JPH0814583B2 - 改良活性化および結合ポリスチレン支持体 - Google Patents

改良活性化および結合ポリスチレン支持体

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JPH0814583B2
JPH0814583B2 JP63118385A JP11838588A JPH0814583B2 JP H0814583 B2 JPH0814583 B2 JP H0814583B2 JP 63118385 A JP63118385 A JP 63118385A JP 11838588 A JP11838588 A JP 11838588A JP H0814583 B2 JPH0814583 B2 JP H0814583B2
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Description

【発明の詳細な説明】 新規かなり官能化された固体支持体が、その製造方法
と共に多種類の組成物に対する官能基を有して提供され
る。本発明の製品は、診断、治療、加工並びに他の用途
における広範な使用が見い出され、固体表面に対する粒
状成分の結合が望ましい。
固体表面は、成分の混合物から成分を分離し、特定の
部位へ１種あるいはそれ以上の成分を配置し、種々の分
子、分子凝集体、細胞あるいは組織の特性を調べる能力
において、または規定された範囲で成分を有する他の状
況において、所望により特定の媒体に関して、重要な役
割を果たす。従って、固体支持体は、ハプテン、抗原並
びに核酸用の診断、アフィニィティークロマトグラフィ
ー、生理液からの成分の除去（aphoresis）、細胞伝達
並びに他の用途における適用が見い出された。この固体
支持体には、例えば非特異性結合度、透明度、成形加工
の容易さ、有効性、等について多くの重要な特徴があ
る。この特徴は、特定の用途により重要性が異なる。本
発明の目的のため、本質的な特徴は、官能基が誘導さ
れ、他の基に結合するそのような官能基の便宜性、その
ような官能基とこの官能基に結合した成分との間の相互
作用、結合に有効な官能基の密度、この官能化の再現
性、および結合に用いられる方法を含む。また、容器、
例えばびんあるいはフラスコの中身を容易に見ることの
できることにも関係する。
多くの場合、表面に高密度の粒状成分を有することが
かなり望ましい。高密度を有することにより、多くの相
互作用が、あらかじめ決められた表面部位において達成
される。これは、使用する量を少なくし、接触時間を短
くし、シグナルの強さを増し、並びに他の利点を可能に
する。
従って、固体支持体の改良を可能にする新しい方法お
よび組成物を開発することに関心がある。そのような改
良は、診断アッセイの効率、複合混合物中の成分の分離
の効率、小さな表面部位への特定の成分をパックする能
力、並びに他の改良に作用する。
Olahらは、J.Am.Chem.Soc.（1962）84巻、3687頁にお
いて、テトラメチレンスルホン中のニトロ化を報告して
いる。ポリスチレンの官能化は、米国特許第3,956,219
号;3,886,486号;3,974,110号;3,995,094号および4,226,
958号に記載されている。シッフ塩基による固体支持体
への結合は、米国特許第4,419,444号および4,217,338号
に記載されている。
付加重合した芳香族モノマーを含んでなる新規官能化
固体支持体が提供される。この新規支持体は、少量の極
性配位試薬を含む、実質的にポリマーを溶解できない溶
媒中において、求電子試薬、特にニトロ化剤による芳香
族ポリマー表面のニトロ化によって製造されるポリニト
ロ置換支持体である。かなりの割合の芳香族基がニトロ
基により置換される。次いでこのニトロ基は、ニトリロ
基、特にアミノ基または多くの分子に結合部位を提供す
る他の還元窒素基に還元される。得られる固体支持体
は、成分の分離あるいは高密度充填に対する特定の用途
が見い出された。
新規官能化芳香族支持体は、固体芳香族支持体の実質
的全表面が官能化されるところで提供される。高官能化
表面は、芳香族求電子置換できる求電子試薬、特にニト
ロ化剤、および比較的非極性であり、ポリマーが実質的
に不相溶性であり、膨潤しない溶媒を用いて達成され
る。反応媒体中には、少量の極性物質、特に求電子試薬
と配位できるヒドロキシ化合物が含まれる。
この固体支持体はホモあるいはコポリマーであり、通
常架橋していないかまたは低レベルの架極を有し（＜2.
0％ポリエンモノマー）、少なくとも50モル％、より通
常には少なくとも約80モル％が芳香族付加重合可能な炭
化水素モノマーであり、特に１〜３個の環のアリール基
を有しおよび０〜１個のアルキル置換基、１〜３個の炭
素原子を、通常パラ位以外の位置において有するもので
ある。大部分は、この物質は従来の方法に従い製造さ
れ、種々の形状、例えばびん、プレート、容器、二次加
工品、等の形状のポリスチレンである。容器のかわりに
この固体は粒子、中空ファイバー、ストランド、チョッ
プトストランド、膜、等でもよい。このポリマーを成
形、押出、機械加工、等をしてもよく、通常透明な比較
的滑らかな表面が得られる。
大部分は、求電子試薬、特にニトロ化剤が用いられ、
ニトロニウムイオンが溶媒中で十分なイオン化が可能な
陰イオン、特に錯陰イオン、とりわけポリハロゲン化陰
イオンと配位する。典型的なポリハロゲン化陰イオン
は、テトラフルオロ硼酸塩、六弗化アンチモン、六弗化
燐、等を含む。
溶媒は、ポリマーが溶解せず、膨潤もしないもの、特
にテトラメチレンスルホン（TMS）である。この溶媒と
しては、ニトロニウムイオンと配位できる極性配位化合
物が含まれる。従来水が用いられたが、他のオキシ化合
物、例えばメタノールも用いてよいことがわかった。極
性化合物は、ニトロニウムイオンとの配位から陰イオン
と溶媒の両方を置換できるべきである。極性成分は、好
ましくはニトロニウムイオン濃度に対し約等モル量以下
で存在し、通常ニトロニウムイオンのモル濃度の少なく
とも約0.05倍、より通常は少なくとも約0.25倍、一般的
には少なくとも約0.5倍で存在する。
ニトロニウムイオンは、一般的に少なくとも約0.05
M、通常は少なくとも約0.1M、約0.8M以下である。特定
の濃度は、ポリマー表面を実質的に完全に官能化するに
十分な量の反応体が存在する限り、都合のよい濃度であ
る。
反応の温度は試薬の性質により異なり、一般的には約
４℃以上約60℃以下であり、通常約40℃を越えず、好ま
しくは30℃〜40℃の範囲である。反応の時間は、温度に
より異なり、温度が低くなれば時間は長くなる。一般的
に、この反応は、少なくとも１時間かかり、約48時間を
越えず、通常約２〜24時間行なわれる。
反応媒体をポリマー表面と接触させ、通常少なくとも
約1.5倍過剰で、有効な芳香族基と化学量論量の反応体
を提供し、ここでよりモル過剰を用いることが都合がよ
い。例えば、表面の官能化のレベルを最適にするため、
異なる量のニトロニウムイオンを用いて多くの反応混合
物を製造することが望ましい。
反応終了後、反応混合物を捨て、表面を洗浄しすべて
の残留物質を除去する。表面を洗浄するため、種々の溶
媒、例えばメタノール、エタノール、ジメチルスルホキ
シド（DMSO）、水、ニトロメタン等を用いてもよい。洗
浄に用いられる特定の物質は、本発明に対し重要ではな
く、この溶媒によりポリマーが溶解せず、膨潤しないよ
うなものが都合がよい。
得られるポリマー表面は、化学分析用の電子分光（ES
CA）により、アリールに対する窒素の比が少なくとも0.
1、通常は少なくとも約0.15、より通常には少なくとも
約0.25を有し、深さ100Åを有することがわかった。好
ましくは、アリールに対する窒素の比は約0.25〜１であ
る。
得られる表面がニトロ化されたポリアリール固体支持
体は、多くの望ましい特性を有する。上記方法に従い製
造された得られる官能化ポリマーは透明であり、妨害せ
ずこのポリマーを通して光を通すことができる。従っ
て、このニトロ化ポリアリール固体支持体を種々の用
途、特に容器を通して通過した光の量を測定するため光
が透過する容器を有することおよびサンプルを通して光
を透過させることを望む場合に用いてよい。あるいは、
容器内で生ずること、例えば細胞増殖、プラック形成、
細胞生育力、凝集、等を観察したい場合に用いられる。
これらの目的のため、ニトロ基は通常、種々の化合物と
結合するより都合のよい官能基を与えるよう改質され
る。
これらの適用において、通常サンプルの輻射の効果に
関心がもたれる。サンプルは光、蛍光を吸収し、その他
に化学ルミネッセンス反応も含まれ、サンプルは光を発
する。
ニトロ基は還元状態の中間体を介して、反応を受け、
用いられる特定の条件によりニトリロ基、例えばニトロ
ソ、オキシム、アゾキシ、アゾ、ヒドラジノあるいはア
ミノを提供できる。生成物が２個の窒素を有する場合、
ニトロ化表面は第２のニトロ化合物と反応し、１〜２個
の窒素原子を有する窒素ブリッジにより連結し混合生成
物が得られ、あるいは、部分的に官能基が還元された中
間体、例えばニトロソと反応できるアミノ化合物が用い
られ、そこでニトロソ基はアミノ基と反応しアゾ基を形
成する。特に興味深いものは、ジアザ基（−Ｎ−Ｎ）、
例えばジアゾ、ヒドラゾン、セミカルバゾン、ヒドラジ
ノ等である。
ニトロ基還元用に用いられる従来の試薬の大部分は、
本発明のニトロ化物質と共に用いてもよい。これらの還
元剤は触媒水素、例えば白金あるいはパラジウムを有す
るもの；塩化第一錫；亜ニチオン酸ナトリウム；金属、
例えば亜鉛、鉄、または錫酸あるいは水カップル;Al（H
g）−水性エタノール；水素化アルミニウム；水素化硼
酸；硫化アウモニウム；亜砒酸ナトリウム；電解還元等
を含む。
官能基の性質により、固体支持体の透明度を維持しな
がら、この固体支持体表面に対象化合物を結合させるた
め種々の反応が行なわれる。アミンとのニトロ基の反応
は、すでに示された。アリールアミンの広範囲の反応を
うけることが知られている。アリールアミンは、非オキ
ソカルボニル（官能性のカルボキシカルボニル）、例え
ばハロゲン化アシル、無水物、活性エステル、例えばｐ
−ニトロフェニル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、
ｐ−ニトロ−ｏ−クロロフェニル等、または活性化剤、
例えばカルボジイミドにより活性化されたカルボン酸を
用いてアシル化される。
アミノ基はニトロソ化合物と反応し、アゾ結合を形成
する。アミノ基を有するヒドラジンを形成するためハロ
ゲン化アミノを用いる。イミンあるいはアルキル化アミ
ンを形成するため、特に還元条件下でそれぞれアルデヒ
ドあるいはケトンを反応させる。
アミンがジアゾ化される場合、アミンは多種類の官能
基、例えばハロゲン化物、アシル基、オキシ基、メルカ
プト基、シアノ基、シリル基等で置換される。
この他に、アゾ基は活性化芳香族化合物、例えばフェ
ノールあるいはN,N−ジアルキルアニリン化合物と結合
する。さらに、チロシニル化合物はジアゾ基と結合し、
この場合チロシンは大きな分子、例えばオリゴペプチド
あるいは蛋白質の一部である。チロシンのかわりに、種
々のプリンあるいはピリミジンをアゾ基と結合させても
よく、この場合、プリンあるいピリミジンはモノマーま
たはRNAあるいはDNA一重鎖または二重鎖の一部である。
さらに、アミノ基は官能化され、種々の反応性官能
基、例えばイソシアネート、ウレタン、シアナミド等を
提供し、この場合、官能基はアルコール、アミン、ある
いはチオールと反応し、ウレタンおよびウレアを形成す
る。
アミノ基のかわりにヒドラジノ基が示されたようにし
てまたはジアゾ基の還元により製造され、この場合、ヒ
ドラジノ基は結合のサイトとして供給される。ヒドラジ
ノ基は種々の試薬により酸化されジアゾ基を形成し、ま
たは酸化窒素によりアジドを形成し、この場合、UV−輻
射によりアジド基はニトレンを形成する。反応性の高い
ニトレンは多種の化合物、特に不飽和化合物（脂肪族お
よび芳香族の両方）に浸入する。従って、アジリジンが
形成され、この物質に対する化合物の結合サイトを提供
する。
表面への結合ペプチドに関心があるため、多くの特定
の結合基あるいはスペーサーアームが、表面へペプチド
あるいは他の成分を結合させるに好ましい。結合基試薬
の１つの基は、アミドを形成するカルボキシ基を含む。
自然に現われ、結合サイトを提供するよう改質されるよ
うに、カルボン酸は多くの活性官能基により官能化さ
れ、ペプチドと共有結合を生ずる。
結合のための官能基は、アルデヒド、カルボキシエス
テル、ハロアセトアミド、メルカプト、およびジチオエ
ーテルを含む。カルボン酸基はさらにオキシ基、ヒドロ
キシあるいはエーテル、シアノ、置換アミノ遊離水素原
子、第四アンモニウム等で置換される。炭化水素鎖は脂
肪族または芳香族である。
特定の結合剤は、ｐ−ホルミル安息香酸、Ｎ−スクシ
ンイミジル酒石酸、酒石酸のモノヒドラジド、ｐ−ヨー
ドアセトアミド安息香酸、３−メルカプトプロピオン
酸、および５−α−ピリジ−３−ジチオプロピオン酸を
含む。
安定な結合を提供するため、カルボン酸以外の試薬、
例えばポリ（ジアルデヒド）、例えばポリグルタルアル
デヒドを用いてもよく、この場合、その後の反応のため
アルデヒドおよびオレフィン基を除去する。ミカエル
（Michael）付加によりアミノ基が付加する。
さらに、アミノ基を有効にジアゾ化し、得られるジア
ゾ基を種々の方法で用いる。ジアゾ基をオキシあるいは
チオ官能基で置換し、種々の基と結合する官能基を製造
し、求核官能基、例えばフェノール、アニリン、アミノ
等と反応させ、架橋を形成する、またはヒドラジノある
いはアミノ基に還元する。この架橋は支持体の目的によ
り比較的短かくてもまたは長くてもよい。
典型的結合基は、ジアミノポリエチレングリコールの
ビス−ｐ−ヒドロキシベンズアミドを含み、この場合、
１個のフェノール基はジアゾ基と結合し、他のフェノー
ル基はｐ−ジ（ジアゾ）ベンゼンあるいはp,p′−ジ
（ジアゾ）ビフェニルを介して核酸あるいは蛋白質に結
合する。ジアゾ基はチロシル基を介して直接蛋白質に結
合する。フェノール基は酸化エチレンにより伸長し、結
合基を提供し、この結合基はアミノ官能基を末端基とす
る。この架橋は、現場ペプチド合成に用途が見い出され
た。ヒドラジノ基は、アミノ基と同様にしてグリコール
開裂糖蛋白質に結合し、イミンあるいはシッフ塩基を形
成し、メチレンヒドラジンあるいはアミンに還元され
る。ヒドラジンはグリオキシル酸と結合し、結合用のカ
ルボキシ官能基を出す。
メルカプト基は結合用のチオールを提供しまたはジア
ゾ基はメルカプト基により置換され、ジアゾ基をジチオ
エリスリトールと反応させるようなチオエーテルを形成
する。
異なる合成過程を用いる他の架橋あるいは結合基も用
いられる。文献は、表面の官能基に対する結合分子、例
えば蛋白質、脂肪、糖、核酸および合成分子用の広範囲
の試薬および方法を示している。
架橋あるいは結合基は、単一の二価基、オリゴマーあ
るいはポリマー、例えばポリ（アミノ酸）、ポリウレタ
ン、ポリウレア、酸化ポリアルキレン、ポリエステル、
ポリアミド、核酸等である。ある場合、結合した分子が
表面から遊離するよう、開裂可能な結合を有することが
望ましい。従来酵素触媒を用いる、還元、酸化、加水分
解等により開裂される結合を用いる。従って、結合基
は、酵素、例えばジペプチダーゼ、例えばKEX1コラゲナ
ーゼ、パパイン、ノイラミンダーゼ、アミラーゼ、他の
エンドサッカリダーゼ、エンドヌクレアーゼ、ホスファ
ターゼ、ピロホスファターゼ用の特定の認識部位を含
み、この場合、結合はアミドエーテル、燐酸エステル、
等を含む。開裂可能な結合基は放出される成分中に存在
する同じ開裂可能な基の存在を避けるよう選択される。
多種類の物質に結合されることにより、本発明の生成
物は、診断、治療、加工、合成等のすぐれた適用が見い
出された。本発明の種々の基は直接アリール炭素原子ま
たはスペーサーあるいは結合アームに結合する。スペー
サーは立体的障害が関係し、固体物質からの基の分離が
関係し、または間隔が基に関する環境、例えば極性、電
荷、等を提供するところでの使用が見い出された。通
常、結合基は約１〜30個の原子またはそれ以上であり、
鎖中１〜20個の原子であり、炭素、酸素、窒素、硫黄、
燐、等を含む。スペーサーあるいは結合アームの選択
は、結合アームに含まれる官能基、特性、合成の都合、
スペーサーの長さにより異なる。
すでに示したように、異なる機能を有する多種類の分
子を、単分子層、あるいは所望により多分子層で有効に
表面に結合させ、多くの用途に用いられる。本発明の方
法は、結合および／または操作の有効性を高める多くの
情況において、表面に結合した分子の望ましい配列を提
供する。
結合した化合物は、配位子、例えばヘプテン並びに抗
原、受容体、例えば抗体、酵素、自然に生ずる受容体、
例えば表面膜蛋白質、植物凝集素、血液蛋白質、例えば
チロキシン結合グロブリン、錯生成剤、例えばクリプタ
ンド（cryptand）、クラウンエーテル、ポルフィリン、
フタロシアニン、等、核酸、RNAあるいはDNAまたはオリ
ゴヌクレオチド、染料、フルオレッサー（fluoresce
r）、ケミルミネッサー（chemiluminescer）、酵素（こ
の酵素は受容体というよりもむしろ触媒として用いられ
る）、酵素基質、阻害剤あるいは補助因子、同一あるい
は異なる分子の検出に重要であるまたは調節、単離、反
応、相互作用あるいは他の現象に用いられる他の分子を
含む。
文献には、アミノ官能基を介して固体表面にほとんど
すべての官能基を結合させるため用いられる基が多数示
されている。米国特許第3,817,837号は、蛋白質あるい
はヘプテンをアミノ官能基に結合させるため用いられる
多数の官能基が記載されている。アフィニティーカラ
ム、生理液からの成分の除去（aphoresis）、診断面、
クロマトグラフィー面、反応面への結合を示す他の文献
は、例えばBRLカタログ、Bio−Radカタログ、Sigmaカタ
ログ、Pierceカタログ、Pharmaciaカタログ等に示され
ている文献に見られる。重要な化合物を表面を結合させ
る方法は、様々である。特定の状況において、特性のた
め１種のスペーサーアームが選択される。
本発明の固体支持体は、Fab分画としてあるいは完全
な免疫グロブリンとして免疫グロブリンの配位を可能に
する。例えば、この物質のアミノ基をヨードアセチル化
し、続いて切断した免疫グロブリンの有効なメルカプト
基と反応させる。この他に、完全な免疫グロブリンをグ
リコール開裂剤、例えば過沃素酸塩で酸化し、得られる
ジアルデヒドをアミノ基あるいはヒドラジンと反応さ
せ、シッフ塩基あるいはイミンを形成する。
ポリアルキレングリコールアームを用いて核酸を固体
支持体に結合し、この場合、アルキレンは２〜３個の炭
素原子を有し、鎖は２〜100個、通常２〜30個のアルキ
レンオキシユニットを有する。結合基は、ジアシル化
α，ω−ジアミノポリエチレングリコール、例えばジア
ミノポリエチレングリコールのジメチルアミノベンゾイ
ル誘導体を有する固体支持体上のジアゾ官能基を用いる
ことにより達成される。ジメチルアミノ活性化アロイル
基は結合部位として用いられ、そこではジアゾ基に共有
結合し、他のものを他の化合物に結合するため用いられ
るよう放出する。この方法において、フェニレンジアミ
ン、ベンジジン、あるいは他のアリールジアミノ化合物
はジアゾ化され、ジメチルアミノアロイルと核酸の間の
結合を形成する。表面に核酸を結合させるためのジアゾ
基の使用は、すでに述べられた。
本発明の用途をここで述べる。重要な第１の用途は、
診断である。固体表面を含む診断は、固体表面が分離工
程を必要とせず含まれるような増大する数の診断プロト
コールが存在するが、大部分が分離工程を含む異質性と
される。診断において、配位子および受容体を含んでな
る特定の結合ペアーのメンバーの結合が重要であり、結
合し錯体を形成し、そこで特定の結合ペアーの均質なメ
ンバーは、互いに高い会合定数を有し、通常108/mol
以上である。
ヘプテンは一般的に約150〜5000ダルトンであり、通
常最大2000ダルトンであり、自然発生ホルモン、自然発
生薬剤、合成薬剤、汚染物、影響分子、成長因子、リン
ホカイン、アミノ酸、オリゴペプチド、化学的中間体、
ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド等を含む。そのよう
な化合物の診断は薬剤の誤用、治療投与量の監視、健康
状態、病気、例えば内毒素の検出である。蛋白質は多く
の診断、例えば細胞集団、血液型、病原体、病原体に対
する免疫応答、免疫錯体、糖類、自然発生受容体、等の
検出に重要である。受容体は、ヘプテン、蛋白質、他の
受容体への結合または病原体の存在、生理的液体中の特
定の蛋白質のレベル、多くのサンプル、例えば生理的液
体、空気、水等中のヘプテンの存在の検出に使用が見い
出された。核酸、補体ストランド等への蛋白質の結合の
検出において、核酸も使用が見い出された。
微生物および細胞（ウィルス、原核生物並びに真核生
物細胞、単細胞並びに多細胞生体細胞、例えば、菌類、
動物、哺乳類、等を含む）またはそのフラグメントの結
合が特に重要である。通常、これらの大きな凝集体は、
特定の結合ペアーメンバー複合体を介して表面に非共有
結合される。表面に結合した高密度の結合メンバーを有
することにより、細胞あるいはウィルスは多数の結合ペ
アーメンバーにより複合し、細胞、ウィルスあるいはフ
ラグメントのとても強い定着をおこなう。次いでこのシ
ステムを、特定の結合の除去に関係せず勢いよく処理を
行ない、非特異的結合した物質は、容易に除去される。
種々の分析物は検出するため、多数の案が存在する。
この案はシグナル発生システムの使用を含み、このシス
テムは直接あるいは間接的に検出されるラベルした結合
を含む。これらの方法は、染料、酵素、酵素基質あるい
は補助因子、酵素阻害剤、フルオレッサー（fluoresce
r）、ケミルミネッサー（chemiluminescer）、粒子等を
用いる。
本発明の目的のため、電磁線、特に紫外、可視あるい
は赤外部の光を検出する、サンプル中の分析物の存在に
関連してシグナルを提供すべきである。本発明の固体支
持体を用いることにより、通常誤差が著しい反射を必要
とするよりむしろ、固体支持体を通して光が検出され
る。さらに、米国特許第3,939,350号に記載されたよう
に、総内部反射を含む方法が用いられる。重要な案を記
載している他の特許は、米国特許第3,654,090号、3,85
0,752号、4,347,312号およびEPA2,963号を含む。
検定は種々の案に従い行なってよい。本発明に従い、
サンプルを本発明の固体支持体と接触させ、種々の操
作、例えば種々の試薬の添加、インキュベーション、洗
浄等を行なう。検定の最終結果は、分析物の存在あるい
は量に相応する光吸収あるいは光発生のいずれかにより
光を吸収あるいは発生する生成物の量により変化する。
通常、これは特異的結合ペアーの補足的メンバーの間の
特異的結合複合体の形成の結果であり、このメンバーの
１つは架橋として供給され、サンドイッチを形成する、
または単一の複合体である、または複合体は複合体結合
蛋白質、例えばS.aureus蛋白Ａ、リウマチ様因子、免疫
複合体に特異的な免疫グロブリン等と結合する。
蛍光マーカー、例えば蛍光粒子、蛍光共役抗体、等を
有することにより、サンプルをフルオレッサーおよび発
した光により吸収した光で輻射する。例えば、微小滴定
ウェルを有する場合、実質的に活性化光より生ずるバッ
クグランドを最小にして、ウェルの側面を通り発生した
蛍光を測定できる。染料をラベルとして用いた場合また
は反応、例えば酵素的に触媒化された反応の結果として
生じた場合、サンプルおよび容器を通り光は通過し、容
器による吸収のレベルは比較的低いので、分析物の存在
を示すものとして測定される。従って、本発明のシステ
ムにより感度の高い検定が用いられる。
同様に、雑種形成を含む核酸検定により、補足的シー
ケンスが存在するかどうかを決定する必要な工程を行な
うことができ、多くの案を用いることにより、着色した
あるいは蛍光ラベルまたはラベルの生成物を提供でき、
このラベルは補足的シーケンスの存在あるいは非存在を
示す。
例えば、アミノ官能基をジアゾ化し、活性化表面に共
有結合するよう核酸サンプルを加え、次いで例えばビオ
チンラベルを有することにより官能化されたシーケンス
に補足的なシーケンスを有するプローブを用いる。雑種
形成工程終了後、雑種形成により表面に結合したあらゆ
るビチオンに結合するアビジンに結合した酵素を加え
る。非特異的に結合したアビジンを洗浄して除去した
後、酵素の基質を加え、生成物の形成が補足的シーケン
スの存在および量を示す。
本発明の容器を病原菌の検出に用いてもよい。モノク
ロナール抗体を表面に結合し、キャッチ抗体を提供す
る。次いでサンプルを加え、抗体により認識されるエピ
トープを有する細胞を表面の抗体に結合させる。非特異
的に結合した細胞を、実質的に特異的に結合した細胞の
みを残して洗浄除去する。次いでキャッチ抗体により認
識されるエピトード以外のエピトードに特異的である容
器にラベルしたモノクローナル抗体を加える。抗体と細
胞の間の反応を行なうためインキュベートした後、非特
異的に結合した抗体を洗浄し、前記のようにしてラベル
の存在を測定する。
変法として、細胞受容体により認識される抗原が用い
られる。抗原は細胞を補えるため表面に結合し、細胞を
ラベルするためラベルした抗原が用いられる。この受容
体は表面免疫グロブリン（sIg）であってよい。このよ
うにして、特異的に結合した細胞の存在が決定され、そ
れにより表面に結合した受容体に対し補足的な抗原を有
し、そのような抗原に特異的なsIgを有する細胞が決定
される。抗原を有するかわりに、表面に抗原を非共有結
合するため、表面に結合した抗原に対する抗体を有す
る。
本発明の物質のアフィニティーカラム、クロマトグラ
フ、等に用いてもよく、その場合特定の物質が表面に結
合し、複合体形成あるいは他の結合が検出される。本発
明の固体支持体により、カラムの長さに沿って視覚的に
観察でき、複合体形成がおこる特定の部位を決定でき
る。この方法を診断に用いてもよく、この場合、異なる
抗原あるいは受容体カラムに沿った異なる部位において
結合し、その後、シグナルを加え、システム、例えば特
異的結合ペアーメンバー並びに展開剤の結合した酵素を
生じ、色形成の部位を検出する、 本発明の固体支持体は、種々の物質、例えば血漿蛋白
質、成長因子、凝固因子、抗凝固因子、等（これらは種
々の塩溶液により、複合体より解離される）の単離にお
ける使用が見い出された。
この固体支持体は、表面あるいは目に見えるところで
高密度の配位分子を与えたい、または容易に光を透過さ
せたい場合のような、他の目的に用いてもよく、その場
合この物質は、固体表面に非拡散結合する。
以下の例は説明するものであり、限定するものではな
い。
実 験 成形ポリスチレン製の96個のウェルを有する微小滴定
プレートのウェルに、テトラメチレンスルホン（TMS）
中0.5Mのテトラフルオロ硼素酸ニトロ溶液を入れ、37℃
で６時間反応を進行させる。この時間の最後に、反応混
合物を捨て、メタノールでウェルを洗う。次いでプレー
トに6N塩酸中の塩化第一錫の1M溶液を入れ、室温で２時
間反応を行ない、ニトロ基をアミノ基に還元する。1N塩
酸中の１％の亜硝酸ナトリウムを４℃で加え、20分反応
させ、得られるアミノ基をジアゾ化し、その後反応混合
物を洗浄し、チロシンを含む蛋白質の溶液をpH9.3の0.1
M硝酸中0.1,1.0、あるいは10mg/mlで４℃において加え
る。反応を16時間行ない、それにより蛋白質は表面に共
有結合する。
上記の反応法を繰り返すことにより、ニトロニウムイ
オンと等しい濃度の、0.5Mの濃度で水が硝化媒体中に含
まれる。
導入された官能価数を調べるため、化学分析用の電子
分光を用いる。チロシンにより蛋白質を共有結合するか
わりに、染料3,6−ジスルホネートナフトール−１を用
いた。この分析において、表面を軟かいＸ線で輻射し、
そこで放出された電子はＸ線が衝突した原子の種類の作
用である。与えられたエネルギーの電子の数は、与えら
れた種類の原子の数を反映する。以下の表に結果を示
す。
次に、活性化Ｔ−25フラスコへの35S−メチオニンラ
ベルアビジンの結合を説明する。
A.〔35S−met〕−ラベルアビジンｔ−boc−〔35S−メ
チオニン〕−Ｎ−スクシンイミジルエステル（Amersha
m,830Ci/mmole）を、供給者の反応条件を用いるアビジ
ンのリジン残基のε−アミノ基をラベルするため用い
た。ラベルしたアビジンを、0.1M硼酸バッファー、pH9.
3中のアビジンの10mg/ml溶液に希釈し、最終比活性428d
pm/μｇを与えた。
B.表面アニリン基および〔35S−met〕−ラベルアビジ
ンの共有結合を含むＴ−25フラスコのジアゾ化、 25フラスコを37℃で16時間5mlの0.5Mテトラフルオロ
硼素ニトロでニトロ化する。反応媒体をデカントし、蒸
留水で洗浄後、6N HCl中の1Mの塩化第一錫5mlを加え、
室温で２時間反応させた。このフラスコを0.01NのHClで
洗い、アミノ官能化表面を与える。
次いでアミノ基を、冷（４℃）1N HCl中の２％亜硝酸
ナトリウム5mlを加え、続いて４℃で20分間台攪拌器で
穏やかに攪拌することによりジアゾ化した。得られるジ
アゾニウム官能化フラスコを冷0.01N HClで洗い、0.1M
硼酸バッファー、pH9.3中の冷10mg/ml〔35S−met〕−ラ
ベルアビジン2.5mlを加えた。４℃で16時間穏やかに攪
拌した後、フラスコの内容物を吸出し、洗浄液の総カウ
ントが2000dpm以下になるまで室温においてこのフラス
コを0.1M硼酸バッファーで洗った。結合したアビジンの
ほぼ3/4のサブユニットが、室温において48時間６％ド
デシル硫酸ナトリウム（SDS）/0.1Mジチオスレイトール
（DTT）2.5mlによる処理によって除去された。SDS/DTT
溶出液中に回収されたdpmおよび〔35S−met〕−ラベル
アビジンに基づき、活性化Ｔ−25フラスコに共有結合し
たアビジンの量が計算された、以下の表に結果を示す。
次に、架橋基としてポリグルタルアルデヒドを用い
た。
RembaumらのJ.Immun.Methods（1978）24:239頁の方法
に従い、ポリグルタルアルデヒドを製造した。この生成
物を90℃で真空乾燥し、脱水を完了させ、残留している
モノマーグルタルアルデヒドを除去する。乾燥したPGを
無水TMSに37℃で溶解し、10mg/ml溶液を与える。Ｔ−25
アミン官能化フラスコにTMS溶液を5ml加え、このフラス
コを37℃で16時間インキュベートした。温TMSおよび蒸
留水で洗浄した後、0.1M硼酸バッファー、pH9.3中の〔
35S−met〕−ラベルアビジン2.5mlを加え、このフラス
コを室温で16時間インキュベートした。0.1M硼酸バッフ
ァー、pH9.3により洗浄後、前記のようにして６％SDS/
0.1M DTTにより〔35S−met〕−ラベルアビジンサブユニ
ットを解離し、放射活性をカウントした。PG処理したフ
ラスコの結合したアビジンの計算量を前記表に示す。
アビジンのかわりに〔35S−メチオニン〕を用いて前
記実験を繰り返した。ポリグルタルアルデヒド誘導化フ
ラスコを、37℃で16時間、0.1M NaHCl3中の0.1M冷メチ
オニンに希釈した〔35S−メチオニン（Amersham）、125
0Ci/mmole〕より製造した0.1M〔35S〕−メチオニン、28
3dpm/mmole 5mlにインキュベートした。0.5M NaClで洗
浄後、このフラスコを蒸留水で洗い、乾燥し破壊した。
フラスコの底の破片を集め、重量を測り、カウントし
た。フラスコの底の既知重量（3.2g/25cm3）、回収され
た〔35S−メチオニン〕の比活性およびカウントより、
フラスコの底に共有結合したメチオニンの量は43nmole/
cm2であると計算された。
次に、Immulon2プレート（Dynatech）の使用が研究さ
れた。
テトラメチレンスルホン（TMS,Phillips）中のテトラ
フルオロ硼酸ニトロニウム（Fluka,0.5M）の溶液を製造
し、0.9％H2Oとした。この溶液をDrierite乾燥カラムお
よび循環ブロワーをとり付けたグローブボックス内のTr
anstar 96（Costar）送出システムにより96個のウェル
を有するDynatech Immulon2プレートに加えた。このプ
レートの各ウェルに100μのTMS溶液を加え、このプレ
ートを酢酸セルロースカバー（Dynatech）でシールし、
穏やかに攪拌しながら37℃で６時間インキュベートし
た。インキュベート後、プレートのシールを除き、ニト
ロ化溶液を出し、多量のH2Oで洗った。
あらかじめ製造したおいたニトロ化プレートを乾燥
し、各ウェルに6N HCl中の0.1M SnCl2を200μ加え
た。このプレートを室温で２時間振盪し、多量のH2Oで
洗浄した。このプレートを2N HCl（200μ／ウェル）
で４℃において貯蔵しまたはH2O洗浄後直接用いてもよ
い。
誘導されたアミンプレートを乾燥し、４℃に冷却し
た。1N HCl中の２％NaNOの溶液を４℃で製造し、この溶
液200μを96−ウェルプレートに加えた。４℃で30分
間振盪後、このプレートを乾燥し、冷（４℃）で0.01N
HClで洗浄し、種々の蛋白質塗布溶液で処理した。
0.1硼酸（Na+）、pH9.2中の35S−ラベルヒトIgG（Sig
ma）を、10,1.0,0.1および0.01mg/mlで製造した。0.2％
Tween20存在で1.0,0.1および0.01mg/ml溶液も製造し
た。前記の誘導ジアゾニウムプレートを、４℃で蛋白溶
液で製造した後すぐに処理した。正確に同じ方法で、未
誘導のImmulon2プレートを４℃で被覆した。96時間イン
キュベーション後、過剰の被覆溶液をプレートから除去
し、このウェルを４℃で48時間PBSで洗浄した（７×15m
l）。次いでこのプレートをシンチレーション液に入
れ、カウントした。以下の表３に結果を示す。
次にヒドラゾン結合を用いることによる、アミノ官能
化ポリスチレン表面への免疫グロブリンの結合を研究し
た。
Ｏ′ShannessyらのImmunol.Lett.（1985）８:273〜27
7頁の方法に従い、0.1Mアセテート（Na+）、pH5.5中のI
gG（モノあるいはポリクローナル）の溶液2mg/mlを４℃
に冷却した。
この溶液をH2O中の0.25M NaIO4の適当量で処理し、総
IO4 -濃度を10mMにし、この溶液を４℃で１時間穏やかに
攪拌した。粗生成物をＧ−10カラム（0.1Mアセテート、
pH＝5.5）（ベッド体積10ml/反応混合物1ml）で精製し
た。典型的にはボイド体積は、同じ体積で70％の最初の
蛋白質を含む。酸への酸化を避けるため、すぐにアルデ
ヒド溶液を用いた。
前記の酸化IgG溶液に酒石酸ジヒドラジンを加え（Lut
terら、FEBS Lett.（1974）48:288〜292頁）、酒石酸ジ
ヒドラジン中0.5Mの濃度にした。30分振盪後、溶液は透
明になった。２時間後、この溶液をＧ−10カラム（0.1M
アセテート、pH＝5.5）（ベッド体積10ml/反応混合物1m
l）に通すことによって反応を停止し、４℃で透析した
（0.1Mアセテート、pH5.5、１、８時間および２、
８時間）。Ｇ−10カラム（0.1Mアセテート、pH＝5.5）
（ベッド体積10ml/透析した溶液1ml）により最終精製を
行った。ボイド体積は、最初の酸化蛋白質を50％含むこ
とがわかった。この溶液を0.1mg/ml（A280＝0.160）に
希釈し、アルデヒド表面への被覆に用いた。
氷酢酸中0.25Mのテトラフタルアルデヒドの溶液を、
前記のようにして製造したアミノポリスチレン表面（0.
15ml/cm2）に塗布した。室温で２時間反応を行った。次
いでこの溶液を除去し、表面を無水エタノールで15分
間、計６回洗った。バッファーで１度洗浄後（1ml/c
m2、0.1Mアセテート、pH＝5.5）、表面をすぐにIgGヒド
ラジドで処理した。
IgGヒドラジド（0.1mg/ml、0.1Mアセテート、pH＝5.
5）をあらかじめ製造したアルデヒド表面に、室温で14
時間穏やかに振盪あるいはローリングすることにより塗
布した。蛋白質の消耗は、IgGヒドラジドの224nmの吸収
の減少により検知される。表面をPBSで５回（1ml/cm2）
洗い、必要とするまで４℃で貯蔵した。
他の方法 10％水性酢酸中の酒石酸ジヒドラジドの0.5M溶液を、
室温で２時間あらかじめ製造したアルデヒド表面に塗布
した（0.15ml/cm2）。この溶液を吸い出し、表面を多量
のH2Oで洗浄した。
0.1Mアセテート、pH＝5.5中の酸化IgGの0.1mg/ml溶液
を、室温で18時間穏やかに攪拌しながらインキュベート
することにより、あらかじめ製造したアルデヒド／ヒド
ラジド表面（0.10ml/cm2）に塗布した。この溶液を吸い
出し、表面を５回PBSで洗浄し（1ml/cm2）、必要まで４
℃で貯蔵した。
次に、ポリスチレンビーズを免疫グロブリンにより官
能化した。
前記方法に従い、ポリスチレンビーズ（直径1/4およ
び1/8インチ、鏡面仕上）をアミン官能化した。ビーズ
の１部をジアゾ化し、ビーズの３種の群、つまり未処
理、アミン官能化、およびジアゾ化、を0.1M硼酸バッフ
ァー、pH9.2中の10mg/ml〔35S−met〕−ラベルヒトIgG
〔35S−IgG〕と４℃で16時間インキュベートした。反応
後、〔35S−IgG〕−ラベルビーズを４℃において0.5M N
aClを含む0.1M硼酸バッファー、pH9.2で洗浄した。洗浄
液が未処理ビーズに対して200dpm以下、ジアゾ化ビーズ
に対し2000dpm以下になるまで洗浄を続けた。Opti−Flu
or（Packard）内で直接ビーズをカウントすることによ
り〔35S−IgG〕の量、比活性1.48dpm/mgを測定した。結
果を下の表に示す。
次に、高レベルの有効な結合部位を与えるアミン官能
化Ｔ−25フラスコへ抗体を結合させた。
Ｔ−25フラスコ中で50mgのｐ−ホルミル安息香酸（FB
A）と450mlのトシレートＮ−シクロヘキシルを合わせ、
TMS10ml中のＮ′−（Ｎ″−メチルモルホリノ−２−エ
チル）カルボジイミドとこの混合物を30分間音波処理し
た。このFBA官能化フラスコを氷酢酸中のスクシン酸ジ
ヒドラジド（0.2M）と室温において２時間台ロッカー上
で接触させた。次いでこのフラスコを蒸留水で５回、0.
1Mバッファー、pH9.2で３回、蒸留水で３回、イソプロ
パノールで３回、および蒸留水で３回洗った。このフラ
スコを使用するまでアセテートバッファー（0.1M、pH5.
5）と共に室温で貯蔵した。
抗−Leu−１モノクロナール抗体を、前記のようにし
て酸化し、前記のようにヒドラゾンを形成するよう結合
させた。得られる抗Leu−１結合フラスコを以下の研究
に用いた。
以下のようにして、ヒト血液から単球−放血液血液リ
ンパ球を調整した。淡黄色のコート細胞を75mlのHBSS−
Ｅ（1mMのEDTAを含むHank′s Balanced Salt Solutio
n）に加え、よく混合した。この血液−HBSS−Ｅ溶液を
４分し、50ccの円筒遠心チューブに入れた。この溶液は
約14mlのあらかじめ温めたヒストパック（Histopaque）
により下層となる。細胞を室温において30分間1500rpm
で遠心した。界面層を取り出し、細胞をHBSS−Ｅで１回
洗った。室温において10分間1000rpmで遠心後、上澄液
を吸い出し、細胞を冷却した。次いで細胞を２回以上洗
浄し、再びHBSS−Ｅ（Hank′ｓ−カルシウムおよびマグ
ネシウムを含まない）＋１％血清（EDTAを含まない）に
懸濁し、Ｔ−75フラスコに移した。このフラスコをその
側面で37℃で30分間インキュベートし、単球を表面に結
合させた。30分後、フラスコ内容物を穏やかに振ること
によって、結合していない細胞を除去した。このフラス
コをHBSS−CMFで２回洗い、室温において10分間1000rpm
で遠心することによって結合していない細胞を集めた。
次いでこの細胞を１％血清を含むHBSS−Ｅに再び懸濁し
た。フラスコあたり2.7×107個の細胞をＴ−25フラスコ
に入れた。20〜30分間隔で細胞懸濁液を穏やかに振りな
がら、フラスコを室温で１〜２時間インキュベートし
た。その時間の最後に結合していない細胞懸濁液を除去
し、HBSS−Ｅで３回フラスコを洗浄し、残っている結合
していない細胞を除去した。
前記のようにして製造した抗−Leu−１表面と共に室
温で1.5時間20分ごとに混合してインキュベーションし
た後、結合していない細胞を染色用に回収した。結合し
た細胞をカウントした。25×106個の細胞を99％生存で
入れた。25×106個の細胞がフラスコに結合した。比結
合細胞を蛍光活性化細胞選別（FACS）により分析し、Le
u−１およびLeu−４細胞それぞれ98.7％および95％の消
耗を示した。4mMの塩化マグネシウム溶出後、このフラ
スコを20×106PBL（単球消耗）と共に再利用した。Leu
−１およびLeu−４の99％および91％消耗が得られた。
上記結果より、本発明が従来の有効な固体支持体、特
に容器、スライド、ビーズ、ウェル、等に実質的改良を
与えることが明らかである。本発明に従い、表面での物
質の定着を確実にする方法で、高濃度の物質を表面に塗
布できる。従って、多種類の重要な化合物の測定あるい
は単離における高い効果および感度用に少量が用いられ
る。アミノ官能性はとても多能な官能性であるので、直
接あるいはスペーサーアームを介してのいずれかで種々
の官能性を表面に結合するために比較的簡単な方法が開
発される。高い透明度が得られることにより、反応を観
察することができ、細胞生長を観察でき、表面を透過し
測定でき、より高い有効性および感度を与える。さら
に、高レベルのエピトープおよび結合部位が与える望ま
しい配位子および受容体の配位が達成される。
上記結果より、本発明が多種類の用途に用いられる実
質的に改良された固体支持体を提供することが明らかで
ある。表面に存在する高率の有効なアリール基が官能化
され、多数の重要な分子が共有あるいは非共有のいずれ
かで表面に結合し、官能性の高い固体表面を提供する。
この方法において、多くの方法、診断、治療、加工等が
少量を用い、および改良された結果を有し、より高い有
効性で実行される。
前記発明は、理解をより明確にするため例によって詳
細に記載されたが、請求の範囲において変化および改良
を行ってもよいことは明らかであろう。

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】表面の少なくとも一部が求電子試薬により
    官能化されたポリスチレン固体支持体を含み、前記表面
    の一部において化学分析用の電子分析（ESCA）により測
    定したところアリール基の少なくとも５％が100Åの深
    さまで前記求電子試薬により官能化されており、残りの
    アリール基が実質的に未置換であり、そして得られる官
    能化された支持体が光学的に透明である物品。
  2. 【請求項２】前記アリール基の少なくとも25％が100Å
    の深さまで前記求電子試薬で置換されている、請求項１
    記載の物品。
  3. 【請求項３】前記アリール基の100％が100Åの深さまで
    前記求電子試薬で置換されている、請求項２記載の物
    品。
  4. 【請求項４】前記求電子試薬が、アミノ、アゾ、ヒドロ
    キシもしくはメルカプト置換基である極性基に転化され
    ている、請求項１〜３のいずれか記載の物品。
  5. 【請求項５】配位子、受容体、または核酸が直接もしく
    はスペーサーアームを介して前記アミノ、アゾ、ヒドロ
    キシ、またはメルカプト基に共有結合している、請求項
    ４記載の物品。
  6. 【請求項６】前記配位子、受容体、または核酸が特定の
    結合ペアーのメンバーである、請求項５記載の物品。
  7. 【請求項７】サンプルから分析物を検出または除去する
    方法であって、分析物を含むサンプルを請求項６記載の
    物品と接触させることを含み、前記分析物が前記特定の
    結合ペアーと結合することができ、物品に結合した分析
    物を検出または回収することを含む方法。
  8. 【請求項８】分析物が細胞または微生物である、請求項
    ７記載の方法。
  9. 【請求項９】分析物が医薬、汚染物、影響分子、成長因
    子、リンホカイン、アミノ酸、オリゴペプチド、化学的
    中間体、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドであ
    る、請求項７記載の方法。
  10. 【請求項１０】ポリスチレン固体支持体の表面の少なく
    とも一部が官能化されており、前記表面の一部の官能化
    度が高くかつ得られる官能化された支持体が光学的に透
    明である請求項１記載の物品の製造方法であって、以下
    の工程 前記ポリスチレン固体支持体の表面の少なくとも一部
    を、置換する求電子試薬と接触させ、この求電子試薬は
    溶媒中でイオン化を示すアニオンと配位しており、従っ
    てカチオンであり、ポリスチレンは前記溶媒中に溶解せ
    ずかつ前記溶媒中で膨潤しないものである、そして前記
    カチオンにより前記表面の一部においてアリール基を官
    能化することを含む方法。
  11. 【請求項１１】前記溶媒が、配位からアニオン及び溶媒
    を共に求電子試薬カチオンで置換することのできるオキ
    シ極性化合物をさらに含み、前記オキシ極性化合物が0.
    05〜１の求電子試薬に対するモル比で存在する、請求項
    10記載の方法。
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