JPS6037995A - 単クローン性抗ｃｅａ抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、癌胎児性抗原（以下ＣＥＡという）の抗原決
定基に対して特異性を有する単クローン性抗体、その製
造方法および用法に関する。

ＣＩＡは周知の癌特異的胎児性抗原であって、分子量約
８万±３万、糖と蛋白質との比約１：１の、ある種の糖
蛋白質である。癌特異抗原としてＣＩＡがヒトの消化器
のアデノカルシノーマに存在することは、ＧＯｌｃＬお
よびＦｒｅｅｄｍａｎによって報告された〔Ｊ、　Ｅ！
ｐ、　Ｍｅａ、　、　１２１．４３９　（１９６５）　
＋　１ｂｉｄ、　、　１２２゜４６７　（１９６５）　
〕。たとえば血中のＣＫＡ濃度をラジオイムノアッセイ
によって測定し、これを臨床的にヒトの癌の診断治療用
マーカーとする場合や各種の基礎医学研究用にＣＩＡが
重要であることは周知である。しかし、ある種のＣＢＡ
関連正常抗原が存在しており、これらはＣＩＡと免疫学
的交叉反応性を有しているので、ＣＩＡの癌特異性が不
明確になっている。

この種のＣＩＡ関連抗原の例は、非特異的交叉反応抗原
（以下Ｎ０人という）および正常糞便抗原（以下ＮＦＡ
という）である。ＮＣＡは分子量約８万±３万、糖含量
的２０％のある種の糖蛋白質で、たとえばヒトの肺や牌
に存在している［：　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　８ｃｉ、ＵＳＡ、　、　６９．２４９２　
（１９７２）　］。次にＮＦＡはさらにＮＦ’Ａ−１、
ＮＦＡ　−２および正常糞便交叉反応抗原（以下ＮＦＣ
Ａという）に分類される。ＮＦＡ　−２は分子量加万±
５万、糖と蛋白質との比約に１のある棟の糖蛋白質で、
その抗原性および理化学的性状はｉＡと極めて類似して
いる。ＮＦＡ　−１およびＮＦＣＡはＮＦｋ−２の分解
産物であると思われる。

ＮＦＡ　−１は分子量約２〜３万−ｍ会＊　Ｍｌｌ：（
偽の）１＼分子抗原であり、ＮＦＣＡは分子量約８万±
３万の１種の糖蛋白である。

他に、ヒトの正常糞便中に尖便非特異的交叉反応抗ｙＸ
（以下ｆ−１ｉＣＡ　という）という抗原が存在してい
る。ｆ　−ＮＣＡ　の抗原性は前記のＮＣＡのものと実
質的に同一で、ＣＥｉＡ　、　ＮＦＣＡおよびＮＦＡ−
２と交叉反応性を示す。従って、ヒトの正常糞便中には
、本発明の目的に関係のある４種のＣＩＡ関連抗原が存
在している。

癌ヤーカーとしてのＣＢｉＡの利用を改良するために、
ＣＥｉＡ関連抗原とＩＡとを正確に識別しなければなら
ない。このために、（ＪＡの抗原決定基に対して明確な
特異性を有する抗ＣＥＡ抗体の提供が従来試みられてい
る。しかし、公知の各種の多クローン性抗体には、反応
特異性が不明確であるという共通の欠点がある。すなわ
ち、これらの多クローン性ＣＢＡ抗体は、各種の抗体混
合物であって、ＣＪＣＡ分子上の多くの抗原決定基のは
七んど全部と反応性を有している。この欠点をなくする
ために、各種の単クローン性抗ＣＥＡ抗体が重要視され
ている。その理由は次の通シである。

（１１細胞融合という常法によって得られる単りローン
性Ｃ凡Ａ抗体は、唯一つの抗原決定基に対してのみ特異
性を有しているから、抗原との反応性が均一であろう。

（２）　単クローンの増殖によって、所望の均一性をも
つ多量の抗体が得られるであろう。

（３）　多槙類の単クローンを得ることができる。これ
らは全体として、公知の多クローン性抗ＣＥＡ抗体と同
様に広範囲の特異性を持つであろう。

このようにして、単クローン性抗ＣＥＡ抗体の製造が、
たとえば次の文献にあるように試みられている。

Ａｃｃｏｌｌａ、Ｒ，Ｓ、ｅｔ　ａユ、ＰｒｏＣ，１Ｊ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、。

７７、５６３　（１９８０）　；Ｍｉｔｏｈｅｌｌ、　
Ｋ＋Ｆ、　、　Ｃａｎｃｅｒ工ｍｍｕｎｏ１゜工ｍｍｕ
ｎｏｔｈｅｒ、ＩＱ、　ｌ　（１９８Ｑ　）　；Ｒｏｇ
ｅｒｓ、　Ｇ、’Ｉ’＋ｅｔ　ａｍ。

Ｂｒ、Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、　４３．１　（１９８１）
；　Ｋｕｐｃｈｉｋ、　Ｈ，Ｚ、　ｅｔａｌ、　Ｃａｎ
ｃｅｒ　１（Ｃ８，、４１，３３（１６（１９８１）。

これら既報の琳クローン性抗体の反応％異性ｔよ、次の
通りに費約さすしる。

（１）　Ａｃｃｏｌｌａら。　２つのハイプリドーマか
ら得られた抗体はＮＧＤ　（ＮＣＡと同等であると思わ
れる）と微弱に反応し、ＣＥＡと強く反応した。これら
の２つの抗体とＣｌとの反応には競合的阻害がみられな
かった。各抗体はＣＩＡ分子上の別の抗原決定基と反応
するようである。

＋２）　’　Ｍｉｔｃｈｅｌｌ。１つの抗ＣＥＡ抗体が
得られた。

これはＣＦＩＡと反応したがＮＣＡと反応しなかった。

ＣＥＡとの反応を多クローン性ヤギ抗ＣＥＡ抗体で阻止
できなかった。

（３）　ＲＯｇｅｒｌｉｌら。　１つの単りローン性抗
ＣＩＡ抗体が得られた。これは腫瘍組織からのＣ１１ｉ
Ａ標品と弱く反応したが、患者の血清中のＣＥＡと強く
反応した。

（４１Ｋｕｐｃｈｉｋ　０９個のクローンのうちの１個
の単りローン性抗ＣＩＡ抗体が検討された。その反応特
異性と多クローン性ヤギ抗Ｃｉ抗体と比較したところ単
りローン性抗ＣＦｉＡ抗体は、多クローン性抗Ｃ］ｌｉ
Ａ抗体と反応するＣＩＡ分子のうちの１部のＣＥＡ分子
とのみ反応した。

これらの公知の単りローン性抗ＣＲＡ抗体の反応特異性
についてのよりくわしい検索はなされていない。

この間に我々は、ある種のＣ１１ＪＡ連抗原すなわち前
記のＮＦＡ　−１、ＮＦＡ−２およびＮＦＣＡがヒトの
正常糞便に存在することを見出し、これらの分離に成功
したし％開明５６−４６８１９号、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ
ｓ、　。

玉、　７１３−７２０　（１９８１））。さらＫこれら
のＣＥＡ関連正常抗原を用いてＣＥＡ分子の抗原構造を
調べた結果、ＣＥＡ分子上の多くの抗原決定基を、たと
えは次の通りに分類し得ることを提案した。

（１）個体特異的抗原決定基 免疫抗原として用いた個々のＣＢ、Ａ標品にのみ見出さ
れる特異的な抗原決定基で、他の個体から得られたＣＥ
Ａ標品には見出されないもの。

（２１ＣＩＡ特異決定基 癌組織から得られたＣＢＡ標品に共通して見出される抗
原決定基であるが、ＮＦＡやＮＣＡなどＣＥＡ関連正常
抗原には見出されない。最も動物異性の：番層坩１σり
拉９４ルマ寥ムス− （３）　ＮＦＡ　−１共通決定基 ＣＲｉＡ％ＮＦＡ−２およびＮＦＡ−１の３者に共通し
て見出される抗原決定基で、ＣＩｎＡ分子上の主要抗原
決定基の１つである。

（４）　ＮＰＣＡ共通決定基 Ｃｆ１Ａ　、ＮＦＡ　−２およびＮＦＣＡの３者に共通
して見出される抗原決定基で、これもＣＦｉＡ分子上分
子製抗原決定基の１つである。

（５１ＮＣｈ共通決定基 ＯＦ；Ａ　、　ＮＦＡ　−２、ＮＦＣＡおよびＮＣＡの
４者に共通して見出される抗原決定基で、ＣＢＡおよび
関連抗原に最も広く共通して認められる抗原決定基であ
る。

本発明は、我々がひとの正常糞便から分離した上記の（
ＪＡ　Ｍ連抗原を用いることによって、単クローン性抗
ＣＥＡ抗体産生能を有する単クローンを、抗原との反応
性の観点において選別し得るという知見に基いている。

不発明の目的は、単クローン性抗ＣＥＡ抗体の製造方法
、この方法に用いられる単クローンおよびこの種の抗体
の用法を提供することにある。

本発明は、哺乳動物を所与のＣＦｉＡ標品（以下第１　
ＣＥＡという）で免疫することによシ、抗体産生能を有
する細胞を産生じ、こうして産生きれた細胞を哺乳動物
から採取し、採取された細胞を他の哺乳動物由来の株化
ｇｌＷＪ細胞と融合させ、得られた融合細胞（ハイブリ
ドーマ）をクローニングし、得られた単クローンを培養
し、培養物から所望の単クローン性抗体を回収する工程
からなる癌胎児性抗原（ＣＪ！８Ａ　）に対して持具性
を有する単クローン性抗体の製造方法に関する。本発明
の方法は、（イ）上記の所与のＣＦｔＡ　（第１　ＣＦ
ｉＡ　）標品をマーカーとして用いることにより、上記
融合細胞を、マーカー抗原と反応する抗体産生能の観点
から選別すること、督よび（ロ）上記の所与のＣＢＡ　
（第１１Ａ　）以外のＣＫＡ標品（以下第２　ＣＩＡと
いう）と正常成人由来のＣＪＩＣＡ関連抗原とからなる
群から選ばれた１　ｆｍ以上の抗原をマーカーとして用
いることにより、上記のクローニングによって得られた
単クローンを単クローンの産生する単クローン性抗体と
上記の１ｆｆｉ以上のマーカー抗原との反応性の観点か
ら選別することを％徴としている。

次に本発明により、上記方法によって産生された単クロ
ーン性抗体および上記方法によって選別された単クロー
ンが提供される。

実用的には、（ＪＡ関連抗原としてはヒト成人の正常糞
便由来のＮＦＡ−１、ＮＰＡ−２およびｆ−ＮＣＡが選
ばれ、選別は放射性物質で標識されたマーカーを用いる
周知のラジオイムノアッセイ法によって行なわれる。

本発明による単クローンから得られる単クローン性抗体
は、ＣＩＩＣＡ分子上の対応する抗原決定基との反応性
が均一かつ明確であるから、たとえばヒトの効の診断治
療のような臨床応用や各種の基礎医学研究用に有利に用
いることができる。

本発明の単クローンを、たとえｄ次のように常法によっ
て得ることができる。免疫される哺乳動物は、たとえば
マウス、ラット、モルモットのような小動物でも、ウサ
ギ、ヤギ、牛、馬のような大動物でもよい。動物を常法
により免疫する。たとえばマウスを、所与のＣＩＣＡ標
品すなわち第１　Ｃｌｌ１Ａ加μｔを含むフロイントの
完全アジュバントを用いた乳化液０．２ｄの皮下注射に
よって免疫し、５週間徒に食塩水０．２１中の回置のｃ
ｍＡの静脈注射によって免疫する。３８彼に常法により
動物の牌およびリンパ節細胞を採取する。採取された抗
体産生細胞と適当な腫瘍細胞〔たとえばＰ３−Ｘ６３−
Ａｇ８．６．５．３（たとえばＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−
ｕｌ　’）、８ｐ　２１０−Ａｇ１４．２１０、ＲＣＹ
３、Ａｇｌ、２．３　など〕とを１ｘ１０８抗体産生細
胞／ｙｄ対１−２ｘｌＯ″胛瘍細胞／耐の比で、すなわ
ち５対１から１０対１の比で混合し、常法によシ、たと
えばＨＶＪ　（仙台ウィルス）またはＰＥＧ　（ポリエ
チレングリコール）ヲ用いて融合する。ＨＡＴ培地を用
いて選別すると、正常細胞は死滅し、融合細胞が残存す
る。第１１Ａと反応する抗体産生能の観点において、融
合細胞を選別する。選別された融合細胞は抗（ｊＣＡ抗
体産生能を有する融合細胞である。これを常法によりク
ローニングし、得られた単クローンを、単りローー／Ｉ
４−１：ツこ１１＝−＾４ｉｌ＋Ｌｌ”！ｍＡ＊−Ｆｒ
Ｎｌ’ｉ’Ｒ１ＡＭシｋｌ−”１１４−＃＋＋＝ｒＬ／
７’＋Ｆ応性の観点から選別する。それ自体公知のラジ
オイムノアッセイ法によって実用的に選別することがで
きる。下記の実施例で用いた選別法はＦａｒｒの硫安沈
殿法（１？’ａｒｒ、　Ｒ，８，、Ｊ、工ｎｆ、　］）
１ｓ、、　１０３．２３９（１９５Ｂ　）　）である。

ＣＩＡ関連抗原の実用的な例は正常成人由来由来の訂Ａ
−１，ＮＦＡ−２およびｆ　−ＮＣＡで、これらの性状
は前記の通りである。これらのＩＡ関連抗原の製造は後
記参考例に記載されている。

後記実施例１において行なわれた選別の結果が第１表に
示されている。

第１表において、正常成人糞便由来のＣｌム関連抗ｇ　
ＮＦＡ　−２ｉｊ放射性ヨード標識され、次に単りロー
ン培養土清に加見られ、ラジオイムノアッセイが行なわ
れる。その結果、単り四−ン（クローンＡ％実施例１で
は約１０株）と単クローン（クローンＢ、実施例１では
約２００株）が選別される。

クローンＡの産生する抗体ムはＮＦＡ　−２と反応しな
い。クローンＢの産生する抗体ＢはＮＦＡ　−２と反応
する。抗体ＡはヒトのＣＥＡと反応し、正常成人糞便由
来のＣＩＡ関連抗原と反応しない。

１つ以上の第２　ｃｇＡ（実施例では４棟）を用いて、
同様の方法でラジオイムノアッセイを行なうと、クロー
ンムからクローンＡＩ（実施例１では８株）の産生ずる
抗体１は第１　ＣＩＡと反応する。

第２　ＣＢＡと反応せず、クローンＡ２の産生する抗体
２ｌ−Ｉｌｌおよび第２　ＣＢＡと反応する。

同様の方法でＮＩｌ′Ａ−１を用いて、ＩＪＦＡ　−２
と反応する抗体を産生ずるクローンＢを選別すると、ク
ローンＢ１およびＢ２か得られる。クローンＢ１１１Ｆ
Ａ−１およびＮＩＦＡ−２と反応する。クローンＢ２（
実施例１では約１００株）の産生する抗体Ｂ２Ｈ１ＮＦ
Ａ　−２と反応し、ＩＪＦＡ−１と反応しない。ＮＦＡ
−１の分子側°は小さいが、抗原活性は強いので、実施
例１では約７０株のクローンＢ１が得られた。

ｆ　−ＮＣＡを用いて同様の方法でクローンＢ２から、
クローンＢ２−１（実施仙ｌでけ約印株）とＢ２−２（
実施例１では約４０株）が選別される。クローンＢ２−
１の産生する抗体４はｆ　−ＮＣＡと反応しないが、ク
ローンＢ２−２の産生する抗体５けｆ−ＮＣＡと反応す
る。

所望により、ＩＩＦ’Ａ−２以外の他の抗原をクローニ
ングで得られたクローンの最初の選別に用いることがで
きる。たとえば、ＮＦＡ　−１を最初に用いることによ
シ、産生される抗体との”Ａ−１との反応性の観点から
単クローンを選別すること力；できる。

本発明によって選別された５柚類の単クローンから産生
される単りローン性抗ＣＢＡ抗体は、全体Ｌｌ−７″　
めＡｎ＆雀工αＭ−釣シ）壬が工ｇＧ、約ｌＯチがエｇ
ＡＫｊ／Ｒすることがわかった。

本発明による単りローン性抗ＣＢＡ抗体を各種の臨床的
用途および基礎医学研究用に有利に用いることができる
。たとえば、抗体２は臨床用ＫＧも有利であシ、抗体３
は血中ＣＩＡ濃度の測定に価値があると考えられる。な
お、本発明による単クローンを常法によって工業的規模
で増殖することができる。

本発明による単クローン性抗ＣＥＡ抗体の用法は抗体の
反応％異性および用途によって異なるが、代表的な用法
を次に例示する。

１０組織学的検索法 たとえば細胞の浮遊液または塗抹標本あるいは組織切片
のような細胞標品を本発明の単りローン性抗ＣＫＡ抗体
で３７゛Ｃで加分処理し、食塩水で十分に洗浄したのち
、螢光色素（ｔｅｔｒａｍｅ−ｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉ
ｎｅ　１ａｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅまたはｆｌｕｏｒ
ｅｓ−ｃｅｉｎ　１ｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔθ）で標
識した抗マウス免疫グロブリン抗体溶液で３７°Ｃで加
分処理し、螢光顕微鏡を用いて螢光陽性の細胞を検索す
る。

所望によシ螢光色累の代わシに抗マウス免疫グロブリン
抗体に結合されたペルオキシダーゼを用いる酵素抗体法
による検索も可能である。

■、血中ＣＩ！ｉＡ濃度測定法 本発明の単クローン性抗ＣＥＡ抗体による血中ＣＥＡ濃
度の正確な測定は、次に例示するよう忙、たとえは硫安
沈殿によるＦ’ａｒｒの方法、抗マウス免疫グロブリン
抗体を用いる二抗体法、ジルコニウムゲルを用いる２ゲ
ル法および同相抗体サンドイツチ法などによって行なう
ことができる。

（１）　抗マウス免疫グロブリン抗体による二抗体法の
例。

ヒトの血清（資）μｔをプラスチックチューブ（たとえ
ば栄研チューブＩＶｈ１：栄研化学社製；径９．８ｖａ
ｎ、長さ８　ｃｍ　）に入れ、Ｑ、５　％　ＢＡＡを含
むｕ、ｘｕＦ！ｊｉ：酸緩衝液（１）Ｈ６，Ｏ）　２０
０μｔを加えて希釈する。０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６
，０）でＩ倍に希釈した正常マウス血清を用いて、適当
に希釈された本発明の単りローン性抗ＣＩＡ抗体液刃μ
Ｌをとり、上記チューブに入れて３７°Ｃで加分反応さ
せる。後記参考例１記載の方製 法で調デされ１２６エで標識された適当なＣ［Ａ標品（
１，５ｎＳ’）の酢酸緩衝液溶液（５０ｐＬ　）をチュ
ーブニ加え３７°Ｃで１時間反応させる。次いで正常マ
ウス血清（Ｘ５０ｉ５０＃Ｌ）中の免疫グロブリンを充
分に沈降させうる量の抗マウス免疫グロブリン抗体を含
むウサギまたはヤギ抗マウス免疫グロブリン血清ｌＯＯ
μｔｆＣ反応混合液に加え４°Ｃで一夜反応させる。生
じた沈降物を遠心操作（３０００ｒ、　Ｉ）、　ｍ、／
　３０分）で落し、０．９％食塩溶液で沈降物を洗浄し
たのち、沈降物の放射性をガンマ−計測機で測定する。

ＣＥＡを１　ｎｆ　／　ｔｔｔｌから５０１１り／ｄま
での各濃度で含有する０、１　Ｍ酢酸塩緩衝液（子牛ガ
ンマグロブリン１．２ｆｙおよびＥＲＡ　０．５　％と
を含み、ｐＨ６，０）を検体血清と同様に処理し、標準
検量線を作製する。検体血清中のＣＥＡの測定値よシ血
中Ｃｌ１ｉＡ濃度を算出する。

正常人血清の測定値（正常値）は用いる単力　ｍ　＊ノ
ｊ斗＋＃　ｌ’Ｔｌｉ！＾　ｔか　ノＪ−１ｈ　４＆　
Ｋ−５ｌｙ　）　ｂ　６ｎ−１／　＋ｎなるので、簡単
には特定できないが、平均正常値に標準偏差（８，Ｄ、
）の２倍の値を加えた値以上の値を病的高値として悪性
腫瘍検出の判断に用いることが実用的である。

（２）同相抗体サンドインチ法の例。

この方法は最も高感度である。原理は、プラスチック製
ビーズまｆｃはチューブに本発明で得られた単りローン
性抗ＩＡ抗体の中の一種の抗体を同相−次抗体として吸
着結合させる。この同相−次抗体と検体中のＣＩＡとを
反応させたのち、−次抗体とは対応する抗原決定基の異
なった別の単りローン性抗（ＪＡ抗体を１２６１でヨー
ド化した標識二次抗体として反応させると、検体−ψの
ＣＢＡ　ｉに応じて標識二次抗体が結合する。既知量の
ＣＪｌｉＡを同じ揄作で測定して得た検ｔｔＸよシ検体
中のＣＪｌｉｊＡ量を算出する。

（ａｌ　固粕−次抗体の作製 一次抗体としてどのような特性をもった滋りローン性抗
ＣＪＩｌｔＡ抗体を選ぶかは測定系の目的忙よシ変わシ
得るが、最も普遍的な目的には、Ｃ１１ｉＡ分子上の最
も主な抗原部位と考えられるＮＦＡ　−１共通部分に向
けられた抗体３を選ぶとよいので、抗体３の例について
次に説明する。抗体３として分類された単りローン性抗
ＣＢＡ抗体の中からＣＥＡとの反応親和性（Ｋａ　）が
強いもの（少なくともＫａ≧１　ｘ　１０’　ｆ”　）
を選ぶ。Ｋａの測定は次の如く行なう。抗体ＢＩｉｉｉ
品の一定う（たとえば１０μ？）に最高２００μ２まで
のいろいろな量の　ｚＴｔｌｌｔｔたｃＢＡ（０，０１
Ｍ１酸緩衝食塩水（Ｊ３．Ｂ、Ｓ、）ｐＨｓ、ｏ　ｉ正
常ウサヤ血清（１チ）および””ｓ　（０，０５％）を
含む〕を加える。各混合液を３７°Ｃ１１８時間保温し
た後、それぞれ７５　％飽和硫安液（４００μｔ）を加
え、４°Ｃに１時間保ち、次に遠心処理（１８００Ｘ、
？／３１Ｊ分間）により上滑を除去する。

沈降物を５０％飽和硫安溶液で洗浄する。上滑（２００
μｔ）および沈降物の放射活性をガンマカウンターを用
いて測定する。同様の方法をくり返し、結合されたＣＥ
Ａと遊離ＣＥＡとの比をめ、これから常法［Ｓｔｅｗａ
ｒａ　Ｍ。

Ｗ、　＆　Ｐｅｔｔｙ　Ｒ，Ｋ、、工ｍｍｕｎｏ１．．
２２．７４７　（１９７２））により反応親和性（Ｋ＆
）を算出する。こうして得られた高親和性の抗体３標品
をラウリル硫酸ナトリウム（０，０１％）　、　ＥＤＴ
Ａ　（０，０５チ）を含む０．００１　Ｍリン酸紗衝液
（ｐＨ６，０）でたとえは５００倍に希釈しく抗体濃度
として５〜１０μＳ’／１ＩＬｔ程度）、これをプラス
チックビーズまたはチューブのコーチングに用いる。

固相マトリックスとしては各種のプラスグーツク製チュ
ーブやビーズを用いうるが、たとえば直径約６ｆｌのポ
リスチレンビーズ（たとえば米国、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ
　Ｐｌａｓｔｉｏ　Ｂａ１１社ｍ）を十分洗浄したのち
、上記単りローン性抗ＣＦｉＡ抗体（抗体３）溶液に浸
し、室温に一夜静置する。ビーズを２回蒸貿水で洗浄し
たのち、０．００１　Ｍグリシ／塩酸緩衝液］）Ｈ２，
３で処理し、さらに蒸留水で２回洗浄したのち、０．５
Ｍの食塩と０．５　％ウシ血清アルブミン（ＢＡＡ　）
とを含む０．１　Ｍリン酸緩衝液中に３時間浸し、最後
は真空乾録して冷所に保存する。

（１）ｌ　標識二次抗体の作製 標識二次抗体として例を用いるかにより、得られる結果
は著しく異なる。後記第２表かられかるように、たとえ
ば抗体２を二次抗体として用いることによって得られる
ＣＩＡ測定系は、癌組織中のＣＢＡとのみ反応するが、
ＮＦＡやＮＣＡとは反応しない、最高の癌特異性をもつ
系であるが、抗体５を二次抗体として用いることによっ
て得られる測定系は、Ｃ１と共にＮＦＡ　−１以外のす
べての関連抗原をも測定し得る系である。また抗体３と
して同定される各種抗体のなかでもその抗体と反応する
抗原決定基が一次抗体の抗原決定基と同一のものは二次
抗体に用い得ないが、抗体３４ＣＭする抗体のなかでも
、−次抗体の対応する抗原決定基以外の抗原決定基と反
応するものであれは、二次抗体として用いることができ
る。次の例は、抗体２を用いた最高の癌特異性を有する
測定系である。

抗体２として同定された各樺抗体のなかから、ＣＫＡと
の反応親和恒数の最も高い（少なくともＫａ≧１ｘ１０
９Ｍ−”　）ものを選ぶ。Ｃ１ｌ！Ａとセファロース４
Ｂを結合（１０■／１．Ｏｆドライゲル）させた（ＪＡ
吸着剤を用いて、上記単りローン性抗ＣＢム抗体をＩＦ
ｊ！４的に精製しく参考例２参照）、得られた抗体標品
を公知のクロラミンＴ法（：　Ｈｕｎｔｅｒ　＆　Ｇｒ
ｅｅｎ−ＷＯＯ（１，１９６２，Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏ
ｎｃｌｏｎ　）　１９４．４９５　）により１２′５１
で標識し、放射活性の強さ約５ｎＣ１／ｎｐ抗体の標識
抗体を得る。

ｔａ）　ラジオイムノアッセイ 検体として得たヒト血清（または血漿）（資）μＬをプ
ラスチック製試験管（たとえは栄研チューブ９．８　ｘ
　８ｏｍｒ　）　Ｋとシ、ＢＡＡ　（０、，５ｑｂ）を
含む０．１　Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ５，Ｑを２００μＬ加え
、これに上記の抗ＣＦｌｉＡ抗体を結合したビーズ１個
を入れ、室温で試験管を回転させながら４時間反応させ
る。反応抜反応液を吸引除去し、０．９チ食塩水１　ｍ
ｌで１回洗浄し、抗体２をヨード化して得た標識二次抗
体液（１％　Ｂ８Ａを含む０．０５Ｍ　）　！Ｊ　ス塩
酸緩衝液で約６００　ｎＣ１／　ｇｄｊに希釈した標識
塩水で２回洗浄したのち、ビーズの放射活性をガンマー
カクンクーで測定する。

検量線作製用として、ｙＭ製ｃＥＡを１１７１．３Ｍ’
／ＴＲＩ！、１０　ｎｆ　／　ｍｌｉ　、　３０　ｎｆ
　／ｗｉｔ　オｊび１００　ｎｆ　／　ｗｅ　（Ｄ　濃
ｇ　ＶＣｌｌ、２　％　ｆｙ　シカンマｒロブリンおよ
び０．５　％　Ｂ８Ａを含む０．ＩＭ酢酸緩衝液’ＰＨ
６，０で調製した各標準溶液を用いる。各標準液刃μｔ
をとシ、上記検体の処置と同様の操作によって、抗体で
コーチングされたビーズおよび放射性ヨードで標識され
た二次抗体とそれぞれ反応させる。このようにして、各
標準溶液の放射活性（Ｂｃｐｍ）得る。ＢｃｐｍからＣ
ＩＡを含まないコントロールの値Ｂ′を差し引いたＥ　
−Ｂ’を算出し、対応するＣＢＡ　９度をプロットして
検量線を描き、これを用いて検体中のＣｌ濃度を算出す
る。

抗体２を標識二次抗体と用いた本例では、正常人血清ま
たは血漿との反応は弱い。さらに正常人のＣＫＡ濃度の
平均値は用いる抗ＩＡ抗体標品の特性たとえばその親和
恒数Ｋａによって著しく異なυ、具体的数値を容易に特
定できない。しかし実用的には正常人の平均値に標準偏
差（Ｓ、Ｄ、）の２倍の値を加えた値以上の値を病的高
値として悪性腫瘍検出の判断に用いることができる。

（３）以上に述べたように本発明は、ＣＢＡおよびＩＡ
関連抗原の濃度測定法を提供する。この方法は、本発明
による単りローン性抗ＣＢム抗体を放射性物質で標識し
てマーカーとすることを％徴としている。この方法によ
って、従来の多クローン性および単りローン性抗ＣＫＡ
抗体を同じ目的に用いる場合に比較して、所望の抗原の
濃度を−そう正確に測定することができる。

癌の診断治療のほかに、本発明による単クローン性抗Ｃ
ＥＡ抗体を、たとえば、細胞の悪性変化に伴ガう遺伝子
発現のｍ１児期への先祖帰り現象としてのＣＨＡ産生や
Ｃ１１ｉＡの生物活性および分子構造の解明に用いるこ
とができる。

下記の本発明の実施例において、Ｐａｒｒのラジオイム
ノアッセイ法は次の通り行なわれた。

”””ｌｊ龍サすタＣＩＡ標品（５−１０ｎｆ　＋　５
）　ｉｔＬ　）および単クローンの培養上清（５０μｔ
）を９６ウエルのマイクロタイタープレートの各ウェル
に入れ、よく混合した。３７゛Ｃで１時間静置した後、
飽和硫安溶液（１００μｔ）を各ウェルに加え、さらに
３７°Ｃで１時間静置した。次に反応混合物を遠心処理
（２０００ｒ、　ｐ、　ｍ、／　３０分間）シテ上清を
分離し、ソノ１００μｔの放射活性をガンマカウンター
で測定した。

−ン性抗ＣＥＡ抗体産生能をもつ融合細胞が同定された
。

実施例１ 約５週令のＢＡＬＢ　／　ｃマウス（８ＰＦマウス：靜
岡県実験動物農業協同組合より入手）２匹をＣＥｉＡ　
（参考例１の方法で［１ｌｉｆｉ）で免疫した。すなわ
ち各動物按ついて、初回□□□μ２のＣＢＡを７０イン
ドの完全アジュバン）（Ｄｌｙｃｏ社［）を用いた乳化
液０．２ｒｕｅと共に腹腔内投与し、５週間後に同量の
Ｃ１１Ａ（食塩水０．２４中ＣＥ１２Ｄμｔ）を各マウ
スの静脈内に投与した。その３日後に動物を殺し、牌お
よびリンパ節より抗体産生細胞Ｃ類リンパ球）を採取し
た。約１ｘｌＯ’個の類リンパ球とｌＸｌ０’個のアゾ
グアニン制性マウス骨髄腫由来株化細胞Ｐ　３−　Ｘ６
Ｂ−Ａ（ｇＢ−ｕ　ｌ　［！ａｌｔｏｎ、　Ｄ、　１．
ａｔ　ａｌ、、　Ｃｕｒｒ、　Ｔｏｐ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　８１．１
　（１９７８）　）と混合した。４５　％（ｖ／ｖ）ポ
リエチレングリコール４０００　（米国シグマ社＃　）
　１　ｍｌを混合物に滴下し、３７°ＣＶＣ７分間保ち
、その後Ｄ−ＭＢＭ　（日永製薬製）１５１を混合ルを
希釈した。融合細胞をＤ−ＭＥＭ　（３０ｄｌ　）で洗
い、１０チウシ胎児血清（Ｆｅ２　）　（米国Ｇｉｂｃ
ｏ製）、ペニシリン＋’ｌＯｏ　単位／ｍ　）　、！：
　ｐｉンタマイシン（５０μｔ／ｌｄ　）とを含むｐ　
−ＭＥＭ　（１００ｍ＃　）中に浮遊させた。細胞浮遊
液（各１１）を％のウェルに入れ（各かウェルのミクロ
タイター板使用）、炭酸ガス存在下で３７°ＣｔＩＣ−
夜放置した後、ＨＡＴ培地（４Ｘ　１０−７Ｍのアミノ
プテリン、１．６Ｘ１０＝Ｍのチミジンおよび１ｘｌＯ
−’Ｍのヒボキサンチンを含む培地、ｐＨ７）各１１を
各ウェルに分注し、次に培地の半分を２日おきに新しい
ＨＡＴ培地と取りかえた。１１日目に培地の半分をＨＴ
培地（上記ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いたもの
）と取りかえ、次に２日おきに培地の半分を１０％ＦＣ
Ｂを含むＤ　−Ｍ］ｌｉＭと取りかえた。

はとんど全部（９８％以上）の培地で融合細胞の発育が
認められた。培地の上清を各ウェルから採取し、前記の
第１　ＣＩＣＡを用いるＦａｒｒの硫安沈殿法によって
抗ＣＥＡ抗体を産生する融合細胞（ハイブリッドーマ）
を選別した。次に抗ＣＦｌｉＡ抗体産生能を有すると認
められた融合細胞を次のように限界希釈法によって単ク
ローン化した。

１０チのＦｅ２　（ウシ胎児血清）を含むＤ−ＭＢＭで
融合細胞を３細胞／１になるように希釈し、各０．２ｄ
をミクロタイタープレートの各ウェルに入れた。

４凝 ｘｗＭ照射された若いＢＡＬＩＢ１０マウスの胸Ｖ細胞
く約５ｘｌＯ’細胞／ＩＩｔｌ）を含むＤ−ＭｌｊＭを
用いて３７°Ｃで２週間培養後、ウェル中で増殖する細
胞を単クローン融合細胞として同定し、さらに限界希釈
法を〈シ返し行なうことによシ、単クローン性を確実に
した。

こうして培養上清中に約１０ｎｆ／ｄ以上の抗Ｃｌ１ｉ
Ａ抗体産生能をもつ単クローン性融合細胞が得られた。

実施例１で用いられた第１　ＣＦ！Ａは稜記参考例１記
載の方法で得られたものであるが、所望によりその他の
適当なＣＩＡ標品を同じ目的に用いることもできる。２
匹のマウスより通常加−加個の単りローン性抗ＣＲｉＡ
抗体産生融合細胞が得られる。

上記操作を士数回繰シ返して得られた約３００株の抗Ｃ
ＩｊＡ抗体産生融合細胞の培養上清と放射性式−ドで標
識したＣｌｌ１Ａ、ＩＩＩＦム−２、ＮＦＡ−１および
ｆ　−ＮＣＡとの反応性をＦａｒｒの硫安沈殿法による
ラジオイムノアッセイによって検索した。結果を前記の
第１表に示す。

実施例２ 実施例１の方法で得られた抗体ｌから５まで（第１表参
照）を別々に第１ｃＩＡ、第２　ＣＥＡおよび正常人糞
便由来のＣＩＡ関連抗原すなわちＮＦＡ　−１、ＮＦＡ
　−２およびｆ−ＮＣＡを用いたＦａｒｒのラジオイム
ノアッセイ法によって調べ、全抗体１から５までと、上
記全抗原との反応性を解明した。その結果を示す第２表
において、ｒ＋Ｊ　ｒ−Ｊは反応性の有無を現わしてい
る。

第２表　単りローン性抗ＣＩＡ抗体とＣ１！ｉＡおよび
Ｃ１１ｉム関連抗原との反応性 抗　原　抗体　１２３４５ ヒトＣＢＩＡ第１”　＋　＋　＋　＋　＋第ｚ”　−＋
　＋　＋　＋ 正常関連抗原 ＮＦＡ　−１−−＋　−− ＮＦＡ−２−−＋　＋　＋ ｆ−１ＪＣＡ　−−−−＋ （注）　ネ動物免疫用Ｃ］ｉＡ 中中第１（ＪＡ以外のＣＢＡ 第２表から本＠明の単りローン性抗ＣＩ［ｆＡ抗体が次
の反応特異性を有していることがわかる。

（１）　全部の抗体１−５は第１　ＣＢＡすなわち動物
の免役に用いられたＣＩＩＣＡと反応する。

（２）抗体１は第１　ＣＩＩＩＩＡのみと反応する個体
特異的抗体である。本抗体は個体ごとの尚の診断治療に
有用であると考えられる。

（３）抗体２は第１　ＣＢＡおよび第２　ＣＥＡと反応
するが、すべてのＣＢＡ関連正常り便抗原すなわちＮＦ
Ａ−１、ＮＦＡ　−２およびｆ　−ＮＣＡと反応しない
。なお実施例１では別々の患者から得られた４つのＣＦ
ｉＡ標品を第２　ＣＩＡとして用いた。本抗体は抗ＣＲ
Ａ特異抗体であって、最高の癌特異性゛を有するから、
各種の臨床用（たとえば癌の診断確定、放射性物質や抗
癌剤を癌組織に送るための担体など）や基礎医学研究用
等普遍的ガ用途に使用することができる。

（４）抗体３は第１ｃＩＩ！ｉＡオｊび第２　（ＪＡと
反応するほか、ＮＦＡ　−１およびＮＦＡ−２とも反応
するので、実用的価値のある抗体である。また抗体３産
生能をもつ単クローンを他の抗体産生能をもつ単クロー
ンよりも簡単な方法で選別することができる。

（５）他の抗体すなわち抗体４．５も、従来の多クロー
ン性および単りローン性抗ＣＫＡ抗体とくらべて、より
明確な反応特異性と均一性とを有している。

実施例３ 抗ＣＩＡ抗体産生融合細胞なりＡＬＢ　／　ｃマウスの
腹腔内に移植して単りローン性抗ＣＢＡ抗体を生産した
例。

市販（静岡系実験動物農業協同組合より入手）ＢＡＬＢ
／ｃマウス（５〜６週令、雌または雄）を試験動物とし
て用いた。各マウスの腹腔Ｋ　Ｏ，５ｍのプリスタンを
投与し、７−１０日後に５Ｘ１０’〜１０′ｙ個／ｄの
単クローン性融合細胞（実施例１の方法で得たもの）を
含むＤ−ＭＩｌｆＭ　Ｏ，５ｄを同じく腹腔内に注射し
た。７〜１０日のち十分に腹水が貯留したマウスから腹
腔穿刺にて腹水を採取し、以後２日おきに５回腹水を採
取したのち、マウスを殺して全採血した。得られる腹水
量は融合細胞の性状により異なシ、約２　ｍｌから２０
−であったが、平均約１０ｍが得られた。各動物の腹水
および血清中に含まれる単りローン性抗ＣＩＡ抗体の濃
度も融合細胞の性状により異なり約１■／１から約１０
■／ｄであり、得られる抗体の量も２〜３′＃ｖから１
１００ＷＩ以上とかなシの差が認められた。

参考例 下記の参考例において、加圧風乾法による溶液の濃縮は
次の方法によって行なわれた（以下風乾法という）。風
乾されるべき浴液を数本のセロファンチューブに入れた
。たとえば溶液（３Ｌ）を８−９本のチューブ（米国ビ
スキング社製、１８／３２、長さ１５０ｃｒｎ）に分注
し、チューブの上部を適当な導管を介して、たとえば送
風機に連結した。チューブを垂直に支え、下方約％を脱
塩水または適当な緩衝液を満たした容器に浸漬し、残り
の部分に扇風機からの風を尚てた。

参考例１ 本明細病記載のＣ］ＩｉＡ標品は、特記しない限シ、次
の方法によって作成された〔資料。特開昭５６−４７７
６２号公報〕。

ヒトの大腸幅計転移巣１２０ｆに生理食塩水７００１を
加えてすりつぶし、遠心処理（９０００ｒ、　ｐ、　ｍ
、７４０分間）により上清を得た。上清７１０ｍ１ｍ６
０％過塩素酸溶液８０−（過塩素酸濃度０．６　Ｍ　）
を加え、生じた沈殿を遠心処理（９０００ｒ、　Ｉ）、
　ｍ、／　４０分間）により除去し、得られた上清を一
夜流水で透析し、過塩素酸および透析性不純物を除去し
た。透析内液をセロファンチューブ（ビスキングｆｉ、
１８／３２、長さ１５０ｃｒｎ）３本に分注し、前記の
風乾法により合Ｉｔ　８−に濃縮した。濃縮液を遠心処
理（１５０００ｒ、　Ｉ）、　ｍ、７３０分間）するこ
とにより、ＣＦｉＡ粗抽出液を得だ。

セファロース４Ｂ（スエーデン国、ファルマシア・ファ
イン・ケミカルズＡＢ製）のカラム（２，６×１７１ｃ
ｒｎ）を０．０５　Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５
，２）で洗浄し、上記のＣ凡Ａ粗抽出液７．５−を負荷
し、上記と同様の緩衝液で溶出した。カラムの溶媒容量
と同じ位置に溶出する分画４Ｂ−１のほか、それぞれ２
．１．２．５および２．７倍の位置に溶出する分画４Ｂ
−２ないし４Ｂ−４が得られた。（ＪＡの大部分を含む
分画４Ｂ−２を回収し、前記の風乾法により濃縮液（ａ
、５ＩＩＬｌ）を得た。セファロース６Ｂ（スエーデン
国、ファルマシア・ファイン・ケミカルズ製）のカラム
（１，９ｘ　１４５　ｃｍ　）を上記と同様の緩衝液で
洗浄し、上記の濃縮液３，５１を負荷し、同様の緩衝液
で溶出し、カラムの溶媒容量の１．６倍の位置に非対称
形のピークが出現した。溶出の初期に得られる分画６Ｂ
−１（約２０ｍＡ）は高分子量の不純物を含み、終りに
得られる分画６Ｂ−３（約％）はＮＣＡ　（非特異的交
叉反応抗原）を含んでいた。全体の約％に相当する中間
部（約６０ｍｇ）を回収して集め、風乾法によって分画
６Ｂ−２（３ｍｌ　）　ヲ得た。セファデックスａ　−
２００（スエーデン国、ファルマシア・ファイン・ケミ
カルズ製）のカラム（１，９ｘ　１４５　ｃｍ　）を上
記と同様のリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄した後、分画
６Ｂ−２（３ｄ）を負荷して、同様の緩衝液で溶出した
ところ、カラムの溶媒各賞の約１．２倍の位置に対称形
のピークが出現した。このピークの中間％に位置する分
画（約４５ｄ）を回収して集め、風乾法によシ濃縮した
。このｍＩＩＩ液から精製されたＣＢＡ　（５０■）が
回収された。その高純度であることが、たとえば免疫電
気泳動法（ウサギ抗体使用）によって確認された。精製
されたｃＢｈ　Ｉｄ−８の糖蛋白質であって、分子蒼：
は約肋万±８万、糖と蛋白質との比は約１：１、紫外線
吸収ス械りトルにおける極大吸収は２７７ｎｍ、小さな
肩部が２８３ｎｍＫ見られた。

参考例２ 本明細書記載のＩＡ関連正常抗原すなわちＮＦＡ−１、
ＮＦＡ　−２およびｆ−ＮＣＡは次の方法によって得ら
れた（資料。特開昭５６−４６８１９号公報）。

成人の正常轟便２５０１を０．６Ｍ過過塩素浴溶液２５
００−加え、よくかくけんし、ガーゼで濾過し、食物残
渣などの不溶解物を除いた。これを遠心処理（７０００
ｒ、　ｐ、　ｍ、／　３０分間）して得た上清を流水で
一夜透析して、過塩素酸および透析性不純物を除いた。

透析内液を９本のセロファンチューブ（／ビ メスキング製、１８／３２、長さ１５０　ｃｒｎ）に分
注し、前記の風乾法で合計３０ｄまで濃縮した。同様の
操作を４回くり返すことにより、合計１２０ｄの粗抽出
液を得た。このものは合計的１０■の所望のＣＥＡ関連
正常抗原を含有していた。

特異抗ＣＥＡ抗体と結合された抗ＣＩＤＡ抗体吸着剤（
１（１９，後記の方法で製造された）を上記の粗抽出液
に加え、４°Ｃで冴時間反応させた。反応液を除去した
後、冷硼酸緩衝液（ＰＨ＝　８．Ｏｆ　０．０１　Ｍ硼
酸緩衝液１．１５ＭのＮａＣ２を含む）で洗浄し、グリ
シン塩酸緩衝液（０，１７５Ｍ　＋　ｐＨ＝　２．３　
；　２００　ｄ　”）で溶出した後、グリシンＮａＯＨ
緩衝液（１，Ｑ　Ｍ　；ｐＨ＝９）で中和すること拠よ
シ、粗ＣＢＡ関連抗原（乾燥Ｎ、量９Ｗ）を含む溶液を
得たこの溶液を上記の風乾法で１．２−まで濃縮し、セ
ファロース６Ｂ（スエーデン国、ファルマシア・ファイ
ン・ケミカルズ製）のカラム（１，３ｘ　８ｏｃｍ　）
　ＩＣ負荷した。リン酸塩緩衝液（０−０１Ｍ　；　ｐ
Ｈ５，Ｏ：　０．１５　Ｍ　ＮａＣｔヲ含ｂ　）で溶出
し、各１ｄの分画を試験管に分取した。試験管番号６０
−７５および８１−９５をそれぞれ集め分画１と分画２
とした。

分画１を約１ゴに濃縮し、セファデックスＧ−２００（
１００ｄ）のカラムに負荷し、前記と同様のリン酸塩緩
衝液で溶出し、各１−の分画を試験管に分取した。′！
′Ｉ４製ＮＦ’Ａ−２を含む試験管番号３０−４０を集
め濃縮した。この濃縮液自体を精製ＮＰＡ−２の標品と
してそのまま用いることができる。こうして得られ九Ｎ
ＦＡ−２は一槙の糖蛋白質であって、分子蓋約加万±３
万、糖と蛋白質との比的１＝１、紫外線吸収スペクトル
において極大吸収は２７７　ｎｍにある。本品のアミノ
酸組成はＣＥＡのものと極めて類似し、ＮＦＡ−２のＮ
Ｈ，末端アミノ酸配列は少なくとも１１位までは（ＪＡ
Ｏものと同一である。

ジエチルアミノエチル・セルロース・クロマトグラフィ
ーによって、分画２から褐色色素を除き［Ｃａｎｃｅｒ
　ＲθＢ、、　４１．７１３．　（１９８１）参照〕、
残りの溶液に、後記の抗ＣＥ抗体吸着剤３．５ｍＪを加
えた。混合物を４°Ｃで２日間反応させた。吸着剤を回
収し、よく洗浄し、次にグリシン塩酸緩衝液（０，１７
５Ｍ　＋　ｐＨ＝　２．３３２０ｄ　）で溶出し、次に
グリシンＮａＯＨ緩衝液（Ｉ　Ｍ　＋　ｐＨ＝　９　）
で中和し、そのＨｎ、Ｂ、ｓ、に対して透析し、透析内
液を風乾法で濃縮した。この濃縮液は精＃ＮＣＡ（乾燥
室ｉｌｌ■）を含み、それ以上ｎｍ製しなくても、本発
明の目的に用いられる。こうして得られたｆ−ＮＣＡｉ
ｊ−柚の糖蛋白質で、分子量約８刀±３万、糖含量約加
チである。本品のＮＨＩＩ末端ア電ノ酸配列のうち、少
なくとも及位まではＣＥＡと同一である。ｆ−ＮＣＡの
理化学的性状は、たとえば肺や牌に存在するＮＣＡのも
のと実質的に同一である。

上記の抗ＣＥ抗体吸着剤に吸着されなかった物質を含む
溶液を０．５１に濃縮し、セファデックスＧ　−１００
スーパーファイン（スエーデン国、ファルマシア・ファ
イン・ケミカルズ＃）のカラム（１，３ｘ　４３．４　
ｃｒＩＴ）　Ｋ負荷し、前記と同様のリン酸塩緩衝液（
０，０１Ｍ　＋　ｐＨ５，Ｏｊ　０−１５　Ｍ　ＮａＣ
Ｌを含む）で溶出し、試験管に各１−ずつ分取した。試
験管５ 番号４５−５５（分画ａ）および６５−＃　（分画ｂ）
をそれぞれ回収して集めた。セファデックスＧ−１００
スーパーフアインの同じカラム（１，３ｘ　４３．４ｃ
ｒｎ）を用いて、分画ａおよびｂをそれぞれ再度クロマ
トグラフ処理した。このようにして、分１ｉ１ｉｌａか
ら精製Ｎ１１’ＣＡ、分画すから精１ｉ１ｉ１ＮＦ’Ａ
−１（各乾燥重量ｏ、ｓｍｙ）が得られた。これらはさ
らに精製することなく、本発明の目的に用いることがで
きた。こうして得られたＩＪＦＡ　−１は一種の糖蛋白
質で、分子黄約２万ないし３万、糖含量約１３チである
。

ＮＪ″Ａ−１のアミノ酸組成はＣｇＡのものに類似であ
るが、しかしフェニルアラニン、リジンおよびプロリン
のようないくつかのアミノ酸ではわずかでｔまあるが有
意な差違が見られた。しかし、ＮＦＡ−１のＮＨ２末端
アミノ酸配列はＣＩ！ｉＡ、　ＮＦＡ−２またはＮＣＡ
のものと全く異なっている。

前述の抗ＣＥＡ抗体吸着剤および抗ＮＣＡ抗体吸着剤は
次の方法で得られたものである。

参考例１の方法で得られた（ＢＡ標品（乾燥重量ｌＯ■
）を常法によりＣＮＢＲセファロース４Ｂ（乾ｆｆｌケ
ｋ　１９　ｉスエーデン国、ファルマシア・ファイン・
ケミカルズ！１１！りと結合させてＣＩＡ吸着剤を得た
。これを抗ＣＥＡ抗体（５０ｄ）と４°Ｃで３日間反応
させた。この抗血清をつくるために、任意のＣＭムを用
いることができる。抗ＣＥＡ抗体を結合したＣＦＩＡ吸
着剤を回収し、蛋白への出現を認めなくなるまで冷Ｂ、
　Ｂ、Ｓ、で洗浄し、次にグリシン塩酸緩衝液（各１０
ｍ１；　０．１７５　Ｍ；　ｐＨ＝２−３　）で５回溶
出した。溶出されだ液を集めてグリシンＮａＯＨ緩衝液
（ＩＭ；ｐＨ＝９）で中和し、次にＢ、　Ｂ、　８．に
対して４°Ｃで一夜透析した。透析内液を１０ｄまで濃
縮した。この液は特異的多クローン性抗ＣＩＩｔＡ抗体
５０１１ｖを含んでいた。上記の方法を２回〈シ返すこ
とによって得られた濃縮液２０ｄは、特異的に精製され
た多クローン性抗Ｃ１１ｆＡ抗体ｌｏｏ■を含んでいた
。こうして得られた多クローン性抗ＣＦｆＡ抗体１００
■をＣＮＢＲセファロース４Ｂ（１ｏｔ；スエー≠ン国
、ファルマシア・ファイン・ケミカルズ！Ｉｆりと常法
によって結合した。これによって、特異的に精製された
抗Ｃ１１ｔＡ抗体１００〜と結合された所望の抗ＣＥＡ
抗体吸着剤が得られた。

抗ＣＥＡ抗体の代わりに抗ＣＥ抗体を用いて、上記の方
法をくり返すことＫよって、セファロース４Ｂと結合さ
れた抗ＮＣＡ抗体吸着剤が得られる。

特許出願人　松　岡　雄　治

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）　Ｉｌｌ乳動物を所与の尚胎児性抗原で免疫する
   ことによシ、抗体産生能を有する細胞を産生じ、こうし
   て産生された細胞を哺乳動物から採取し、採取された細
   胞を他の哺乳動物由来の株化腫瘍細胞と融合させ、得ら
   れた融合細胞をクローニングし、得られた単クローンを
   培養し、培養物からＦ９ｒ望の単り四−ン性抗体を回収
   する工程からなる癌胎児性抗原に対して特異性を有する
   単クローン性抗体の製造方法において、（イ）上記の所
   与の癌胎児性抗原をマーカーとし２て用いることにより
   、上記融合細胞を、マーカー抗原と反応する抗体産生能
   の観点から選別すること、および（ロ）上記の所与の幅
   胎児性抗原以外の第２の勲胎児性抗原と正常成人由来の
   幅胎児性抗原関連抗原とから々る群から選ばれたＩＮ１
   以上の抗原をマーカーとして用いることにより、上場己
   のクローニングによって得られた単クローンを、単クロ
   ーンの産生ずる単クローン性抗体と上り己の１　ｆｊＭ
   以上のマーカー抗原との反応性に関して選別することを
   特徴とする癌胎児性抗原に対して特異性を有する単クロ
   ーン性抗体の１！場造方法。
2. （２）哺乳動物が、マウス、ラット、モルモット、ウサ
   ギ、ヤギ、馬または牛である特許請求の範囲第１項によ
   る方法。
3. （３）癌胎児性抗原関連抗原が、正常糞便抗原１、正常
   糞便抗原２および正常成人由来の非特異的父叉反応抗原
   の３者の中から選ばれた１種以上の抗原である特許請求
   の範囲第１項による方法。
4. （４）選別が放射性物質でＳ識されたｉ−カー抗原を用
   いるラジオイムノアッセイによって行なわれる特許請求
   の範囲第１項による方法。
5. （５）抗体が抗血清の形である特許請求の範囲第１項に
   よる方法。
6. （６）特許請求の範囲第１項記載の方法で選別された単
   クローン性抗体産生能をもつ単クローン。
7. （７）抗体産生のために＠乳動物の免疫に用いられた癌
   胎児性抗原と反応性を有するが、上記の灼胎児性抗原以
   外の癌胎児性抗原およびすべての癌胎児性抗原関連抗原
   とは反応性を有しない単クローン性抗体。
8. （８）すべての癌胎児性抗原と反応性を有するが、すべ
   ての癌胎児性抗原関連抗原と反応性を有しない単クロー
   ン性抗体。
9. （９）すべての癌胎児性抗原、正常糞便抗ｙＡ１および
   正常糞便抗原２と反応性を有するか、正常成人由来の非
   特異性交叉反応抗原と反応性を有しない単クローン性抗
   体。
10. （１０）　すべての癌胎児性抗原および正常糞便抗原２
    と反応性を有するが、正常糞便抗原１および正常成人由
    来の非特異的交叉反応抗原と反応性を有しない単クロー
    ン性抗体。 θ１）すべての癌胎児性抗原、正常糞便抗原２および正
    常成人由来の非特異的交叉反応抗原と反応性を有するが
    、正常糞便抗原１と反応性を有しない単クローン性抗体
    。 ＋１２５　癌胎児性抗原および尚胎児性抗原関連抗原の
    濃度をラジオイムノアッセイによって測定する方法にお
    いて、特許請求の範囲第１項記載の方法で得られた単ク
    ローン性抗体を放射性物質で標識したマーカー抗体とし
    て用いることを特徴とする方法。