JPH08105899A - クレアチニン検定方法 - Google Patents
クレアチニン検定方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 より簡易にかつ高感度にクレアチニンを検出
する方法を提供することを目的とする。 【解決手段】 アルカリ性状態下でクレアチニンと反応
して有色の反応生成物を形成する乾燥試薬として使用す
る、一価のカチオンと塩を形成し得る有機酸を、クレア
チニンを含有する水性溶液と接触させ、かつ該溶液によ
り溶解させる、水性溶液中のクレアチニンの検定方法に
おいて、乾燥試薬として、該有機酸のリチウム塩を使用
する方法。
する方法を提供することを目的とする。 【解決手段】 アルカリ性状態下でクレアチニンと反応
して有色の反応生成物を形成する乾燥試薬として使用す
る、一価のカチオンと塩を形成し得る有機酸を、クレア
チニンを含有する水性溶液と接触させ、かつ該溶液によ
り溶解させる、水性溶液中のクレアチニンの検定方法に
おいて、乾燥試薬として、該有機酸のリチウム塩を使用
する方法。
Description
【０００１】クレアチニンは、クレアチンがクレアチン
リン酸になり、筋収縮のエネルギー源として使用される
ときの最終代謝物である。このクレアチニンは、腎臓の
糸球体によってろ過され、再吸収なしに尿中に排泄され
る。体液中のクレアチニンの検出は、筋肉の疾患、或い
は腎炎や腎不全のような腎臓の疾患を診断するために有
効である。
リン酸になり、筋収縮のエネルギー源として使用される
ときの最終代謝物である。このクレアチニンは、腎臓の
糸球体によってろ過され、再吸収なしに尿中に排泄され
る。体液中のクレアチニンの検出は、筋肉の疾患、或い
は腎炎や腎不全のような腎臓の疾患を診断するために有
効である。
【０００２】Jaffe 法として知られている、尿中のクレ
アチニン検出のための最初の実践的な試験は、アルカリ
溶液中でのピクリン酸とクレアチニンとの結合によって
黄褐色のピクリン酸クレアチニンの生成を伴う。クレア
チニン検出のためのより最近の方法は、BenedictとBehr
e (J.Biol.Chem., 113:515(1936)) によって報告されて
おり、その方法は、アルカリ媒体中でのクレアチニンと
３，５−ジニトロ安息香酸との反応を伴う。クレアチニ
ンの比色測定では、クレアチニンを脱プロトン化して有
色の反応生成物の形成を可能にするために、約１１．５
〜１２．５のオーダーの高いｐＨが要求される。アルカ
リ金属やアルカリ土類金属の水酸化物のような強塩基性
物質が、試薬系において適当な高いｐＨを維持するため
に典型的に用いられる。
アチニン検出のための最初の実践的な試験は、アルカリ
溶液中でのピクリン酸とクレアチニンとの結合によって
黄褐色のピクリン酸クレアチニンの生成を伴う。クレア
チニン検出のためのより最近の方法は、BenedictとBehr
e (J.Biol.Chem., 113:515(1936)) によって報告されて
おり、その方法は、アルカリ媒体中でのクレアチニンと
３，５−ジニトロ安息香酸との反応を伴う。クレアチニ
ンの比色測定では、クレアチニンを脱プロトン化して有
色の反応生成物の形成を可能にするために、約１１．５
〜１２．５のオーダーの高いｐＨが要求される。アルカ
リ金属やアルカリ土類金属の水酸化物のような強塩基性
物質が、試薬系において適当な高いｐＨを維持するため
に典型的に用いられる。
【０００３】共同でなされた米国特許出願第１６０，２
３９号明細書には、単一の尿試料中の、尿中の蛋白とク
レアチニンを検出するための単一法が開示されている。
この種の検出法において、クレアチニンの検出は、蛋白
質／クレアチニン比を用いることによる、尿の高い流動
という問題を極小化するために行われ、その結果、尿中
濃度が正常化される。この開示には、尿中の蛋白とクレ
アチニンの単一検出法が記載されており、この方法にお
いては、尿試料が、第一および第二反応域を含む反応容
器中に導入される。第一反応域には、尿蛋白に特異的
な、乾燥した免疫試薬が組み込まれており、第二反応域
には、これら反応域に導入された反応液のｐＨをクレア
チニンを検出するのに適したレベルに高め得る、乾燥し
た塩基性試薬が組み込まれている。尿試料を第一反応域
に導入して免疫試薬と接触させるとき、免疫試薬と尿蛋
白との相互作用により、反応液の濁りを増大させながら
免疫試薬が溶解し、この濁りの増大が尿中蛋白の濃度を
決定するために利用される。次に、クレアチニン検出の
ための試薬を含有するその反応液を、第二反応域中の、
乾燥した塩基性試薬と接触させ、それにより塩基性試薬
が溶解し、クレアチニンの比色検定のために要求される
レベルにその反応液のｐＨを上げる。別の手段として
は、クレアチニン検出試薬を塩基性試薬と共に第二反応
域上にあらかじめ乾燥させる。単一分析のこのシステム
を最高の効率で作動させるためには、乾燥したクレアチ
ニン反応試薬を、十分な量で第二反応域の表面上に乾燥
させることが必須であり、これによりこの試薬の再水和
を伴うクレアチニン検出反応が容易になる。
３９号明細書には、単一の尿試料中の、尿中の蛋白とク
レアチニンを検出するための単一法が開示されている。
この種の検出法において、クレアチニンの検出は、蛋白
質／クレアチニン比を用いることによる、尿の高い流動
という問題を極小化するために行われ、その結果、尿中
濃度が正常化される。この開示には、尿中の蛋白とクレ
アチニンの単一検出法が記載されており、この方法にお
いては、尿試料が、第一および第二反応域を含む反応容
器中に導入される。第一反応域には、尿蛋白に特異的
な、乾燥した免疫試薬が組み込まれており、第二反応域
には、これら反応域に導入された反応液のｐＨをクレア
チニンを検出するのに適したレベルに高め得る、乾燥し
た塩基性試薬が組み込まれている。尿試料を第一反応域
に導入して免疫試薬と接触させるとき、免疫試薬と尿蛋
白との相互作用により、反応液の濁りを増大させながら
免疫試薬が溶解し、この濁りの増大が尿中蛋白の濃度を
決定するために利用される。次に、クレアチニン検出の
ための試薬を含有するその反応液を、第二反応域中の、
乾燥した塩基性試薬と接触させ、それにより塩基性試薬
が溶解し、クレアチニンの比色検定のために要求される
レベルにその反応液のｐＨを上げる。別の手段として
は、クレアチニン検出試薬を塩基性試薬と共に第二反応
域上にあらかじめ乾燥させる。単一分析のこのシステム
を最高の効率で作動させるためには、乾燥したクレアチ
ニン反応試薬を、十分な量で第二反応域の表面上に乾燥
させることが必須であり、これによりこの試薬の再水和
を伴うクレアチニン検出反応が容易になる。
【０００４】分析方法全般において、リチウム塩類の使
用は既知である。例えば、米国特許第５，１５１，３６
９号明細書において、リチウム塩類、とくにチオシアン
酸リチウムを使用して、溶血およびヘモグロビンを変性
させる方法が開示されている。
用は既知である。例えば、米国特許第５，１５１，３６
９号明細書において、リチウム塩類、とくにチオシアン
酸リチウムを使用して、溶血およびヘモグロビンを変性
させる方法が開示されている。
【０００５】本発明は、水溶液中のクレアチニンの検定
の改良法であって、アルカリ性条件下でクレアチニンと
反応して有色の反応生成物を形成する有機酸試薬を、ク
レアチニンを含有する水溶液と接触させ、この溶液に溶
解させる。この改良法は、このクレアチニン反応性試薬
のリチウム塩を含む。
の改良法であって、アルカリ性条件下でクレアチニンと
反応して有色の反応生成物を形成する有機酸試薬を、ク
レアチニンを含有する水溶液と接触させ、この溶液に溶
解させる。この改良法は、このクレアチニン反応性試薬
のリチウム塩を含む。
【０００６】ジニトロ安息香酸リチウム（ＬｉＤＮＢ
Ａ）、ピクリン酸リチウムおよび１，４−ナフトキノン
−２−スルホン酸リチウム等の有機酸のリチウム塩の、
クレアチニン検出試薬としての使用は、乾燥試薬を使用
するいかなる種の分析計画においても有効である。例え
ば、このリチウム塩は、乾燥試薬試験片フォーマットに
おいて使用され得、このフォーマットにおいては、例え
ばＬｉＤＮＢＡのようなその塩の浸液およびＬｉＯＨ
（または他の塩基）が、試験片マトリックスに含浸させ
るために使用される。この試薬試験片は、試料中のクレ
アチニンと反応して、有色の応答を生む。また別の手段
としては、この試験片は、２つの浸せきフォーマットを
用いて調製され得、このフォーマットにおいて、第一の
浸せきフォーマットはそのリチウム塩を含有し、第二の
浸せきフォーマットはアルコール／水の混合物中にアル
カリ性試薬を含有する。例えば尿のような、クレアチニ
ン濃度を測定すべき水性液体に後に溶解させるためにク
レアチニン反応性試薬が支持材料上に乾燥した、クレア
チニン検出のためのいかなる分析技術も本発明を使用す
ることにより利益を得ることができる。クレアチニン試
薬として最も知られているＤＮＢＡの場合、文献中に、
沸騰水５３部では遊離酸の溶解度が約１ｇであること
（０．０８９Ｍ）および冷水中では極めて低い溶解度で
あることが報告されている。当業者は、ＤＮＢＡがその
塩の形態ではより可溶であると期待するであろう。実験
結果は、室温でのＤＮＢＡのカリウム塩の溶解度が約
０．０５Ｍであり、室温でのそれのナトリウム塩の溶解
度が約０．１１Ｍであることを示した。意外にも、室温
でのＤＮＢＡのリチウム塩の溶解度が約１．８９Ｍであ
ることが判明した。ＤＮＢＡ塩の混合物もまた、適度な
溶解度を有する；例えば、そのナトリウム塩とそのカリ
ウム塩の混合物は、室温で０．５８Ｍの溶解度を示し、
他方、そのナトリウム塩とそのリチウム塩の混合物は
０．９２Ｍの溶解度を有し、そのカリウム塩とそのリチ
ウム塩の混合物は０．９１Ｍの溶解度を示した。その高
い溶解度のため、そのリチウム塩は、クレアチニン試薬
が固体支持体上に乾燥しているタイプでの分析における
使用においてより好ましい。クレアチニン反応性基質の
塩の濃度が大きくなるにつれて、特定量のその溶液から
析出し得るその塩の量が大きくなるからである。その
上、ＤＮＢＡまたは別のクレアチニン反応性物質を溶解
すべき場合、そのような溶解は、そのリチウム塩の使用
によって容易となる。
Ａ）、ピクリン酸リチウムおよび１，４−ナフトキノン
−２−スルホン酸リチウム等の有機酸のリチウム塩の、
クレアチニン検出試薬としての使用は、乾燥試薬を使用
するいかなる種の分析計画においても有効である。例え
ば、このリチウム塩は、乾燥試薬試験片フォーマットに
おいて使用され得、このフォーマットにおいては、例え
ばＬｉＤＮＢＡのようなその塩の浸液およびＬｉＯＨ
（または他の塩基）が、試験片マトリックスに含浸させ
るために使用される。この試薬試験片は、試料中のクレ
アチニンと反応して、有色の応答を生む。また別の手段
としては、この試験片は、２つの浸せきフォーマットを
用いて調製され得、このフォーマットにおいて、第一の
浸せきフォーマットはそのリチウム塩を含有し、第二の
浸せきフォーマットはアルコール／水の混合物中にアル
カリ性試薬を含有する。例えば尿のような、クレアチニ
ン濃度を測定すべき水性液体に後に溶解させるためにク
レアチニン反応性試薬が支持材料上に乾燥した、クレア
チニン検出のためのいかなる分析技術も本発明を使用す
ることにより利益を得ることができる。クレアチニン試
薬として最も知られているＤＮＢＡの場合、文献中に、
沸騰水５３部では遊離酸の溶解度が約１ｇであること
（０．０８９Ｍ）および冷水中では極めて低い溶解度で
あることが報告されている。当業者は、ＤＮＢＡがその
塩の形態ではより可溶であると期待するであろう。実験
結果は、室温でのＤＮＢＡのカリウム塩の溶解度が約
０．０５Ｍであり、室温でのそれのナトリウム塩の溶解
度が約０．１１Ｍであることを示した。意外にも、室温
でのＤＮＢＡのリチウム塩の溶解度が約１．８９Ｍであ
ることが判明した。ＤＮＢＡ塩の混合物もまた、適度な
溶解度を有する；例えば、そのナトリウム塩とそのカリ
ウム塩の混合物は、室温で０．５８Ｍの溶解度を示し、
他方、そのナトリウム塩とそのリチウム塩の混合物は
０．９２Ｍの溶解度を有し、そのカリウム塩とそのリチ
ウム塩の混合物は０．９１Ｍの溶解度を示した。その高
い溶解度のため、そのリチウム塩は、クレアチニン試薬
が固体支持体上に乾燥しているタイプでの分析における
使用においてより好ましい。クレアチニン反応性基質の
塩の濃度が大きくなるにつれて、特定量のその溶液から
析出し得るその塩の量が大きくなるからである。その
上、ＤＮＢＡまたは別のクレアチニン反応性物質を溶解
すべき場合、そのような溶解は、そのリチウム塩の使用
によって容易となる。
【０００７】前述のように、本発明は、同時係属出願で
ある米国出願第１６０，２３９号明細書において開示さ
れた、尿中の蛋白とクレアチニンの単一測定のための装
置との組み合わせにおいて特に有効である。試験される
べき尿が第一および第二反応域を含む反応容器に導入さ
れる系において、第一反応域に、例えばヒト血清アルブ
ミン（ＨＳＡ）に向けられた乾燥したヤギ抗血清を取り
込み得る。この材料は市販されており、また、二倍に濃
縮しかつ乾燥の間および乾燥後長期保存中にその抗体が
安定化するように２〜５％のスクロース／トレハロース
の混合物を添加することを除き、付加的な処理なしに使
用され得る。添加剤もまた、物理的安定性を提供し、乾
燥試薬のはがれ落ちや凝結を防止する。典型的には、そ
の抗体溶液の１５μＬ分を、第一反応域上で乾燥させ、
１５分間６０℃で作動させたトンネル乾燥機を用いて乾
燥させる。
ある米国出願第１６０，２３９号明細書において開示さ
れた、尿中の蛋白とクレアチニンの単一測定のための装
置との組み合わせにおいて特に有効である。試験される
べき尿が第一および第二反応域を含む反応容器に導入さ
れる系において、第一反応域に、例えばヒト血清アルブ
ミン（ＨＳＡ）に向けられた乾燥したヤギ抗血清を取り
込み得る。この材料は市販されており、また、二倍に濃
縮しかつ乾燥の間および乾燥後長期保存中にその抗体が
安定化するように２〜５％のスクロース／トレハロース
の混合物を添加することを除き、付加的な処理なしに使
用され得る。添加剤もまた、物理的安定性を提供し、乾
燥試薬のはがれ落ちや凝結を防止する。典型的には、そ
の抗体溶液の１５μＬ分を、第一反応域上で乾燥させ、
１５分間６０℃で作動させたトンネル乾燥機を用いて乾
燥させる。
【０００８】アルカリ性試薬およびクレアチニン反応試
薬を、第二反応域の表面上に、典型的にはこれらの溶解
前においてそれらを分離させ続けるように第二反応域の
異なる面上に乾燥させる。クレアチニン検出のためのア
ルカリ性試薬は、アルカリ金属の水酸化物溶液（例えば
２．５ＭのＫＯＨ）、或いはアルカリ金属の水酸化物
と、リン酸塩、ホウ酸塩またはグアニジン誘導体のよう
なアルカリ性緩衝物質との混合物のいずれかからなる。
典型的には、１Ｍのリン酸塩と４．０Ｍの水酸化カリウ
ムとの混合物並びに１０％の上記添加剤が使用される。
この試薬を、例えば１５μＬのその濃縮溶液を第二の反
応室の１表面に塗布して乾燥させることによって、第二
反応域の１表面上に乾燥させる。クレアチニン反応性試
薬、典型的には水中の３，５−ジニトロ安息香酸リチウ
ムは、かなり飽和した、例えば１．４Ｍの溶液として与
えられる。ＬｉＤＮＢＡの溶解限界まで十分に飽和した
溶液を使用し得るが、製造工程の間は望ましくはない。
濃度や温度における微妙な変化によって、固体物質が容
易に析出するからである。この溶液を、通常は上述のよ
うなタイプの安定化剤で処理し、１５μＬの溶液で第二
反応域の適当な表面上に塗布し、続いて乾燥させる。
薬を、第二反応域の表面上に、典型的にはこれらの溶解
前においてそれらを分離させ続けるように第二反応域の
異なる面上に乾燥させる。クレアチニン検出のためのア
ルカリ性試薬は、アルカリ金属の水酸化物溶液（例えば
２．５ＭのＫＯＨ）、或いはアルカリ金属の水酸化物
と、リン酸塩、ホウ酸塩またはグアニジン誘導体のよう
なアルカリ性緩衝物質との混合物のいずれかからなる。
典型的には、１Ｍのリン酸塩と４．０Ｍの水酸化カリウ
ムとの混合物並びに１０％の上記添加剤が使用される。
この試薬を、例えば１５μＬのその濃縮溶液を第二の反
応室の１表面に塗布して乾燥させることによって、第二
反応域の１表面上に乾燥させる。クレアチニン反応性試
薬、典型的には水中の３，５−ジニトロ安息香酸リチウ
ムは、かなり飽和した、例えば１．４Ｍの溶液として与
えられる。ＬｉＤＮＢＡの溶解限界まで十分に飽和した
溶液を使用し得るが、製造工程の間は望ましくはない。
濃度や温度における微妙な変化によって、固体物質が容
易に析出するからである。この溶液を、通常は上述のよ
うなタイプの安定化剤で処理し、１５μＬの溶液で第二
反応域の適当な表面上に塗布し、続いて乾燥させる。
【０００９】操作において、緩衝液（例えば、４％ポリ
エチレングリコール、２５mMのＴｒｉｓ、５mMのＥＤＴ
Ａ、０．１％のアジ化ナトリウムおよび０，１％のゼラ
チン、ｐＨ＝８．５）、並びに、ＨＳＡ、クレアチニン
またはＨＳＡとクレアチニンとの混合物を含む３０μＬ
の試料をその装置に導入して反応を開始させる。ブラン
クを測定後、抗体試薬を溶解し、５３１nmでの吸光度を
２分間測定した。吸光度の増加の割合は、試料中のＨＳ
Ａの濃度に比例する。次に、そのアルカリ性試薬とＬｉ
ＤＮＢＡを溶解し、５３１nmでの吸光度を３分間再び測
定した。試料中のクレアチニンの濃度に比例して吸光度
が増加した。本発明は、さらに以下の例によって示され
る。
エチレングリコール、２５mMのＴｒｉｓ、５mMのＥＤＴ
Ａ、０．１％のアジ化ナトリウムおよび０，１％のゼラ
チン、ｐＨ＝８．５）、並びに、ＨＳＡ、クレアチニン
またはＨＳＡとクレアチニンとの混合物を含む３０μＬ
の試料をその装置に導入して反応を開始させる。ブラン
クを測定後、抗体試薬を溶解し、５３１nmでの吸光度を
２分間測定した。吸光度の増加の割合は、試料中のＨＳ
Ａの濃度に比例する。次に、そのアルカリ性試薬とＬｉ
ＤＮＢＡを溶解し、５３１nmでの吸光度を３分間再び測
定した。試料中のクレアチニンの濃度に比例して吸光度
が増加した。本発明は、さらに以下の例によって示され
る。
【００１０】
【実施例】実施例Ｉ ＫＯＨ、ＮａＯＨおよびＬｉＯＨ水溶液中でのＤＮＢＡ
の溶解度を、以下にしたがって決定した：不溶のＤＮＢ
Ａが観察されるまで、ジニトロ安息香酸を、１．５、
２．０、２．５または３．０Ｍの水酸化カリウム、水酸
化ナトリウムおよび水酸化リチウム溶液に加えた。その
結果物を攪拌し、室温で１時間放置し、ＤＮＢＡの飽和
した上澄液を取り出し、溶液中のアルカリ金属塩の濃度
を３４０nmでのＵＶ吸収により決定した。この実験での
結果を図１に図示したが、この図から、水酸化カリウム
や水酸化ナトリウムを使用した場合よりも、５〜１０倍
以上濃度の高い溶液が、水酸化リチウムとＤＮＢＡから
調製されたことがわかる。
の溶解度を、以下にしたがって決定した：不溶のＤＮＢ
Ａが観察されるまで、ジニトロ安息香酸を、１．５、
２．０、２．５または３．０Ｍの水酸化カリウム、水酸
化ナトリウムおよび水酸化リチウム溶液に加えた。その
結果物を攪拌し、室温で１時間放置し、ＤＮＢＡの飽和
した上澄液を取り出し、溶液中のアルカリ金属塩の濃度
を３４０nmでのＵＶ吸収により決定した。この実験での
結果を図１に図示したが、この図から、水酸化カリウム
や水酸化ナトリウムを使用した場合よりも、５〜１０倍
以上濃度の高い溶液が、水酸化リチウムとＤＮＢＡから
調製されたことがわかる。
【００１１】実施例II 尿中の蛋白とクレアチニンの併合分析は、湿式分析フォ
ーマットでよく実施され、米国特許第４，９９０，０７
５号明細書に開示されているような連続分析的検定を実
施するための反応容器への適用に特に適している。この
特許は、実質的に水平な回転軸、並びに、液体試験試料
中の被検体と相互作用してその被検体の関数として検出
可能な応答を発する第一および第二の分析試薬を取り込
ませた第一および第二反応域を含む分析試薬反応チャン
ネル、を有する反応容器を開示している。この第二反応
域は、第一反応域から所定の距離をおいて位置付けら
れ、かつ液体が通じる関係にある。そのために、その反
応チャンネルに導入された液体試験試料は、その回転軸
の回りにその反応容器を回転させることにより、これら
反応域の間の反応チャンネルに沿って、重力により移動
させ得る。この反応容器は、反応容器内へ液体試験試料
の単一方向の流れを与えるための液体試験試料供給手
段、および、その供給手段と液体が通じる関係にある、
その供給手段中へその液体試験試料を導入するための入
口手段を有する。
ーマットでよく実施され、米国特許第４，９９０，０７
５号明細書に開示されているような連続分析的検定を実
施するための反応容器への適用に特に適している。この
特許は、実質的に水平な回転軸、並びに、液体試験試料
中の被検体と相互作用してその被検体の関数として検出
可能な応答を発する第一および第二の分析試薬を取り込
ませた第一および第二反応域を含む分析試薬反応チャン
ネル、を有する反応容器を開示している。この第二反応
域は、第一反応域から所定の距離をおいて位置付けら
れ、かつ液体が通じる関係にある。そのために、その反
応チャンネルに導入された液体試験試料は、その回転軸
の回りにその反応容器を回転させることにより、これら
反応域の間の反応チャンネルに沿って、重力により移動
させ得る。この反応容器は、反応容器内へ液体試験試料
の単一方向の流れを与えるための液体試験試料供給手
段、および、その供給手段と液体が通じる関係にある、
その供給手段中へその液体試験試料を導入するための入
口手段を有する。
【００１２】図２を参照しながら説明すると、抗体と、
単糖類、二糖類またはオリゴ糖等の添加剤とを、反応容
器１０の第一反応室２４中の第一反応部位２８上に乾燥
させる。前述の特性に加えて、この添加物はまた、乾燥
試薬のはがれ落ちや凝結を防止するような物理的安定性
を与える。この装置は内壁１４を有するが、この壁は、
この装置内への、少量の尿のような液体試験試料の導入
を許容する供給室２３を形成する。また、この供給室
は、反応室２１と液体が通じる関係にあるので、液体試
験試料は、その供給室を通ってその反応室に入りその反
応チャンネルに入ることができ、かつ、水平方向の回転
軸に沿ったこの装置の時計回りの回転によって、その反
応チャンネルに沿って流され得る。その試験試料は、便
利にも、図２に示される入口手段および供給手段のよう
に、毛管ディスペンサー１２を通して供給される。少量
の尿のみが供給チャンネルを通して導入されるので、適
当な緩衝剤を含む付加的反応液体は、供給チャンネルを
通して、或いは、本発明の分析検定操作を行うために、
緩衝剤および／または液体試薬を含有するよう調整され
た液体供給貯槽２６のような別の源から導入され得る。
典型的に、その反応液体は、第一反応域中に存在する抗
体試薬と特異的に結合して凝集型免疫検定を提供する、
高分子凝集剤を含有する。この液体供給貯槽は、要求さ
れるまで液体を保持する液体貯槽として働く、くぼみを
有する貯槽ボディ２７を含む。この貯槽２６は、膜（図
示せず）によってカバーされるが、この膜は除去され
得、貯槽２６中の液体が、反応チャンネル２１中へ流出
することを可能にする。この装置の単純な操作は、液体
貯槽２６からの液体によって運ばれた試験試料の、観察
口４２を通して観察する位置への流入をもたらす。
単糖類、二糖類またはオリゴ糖等の添加剤とを、反応容
器１０の第一反応室２４中の第一反応部位２８上に乾燥
させる。前述の特性に加えて、この添加物はまた、乾燥
試薬のはがれ落ちや凝結を防止するような物理的安定性
を与える。この装置は内壁１４を有するが、この壁は、
この装置内への、少量の尿のような液体試験試料の導入
を許容する供給室２３を形成する。また、この供給室
は、反応室２１と液体が通じる関係にあるので、液体試
験試料は、その供給室を通ってその反応室に入りその反
応チャンネルに入ることができ、かつ、水平方向の回転
軸に沿ったこの装置の時計回りの回転によって、その反
応チャンネルに沿って流され得る。その試験試料は、便
利にも、図２に示される入口手段および供給手段のよう
に、毛管ディスペンサー１２を通して供給される。少量
の尿のみが供給チャンネルを通して導入されるので、適
当な緩衝剤を含む付加的反応液体は、供給チャンネルを
通して、或いは、本発明の分析検定操作を行うために、
緩衝剤および／または液体試薬を含有するよう調整され
た液体供給貯槽２６のような別の源から導入され得る。
典型的に、その反応液体は、第一反応域中に存在する抗
体試薬と特異的に結合して凝集型免疫検定を提供する、
高分子凝集剤を含有する。この液体供給貯槽は、要求さ
れるまで液体を保持する液体貯槽として働く、くぼみを
有する貯槽ボディ２７を含む。この貯槽２６は、膜（図
示せず）によってカバーされるが、この膜は除去され
得、貯槽２６中の液体が、反応チャンネル２１中へ流出
することを可能にする。この装置の単純な操作は、液体
貯槽２６からの液体によって運ばれた試験試料の、観察
口４２を通して観察する位置への流入をもたらす。
【００１３】第一反応域は、第一反応部位２８において
乾燥した抗体試薬を含むが、この試薬は、典型的には図
３中の１８ａおよび１８ｂで示される側面の１つか、或
いは、反応容器の内壁１６に付着している。この装置の
適当な回転は、反応溶液を部位２８における乾燥した抗
体試薬に接触させてその溶解を容易にし、その結果、凝
集免疫検定における凝集剤と反応することができる。抗
体試薬を、尿試験試料を含む反応液体中に適当に溶解さ
せる場合、この装置１０を時計回りに４５°回転させて
図４に示すようにその液体が観察口４２を覆うように
し、ここで分光光度的な読み取りを行い、これから時間
を関数とした濁度の変化を測定する。これら読み取り
と、既知量の蛋白質を含む尿試料を用いて準備したグラ
フとを比較することによって、試験試料中の蛋白質濃度
を決定する。
乾燥した抗体試薬を含むが、この試薬は、典型的には図
３中の１８ａおよび１８ｂで示される側面の１つか、或
いは、反応容器の内壁１６に付着している。この装置の
適当な回転は、反応溶液を部位２８における乾燥した抗
体試薬に接触させてその溶解を容易にし、その結果、凝
集免疫検定における凝集剤と反応することができる。抗
体試薬を、尿試験試料を含む反応液体中に適当に溶解さ
せる場合、この装置１０を時計回りに４５°回転させて
図４に示すようにその液体が観察口４２を覆うように
し、ここで分光光度的な読み取りを行い、これから時間
を関数とした濁度の変化を測定する。これら読み取り
と、既知量の蛋白質を含む尿試料を用いて準備したグラ
フとを比較することによって、試験試料中の蛋白質濃度
を決定する。
【００１４】このシステムにおいては、この時点で、ク
レアチン濃度の測定という分析操作の第二段階の準備が
完了している。適当なクレアチニン試薬、例えばＬｉＤ
ＮＢＡを、第二反応域３４に位置する第二の試薬部位３
２ａ上に乾燥させる。アルカリ性試薬を、試薬部位３２
ａとは反対側の容器の壁上にある第三の試薬部位３２ｂ
上に乾燥させる。これにより、それらは互いに物理的に
分離される。蛋白質検定が完了した後、その容器を右に
更に１３５°回転させて元の位置からひっくり返し、図
５に示すように、その緩衝液を、試薬部位３２ａにおけ
る乾燥したクレアチニン検出試薬と、試薬部位３２ｂに
おけるアルカリ性試薬と接触させてこれらを溶解させ
る。これは結果的に、緩衝液のｐＨを、クレアチニン検
出反応が起こるのに必要な約１１．５〜１２．５のレベ
ルに引き上げる。クレアチニン試薬と尿中のクレアチニ
ンとの相互作用から生ずるこの色の変化は、分光光度的
に測定される。これは、反時計回りに反応容器を１３５
°回転させ、かつ、観察口４２を介して読み取ることに
よりなされ得る。この読み取りの結果を、既知のクレア
チニン濃度で読み取ったものと比較する。
レアチン濃度の測定という分析操作の第二段階の準備が
完了している。適当なクレアチニン試薬、例えばＬｉＤ
ＮＢＡを、第二反応域３４に位置する第二の試薬部位３
２ａ上に乾燥させる。アルカリ性試薬を、試薬部位３２
ａとは反対側の容器の壁上にある第三の試薬部位３２ｂ
上に乾燥させる。これにより、それらは互いに物理的に
分離される。蛋白質検定が完了した後、その容器を右に
更に１３５°回転させて元の位置からひっくり返し、図
５に示すように、その緩衝液を、試薬部位３２ａにおけ
る乾燥したクレアチニン検出試薬と、試薬部位３２ｂに
おけるアルカリ性試薬と接触させてこれらを溶解させ
る。これは結果的に、緩衝液のｐＨを、クレアチニン検
出反応が起こるのに必要な約１１．５〜１２．５のレベ
ルに引き上げる。クレアチニン試薬と尿中のクレアチニ
ンとの相互作用から生ずるこの色の変化は、分光光度的
に測定される。これは、反時計回りに反応容器を１３５
°回転させ、かつ、観察口４２を介して読み取ることに
よりなされ得る。この読み取りの結果を、既知のクレア
チニン濃度で読み取ったものと比較する。
【００１５】クレアチニン検出試薬のリチウム塩の使用
は、そのクレアチニン検出試薬の溶解速度を増加させ、
また、この試薬のより濃度の高い溶液の生成を許容する
であろう。上記装置の第二反応域で使用される、この乾
燥したクレアチニン検出試薬とアルカリ性物質は、以下
のように調製される：
は、そのクレアチニン検出試薬の溶解速度を増加させ、
また、この試薬のより濃度の高い溶液の生成を許容する
であろう。上記装置の第二反応域で使用される、この乾
燥したクレアチニン検出試薬とアルカリ性物質は、以下
のように調製される：
【００１６】Ａ．乾燥したＬｉ−ＤＮＢＡ試薬の調製 ジニトロ安息香酸（ＤＮＢＡ，３．４ｇ）を水酸化リチ
ウム（６．２mlの２．５Ｍ溶液）と混合した。ＤＮＢＡ
のすべてを溶解させて、約４．７のｐＨを有するやや明
黄色の溶液を得た。この溶液を、０．５４mlの蒸留水で
希釈し、その混合物４．５mlをスクロース０．５グラム
と混合して１０％スクロース溶液を作成した。この混合
物の一部（１５μｌ）を、この試薬カートリッジの第二
反応域の部位３２ａに析出させ、かつ、６０℃において
乾燥時間１５分で作動させたトンネル乾燥機を用いて乾
燥させた。
ウム（６．２mlの２．５Ｍ溶液）と混合した。ＤＮＢＡ
のすべてを溶解させて、約４．７のｐＨを有するやや明
黄色の溶液を得た。この溶液を、０．５４mlの蒸留水で
希釈し、その混合物４．５mlをスクロース０．５グラム
と混合して１０％スクロース溶液を作成した。この混合
物の一部（１５μｌ）を、この試薬カートリッジの第二
反応域の部位３２ａに析出させ、かつ、６０℃において
乾燥時間１５分で作動させたトンネル乾燥機を用いて乾
燥させた。
【００１７】Ｂ．乾燥したアルカリ性試薬の調製 第二リン酸カリウムの三水和物（２２．８ｇ）を水酸化
カリウム（２．５Ｍ）と混合して、全量を水酸化カリウ
ムで１００mlにした。その混合物のアリコート４．５ml
を０．５ｇのスクロースと混合して１０％のスクロース
溶液を作成した。この混合物（１５μＬ）を試薬カート
リッジの第二反応域の部位３２ｂ上に析出させ、かつ、
６０℃において乾燥時間１５分で作動させたトンネル乾
燥機を用いて乾燥させた。
カリウム（２．５Ｍ）と混合して、全量を水酸化カリウ
ムで１００mlにした。その混合物のアリコート４．５ml
を０．５ｇのスクロースと混合して１０％のスクロース
溶液を作成した。この混合物（１５μＬ）を試薬カート
リッジの第二反応域の部位３２ｂ上に析出させ、かつ、
６０℃において乾燥時間１５分で作動させたトンネル乾
燥機を用いて乾燥させた。
【図１】様々な濃度の各種アルカリ溶液における、ＤＮ
ＢＡの溶解度を示した図である。
ＢＡの溶解度を示した図である。
【図２】本発明で使用される反応容器の、回転軸に対し
て直交する面で切断した図である。
て直交する面で切断した図である。
【図３】本発明で使用される反応容器の、回転軸に対し
て平行する面で切断した図である。
て平行する面で切断した図である。
【図４】図２の状態から、時計回りに４５°回転させた
反応容器の、回転軸に対して直交する面で切断した図で
ある。
反応容器の、回転軸に対して直交する面で切断した図で
ある。
【図５】図４の状態から、時計回りに１３５°回転させ
た反応容器の、回転軸に対して直交する面で切断した図
である。
た反応容器の、回転軸に対して直交する面で切断した図
である。
１０ 反応容器 ２１ 反応室 ２３ 供給室 ２４ 第一反応室 ２６ 液体放出貯槽 ２７ 貯槽ボディ ２８ 第一反応部位 ３４ 第二反応域 ４２ 観察口
Claims (10)
- 【請求項１】 アルカリ性状態下でクレアチニンと反応
して有色の反応生成物を形成する乾燥試薬として使用す
る、一価のカチオンと塩を形成し得る有機酸を、クレア
チニンを含有する水溶液と接触させ、かつ該溶液に溶解
させる、水溶液中のクレアチニンの検定方法において、
乾燥試薬として、該有機酸のリチウム塩を使用する方
法。 - 【請求項２】 該有機酸が、３，５−ジニトロ安息香
酸、ピクリン酸または１，４−ナフトキノン−２−スル
ホン酸である、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 該有機酸が、３，５−ジニトロ安息香酸
である、請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 該有機酸のリチウム塩がマトリックス物
質片上で乾燥した、請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 固体状の３，５−ジニトロ安息香酸を、
クレアチニンを含有する強アルカリ性溶液に溶解させ
る、水溶液中のクレアチニンの検定方法において、固体
状の３，５−ジニトロ安息香酸がそのリチウム塩の形態
である方法。 - 【請求項６】 尿中の蛋白とクレアチニンの検定方法に
おいて、 ａ）実質的に水平な回転軸を有する反応容器、 第一および第二反応域を有する分析反応チャンネル（こ
こで第二反応域は、第一反応域と所定の距離をおいて位
置付けられ、かつ、液体が通じる関係にあり、これらに
より、該反応チャンネルに導入された液体試験試料は、
これら反応域間の反応チャンネルに沿って、回転軸まわ
りの反応容器の回転によって、重力により移動され得
る）、 液体試験試料の単一方向の流れを反応容器に与えるため
の供給手段、および供給手段と液体が通じる関係にあ
り、供給手段中に液体試験試料を導入するための入口手
段を提供する工程（ここで、第一反応域は乾燥した抗体
試薬を有し、第二反応域はアルカリ性状態下でクレアチ
ニンと反応して有色の反応生成物を形成し得る乾燥した
有機酸のリチウム塩と、その再水和がクレアチニン／有
機酸反応のために必要なアルカリ性値を与える乾燥した
アルカリ性物質とを含有し、また反応容器は、第一と第
二反応域間に位置した観察口をも有する）； ｂ）蛋白質やクレアチニンを含有する疑いのある尿を、
液体試験試料として、供給手段を通して反応容器に導入
し、また、第一反応域中で乾燥した抗体試薬と特異的に
結合する高分子凝集剤を含有する反応液体を導入する工
程（これにより、抗体試薬が可溶化し、かつ、観察口を
通しての読み取りにより定量化し得る凝集反応をもたら
す）；並びに ｃ）反応容器をその回転軸まわりに回転させ、液体試験
試料／反応液体を共に、該有機酸のリチウム塩とアルカ
リ性物質に接触させ（これにより、それらを溶解し、該
有機酸のアニオンと液体試験試料中に存在するすべての
クレアチニンとの間に有色の応答が生ずる）、尿試料中
のクレアチニンの関数としてこの有色応答の強度を測定
する工程を含む検定方法。 - 【請求項７】 該有機酸が、３，５−ジニトロ安息香
酸、ピクリン酸または１，４−ナフトキノン−２−スル
ホン酸である、請求項６記載の方法。 - 【請求項８】 該有機酸が、３，５−ジニトロ安息香酸
である、請求項７記載の方法。 - 【請求項９】 該アルカリ性物質が、アルカリ金属の水
酸化物である、請求項６記載の方法。 - 【請求項１０】 アルカリ金属の水酸化物が、カリウ
ム、ナトリウムまたはリチウムの水酸化物である、請求
項９記載の方法。
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| US08/312559 | 1994-09-26 | ||
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| EP (1) | EP0703453B1 (ja) |
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| DE (1) | DE69523707T2 (ja) |
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| ES (1) | ES2167396T3 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004036225A1 (ja) * | 2002-10-15 | 2004-04-29 | Arkray, Inc. | クレアチニン測定用試験片 |
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| US5610073A (en) * | 1995-09-26 | 1997-03-11 | Bayer Corporation | Use of CO2 absorbant for stabilization of dried alkaline reagent in creatinine assay |
| US5998150A (en) * | 1995-10-02 | 1999-12-07 | Uab Research Foundation | Methods of measuring urinary myelin basic protein-like material |
| AT403325B (de) * | 1996-06-14 | 1998-01-26 | Lehmann Juergen | Teststreifen für urinanalyten und auswertefarbtafeln |
| US5733787A (en) * | 1996-06-17 | 1998-03-31 | Bayer Corporation | Method for the detection of creatinine |
| US6306347B1 (en) | 1998-01-21 | 2001-10-23 | Bayer Corporation | Optical sensor and method of operation |
| US6190612B1 (en) | 1998-01-21 | 2001-02-20 | Bayer Corporation | Oxygen sensing membranes and methods of making same |
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| US6446516B1 (en) | 1998-05-13 | 2002-09-10 | Bayer Corporation | Sample introduction device |
| US6107083A (en) * | 1998-08-21 | 2000-08-22 | Bayer Corporation | Optical oxidative enzyme-based sensors |
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| US7157056B2 (en) * | 1999-05-12 | 2007-01-02 | Bayer Corporation | Sample introduction device |
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| DE102008022609B4 (de) | 2008-05-05 | 2011-07-28 | Otto-von-Guericke-Universität Magdeburg Medizinische Fakultät, 39120 | Verfahren zum Nachweis des Vorkommens von Nierensteinen und/oder Entzündungen der ableitenden Harnwege |
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| CN105013546B (zh) | 2015-07-03 | 2017-12-08 | 艾康生物技术(杭州)有限公司 | 生物样品反应盒 |
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1995
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