ
フアクリルＳ−200（フアルマシア製）の代わりに
セフアクリルＳ−300（フアルマシア製）を使用し
て上記記載におけると同様に溶出操作をおこな
い、再び限外過法により加圧濃縮した。 次に得られた濃縮液５mlについて蔗糖濃度勾配
遠心分離（24000rpm、16時間）をおこなつた。
濃度勾配は５〜60％（ｗ／ｖ）の範囲においてお
こない、５％、15％、25％、35％では各10mlに、
45％、60％では各５mlになるように作製し、濃縮
液を最上部に添加した。処理後チユーブ底より
2.5ml／tubeの割合で分劃し、抗原活性を有する
蔗糖濃度25〜40％相当劃分をプールした。プール
した劃分についてトリス塩酸緩衝生理食塩液
（0.01M、PH7.5）で透析をおこない、限外過法
（アミコン製PM−10）により加圧濃縮した。 次に得られた濃縮液について塩化セシウム平衡
密度勾配遠心分離（40000rpm、20時間）をおこ
なつた。1.00〜1.50ｇ／cm³の密度勾配範囲におい
て各4.5mlを作製し、濃縮液を最上部に添加した。
処理後、チユーブ上層より、0.2ml／tubeの割合
で分劃し、抗原活性を有する塩化セシウム密度
1.15〜1.25ｇ／cm³相当劃分をプールした。なお各
劃分の比重はアツベの屈折計で測定した。プール
した劃分についてのトリス塩酸緩衝生理食塩液
（0.01M、PH7.5）で透析した。 ここに得られた溶液に含まれる物質の理化学的
性状は下記のごとくであり、実験例１、３、４、
５の各実験における本発明物質として使用した。 分子量 150万以上（ゲル過法） 沈降定数（10^-13） 51.5S（超遠心分析法） 浮上密度（ｇ／cm³） 1.15〜1.25（塩化セシウム
中および臭化カリウム中） 粒子直径（ｎｍ） 26〜37 電気的移動度
α₂−α₁グロブリン領域（アガロースゲル中） また、本発明物質に対する抗体（非Ａ非Ｂ型肝
炎患者の回復期血清由来）を用意し、これと本発
明物質とを試験管内で混合し、37℃で60分間イン
キユベートし、つづいて４℃で一昼夜静置し、
10000rpmで20分間遠心分離した。その結果、本
発明物質は抗原抗体複合物の沈渣として回収さ
れ、これを電顕観察すると、直径約26〜37nｍの
球形粒子が相互に凝集しているのがみられる。 実施例 ２ 実施例１で得られた溶液にフロイント完全アジ
ユバントを１：１の比に加えて乳化した。乳化液
0.5mlをウサギの背部皮下、皮内および足蹠部に
分割注射して免疫した。１週間後に同量の乳化液
を同様にして追加免疫し、さらに初回の免疫より
１カ月後に倍量の乳化液を再度追加免疫した。最
後の免疫より１週間後より数回にわたつて採血
し、血清を分離した。この血清に同量の正常ヒト
肝血清を加え、37℃で１時間、さらに４℃で１夜
放置した。これを10000rpmで10分間遠心分離し、
上澄液を採取した。得られた抗血清中の抗体を硫
酸アンモニウムによる塩析およびDEAEセルロー
ズによるカラムクロマトグラフイーにより精製
し、ついでPH9.0、0.1Mのバルビタール緩衝液に
溶解し、蛋白質濃度を10mg／mlに調製した。これ
をブロムシアン活性化セフアローズ4Bゲルに同
量加え、４℃で24時間反応させた。ついで未反応
の蛋白質をPH7.5、0.05Mのリン酸緩衝生理食塩
液で洗浄除去した後、これを直径1.5cm、長さ20
cmのカラムに充填した。このカラムに実施例１で
得られた溶液を添加した。前記リン酸緩衝生理食
塩液を用いて未反応物を洗浄除去した後、解離剤
をカラムに加え、溶出せしめた。採取した溶出液
を蒸留水で透析して解離剤を除去し、ついでアミ
コンダイヤフローXM−50によつて濃縮した。こ
こに得られた溶液は実施例３、４、５のPHA法、
RIA法、EIA法を利用する診断薬を製造するため
の非Ａ非Ｂ型肝炎関連抗原に使用される。 実施例 ３ ヒツジ血液を遠心管にとり、生理食塩液を用い
て2000rpmで10分間の遠心分離を５回繰返し、赤
血球を洗浄した。この赤血球にPH7.5、0.15Mの
リン酸緩衝生理食塩液を加えて５％濃度に調製し
た。同リン酸緩衝生理食塩液で2.5％濃度に調製
したグルタールアルデヒド溶液を前記赤血球浮遊
液中に、その５分の１容を加え、撹拌しながら室
温で約５時間反応させ、赤血球を固定した。つい
でこの溶液を遠心分離して固定赤血球を得、さら
に生理食塩液を用い遠心分離により数回洗浄し
た。この固定赤血球を前記リン酸緩衝液で５％浮
遊液に調製し、これに同リン酸緩衝生理食塩液で
５mg／dlに調製したタンニン酸溶液を等量添加し
て30分間撹拌した。この溶液を遠心分離してタン
ニン酸処理固定赤血球を得、さらに生理食塩液を
用い遠心分離により数回洗浄した。得られたタン
ニン酸処固定赤血球に前記リン酸緩衝液を加え、
５％赤血球浮遊液とした。 この赤血球浮遊液と、実施例２で得られた溶液
を前記リン酸緩衝生理食塩液で蛋白質濃度約10μ
ｇ／mlに調製した液とを同量混合し、室温で60分
間撹拌して感作した。この液を遠心分離して感作
血球を得、さらに生理食塩液を用い遠心分離によ
り数回洗浄した。得られた感作赤血球に２％正常
家兎血清含有リン酸緩衝生理食塩液を加えて７％
浮遊液とした。この感作赤血球はPHA法を利用
する診断薬に使用される。 実施例 ４ 実施例１あるいは実施例２で得られた溶液をPH
7.5、0.05Mのリン酸緩衝液に溶解し、蛋白質濃
度を１mg／mlに調製する。この液10μに１ミリ
キユーリーの ¹²⁵I−Na50μを加え、さらにク
ロラミンＴを前記リン酸緩衝液に1.5mg／mlの割
合に溶解した液を10μ加えて30秒間撹拌する。
次いでメタ重亜硫酸ナトリウムを前記リン酸緩衝
液に２mg／mlの割合に溶解した液を100μ加え
て反応を停止させる。ヨウ化カリウムを前記リン
酸緩衝液に10mg／mlの割合に溶解した液100μ
をこの反応液に加え、ただちにセフアデツクスＧ
−50を用いたゲル過法により ¹²⁵I標識物質と
¹²⁵Iとを分離する。得られた ¹²⁵I標識物質の比放
射能は約20〜60μCi／μｇとなる。この ¹²⁵I標識
物質はRIA法を利用する診断薬に使用される。 実施例 ５ 実施例１あるいは実施例２で得られた溶液を５
〜10mg／ml（0.05Mリン酸生理食塩緩衝液中）と
なるまで濃縮し、この0.1〜0.2mlに対してアルカ
リホスフアターゼ（５mg／ml）を0.3mlの割合で
添加し撹拌する。次に2.5％グルタールアルデヒ
ド溶液50μを添加し、室温で30分間撹拌する。
これを0.05Mトリス塩酸緩衝液（PH8.0）で一昼
夜透析し、2000rpmで10分間遠心分離したのち、
その上清を酵素標識抗原としてEIA法を利用する
診断薬に使用される。 実施例 ６ PH7.5、0.01Mのトリス塩酸緩衝液（0.15Mの塩
化ナトリウムおよび0.1％の窒化ナトリウムを含
む）中にアガロースを1.2％濃度になるように加
熱溶解した。このアガロース溶液80mlを約56℃ま
で冷却し、実施例１で得られた溶液20mlを添加し
て撹拌した。これをプラスチツク容器中に注入し
て放冷し、厚さ１mmのアガロースゲル平板となし
た。この平板に一定の間隔をおいて直径３mmの試
料孔をあけた。 得られたものはSRID法を利用する診断薬に使
用される。

【図面の簡単な説明】

図１は実験例１結果の項に記載の図１に相当
し、マイクロオクタロニー法によつて寒天ゲル内
反応をさせた場合に生ずる沈降線の生成状況を示
す模式図であり、図中Ａは本発明物質、Ｂは非Ａ
非Ｂ型肝炎回復期患者の血清その一、Ｃは同その
二、Ｄは頻回輸血歴のある患者の血清、Ｅは正常
ヒト血清、Ｆは正常ヒト肝ホモジネート上清をそ
れぞれスポツトした配置エリアを示す。 図２乃至図５は実験例４の結果の項に記載の図
２乃至図５に相当し、非Ａ非Ｂ型肝炎患者におけ
る非Ａ非Ｂ型肝炎抗体（〇印線）およびGPT（●
印線）の経時的推移を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 非Ａ非Ｂ型肝炎剖検肝からの分離精製によつ
   て得られ、下記の理化学的性状を有する非Ａ非Ｂ
   型肝炎関連抗原。 分子量 150万以上（ゲル過法） 沈降定数（10^-13） 51.5S（超遠心分析法） 浮上密度（ｇ／cm³） 1.15〜1.25（塩化セシウム
   中および臭化カリウム中） 粒子直径（ｎｍ） 26〜37 電気的移動度
   α₂−α₁グロブリン領域（アガロースゲル中） ２ 非Ａ非Ｂ型肝炎剖検肝からの分離精製によつ
   て得られ、下記の理化学的性状を有する非Ａ非Ｂ
   型肝炎関連抗原を主要な構成成分として含有する
   非Ａ非Ｂ型肝炎診断薬。 分子量 150万以上（ゲル過法） 沈降定数（10^-13） 51.5S（超遠心分析法） 浮上密度（ｇ／cm³） 1.15〜1.25（塩化セシウム
   中および臭化カリウム中） 粒子直径（ｎｍ） 26〜37 電気的移動度
   α₂−α₁グロブリン領域（アガロースゲル中）