JPH11508235A - 腫瘍関連エピトープ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、モクローナル抗体88BV59および抗体 16.88が反応するエピトープに関する。これらの抗体は、自己腫瘍抗原によって能動的に免疫感作された癌患者のＢ−細胞から誘導されるＢ−細胞系によって産生した。エピトープは共に、腫瘍組織において同じ抗原上に存在する。これらのエピトープは、ヒトの癌の診断手法および治療の両方で使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】 腫瘍関連エピトープ 本発明は、1987年６月２日に出願され、現在は放棄されている米国出願 No.07 /069,478の一部継続出願である、1989 年２月28日に出願され、現在は放棄され ている米国出願No.07/343,475 の継続出願である、1992 年８月13日に出願され 、1994年８月16日に米国特許5,338,832として発行された、米国出願 No.07/929, 842の一部継続出願である、1994年７月８日に出願された米国出願No.08/272,402 の一部継続出願である。 本出願はまた、1984年１月31日に出願され、現在は放棄されている米国出願No .06/575,533の一部継続出願である、1985年１月31日に出願され、現在は米国特 許No.4,828,991である米国出願No.06/697,078の一部継続出願である、1989年１ 月25日に出願され、現在は米国特許 No.5,106,738である米国出願No.07/302,155 の一部継続出願である、1990年12月31日に出願され、現在は放棄されている米国 出願No.07/636,179の継続出願である、1993 年５月21日に出願された米国出願No .08/065,517の一部継続出願である、1994年２月４日に出願 された来国出願No.08/192,089の一部継続出願でもある。これらの特許出願の開 示は、参考として本明細書に組み入れる。発明の分野 本発明は、自己腫瘍抗原で能動的に免疫感作された癌患者のＢ−細胞から誘導 されるハイブリドーマまたは形質転換されたＢ−細胞系によって産生されるモノ クローナル抗体の標的とされるエピトープに関する。これらのエピトープは、ヒ トの癌の診断手法および治療ならびに抗体および抗体断片のスクリーニングに使 用できる。発明の背景 本発明者らは、特定の癌と関連する抗原と特異的に反応するヒトモノクローナ ル抗体の標的とされるエピトープを同定した。本発明はまた、これらのエピトー プを標的として、および免疫原の活性部分として使用する、診断手法、抗体スク リーニングおよび癌の治療に関する。 抗体は、普通は、骨髄によって産生されるＢ−細胞リンパ球によって合成され 、血流において運ばれるタンパク質分子である。体内のどんな抗原も、すなわち 、簡単な有機化学物質から複雑なタンパク質まで、どんな外来または非自己分子 も、その 特定の化学構造を認識して、それに結合する抗体が産生される。特定の抗体が結 合し得る抗原上のユニークな化学構造は、抗原決定基またはエピトープと言う。 体内のＢ−細胞リンパ球（Ｂ−細胞、リンパ球または白血球と言う。）は、遺伝 的にプログラムされた数億個の異なる細胞として存在し、各々は、異なるエピト ープに対して特異的な抗体を産生する。抗体産生を刺激する抗原は、その表面上 にいくつかのエピトープを有し得る。抗原に出会うと、その抗原上のエピトープ に特異的な抗体をその表面上に運ぶＢ−細胞が複製する。このクローナル拡張に より、血流にその抗体を分泌する多くの娘細胞が生じる。 抗原の認識および抗原への結合における抗体の特異性のために、１個のエピト ープに対して特異的である、すなわち、その特定のエピトープを有する抗原また は組織のみに結合する抗体を同定ことが所望された。いったんエピトープが同定 されると、それは、細胞系によって産生される抗体のスクリーニングおよびポリ クローナル血清からの抗体の免疫精製に対してさえも利用できた。エピトープは また、大きい分子（合成または天然）の一部として、有効な免疫原としても使用 できる。 モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンによって汚染さ れていない純粋な形状で合成され。モノクローナル抗体産生細胞を使用すると、 ある特定の抗原上の一つのエピトープに対して特異的である抗体を本質的に無限 の量で産生することができる。特定の癌に特異的な抗体は、種々の治療および診 断法で使用することができる。 モクローナル抗体は、化学療法薬物、毒素および放射性同位元素の特異性を増 大させる。すなわち、その必要量を劇的に低下させることにより、毒性は減少さ せながら、効力は増加する。さらに、放射性核種または金属トレーサーと結合し た抗体は、プロトン放射（ＰＥＴ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、コンピューター断 層撮影法（ＣＴ）ならびに平面およびシングルフォトンエミッションＣＴなどと ともに in vivo 診断および転移の位置確認に対する画像化に使用でき、また、 プローブを使用して手術中に確認されるべき腫瘍組織の標識化に使用できる。抗 体はまた、癌に対する診断または予後検査として、血液中の腫瘍抗原の有無の検 出にも使用できる。動物の腫瘍に関連する抗原の存在は、前世紀に文書で実証さ れ、ヒトの癌の抗原性の特徴は、主にモノクローナル抗体による最近の研究によ り、十分確立されている。しかし、本発明を生み出した研究が行われるま では、ほとんどの癌の抗原は、実際には、分子レベルでの解析がなされておらず 、ヒトの癌と関連した一群の抗原決定基（Ｂ−細胞腫瘍の免疫グロブリンイディ オタイプ）のみが、ユニークな腫瘍特異性を有する、すなわち腫瘍細胞上には高 い確率で生じるが、正常な組織には有意な程度には生じないと記載されているに すぎない(Oldham および Smalley,J.Biol.Response Modifiers,19983; Stratte ら、J．Biol．Response Modifiers,Volume 1,1982)。 ヒトの癌に特異的なモノクローナル抗体を誘導する試みは、過去には、Ｂ−細 胞に関して２つの方法が採られた。すなわち、１）Ｂ−細胞を、ヒトの腫瘍に対 して免疫感作したマウスの脾臓から抽出した（米国特許 4,172,124）；および２ ）ヒトＢ−細胞を癌患者において腫瘍を排出する抹消血またはリンパ節から抽出 した。どちらの方法も十分な結果は得られなかった。 ヒトの腫瘍に対して免疫感作したマウスは、反応性も広い。すなわち、生じた マウスモノクローナル抗体のほとんどは、正常組織および腫瘍組織に存在するヒ ト抗原と反応する。腫瘍細胞のみと反応する抗体を、産生した広範囲の抗体から 選択することは非常に困難である。例えば、ヒト小細胞肺癌で免疫感作 したマウスから誘導される 20,000 個のハイブリドーマを腫瘍細胞との反応性に 対してスクリーニングすると(Science,1982,216:283)、この実験群によって確認 される反応性の頻度は非常に低かった（＜0.4%）。これに対して、本発明では、 免疫感作した結腸癌患者から誘導されるハイブリドーマの 16%までが、腫瘍細胞 と特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するという結果が得られた。さら に、マウスＢ−細胞から誘導されるモノクローナル抗体の癌治療での適用可能性 は限られている。それらを繰り返し投与すると、それらはヒト免疫系を刺激して 「抗−マウス」抗体を産生するが、それは、臨床試験では、マウスモノクローナ ル抗体の活性を中和することが示された。本発明者らのモノクローナル抗体を使 用すると、これらの困難を回避することができる。 ヒトおよびマウスのモノクローナル抗体間の別の明らかな相違は、その標識パ ターンである。マウス抗体による以前の研究では、腫瘍領域内の細胞の標識がし ばしば不均一であることが示された。この反応性パターンは、何人かの著者によ れば、腫瘍細胞の抗原性の不均一性に起因している(Hand ら、Cancer Research, 43:728-735,1983)。これに対して、本発明者らの方 法によって開発されたヒトモノクローナル抗体は、腫瘍との反応性に関して均一 であった。マウスモノクローナル抗体の不均一な染色は、それが、推定上の腫瘍 関連抗原よりもむしろ、腫瘍細胞上において豊富な、相または細胞サイクルに特 異的な分化抗原のマウス免疫認識を表していると説明するのがもっともらしい。 マウスをヒト腫瘍細胞で免疫感作すると、実質的に抗原性の競合が存在し、宿主 による免疫応答性に対して、割合的により少ない腫瘍関連抗原とうまく競合する 組織型および分化抗原がより豊富にかつより支配的に生じると予想することは不 当ではない。すなわち、ヒトの自己免疫の結果、マウスでは免疫原性が通常は小 さい抗原群に対する抗体が引き出される可能性がある。この証拠は、ヒトおよび マウスが種々の腫瘍抗原に応答し得ることを示唆している。この仮説に関する本 発明者らの発見は、本発明者らが産生した最初の36個のヒトモクローナル抗体の どれにも、ヒト腫瘍細胞に対して作製されるマウスモノクローナル抗体によって しばしば認識される抗原である、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）との反応が見られなか ったことである。 ヒト腫瘍抗原に対して特異的なモクローナル抗体の作製における主要な問題は 、特異的免疫性Ｂ−細胞源を見いだすことが できないということである(Science，1982，216:285)。ヒトでは、初期の癌細胞 巣は、その病気の何らかの明白な臨床的証拠が現れる前に、長期間（寿命の 1〜 10%）にわたって増殖する傾向がある。患者は、このときまでに、その腫瘍に対 して免疫学的に少し応答性を有するか、恐らく免疫学的に耐性を有する。すなわ ち、本発明より前には、腫瘍関連抗原に対して特異的なヒトモクローナル抗体の 発生およびそれらの標的エピトープの同定は、再現性をもって得ることはできな かった。 本発明の腫瘍特異的エピトープの同定は、特定の癌を有する患者において免疫 応答を誘導する腫瘍関連抗原と特異的に反応するモクローナル抗体を発生させる ために努力して開始した研究の結果、得られたものである。これは、特異的ワク チンの作製において、自身の腫瘍細胞で免疫感作した患者由来の末梢血Ｂ−細胞 を使用してモクローナル抗体を得るための、新規かつより効果的な方法であった 。能動特異的免疫療法を達成するために、患者を自身の腫瘍細胞で免疫感作した 。腫瘍細胞に対して目的の免疫応答を持った人は、特に、良好な活性化Ｂ−細胞 源であることが分かった。自身の腫瘍に対して能動的に免疫感作されたこれらの 患者の末梢血は、そのような活性Ｂ−細胞の 豊富な源であった。 臨床研究により、目的の免疫応答は、特定の癌を有する患者を皮膚検査、すな わち遅延皮膚過敏症（ＤＣＨ）によって処置すると生じることが示された。免疫 感作された患者は、自身の結固直腸癌に対して遅延皮膚過敏症を示した。さらに 、モクローナル抗体は、他の患者の同じ組織型の腫瘍と反応する、免疫感作され た患者のＢ−細胞から発生した。これらの結果は、患者の体液性免疫応答である 抗体の産生が、一般的に結腸直腸癌抗原に特異的であり、免疫感作された患者自 身の腫瘍に対してはユニークでないことを示した。ユニークなエピトープを含む 腫瘍と関連する特異的抗原が存在することを示した、この一般的応答は、標準化 されたワクチンの開発に特に重要である。 腫瘍細胞関連抗原、特に大半の場合のように細胞表面抗原上の特定のエピトー プに特異的な反応性を有する抗体を産生するＢ−細胞の作製は有利な結果である が、免疫感作の研究を始めたときは精々思弁的であった。これらが、腫瘍細胞に よって提示される特定のエピトープであり、正常な細胞では比較的小さい程度に 発現されて見いだされるという発見もそうであった。ヒト免疫感作手法に基づく 動物実験の間、腫瘍特異的抗体の産 生ではなく、免疫感作処理のみを観察して測定した。 患者の状態の改善を伴う一般的免疫応答は、マクロファージおよびＴ−細胞が 腫瘍細胞抗原の存在下で活性化され、腫瘍細胞を破壊する細胞応答を示した。抗 体応答は、ほとんどの環境下で免疫感作により予想通り誘発されるが、抗体応答 および細胞応答の時間経過は、ほとんどの場合、異なる。さらに、患者が自己腫 瘍細胞、すなわち患者自身の腫瘍細胞で免疫感作されているという事実、および 以前の研究者らによる、患者自身の腫瘍では抗体の産生がほとんど、または全く 誘発されないという経験から、腫瘍特異的抗体を産生するＢ−細胞が免疫感作後 に生じるという発見は予期せぬ有益な結果となった。 いくつかの細胞および体液性免疫応答は、互いに独立して生じ得る。例えば、 明らかな細胞性免疫の不在下で、体液性免疫を開始することは可能である。逆に 、潜在的細胞性免疫、特に遅延皮膚過敏症（ＤＣＨ）は、抗体応答が最少である にもかかわらず、発生し得る。従って、能動的免疫治療に対して陽性の応答を示 す患者が腫瘍特異的抗体を産生する優れたＢ−細胞源であったことは驚くべきこ とであった。 腫瘍特異的抗体を産生するＢ−細胞の単離は、能動特異的免 疫感作に対して十分なワクチンの作製、免疫感作されたＢ−細胞の抽出処理、モ クローナル抗体産生細胞系の産生、およびモクローナル抗体の産生を必要とした 。悪性腫瘍を、酵素製剤を使用して消化した。得られた細胞は、必要な細胞生存 力を有する非腫瘍形成性腫瘍細胞調製物が得られるように処理し、腫瘍源であっ た患者にワクチンとして注入した。末梢血Ｂ−細胞は、接種した患者から予め定 めた間隔の後に得た。そして、それを、骨髄腫細胞と融合した後、融合細胞を免 疫グロブリンの合成に対してスクリーニングすることによるモクローナル抗体産 生細胞の調製に使用した。モクローナル抗体産生細胞はまた、連続培養において 生存し得る、自然に形質転換されたＢ−細胞を選択することにより、および、Ｂ −細胞を、エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）または別のリンパ栄養ウイ ルスなどの、細胞を形質転換し得る物質に暴露することによっても得た。 より多量の抗体は、ＥＢＶ−形質転換細胞をマウス骨髄腫細胞およびヒト−マ ウス異種骨髄腫と融合することにより得た。免疫グロブリンを合成した細胞を、 悪性組織の抗原特性と反応する抗体の産生に対して試験した。選択された細胞は 、患者が苦しんでいる特定の型の腫瘍と反応するモクローナル抗体を産 生するために培養した。これらの抗体と反応性のある新規エピトープの本発明者 らによる同定により、他の有用な免疫グロブリンのスクリーニングが可能になる 。同定されたモクローナル抗体は、診断用ならびに主な腫瘍および転移部位への 治療薬の運搬のためのラジオイムノシンチグラフィー（ＲＩＳ）剤として使用で きる。エピトープ自体も、腫瘍抗原に対する抗体の単離に、また in vivo画像化 および治療のための標的として、ならびに in vitro組織分析に対して、直接的 に有用である。また、より大きい分子と組み合わせると、免疫治療および抗体産 生ための免疫源として使用することもできる。 モクローナル抗体を高めた後のエピトープの同定は、抗原配列情報が普通は利 用できないし、抗原は単純なタンパク質ではない可能性があるし、エピトープ自 体は、線状配列での反応性がほとんど、または全くない三次元立体配座のエピト ープである可能性があるので、成功は確かでない。本発明のエピトープは、16.8 8 および 88BV59抗体が、配列情報が利用できる一定のサイトケラチンと反応す るという本発明者らの発見の後に初めて同定し、配列決定することができた。発明の要旨 本発明は、腫瘍抗原ＣＴＡＡ 16.88上に存在する腫瘍関連エピトープに関する 。それらは、アミノ酸配列TyrSerLeuGlySerSerPheGlySerGlyAlaGlySerSerSerPhe Ser を含む、ＣＴＡＡ 16.88上および天然のサイトケラチン８上に存在する 88B V59エピトープ、ならびにサイトケラチン８、１８および１９上に存在するエピ トープと相同であり、アミノ酸配列 ThrLeuGlnGlyLeuGluIleGluLeuGlnSerGlnLeu SerMetLys を含む、ＣＴＡＡ 16.88 上の 16.88エピトープ、ならびにその機能 的断片および同等物である。図面簡単な説明 図１は、ＣＴＡＡ 16.88の逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰＨＰＬＣ ）のプロフィールを示す。 図２は、ＲＰＨＰＬＣによるＣＴＡＡ 16.88（ＣＡＴ♯１）のピーク１および ピーク２に関する、ＭＣＡ 16.88、ＭＣＡ88BV59、抗サイト８抗体、抗サイト18 抗体および抗サイト19抗体の反応性を示す。 図３は、サイトケラチン８の部分配列と 88BV59エピトープ配列との間の相同 性を示す。 図４は、PEPSCANおよびサイトケラチン８の一部との反応性によるＭＣＡ 88BV 59のエピトープ特異性を示す。態様の詳細な説明 1994年２月４日に出願された米国出願 08/192,089（参考として本明細書に組 み入れる。）に記載のモクローナル抗体88BV59は、結腸腫瘍関連抗原（ＣＴＡＡ ）16.88（ＣＴＡ♯１とも言う）として命名された抗原を認識することが分かっ た。この抗原は、1994年８月16日に発行された米国特許 5,338,832（同じく、参 考として本明細書に組み入れる。）にクレームされている。ＣＴＡＡ 16.88は、 ヒトＩｇＭ抗体 16.88（ＭＣＡ 16.88）を使用して最初に同定されたものであり 、1991 年３月５日に発行された米国特許 4,997,762（参考として本明細書に組 み入れる。）で規定されている。ＭＣＡ 88BV59 およびＭＣＡ 16.88は共に、同 じ腫瘍関連抗原を認識するが、その抗原上の異なるエピトープと反応する。 本発明のエピトープ（88BV59エピトープおよび 16.88エピトープ）を標的とす ると、癌を診断・治療するための手段が得られる。放射性同位元素または金属ト レーサーによって常法により標識したＭＣＡ 88BV59およびＭＣＡ 16.88は放射 線走 査に使用されている。使用できる同位体としては、それらに限定されないが、ヨ ウ素−131、ヨウ素−125、インジウム−111およびテクネチウム−99m が挙げら れる。放射線標識した抗体の特異的活性は特に限定されず、約2〜4mCi/mgの抗体 が許容され得ることが分かった。例えば、約15〜約41 mCiの^99mTC-88BV59 を30 分にわたって静脈内に注入すると、良好な画像が得られた。この量は、患者の体 重および同位体の種類などの因子に応じて変わり得る。放射線標識した抗体を体 内に導入する他の方法（リンパ管内および腹腔内投与など）を使用してもよい。 同様に、ＭＣＡ 16.88も、それ自体が腫瘍の画像化に有用であることが示された 。乳房内投与した¹¹¹In-LiLo-16.88は、原発性乳癌の手術前の病期分類に使用し た。また、結陽直脳癌の¹³¹Ｉ−16.88による平面画像化は、２つの研究において 、患者の少なくとも 75 %が陽性であった。放射線標識したＭＣＡ 88BV59 およ びＭＣＡ 16.88による免疫検出の詳細は、総説論文である DeJage rら、「放射 線標識したヒトモクローナル抗体による癌の免疫検出の現状」、Seminars in Nu clear Medicine，Volume XXIII，No.2(April),1993: pages 165-179（その内容 は、参考として本明細書に組み入れる。）に見いだ される。放射線標識したＭＣＡ 88BV59および放射線標識したＭＣＡ 16.88の投 与は共に、安全かつ耐性も十分であり、副作用もあまり報告されていないことが 分かった。 今までに集めたデータは、平面および断層撮影法を共に使用した^99mTC-88BV59 による抗体走査が、腹内および骨盤転移の検出に対するＣＴ走査よりも優れて いることを明らかに示している。二つの方法を組み合わせると、最適の検出が得 られると思われる。さらに、放射を検出するプローブが、手術中に、切除のため の腫瘍および転移組織の同定に使用されている。88BV59エピトープまたは16.88 エピトープに対する特異性を有する抗体はいずれも、腫瘍組織の同定に有用であ る。ＭＣＡ88BV59、ＭＣＡ 16.88およびその断片などのヒトモクローナル抗体は 、免疫原性でないという利点を提供する。 88BV59または 16.88エピトープの別の重要な用途は、腫瘍の画像化および腫瘍 の治療薬による標的化のために診療室において有用であろう抗体を同定するため の、腫瘍組織に対して高められた抗体のスクリーニングである。抗体はまた、腫 瘍組織の有無の同定または確認に対して臨床実験室で使用され得る該スクリーニ ングによって同定することもできる。 88BV59は、次の正常なヒト組織との反応性に対して陰性を示した。すなわち、 卵巣、子宮、精巣、膣、副腎、前立腺、甲状腺、胸腺、リンパ節、脾臓、骨髄、 心筋層、大脳皮質細胞、皮膚、筋肉および造血細胞である。88BV59は、次の組織 に対してはわずかに反応性を示した。結腸（刷子縁および表面腺）、小胞（刷子 縁および表面腺）、冑（胃小窩および表面腺）、食道（腺）、膵臓（いくつかの 管および外分泌腺上皮）、腎臓（集合管の50%）、頸（上皮内層（２／３の組織 は陽性であった））、乳房（腺房および管土皮）、肺（いくつかの肺胞および気 管支細胞）、脳（星状神経膠細胞（２／３の組織は陽性であった））、脊髄（神 経網）、皮膚（真皮の 50%の腺）およぴ肝臓（胆管）である。88BV59のヒトの腫 瘍細胞系との反応性は、表２に示す。表３は、88BV59の腫瘍組織試料との反応性 を示す。これらの研究の結果は、たとえ正常な組織が 88BV59エピトープを含む 天然のサイトケラチン８を含むことが予想されても、そのエピトープは、腫瘍組 織の同定に対して実用性があることを示した。ＭＣＡ 16.88の正常細胞および腫 瘍細胞との反応性は、米国特許 4,997,762（例えば、実施例II）および米国特許 5,338,832（両方とも、参考として本明細書に組み入れる。） にすでに記載されている。どちらもエピトープは、腫瘍細胞でより強く発現され るように見え、または、正常組織ではエピトープが遮蔽されると考えられる。ど ちらの場合も、88BV59 および16.88エピトープは共に、腫瘍組織の標的化および 同定に有用である。 ＣＴＡＡ 16.88は、分子量範囲が 35〜43KDのポリペプチドの複合体である（ 変性条件下）。このポリペプチド複合体内には、中間フィラメントタンパク質、 特にサイトケラチン８、１８および１９に関するエピトープがある。これらのサ イトケラチンに対して特異的なモクローナル抗体は、この腫瘍関連抗原と交差反 応することが分かった。ＭＣＡ 88BV59は、ＣＴＡＡ 16.88（記載した分子量範 囲内）として認識されるポリペプチドのサブセットに結合する。サイズ排除クロ マトグラフィーおよび天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動などの非変性条件下 では単一のタンパク質物質として挙動する天然の抗原は、逆相高性能液体クロマ トグラフィーにより２つの成分に分離できる。このクロマトグラフィーのプロフ ィールを図１に示す。 間接的酵素結合イムノアッセイ（ＥＩＡ）は、ＭＣＡ 88BV59が主に、逆相ク ロマトグラフィープロフィールで得られる第一 のピークを認識することを示した。このデータは、図２に示す。 ＭＣＡ 88BV59のＣＴＡＡ 16.88との免疫反応性をさらに解析するために、Ｎ −末端タンパク質配列分析¹を行った。図３に見られるように、逆相ＨＰＬＣピ ーク１内に位置するポリペプチドから得られる主な配列は、中間フィラメントタ ンパク質サイトケラチン８との相同性が強い。ＣＴＡＡ 16.88の組換え体を得る ことはできなかったし、ＭＣＡ 88BV59は天然のサイトケラチン８と反応するの で、ＭＣＡ 88BV59のエピトープ特異性を決定するために、サイトケラチン８に 対して以前確立されたタンパク質配列を使用した。 抗体によって認識されるエピトープを規定する本発明者らの方法は、細菌の発 現系を使用して反応性タンパク質のセグメントを合成した後、これらのペプチド を問題の抗体と反応させるものである。この方法を使用して、サイトケラチン８ のカルボキシル末端が 88BV59によって認識されるエピトープを含むことを測定 した。これを図４Ａに示す。 抗体によって認識されるエピトープを規定する別の方法は、PEPSCAN法である 。この方法は、関与するタンパク質の長さに沿って各位置で始まる規定長さの短 いペプチドを合成した後、 そのペプチドを問題の抗体と反応させることを含む。この方法の使用により、抗 体 88BV59 がサイトケラチン８の尾部領域の広い部分（アミノ酸 417〜464）と 反応し、アミノ酸 437〜453 の領域での反応性が最高であることが測定された。 小さい３個の領域（アミノ酸 353〜366、アミノ酸 400〜411およびアミノ酸 469 〜483）も、その抗体との有意な反応性を示した。この種の反応性プロフィール は、立体配座エピトープの典型である。これらの結果を図４Ｂに示す。 モクローナル抗体16.88の標的とされるエピトープは、16.88が結合活性を示す ことが実証されているサイトケラチン８、１８および１９に関連するエピトープ である。特に、そのエピトープは、アミノ酸配列ThrLeuGlnGlyLeuGluIleGluLeuG lnSerGlnLeuSerMetLys を含むポリペプチドまたはその機能的に同等の断片であ る。 「断片」とは、共通の構造要素および抗体結合特異性を有する、88BV59 また は 16.88 エピトープに対するアミノ酸配列によって規定されるポリペプチドの 一部を含むアミノ酸配列を意味する。それらは、本発明の開示により当業者によ って作製できるので、本発明の範囲内である。 本明細書で使用する「機能的同等物」とは、88BV59 または 16.88エピトープに対して列挙したアミノ酸配列の抗体結合特性をなおも維持し ている、列挙した配列の変形を意味する。これらの機能的特性は、抗体16.88と の反応力である。その配列において生じ、機能的同等性をなおも保ち得る変形は 、欠失、置換、挿入、変換または付加から生じる１個以上のアミノ酸における相 違を含む。生物学的および免疫学的性質を本質的に変えないことが予想されるア ミノ酸置換は記載されている。関連アミノ酸の間のアミノ酸置換または進化にお いてしばしば生じる置換は、とりわけ、Ser/Ala、Ser/Gly、Asp/Gly、Asp/Asn、 Ile/Val である(Dayhof，M.D.，Atlas of Protein Sequence and Structure，Na t．Biomed．Res．Found.，Washington D.C.，1978，vol．5，suppl．3を参照)。 この情報に基づいて、Lipmanおよび Pearsonは、迅速かつ感度の高いタンパク質 比較(Science227，1435-1441，1985)および相同性ポリペプチド間の機能的類似 性を測定するための方法を開発した。また、機能的同等物としては、多重度の結 合部位または接合のための部位を付与する、列挙したアミノ酸配列のマルチマー も挙げられる。エピトープのアミノ酸配列を列挙することにより本発明をクレー ムする場合、クレームは、本明細書で規定する機能的断片およびそ の機能的同等物を含むものとする。 実施例１ ＣＴＡＡ 16.88を、ＨＴ−29結腸腫瘍細胞の粗溶解物から、米国特許 5,228,8 32に記載されているように、硫安沈殿、ゲル濾過クロマトグラフィーおよびアフ ィニティーまたはイオン交換クロマトグラフィーにより精製する。精製した抗原 は、Vydac Ｃ４ 逆相クロマトグラフィーカラムを使用してクロマトグラフィー にかけ、Waters高性能液体クロマトグラフィー系で分析する。カラムは、0.1 % のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む水で平衡にする。サンプルを平衡カラムに 充填し、同じ緩衝液で洗浄した後、0.1 %のＴＦＡを含む水から 0.1 %のＴＦＡ を含む水における 70 %のアクリルニトリルまでの直線勾配を使用して、1 ml／ 分の流速で 30 分かけて溶離する。図１に示すように、これらの条件下では、二 つのタンパク質のピークが精製抗原に対して得られる。 実施例２ 88BV59（および試験される他の抗体）の免疫反応性を測定するために、酵素イ ムノアッセイを準備した。このアッセイでは、マイクロタイタープレートを、逆 相カラムのピーク１またはそ のカラムのピーク２から得られる抗原で被覆した。被覆に使用した抗原の濃度は 、リン酸緩衝食塩水において 10μg/mlであった。プレートは 37℃で２時間被覆 した。0.05%の Tween を含むＰＢＳの溶液で洗浄した後、プレートを、ＭＣＡ 8 8BV59 を5μg/mlの濃度で含む種々の抗体とともにインキュベートした。抗体は 、室温で２時間、プレート上でインキュベートした。次いで、そのプレートをＰ ＢＳ−Tween 溶液で洗浄した後、KPLLaboratories，Rockville，Maryland から 入手したＨＲＰ−標識したヤギ抗−ヒトＩｇ（Ｇ、Ａ、Ｍ）コンジュゲート(1:1 0,000の希釈度)で処理した。コンジュゲートは、室温で１時間、プレート上でイ ンキュベートした後、プレートをＰＢＳ−Tween溶液で洗浄した。次いで、KPL L aboratories から入手したＴＭＢ基質系を使用して発色させた。図２に示される ように、この酵素イムノアッセイの結果は、88BV59 が逆相ＨＰＬＣからのピー ク１と強く反応し、ピーク２との反応はかなり弱いことを示した。さらに、この アッセイによって、ピーク１は、サイトケラチン８に対して特異的なモノクロー ナル抗体と強く反応した。 実施例３ ＣＴＡＡ 16.88抗原のＭＣＡ 88BV59 によって認識される部分を解析するため に、逆相ＨＰＬＣ分析のピーク１を表す抗原を使用してタンパク質配列分析を行 った。この目的のために、Applied BioSystems，Inc．(Foster City，Californi a)製の気相タンパク質シークエンサー 470A 型を使用した。簡単に述べると、50 0 pm の抗原をポリプレン−被覆フィルター上に置き、装置に挿入した。アミノ 酸は、ＰＴＨによって誘導し、逐次切り離した。切り離されたＰＴＨ誘導アミノ 酸は、オンライン式 microboreＨＰＬＣ装置（120A型）を使用して分析した。こ のタンパク質配列分析の結果は、図３に見ることができる。その図は、ＭＣＡ 8 8BV59との反応性を有するＣＴＡＡ 16.88のピーク１から得られた配列がサイト ケラチン８中間フィラメントタンパク質と高い相同性を有していたことを示す。 実施例４ サイトケラチン８遺伝子のコード領域に対応するＤＮＡを、発表された配列² に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＨＴ２９ｃＤ ＮＡから増幅した。このＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の鋳型として 使用して、 図４Ａに示されるアミノ酸83〜483（コイルＩ、II、IIIおよび尾部）、329〜483 (コイル IIIのＣ−末端ハーフおよび尾部)および400〜483（尾部）に対応する、 その遺伝子の３個の断片を増幅した。これらの断片を、EcoRI および BamHI制限 部位を使用して、サイトケラチン配列がβ−ガラクトシダーゼのアミノ末端に融 合して発現される方法で、大腸菌発現／融合ベクター pMLB1113においてクロー ン化した。サンプルは、クーマシー染色ＳＤＳポリアクリルアミドゲルの分析に よって、発現レベルを試験した。標準化した量の融合タンパク質の88BV59 抗体 に対する反応性をウェスタンブロット分析により試験した。簡単に述べると、融 合タンパク質を産生するクローンの細胞溶解物のサンプルを 8%ポリアクリルア ミドゲル上で電気泳動し、ニトロセルロースに移した。ウェスタンブロットを 8 8BV59(5μg/ml)と反応させた後、ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合し たヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗体を使用して検出した。３個の融合タンパク質は全て抗 体と反応し、従って、分子のＣ−末端部分がそのエピトープを含むことが決定さ れた。 実施例５ 88BV59と反応するエピトープをさらに規定するために、い わゆる PEPSCAN法³を使用した。簡単に述べると、サイトケラチン８分子の第三 コイルおよび尾部領域に対応する配列を使用して、タンパク質セグメントに沿っ て各位置で始まる12-merペプチドを生じさせた。これらのペプチドの各々を、液 体／液体型のハイブリダイゼーションで 88BV59と反応させた。陽性の反応性は 、間接的酵素結合アッセイによってアッセイした。この方法により、88BV59は、 立体配座エピトープの典型である、サイトケラチン尾部領域の広い領域（アミノ 酸 417〜464）と反応することが測定された。最も高い反応性は、アミノ酸 437 〜453 の領域においでである。さらに、小さい３個の領域（アミノ酸 353〜366 、アミノ酸 400〜411 およびアミノ酸 469〜483）もまた、抗体との有意な反応 性を示した。これらのデータを図４Ｂに示す。 最も反応性の高い領域は、アミノ酸 437〜453：Tyr Ser Leu Gly Ser Ser Phe Gly Ser Gly Ala Gly Ser Ser Ser Phe Ser に存在した。 ＭＣＡ 88BV59 と反応性のある、それ単独では個々の結合部位であり、一緒に なると立体配座エピトープの形成を助ける他の領域としては、アミノ酸353〜366 ：Leu Ser Glu Leu Glu Ala Ala Leu Gln Arg Ala Lys Gln Asp; アミノ酸 400〜411:Ser Arg Leu Glu S er Gly Met Gln Asn Met Ser Ile;アミノ酸 417〜436: Gly Gly Tur Ala Gly Gl y Leu Ser Ser Ala Try Gly Asp Leu Thr Asp Pro Gly Leu Ser; アミノ酸 454 〜464：Arg Thr Ser Ser Ser Arg Ala Val Va1 Val Ileおよびアミノ酸 469〜48 3：Arg Asp Gly Lys Leu Val Ser Glu Ser Ser Asp Val Leu Pro Lys が挙げら れる。 ¹ＢＣＧ感染のイソニアジド化学予防法 ＢＣＧ −カルメット・ゲラン杆菌 ＨＢＳＳ−ハンクスのバランス食塩水 ＤＭＳＯ−ジメチルスルホキシド ＨＳＡ −ヒト血清アルブミン Ｒ −ラド ＰＢＳ −リン酸緩衝食塩水 ＥＤＴＡ−エチレンジアミン四酢酸 ａ）蛍光強度：４＋強、３＋中位、２＋弱〜中位、１＋弱、−陰性。88BV59-1 の濃度は、10μg/ml であった。対照のヒトＩｇＧ（10ηg/ml）で染色すると、 全細胞で陰性であった。 ｂ）有糸分裂にある細胞に対して優先的に染色。 ｃ）染色は、繊維状細胞骨格染色パターンを示す。 ｄ）示した蛍光強度を示す細胞の割合（％）は、特に断らない限り、100%であっ た。 ｅ）ＮＴ＝試験しなかった。 参考文献 1．Strickler，J.E.，Hunkapiller，N.W.およびWilson，K．J．タンパク質およ びペプチドならびに低ピコモルレベルの液相および固相分解に対する気相シーク エンサーの有用性、Anal．Biochem．140:553-566，1984． 2．S．Kraussおよび W．Franke，Gene 86，241-249，1990． 3．van Grunsuen，W.M.J．J．Virol．67:3980-3916，1993．

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ボス，エボ オランダ国、エヌ・エル−5344・イエー・ アー・オツス、デ・フリエスストラート・ ８ (72)発明者 ハンナ，マイケル・ジー，ジユニア アメリカ合衆国、メリイランド・21701、 フレデリツク、フエアービユー・アベニユ ー・113 (72)発明者 ハスペル，マーテイン・ブイ アメリカ合衆国、メリイランド・20874、 セネカ、ベリービル・ロード・14029 (72)発明者 フーバー，ハーバート・シー，ジユニア アメリカ合衆国、ペンシルバニア・18034、 センター・バレイ、バリー・バニオン・ロ ード・2325

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．アミノ酸配列：Tyr Ser Leu Gly Ser Ser Phe Gly Ser Gly Ala Gly Ser Se r Ser Phe Ser を含む、ＭＣＡ 88BV59 と反応性のあるエピトープ。 ２．Leu Ser Glu Leu Glu Ala Ala Leu Gln Arg Ala Lys Gln Asp 、Ser Arg Le u Glu Ser Gly Met Gln Asn Met Ser Ile 、Gly Gly Tyr Ala Gly Gly Leu Ser Ser Ala Tyr Gly Asp Leu Thr Asp Pro Gly Leu Ser 、Arg Thr Ser Ser Ser Ar g Ala Val Val Val Ile および Arg Asp Gly Lys Leu Val Ser Glu Ser Ser Asp Val Leu Pro Lys から成る群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を 含む、ＭＣＡ 88BV59と反応性のあるエピトープ。 ３．Leu Ser Glu Leu Glu Ala Ala Leu Gln Arg Ala Lys Gln Asp、Ser Arg Leu Glu Ser Gly Met Gln Asn Met Ser Ile 、Gly GlyTyr Ala Gly Gly Leu Ser Se r Ala Tyr Gly Asp Leu Thr Asp Pro Gly Leu Ser 、Arg Thr Ser Ser Ser Arg Ala Val Val Val Ileおよび Arg Asp Gly Lys Leu Val Ser Glu Ser Ser Asp Va l Leu Pro Lysから成る群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列をさら に含む、請求項１に記載のエピトープ。