JPH08103283A

JPH08103283A - トリプトファンの製造法

Info

Publication number: JPH08103283A
Application number: JP6242826A
Authority: JP
Inventors: Kazuhisa Hatakeyama; 和久畠山; Makoto Goto; 誠後藤; Masato Terasawa; 真人寺沢; Hideaki Yugawa; 英明湯川
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1994-10-06
Filing date: 1994-10-06
Publication date: 1996-04-23

Abstract

(57)【要約】【構成】トリプトファンシンターゼまたはトリプトファ
ナーゼを含有する微生物、または、その処理物の存在下
に、インドールとＬ−セリンを含有する水溶液中で酵素
反応させて、Ｌ−トリプトファンを生成させるに際し、
該水溶液中のｐＨを９．０〜１０．０に維持し、かつ、
Ｌ−セリン濃度を３０ｍＭ以上に維持して酵素反応さ
せ、該反応液中にＬ−トリプトファンを３％（ｗ／ｖ）
〜５％（ｗ／ｖ）の濃度まで生成蓄積せしめ、該反応液
からＬ−トリプトファンを採取することを特徴とするＬ
−トリプトファンの製造法。【効果】Ｌ−トリプトファンを高効率で安価に製造す
る事が可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、Ｌ−トリプトファンの
製造法に関し、更に詳しくは、原料としてインドールお
よびＬ−セリンを用い、トリプトファンシンターゼある
いはトリプトファナーゼの酵素反応により、反応液中に
高濃度のＬ−トリプトファンを生成蓄積せしめるＬ−ト
リプトファンの製造法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】固定化酵素源を用いて、インドール及び
Ｌ−セリンからＬ−トリプトファンを製造する方法に於
て、反応液中のＬ−セリンをインドールに対して、理論
当量比よりも過剰に存在させることを特徴とするＬ−ト
リプトファンの製造方法が提案されている（特開昭６３
−４９０９１号報）。該方法によれば、ｐＨ８．５の酵
素反応液を用いてＬ−トリプトファンが０．４３８％
（Ｗ／Ｖ）の濃度で連続的に製造可能なことが開示され
ている。

【０００３】また、本発明者らは先にエシェリヒア属に
属する微生物のトリプトファンシンターゼ又は、トリプ
トファナーゼ活性を利用してインドールとＬ−セリンか
ら酵素反応によるＬ−トリプトファンの製造法を提案
（特公平５−７９３１１、特開平１−５１０９３等）し
たが、反応液中のＬ−トリプトファン濃度には限界があ
った。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】前記の如く、トリプト
ファンシンターゼ又はトリプトファナーゼ活性を利用し
てインドールとＬ−セリンからＬ−トリプトファンを生
成蓄積せしめるに際し、該酵素活性が生成したＬ−トリ
プトファンにより強い活性阻害を受ける為、Ｌ−トリプ
トファンの反応液中の濃度をある程度以上増加させるこ
とが出来なかった。しかしながら、効率よく安価なＬ−
トリプトファンの製造法を確立するために、反応液中に
より高濃度のＬ−トリプトファンを生成蓄積せしめる方
法の提供が求められている。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決する為酵素反応液の組成等を鋭意検討した結果、
トリプトファンシンターゼまたはトリプトファナーゼ活
性に対するＬ−トリプトファンの阻害を回避することに
成功し、反応液中にＬ−トリプトファンを高濃度で生成
蓄積し得ることを見い出し本発明を完成するに到った。

【０００６】すなわち、本発明はトリプトファンシンタ
ーゼまたはトリプトファナーゼを含有する微生物菌体、
または、その処理物の存在下に、インドールとＬ−セリ
ンを含有する水溶液中で酵素反応させて、Ｌ−トリプト
ファンを生成させるに際し、該水溶液中のｐＨを９．０
〜１０．０に維持し、かつ、Ｌ−セリン濃度を３０ｍＭ
以上に維持して酵素反応させ、該反応液中にＬ−トリプ
トファンを３％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）の濃度まで
生成蓄積せしめ、該反応液からＬ−トリプトファンを採
取することを特徴とするＬ−トリプトファンの製造法を
提供する。

【０００７】さらに、本発明を詳細に説明する。本発明
に用いられるトリプトファンシンターゼを含有する微生
物としてはインドールとＬ−セリンからＬ−トリプトフ
ァンを生成しうる能力を有する微生物であれば特に限定
されるものではなく、例えば、エシェリヒア・コリＫ−
１２（ＡＴＣＣ２７３２５）、エシェリヒア・コリＹＫ
２００４（ＦＥＲＭＢＰ−１７３２）、エシェリヒア
・コリＹＫ２００９（ＦＥＲＭＢＰ−３２４４）等が
挙げられる。

【０００８】また、トリプトファナーゼを含有する微生
物としては、インドールとＬ−セリンからＬ−トリプト
ファンを生成しうる能力を有する微生物であれば特に限
定されるものではなく、例えば、エシェリヒア・コリＫ
−１２（ＡＴＣＣ２７３２５）、エシェリヒア・コリ
ＡＴＣＣ２５０１９、エシェリヒア・コリＹＩＦＯ３
３０１、エシェリヒア・コリＫ−１２ＹＫ３００２
（ＦＥＲＭＢＰ−１７３３）、エシェリヒア・コリ
Ｋ−１２ＹＫ３００３（ＦＥＲＭＢＰ−１７３
４）、エシェリヒア・コリＫ−１２ＹＫ３００５
（ＦＥＲＭＢＰ−１７３６）等が挙げられる。

【０００９】トリプトファンシンターゼまたはトリプト
ファナーゼを含有する微生物の培養は、それ自体既知の
通常用いられる、炭素源、窒素源、無機塩等を含む培地
で行うことができる。炭素源としては、例えばグルコー
ス、グリセロール、フラクトース、シュクロース、廃糖
蜜等が、そして窒素源としては、例えばアンモニア、硫
酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム
がそれぞれ単独もしくは混合して用いられる。また、無
機塩としては、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸二
水素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この
他にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティー
プリカー、カザミノ酸、ビオチン、チアミン等の各種ビ
タミン等の栄養素を培地に添加することができる。

【００１０】培養は、通常、通気攪拌、振盪等の好気的
条件下に、培養温度は一般に２０℃〜５０℃の温度で行
うことができる。培養途中のｐＨは５〜１０、好ましく
は７〜８付近とすることができ、培養中のｐＨ調整は酸
又はアルカリを添加して行うことができる。培養開始時
の炭素源濃度は、特に制限するものではないが、通常１
〜１０％（ｗ／ｖ）、更に好ましくは２〜５％（ｗ／
ｖ）である。また、培養期間は通常約５時間〜約５日間
である。

【００１１】本発明の方法は、上記の如く培養して得た
培養物、該培養物を遠心分離法等により分離して得られ
る菌体または該菌体の処理物、例えば洗浄菌体、乾燥菌
体、あるいはそれらの固定化物等の種々の形態が使用さ
れる。また、菌体破砕物、あるいはそれらを抽出・精製
して得た酵素または該酵素を固定化した固定化酵素を使
用してもよい。

【００１２】かくして得られる、トリプトファンシンタ
ーゼまたはトリプトファナーゼを含有する微生物または
その処理物をインドールとＬ−セリンを含有する水溶液
中で酵素反応させて、反応液中にＬ−トリプトファンを
生成蓄積せしめることができる。基質であるインドール
の反応液中の濃度は、特に制限はないが、好ましくは
０．５〜２ｍＭである。

【００１３】セリンの反応液中の濃度は、Ｌ−セリンを
用いる場合は２０ｍＭ〜２０００ｍＭ、好ましくは３０
ｍＭ〜１０００ｍＭ、Ｄ，Ｌ−セリンを用いる場合は４
０ｍＭ〜５００ｍＭ、好ましくは６０ｍＭ〜５００ｍＭ
である。反応液には、基質であるインドール、セリンの
他に、Ｌ−トリプトファンの生成率を高めるためにピリ
ドキサールリン酸（ＰＬＰ）を添加せしめることが好ま
しい。

【００１４】溶媒としては、一般には、水が用いられ、
必要に応じてトリトンＸ−１００（ポリオキシエチレン
アルキルフェノールエーテル系非イオン性界面活性
剤）、ツイーン２０（ポリオキシエチレンソルビタンモ
ノラウレイト系非イオン性界面活性剤）等の界面活性剤
を添加することもできる。反応液中のｐＨは、９〜１０
であり、ｐＨの調整は酸又はアルカリを添加して行うこ
とができる。

【００１５】反応温度は１５〜６０℃、好ましくは、２
０〜５０℃である。上記の如く酵素反応させることによ
りＬ−トリプトファンを、高濃度で生成蓄積させること
ができる。さらに、本製造法は、該酵素や微生物を、膜
を利用して系内に封じ込め、反応と同時に生成物を含有
した透過液を抜き出し、菌体分離を連続的に行いＬ−ト
リプトファンを高濃度に効率よく連続製造することもで
きる。

【００１６】得られたＬ−トリプトファンの分離・精製
は、通常のイオン交換樹脂法、晶析法、その他の公知の
方法を組み合わせることにより、容易に行うことができ
る。

【００１７】

【実施例】以上に本発明を説明してきたが、下記の実施
例によりさらに具体的に説明する。しかしながら、下記
の実施例は本発明について具体的な認識を得る一助とし
てのみ挙げるものであり、これによって本発明の範囲は
何ら限定されるものではない。

【００１８】実施例１（１）トリプトファンシンターゼによるＬ−トリプトフ
ァン生成反応における、セリン濃度の影響ＭＴＰ培地〔組成：Ｋ₂ＨＰＯ₄ ７．０ｇ、ＫＨ₂Ｐ
Ｏ₄ ２．０ｇ、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ １．０ｇ、Ｍｇ
ＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ１００ｍｇ、アデニン塩酸塩５０
ｍｇ、酵母エキス１ｇ、トリプトン１ｇ、グルコー
ス１．０ｇ、蒸留水１Ｌ、ｐＨ７．２〕５０ｍｌを
５００ｍｌ容三角フラスコに分注し、１２０℃で１５分
間滅菌処理したものにエシェリヒア・コリＫ−１２
ＹＫ２００９（ＦＥＲＭＢＰ−３２４４）株を植菌
し、３７℃にて１日振とう培養後、同様にして調製した
ＭＴＰ培地１Ｌを分注した５Ｌ容三角フラスコに、２０
ｍｌの培養液を接種し、３７℃にて１２時間振とう培養
した。また、培養開始３時間後に培地中にインドールア
クリル酸１００ｍｇを添加した。遠心分離を用いて菌体
を回収し、−２０℃で２日間凍結し保存後、以下の実験
に用いた。

【００１９】第１表に示すＬ−セリン濃度に調節した酵
素反応液〔組成：Ｌ−セリン２０ｍＭ、３０ｍＭ、５
０ｍＭ、あるいは、１００ｍＭ、と、インドール１ｍ
Ｍ、ＰＬＰ０．０４ｍＭ、ＮａＣｌ４０ｍＭ、Ｌ−
トリプトファン１９６ｍＭとを含有、２５％アンモニ
ア溶液でｐＨ９．５に調整〕０．９ｍｌに希釈液〔Ｌ−
セリン２０ｍＭ、ＰＬＰ０．０４ｍＭ〕で適宜希釈
した上記の凍結菌体懸濁液０．１ｍｌ添加し、３０℃で
１５分間反応させた後、１０％トリクロロ酢酸溶液１．
０ｍｌを加え反応を停止させる。遠心（８０００×ｇ、
１０分間）した後、上清液を０．５ｍｌ分取し、０．１
ｍｌの５ＮＮａＯＨ溶液とトルエン４．０ｍｌを加え
撹拌後、２分間静置し上層（トルエン層）１．０ｍｌを
呈色液〔組成：ｐ−ジメチルベンズアルデヒド３．６
ｇ、濃塩酸１８ｍｌ、エタノールで２８２ｍｌ〕３．
０ｍｌに加え撹拌する。４０分間放置後吸光度５４０ｎ
ｍを測定し、インドールの残量を測定し、インドールの
減少量からトリプトファン合成活性を算出した。活性測
定の結果を第１表に示す。Ｌ−セリン各濃度におけるト
リプトファン合成活性は、Ｌ−セリン３０ｍＭ添加の場
合を１００とする相対値で示した。

【００２０】

【表１】第１表Ｌ−セリン濃度Ｌ−トリプトファン（ｍＭ）合成活性（相対値）２０５０３０１００５０１１５１００１２０

【００２１】（２）トリプトファンシンターゼによるＬ
−トリプトファン生成反応における、セリン濃度の影響前記実施例１の（１）と同様の方法で調製したエシェリ
ヒア・コリＫ−１２ＹＫ２００９（ＦＥＲＭＢＰ−
３２４４）株の凍結菌体の１０ｇを、インドール０．
１ｇ、Ｌ−セリン３．１５ｇ、ＰＬＰ１００ｍｇ、
ＮａＣｌ２．３ｇを含有する反応液５００ｍｌ（ｐＨ
９．５に２５％アンモニアで調整）に懸濁した後、全体
の体積を水で１０００ｍｌに調整した（調整後のＬ−セ
リン濃度：３０ｍＭ）。本懸濁液をそれぞれ３Ｌジャー
ファーメンター（エイブル社製）に仕込み、３０℃で４
８時間撹拌しながら反応を行った。反応中、反応液のｐ
Ｈを２５％アンモニアで９．５に調整した。また、３分
毎に、０．０２６ｇのインドールを継続的に添加し、総
量として２４．９６ｇのインドールを添加した。さら
に、反応液中のＬ−セリン濃度を高速液体クロマトグラ
フィー（島津製作所製）を用いてモニターしながら第２
表に示す各実験区の指定Ｌ−セリン濃度を超えることな
くＬ−セリン濃度を保てるように連続的あるいは断続的
に添加した。

【００２２】同様にして、反応液中のＬ−セリン濃度を
２０、５０、および、１００ｍＭに調節し上記の方法に
より反応を行った。反応終了後、直ちに反応液を遠心分
離して得た上清液について高速液体クロマトグラフィー
（島津製作所製）で生成したＬ−トリプトファンの分析
を行った。その結果を第２表に示す。また、Ｌ−セリン
濃度２０ｍＭの反応液で行った反応では、４８時間後に
は、Ｌ−セリンの減少は見られなかった。

【００２３】次に、Ｌ−セリン濃度３０ｍＭで反応した
反応終了液５００ｍｌにＮａＯＨ水溶液を加えてｐＨ１
０にしたのち、アンモニア型強酸性イオン交換樹脂（ダ
イヤイオンＳＫ−１Ｂ、三菱化成製）のカラムを通して
Ｌ−トリプトファンの粗結晶を析出させたのち、これを
アセトンで洗浄し乾燥してＬ−トリプトファンの結晶１
５．５ｇを得た。

【００２４】

【表２】第２表Ｌ−セリンの濃度Ｌ−トリプトファン（ｍＭ）生成濃度％（ｗ／ｖ）２０２．５３０４．１５０４．１１００４．１

【００２５】実施例２トリプトファンシンターゼによるＬ−トリプトファン生
成反応における、ｐＨの影響エシェリヒア・コリＫ−１２ＹＫ２００９（ＦＥＲＭ
ＢＰ−３２４４）株を実施例１と同様に培養して得た
凍結菌体８ｇを用いて３Ｌジャーファーメンター（エイ
ブル社製）で反応を行った。反応はＬ−セリンを３０ｍ
Ｍ含有する実施例１の（２）と同様の反応液を用い、但
しｐＨを２５％アンモニア溶液で９．３、９．５、およ
び９．７に調節しながら３７℃で４８時間反応した。ま
た、３分毎に、０．０３３ｇのインドールおよび０．０
３ｇのＬ−セリンを添加した。その結果、総量３１．６
８ｇのインドールおよび２８．８ｇのＬ−セリンを添加
した。同様にして、反応終了後、直ちに反応液を遠心分
離して得た上清液について高速液体クロマトグラフィー
（島津製作所製）で生成したＬ−トリプトファンの分析
を行った結果を第３表に示す。

【００２６】

【表３】第３表Ｌ−トリプトファン反応液のｐＨ生成濃度％（ｗ／ｖ）９．３３．０９．５４．１９．７５．０

【００２７】実施例３（１）トリプトファナーゼによるＬ−トリプトファン生
成反応における、セリン濃度の影響実施例１と同様にしてエシェリヒア・コリＫ−１２
ＹＫ３００５（ＦＥＲＭＢＰ−１７３６）株を培養し
た後、遠心分離を用いて菌体を回収し、−２０℃で２日
間凍結し保存後、以下の実験に用いた。

【００２８】第３表に示すＬ−セリン濃度に調節した酵
素反応液〔組成：Ｌ−セリン２０ｍＭ、３０ｍＭ、５
０ｍＭ、あるいは、１００ｍＭ、インドール１０ｍ
Ｍ、ＰＬＰ０．０４ｍＭ、ＫＣｌ５０ｍＭ、Ｌ−ト
リプトファン１９６ｍＭ、ＫＯＨ溶液でｐＨ９．５に
調製〕０．９ｍｌに希釈液〔Ｌ−セリン２０ｍＭ、Ｐ
ＬＰ０．０４ｍＭ〕で適宜希釈した上記の凍結菌体懸
濁液０．１ｍｌ添加し、３０℃で１５分間反応させた
後、５ＮＮａＯＨ溶液０．１ｍｌを加え反応を停止さ
せる。遠心分離（８０００×ｇ、１０分間）した上清液
を１０倍に希釈した後、０．５ｍｌ分取しトルエン４．
０ｍｌを加え撹拌後、２分間静置し上層（トルエン層）
１．０ｍｌを呈色液〔組成：ｐ−ジメチルベンズアルデ
ヒド３．６ｇ、濃塩酸１８ｍｌをエタノールで３０
０ｍｌにメスアップした溶液〕３．０ｍｌに加え撹拌す
る。４０分間放置後吸光度５４０ｎｍを測定し、インド
ールの残量を測定し、インドールの減少量からトリプト
ファン合成活性を算出した。活性測定の結果を第４表に
示す。Ｌ−セリン各濃度におけるトリプトファン合成活
性は、Ｌ−セリン３０ｍＭ添加の場合を１００とする相
対値で示した。

【００２９】

【表４】第４表Ｌ−セリン濃度Ｌ−トリプトファン（ｍＭ）合成活性（相対値）２０５０３０１００５０１３０１００１５０

【００３０】（２）トリプトファナーゼによるＬ−トリ
プトファン生成反応における、セリン濃度の影響前記と同様にして調製したエシェリヒア・コリＫ−１
２ＹＫ３００５（ＦＥＲＭＢＰ−１７３６）株の凍
結菌体を用いて以下の実験を行った。該凍結菌体の５ｇ
をインドール５．８５ｇ、Ｌ−セリン３．１５ｇ、
ピリドキサールリン酸１００ｍｇ、ＫＣｌ３．８ｇ
を含有する反応液５００ｍｌ（ｐＨ９．５にＫＯＨ溶液
で調整）に懸濁した後、全体の体積を１０００ｍｌに水
で調整した（調整後のＬ−セリン濃度：３０ｍＭ）。本
懸濁液を３Ｌジャーファーメンター（エイブル社製）に
注入し、３０℃で４８時間撹拌しながら反応を行った。
反応中、反応液のｐＨをＫＯＨ溶液で９．５に調整し
た。また、３分毎に、０．０２６ｇのインドールを添加
し、その結果、総量２４．９６ｇのインドールを添加し
た。同様にして、反応液中のＬ−セリン濃度を２０、５
０、および、１００ｍＭに調節し上記の方法により反応
を行った。反応終了後、直ちに反応液を遠心分離して得
た上清液について高速液体クロマトグラフィー（島津製
作所製）で生成したＬ−トリプトファンの分析を行っ
た。その結果を第５表に示す。

【００３１】Ｌ−セリン濃度３０ｍＭで反応した反応終
了液５００ｍｌにＮａＯＨ水溶液を加えてｐＨ１０にし
たのち、アンモニア型強酸性イオン交換樹脂（ダイヤイ
オンＳＫ−１Ｂ、三菱化成製）のカラムを通してＬ−ト
リプトファンの粗結晶を析出させたのち、これをアセト
ンで洗浄し乾燥してＬ−トリプトファンの結晶１５．７
ｇを得た。

【００３２】

【表５】第５表Ｌ−セリンの濃度Ｌ−トリプトファン（ｍＭ）生成濃度％（ｗ／ｖ）２０２．２３０４．０５０４．１１００４．１

【００３３】実施例４トリプトファナーゼによるＬ−トリプトファン生成反応
における、ｐＨの影響エシェリヒア・コリＫ−１２ＹＫ３００５（ＦＥＲ
ＭＢＰ−１７３６）株を実施例３と同様に培養して得
た菌体５ｇを用いて３Ｌジャーファーメンター（エイブ
ル社製）で反応を行った。反応はＬ−セリン３０ｍＭを
含有する実施例３の（２）と同様の反応液を用い、但
し、ｐＨをＫＯＨ水溶液で９．３、９．５、および９．
７に調節しながら３７℃で４８時間反応した。また、３
分毎に、０．０３３ｇのインドールを添加し、その結
果、総量３１．６８ｇのインドールを添加した。反応終
了後、直ちに反応液を遠心分離して得た上清液について
高速液体クロマトグラフィー（島津製作所製）で生成し
たＬ−トリプトファンの分析を行った。その結果を第６
表に示す。

【００３４】

【表６】第６表Ｌ−トリプトファン反応液のｐＨ生成濃度％（ｗ／ｖ）９．３３．０９．５４．０９．７５．０

【００３５】

【発明の効果】本発明によれば、酵素反応液中のＬ−ト
リプトファンを３％（Ｗ／Ｖ）〜５％（Ｗ／Ｖ）の高濃
度で生成させることが可能であり、効率良く安価にＬ−
トリプトファンを製造することが出来る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:185） (72)発明者湯川英明茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号三菱化学株式会社筑波研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】トリプトファンシンターゼまたはトリプ
トファナーゼを含有する微生物、または、その処理物の
存在下に、インドールとＬ−セリンを含有する水溶液中
で酵素反応させて、Ｌ−トリプトファンを生成させるに
際し、該水溶液中のｐＨを９．０〜１０．０に維持し、
かつ、Ｌ−セリン濃度を３０ｍＭ以上に維持して酵素反
応させ、該反応液中にＬ−トリプトファンを３％（ｗ／
ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）の濃度まで生成蓄積せしめ、該反
応液からＬ−トリプトファンを採取することを特徴とす
るＬ−トリプトファンの製造法。
【請求項２】トリプトファンシンターゼまたはトリプ
トファナーゼが、エシェリヒア属に属する細菌に由来す
るトリプトファンシンターゼまたはトリプトファナーゼ
である請求項１に記載のＬ−トリプトファンの製造法。