JPH08154674A - 新規リパーゼ、その製造法及びその用途 - Google Patents
新規リパーゼ、その製造法及びその用途Info
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- JPH08154674A JPH08154674A JP7070589A JP7058995A JPH08154674A JP H08154674 A JPH08154674 A JP H08154674A JP 7070589 A JP7070589 A JP 7070589A JP 7058995 A JP7058995 A JP 7058995A JP H08154674 A JPH08154674 A JP H08154674A
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】PUFA高含有油脂により高い活性を示す新規リパ
ーゼ、その製造法及びその用途に関する。 【構成】PUFA含有油脂においてPUFAによく作用し、且
つ、不飽和脂肪酸含有トリグリセライドに対し、不飽和
度が高い程、良く作用する基質特異性を有する新規リパ
ーゼ、該リパーゼ生産能を有するシュードモナス属の菌
株を栄養培地で培養し、培養物中に該リパーゼを生成せ
しめ、これを採取する新規リパーゼの製造法及び該新規
リパーゼの用途。
ーゼ、その製造法及びその用途に関する。 【構成】PUFA含有油脂においてPUFAによく作用し、且
つ、不飽和脂肪酸含有トリグリセライドに対し、不飽和
度が高い程、良く作用する基質特異性を有する新規リパ
ーゼ、該リパーゼ生産能を有するシュードモナス属の菌
株を栄養培地で培養し、培養物中に該リパーゼを生成せ
しめ、これを採取する新規リパーゼの製造法及び該新規
リパーゼの用途。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規リパーゼ、その製
造法及びその用途に関する。更には、シュードモナス属
の生産する高度不飽和脂肪酸含有油脂に顕著に作用する
新規リパーゼ、その製造法及びその用途に関する。
造法及びその用途に関する。更には、シュードモナス属
の生産する高度不飽和脂肪酸含有油脂に顕著に作用する
新規リパーゼ、その製造法及びその用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来発見されているリパーゼは、エイコ
サペンタエン酸（以下、EPAという）、ドコサヘキサエ
ン酸（以下、DHAという）、アラキドン酸等の高度不飽
和脂肪酸（以下、PUFAという）含有トリグリセリドに
は、作用し難いと言われており、例えば、 Bottino等
は、鯨油に含まれるEPAやDHAのエステルが膵臓リパーゼ
による加水分解を受けがたい事を示し〔Lipids、第２
巻、489-493頁（1967年）〕、そして、Jensen等も、二
重結合位置の異なる15種のcis-オクタデセン酸を含む合
成グリセリドに対する膵リパーゼの特異性を検討し、７
−位以下に二重結合位置を持つcis-オクタデセン酸に難
分解性を示すこと〔Lipids、第８巻、45-47頁（1973
年）〕、且つ又、Geotrichum candidum 由来のリパーゼ
においても９−位の二重結合に難分解性を示すことを明
らかにしている〔Lipids、第７巻、738-741頁（1972
年）〕。
サペンタエン酸（以下、EPAという）、ドコサヘキサエ
ン酸（以下、DHAという）、アラキドン酸等の高度不飽
和脂肪酸（以下、PUFAという）含有トリグリセリドに
は、作用し難いと言われており、例えば、 Bottino等
は、鯨油に含まれるEPAやDHAのエステルが膵臓リパーゼ
による加水分解を受けがたい事を示し〔Lipids、第２
巻、489-493頁（1967年）〕、そして、Jensen等も、二
重結合位置の異なる15種のcis-オクタデセン酸を含む合
成グリセリドに対する膵リパーゼの特異性を検討し、７
−位以下に二重結合位置を持つcis-オクタデセン酸に難
分解性を示すこと〔Lipids、第８巻、45-47頁（1973
年）〕、且つ又、Geotrichum candidum 由来のリパーゼ
においても９−位の二重結合に難分解性を示すことを明
らかにしている〔Lipids、第７巻、738-741頁（1972
年）〕。
【０００３】このため、従来、微生物リパーゼのPUFA含
有トリグリセリドに対する難分解性を利用して、魚油中
のPUFAをグリセリン残基に残し、油脂中のPUFAを濃縮す
る方法が盛んになされている（特開昭61-15692号、特開
昭61-15693号、特公平4-10519号、特公平5-33988号）。
有トリグリセリドに対する難分解性を利用して、魚油中
のPUFAをグリセリン残基に残し、油脂中のPUFAを濃縮す
る方法が盛んになされている（特開昭61-15692号、特開
昭61-15693号、特公平4-10519号、特公平5-33988号）。
【０００４】しかしながら、一方、従来の微生物リパー
ゼのPUFA含有油脂に対する作用が極めて低いにも係わら
ず、その微弱な作用を利用してPUFA含有油脂を直接的に
改質しようとする試みもなされている。例えば、長田等
は、４種類の微生物固定化リパーゼを用いてアシドリシ
スを行い、イワシ油の改質を検討し、Chromobacterium
visucosumおよびMucor mieheiのリパーゼがPUFA含有油
脂に対し、僅かではあるが活性を示すことを明らかに
し、これらリパーゼを用いてPUFAを高濃度に含む遊離脂
肪酸から、直接PUFAを高濃度に含むトリグリセリドを合
成している〔油化学、第39巻、467-471頁（1990年）、
日本水産学会誌、第57巻、119-125頁（1991年）〕。
ゼのPUFA含有油脂に対する作用が極めて低いにも係わら
ず、その微弱な作用を利用してPUFA含有油脂を直接的に
改質しようとする試みもなされている。例えば、長田等
は、４種類の微生物固定化リパーゼを用いてアシドリシ
スを行い、イワシ油の改質を検討し、Chromobacterium
visucosumおよびMucor mieheiのリパーゼがPUFA含有油
脂に対し、僅かではあるが活性を示すことを明らかに
し、これらリパーゼを用いてPUFAを高濃度に含む遊離脂
肪酸から、直接PUFAを高濃度に含むトリグリセリドを合
成している〔油化学、第39巻、467-471頁（1990年）、
日本水産学会誌、第57巻、119-125頁（1991年）〕。
【０００５】そして又、ドコサヘキサエン酸とグリセリ
ンを基質とし、固定化リパーゼを用いてDHAトリグリセ
リドを合成する試みもなされている（特開平5-33110
5）。
ンを基質とし、固定化リパーゼを用いてDHAトリグリセ
リドを合成する試みもなされている（特開平5-33110
5）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】しかし、既存のリパー
ゼのPUFA含有油脂に対する作用は、極めて微弱であり、
そのため、魚油などのPUFA含有油脂の加水分解や改質、
又長鎖或いは、高度不飽和脂肪酸を調製するに際して、
そのエステル合成反応、エステル交換反応、アシドリシ
ス、およびアルコリシス等を、既存のリパーゼを用いて
効率的に行う事は極めて困難であり、PUFA含有油脂によ
り高い活性を示す新たなリパーゼが求められていた。
ゼのPUFA含有油脂に対する作用は、極めて微弱であり、
そのため、魚油などのPUFA含有油脂の加水分解や改質、
又長鎖或いは、高度不飽和脂肪酸を調製するに際して、
そのエステル合成反応、エステル交換反応、アシドリシ
ス、およびアルコリシス等を、既存のリパーゼを用いて
効率的に行う事は極めて困難であり、PUFA含有油脂によ
り高い活性を示す新たなリパーゼが求められていた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】このような現状を鑑み、
本発明者等は、PUFA含有油脂に対し高い活性を示す新規
なリパーゼを生産する菌の探索を行い、目的とするリパ
ーゼを生産する微生物を見いだすことに成功した。
本発明者等は、PUFA含有油脂に対し高い活性を示す新規
なリパーゼを生産する菌の探索を行い、目的とするリパ
ーゼを生産する微生物を見いだすことに成功した。
【０００８】そして、得られたリパーゼは、PUFA含有油
脂によく作用する基質特異性を有する新規リパーゼであ
ることを知り、本発明を完成した。
脂によく作用する基質特異性を有する新規リパーゼであ
ることを知り、本発明を完成した。
【０００９】本発明の酵素生産菌は、新たに土壌から発
見、分離されたものであり、その菌学的性質は、下記の
通りである。
見、分離されたものであり、その菌学的性質は、下記の
通りである。
【００１０】(1) 形態 大きさ：0.5〜0.7×1.0〜3.0μｍ 桿菌 グラム染色性：陰性 運動性：多極鞭毛運動 胞子の有無：無
【００１１】(2) 各培地における生育状態 肉汁寒天平板培養：円形、光沢有り、凸状、柔らか、淡
黄色〜淡褐色 肉汁ゼラチン穿刺培養：ゼラチンを液化する。 リトマス・ミルク培養：ペプトン化する。
黄色〜淡褐色 肉汁ゼラチン穿刺培養：ゼラチンを液化する。 リトマス・ミルク培養：ペプトン化する。
【００１２】(3) 生理学的性質 酸素要求性：好気性 OF 型：酸化 カタラーゼ：陽性 オキシダーゼ：陽性 ＶＰ反応：陰性 インドールの生成：陰性 硝酸塩の還元性：陰性 脱窒反応：陰性 硫化水素の生成：陰性 ウレアーゼ：陽性 クエン酸分解：陽性 カゼイン分解：陽性 チロシン分解：陽性 デンプンの加水分解：陰性 DNA分解：陰性 アルギニン分解：陽性 エスクリン分解：陰性 糖類からの酸生成：Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、
Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンニット
から酸を生成するが、乳糖、麦芽糖、白糖、サリシンか
らは酸を生成しない。 色素産生：ピオシアニン 陰性 ピオベルジン 陽性 生育温度の範囲：４〜37℃で生育（最適25〜33℃） 生育pHの範囲：pH4.6〜9.6（最適 pH６〜8.5） 生育食塩濃度：０〜５％
Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンニット
から酸を生成するが、乳糖、麦芽糖、白糖、サリシンか
らは酸を生成しない。 色素産生：ピオシアニン 陰性 ピオベルジン 陽性 生育温度の範囲：４〜37℃で生育（最適25〜33℃） 生育pHの範囲：pH4.6〜9.6（最適 pH６〜8.5） 生育食塩濃度：０〜５％
【００１３】以上の菌学的性質について、Bergey's Man
nual of Determinative Bacteriology、第８巻（1974
年）及びBergey's Mannual of Systematic Bacteriolog
y、第１巻（1984年）を参照し、本菌をシュードモナス
・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescns）に属す
る菌と同定し、シュードモナス・フルオレッセンス（Ps
eudomonas fluorescens）3−80と命名した。尚、本菌
は、FERM P-14166として、工業技術院生命工学工業技術
研究所に寄託されている。
nual of Determinative Bacteriology、第８巻（1974
年）及びBergey's Mannual of Systematic Bacteriolog
y、第１巻（1984年）を参照し、本菌をシュードモナス
・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescns）に属す
る菌と同定し、シュードモナス・フルオレッセンス（Ps
eudomonas fluorescens）3−80と命名した。尚、本菌
は、FERM P-14166として、工業技術院生命工学工業技術
研究所に寄託されている。
【００１４】本菌を培養して、本発明の酵素を生産する
には、窒素源として、ペプトン、肉エキス、酵母エキ
ス、コーンスティープリカーなど、通常、微生物の培養
に使用される有機窒素源、或いは塩化アンモニウム、硫
酸アモニウム、尿素、硝酸アンモニウムなどの無機窒素
源が使用される。炭素源としては、ラード、バター、魚
油、鯨油などの動物性油脂、オリーブ油、大豆油、米糠
油、綿実油、ゴマ油などの植物性油脂、オレイン酸、パ
ルミチン酸、リノレイン酸などの脂肪酸類及びフラクト
ース、グルコース、マンノース、ガラクトース、異性化
糖、蔗糖、マルトース、キシロース、ソルビトール、マ
ンニトール、グリセロール、澱粉など、種々の糖、糖ア
ルコール及び澱粉やデキストリンなども使用することが
できる。
には、窒素源として、ペプトン、肉エキス、酵母エキ
ス、コーンスティープリカーなど、通常、微生物の培養
に使用される有機窒素源、或いは塩化アンモニウム、硫
酸アモニウム、尿素、硝酸アンモニウムなどの無機窒素
源が使用される。炭素源としては、ラード、バター、魚
油、鯨油などの動物性油脂、オリーブ油、大豆油、米糠
油、綿実油、ゴマ油などの植物性油脂、オレイン酸、パ
ルミチン酸、リノレイン酸などの脂肪酸類及びフラクト
ース、グルコース、マンノース、ガラクトース、異性化
糖、蔗糖、マルトース、キシロース、ソルビトール、マ
ンニトール、グリセロール、澱粉など、種々の糖、糖ア
ルコール及び澱粉やデキストリンなども使用することが
できる。
【００１５】以上の窒素源と炭素源のほか、補足する培
地成分として、リン酸塩、マグネシウム塩、マンガン
塩、バリウム塩などが添加される。培養はpH５〜９、温
度25〜40℃で１〜４日間程度、通気攪拌等の好気的培養
で行い、リパーゼを主に菌体外に生成蓄積せしめる。菌
体外に蓄積したリパーゼは、培養後、遠心、濾過等によ
り除菌し、除菌液を硫酸アンモニウム塩析、或いはアセ
トン、アルコール等を用いる有機溶媒沈澱などの種々の
方法で処理することにより、培養液から取得することが
できる。
地成分として、リン酸塩、マグネシウム塩、マンガン
塩、バリウム塩などが添加される。培養はpH５〜９、温
度25〜40℃で１〜４日間程度、通気攪拌等の好気的培養
で行い、リパーゼを主に菌体外に生成蓄積せしめる。菌
体外に蓄積したリパーゼは、培養後、遠心、濾過等によ
り除菌し、除菌液を硫酸アンモニウム塩析、或いはアセ
トン、アルコール等を用いる有機溶媒沈澱などの種々の
方法で処理することにより、培養液から取得することが
できる。
【００１６】更に高度に精製された酵素標品は、疎水性
担体或いはイオン交換体によるクロマトグラフィーやゲ
ルろ過による分子篩クロマトグラフィーを行うことによ
り得ることができる。
担体或いはイオン交換体によるクロマトグラフィーやゲ
ルろ過による分子篩クロマトグラフィーを行うことによ
り得ることができる。
【００１７】一方、菌体内酵素は、菌体破砕後、遠心分
離等で無細胞抽出液を調製し、同様の精製法で取得する
ことができる。
離等で無細胞抽出液を調製し、同様の精製法で取得する
ことができる。
【００１８】以下、こうして得られた本発明の酵素の理
化学的性質について記載する。
化学的性質について記載する。
【００１９】(a) 作用 本発明の酵素は、PUFA含有油脂によく作用し、PUFAを効
率的に生成せしめる。
率的に生成せしめる。
【００２０】(b)基質特異性 本発明の酵素を炭素数18の飽和及び不飽和脂肪酸含有油
脂に作用させたとき、炭素鎖18-0の飽和脂肪酸よりも炭
素鎖18-1,18-2及び18-3の各種不飽和脂肪酸含有トリグ
リセリドによく作用し（図１に示される。）、又、炭素
数20及び炭素数22の各種不飽和脂肪酸含有トリグリセリ
ドに対しても良く作用する。
脂に作用させたとき、炭素鎖18-0の飽和脂肪酸よりも炭
素鎖18-1,18-2及び18-3の各種不飽和脂肪酸含有トリグ
リセリドによく作用し（図１に示される。）、又、炭素
数20及び炭素数22の各種不飽和脂肪酸含有トリグリセリ
ドに対しても良く作用する。
【００２１】試験例１ トリオレイン 200mg、0.1M PIPES-NaOH緩衝液（pH7.0）
２ml、100 mM CaCl2 0.1ml、本発明のリパーゼ 25単位
を平底ガラス容器（３×６cm）に入れ、２cmの攪拌子で
500rpmで攪拌し、37℃、20分間反応させ反応後油分をジ
エチルエーテルで抽出し分解物をイアトロスキャンTH10
（ヤトロン社製）にて分析した。その結果、加水分解率
16.8％で１，３−ジオレインは僅かであり（0.4 mol
％）、１，２−ジオレインが多く（28.6 mol％）生成し
ていた。
２ml、100 mM CaCl2 0.1ml、本発明のリパーゼ 25単位
を平底ガラス容器（３×６cm）に入れ、２cmの攪拌子で
500rpmで攪拌し、37℃、20分間反応させ反応後油分をジ
エチルエーテルで抽出し分解物をイアトロスキャンTH10
（ヤトロン社製）にて分析した。その結果、加水分解率
16.8％で１，３−ジオレインは僅かであり（0.4 mol
％）、１，２−ジオレインが多く（28.6 mol％）生成し
ていた。
【００２２】(c) 至適pH 至適pHは、約７〜９付近に認められた〔基質オリーブ油
を0.1Ｍの各緩衝液の下で、37℃、20分反応（図２に示
される。）〕。尚、図中で黒丸は、Macllvaine緩衝液、
黒四角は、Glycine-NaOH緩衝液、白三角は、Tris-HCl緩
衝液をそれぞれ示す。
を0.1Ｍの各緩衝液の下で、37℃、20分反応（図２に示
される。）〕。尚、図中で黒丸は、Macllvaine緩衝液、
黒四角は、Glycine-NaOH緩衝液、白三角は、Tris-HCl緩
衝液をそれぞれ示す。
【００２３】(d) 至適温度 至適温度は、約50℃付近に認められた［基質オリーブ油
を0.1Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）の下で、20分反応（図３
に示される。）］。
を0.1Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）の下で、20分反応（図３
に示される。）］。
【００２４】 (e) 温度安定性60分間の処理で約40℃付近まで安定であ
る。［0.1％トリトンX-100を含むPIPES-NaOH緩衝液（pH
7.0）（図４に示される。）］
る。［0.1％トリトンX-100を含むPIPES-NaOH緩衝液（pH
7.0）（図４に示される。）］
【００２５】(f) pH安定性 約pH６〜７付近で安定である。［0.1％トリトンX-100を
含むブリットンロビンソンの広域緩衝液で30℃、24時間
処理（図５に示される。）］
含むブリットンロビンソンの広域緩衝液で30℃、24時間
処理（図５に示される。）］
【００２６】(g) 分子量 約64,000（SDS電気泳動法）
【００２７】(h) 活性化 カルシウムにより活性化される。
【００２８】
【表１】
【００２９】(i) 金属塩（EDTAを含む）の影響
【００３０】
【表２】
【００３１】(j)等電点 アンホライン焦点電気泳動法で測定した結果、本酵素の
等電点は、約4.7付近である。
等電点は、約4.7付近である。
【００３２】(k) 精製法 限外濾過濃縮、エタノール分画、硫安塩析、アセトン分
画、DEAE-トヨパール65M （東ソー社製）等によるイオ
ン交換カラムクロマトグラフィー、ブチル−スーパロー
ス、フェニル−スーパロース（ファルマシア製）等によ
る疎水性カラムクロマトグラフィー、トヨパール HW-55
（東ソー社製）等によるゲルろ過及びクロマトフォーカ
シング（ファルマシア社製）などを組み合わせることに
より高度に精製することができる。
画、DEAE-トヨパール65M （東ソー社製）等によるイオ
ン交換カラムクロマトグラフィー、ブチル−スーパロー
ス、フェニル−スーパロース（ファルマシア製）等によ
る疎水性カラムクロマトグラフィー、トヨパール HW-55
（東ソー社製）等によるゲルろ過及びクロマトフォーカ
シング（ファルマシア社製）などを組み合わせることに
より高度に精製することができる。
【００３３】(l) 活性測定法 JIS規格 K601-88に記載の工業用リパーゼの活性度測定
方法、乳化剤添加法による測定方法（Ｂ法）に準じて行
った。そして、オリーブ油基質（リン酸緩衝液、pH7.
0）に酵素を37℃、20分間反応させた後、１分間に１μm
olの脂肪酸を遊離する酵素量を１単位とした。
方法、乳化剤添加法による測定方法（Ｂ法）に準じて行
った。そして、オリーブ油基質（リン酸緩衝液、pH7.
0）に酵素を37℃、20分間反応させた後、１分間に１μm
olの脂肪酸を遊離する酵素量を１単位とした。
【００３４】更に、本発明の酵素と既存の各種リパーゼ
との基質特異性について、以下に述べるガスクロマトグ
ラフィーを用いる基質特異性分析法に基づき、比較試験
を行った。
との基質特異性について、以下に述べるガスクロマトグ
ラフィーを用いる基質特異性分析法に基づき、比較試験
を行った。
【００３５】基質特異性分析法:リパーゼの脂肪酸に対
する特異性は、基質油脂にリパーゼを添加し、反応させ
た後、n-ヘキサン：エタノール：３Ｎ硫酸混合液を加え
反応を停止させ、反応液中の油分をn-ヘキサンにて抽出
し、遊離した脂肪酸を分離してメチルエステル化し、そ
の脂肪酸組成をガスクロマトグラフィーにて分析する方
法で行った。
する特異性は、基質油脂にリパーゼを添加し、反応させ
た後、n-ヘキサン：エタノール：３Ｎ硫酸混合液を加え
反応を停止させ、反応液中の油分をn-ヘキサンにて抽出
し、遊離した脂肪酸を分離してメチルエステル化し、そ
の脂肪酸組成をガスクロマトグラフィーにて分析する方
法で行った。
【００３６】加水分解率は、アセトン：エタノール混合
液を加え反応を停止させ、アルカリ溶液にて滴定する方
法で求めた。
液を加え反応を停止させ、アルカリ溶液にて滴定する方
法で求めた。
【００３７】即ち、酵素反応は、２連で行い、いずれも
内径３cm、容量50mlのガラス製ふた付き容器に0.1M PIP
ER-NaOH緩衝液１mlと基質油200 mg、100 mM CaCl2 10μ
l、直径２mmのガラスビーズ30個をいれ、ふたをし、37
℃で５分間振盪（振幅３cmで１分間に150回）した後、
酵素液100μlを加えて、更に１時間振盪した。
内径３cm、容量50mlのガラス製ふた付き容器に0.1M PIP
ER-NaOH緩衝液１mlと基質油200 mg、100 mM CaCl2 10μ
l、直径２mmのガラスビーズ30個をいれ、ふたをし、37
℃で５分間振盪（振幅３cmで１分間に150回）した後、
酵素液100μlを加えて、更に１時間振盪した。
【００３８】一方は、アセトン：エタノール混合液
（１：１、V/V）５mlを添加し、反応を停止し、フェノ
ールフタレイン溶液２滴を加え、0.1N 水酸化カリウム
−エタノール標準液にて滴定し、紅色になる点より分解
率を求めた。
（１：１、V/V）５mlを添加し、反応を停止し、フェノ
ールフタレイン溶液２滴を加え、0.1N 水酸化カリウム
−エタノール標準液にて滴定し、紅色になる点より分解
率を求めた。
【００３９】また、他の一方は、遊離した脂肪酸組成の
分析の為に用いた。反応液に５mlのn-ヘキサン：エタノ
ール：３Ｎ硫酸混合液（400:200:1,V/V）を加え反応を
停止した。そして油分の存在するヘキサン層を分取後、
水１mlと１Ｎ水酸化カリウム溶液400μlを加え、アルカ
リ性にし、水層を分取した。次に、水層に対し、１Ｎ塩
酸を800μlを加え、酸性にし、n-ヘキサン４mlを加え、
酵素反応で遊離した脂肪酸をn-ヘキサン層に抽出した。
この遊離脂肪酸画分に三フッ化ほう素メタノール溶液メ
タノール錯体を加えてメチルエステル化した後、ガスク
ロマトグラフィーにて脂肪酸の分析を行った。
分析の為に用いた。反応液に５mlのn-ヘキサン：エタノ
ール：３Ｎ硫酸混合液（400:200:1,V/V）を加え反応を
停止した。そして油分の存在するヘキサン層を分取後、
水１mlと１Ｎ水酸化カリウム溶液400μlを加え、アルカ
リ性にし、水層を分取した。次に、水層に対し、１Ｎ塩
酸を800μlを加え、酸性にし、n-ヘキサン４mlを加え、
酵素反応で遊離した脂肪酸をn-ヘキサン層に抽出した。
この遊離脂肪酸画分に三フッ化ほう素メタノール溶液メ
タノール錯体を加えてメチルエステル化した後、ガスク
ロマトグラフィーにて脂肪酸の分析を行った。
【００４０】各種基質油脂より酵素反応により遊離され
た脂肪酸量は、下記の計算式により求めた。
た脂肪酸量は、下記の計算式により求めた。
【００４１】ガスクロマトグラフィーの条件は、次の通
りである。 装置：島津GC-9Aガスクロマトグラフィー；カラム：Ada
vanceDS 60-80 mesh Chromosorb W,2m×3mmガラスカラ
ム；カラム温度：190−220℃；注入温度：240℃；検出
器：FID；キャリヤーガス：N2 50 ml/min
りである。 装置：島津GC-9Aガスクロマトグラフィー；カラム：Ada
vanceDS 60-80 mesh Chromosorb W,2m×3mmガラスカラ
ム；カラム温度：190−220℃；注入温度：240℃；検出
器：FID；キャリヤーガス：N2 50 ml/min
【００４２】
【数１】
【００４３】尚、数式１中の記号及び数値は、次のこと
を意味する。 H：総加水分解率（％） a：試料溶液の滴定に要したN/10水酸化カリウム−エタ
ノール標準液量(ml) b：空試験に要したN/10水酸化カリウム−エタノール標
準液量（ml） f：0.1N水酸化カリウム−エタノール標準液のファクタ
ー 0.1：0.1N水酸化カリウム−エタノール標準液濃度 0.2：基質油の量（g） S：ケン化価 56.11：水酸化カリウムの分子量
を意味する。 H：総加水分解率（％） a：試料溶液の滴定に要したN/10水酸化カリウム−エタ
ノール標準液量(ml) b：空試験に要したN/10水酸化カリウム−エタノール標
準液量（ml） f：0.1N水酸化カリウム−エタノール標準液のファクタ
ー 0.1：0.1N水酸化カリウム−エタノール標準液濃度 0.2：基質油の量（g） S：ケン化価 56.11：水酸化カリウムの分子量
【００４４】任意の一脂肪酸の加水分解のされ易さを示
す値Ｆ及び任意の一脂肪酸の加水分解率Hiは、それぞれ
次の数式２及び数式３で求められる。
す値Ｆ及び任意の一脂肪酸の加水分解率Hiは、それぞれ
次の数式２及び数式３で求められる。
【００４５】
【数２】
【００４６】
【数３】
【００４７】尚、数式２又は数式３中の記号は、次のこ
とを意味する fi：リパーゼの加水分解後遊離した任意の一脂肪酸のモ
ル分率 f0i：任意の一脂肪酸の未分解油脂中のモル分率 H：総加水分解率（％）
とを意味する fi：リパーゼの加水分解後遊離した任意の一脂肪酸のモ
ル分率 f0i：任意の一脂肪酸の未分解油脂中のモル分率 H：総加水分解率（％）
【００４８】試験例２ イカ油〔DHA(22-6) 17.7％, EPA(20-5) 15.8％含有、理
研ビタミン社製〕、タラ肝油（EPA 12.12％,アラキドン
酸(20-4) 8.96％含有、理研ビタミン社製）、アラキド
ン酸含有油脂（アラキドン酸 25.41％,EPA 4.05％含
有、サントリー社製）、ジホモ−γ−リノレン酸含有油
脂（ジホモ−γ−リノレン酸(20-3,n-6系PUFA) 23.2％,
γ−リノレン酸(18-3,n-6系PUFA) 9.86％含有、サント
リー社製）、及びミード酸含有油脂（ミード酸(20-3,n-
9系PUFA)12.24％、サントリー社製）のそれぞれに、本
発明の酵素、クロモバクテリウム由来のリパーゼ（Chro
mobacterium viscosum, 旭化成社製）、リゾプス由来の
リパーゼ（Rhizopus delemar, 生化学工業社製）、カン
ジダ由来のリパーゼ（Candida cylindracea, シグマ社
製）、アスペルギルス由来のリパーゼ（Aspergillus ni
ger, 商品名：リパーゼ−AP，天野製薬社製）及びシュ
ードモナス由来のリパーゼ（Pseudomonas sp.,商品名：
リパーゼ−AK，天野製薬社製）の各種市販リパーゼを加
水分解率が５から10％になるように添加し、基質特異性
分析法に述べた条件と同一の条件で反応後、遊離する脂
肪酸の組成を上記基質特異性分析法にて分析し、得られ
た各脂肪酸の遊離率を、添加したリパーゼ１単位当たり
の分解率（Hi/U）として図６〜図１０に示した。
研ビタミン社製〕、タラ肝油（EPA 12.12％,アラキドン
酸(20-4) 8.96％含有、理研ビタミン社製）、アラキド
ン酸含有油脂（アラキドン酸 25.41％,EPA 4.05％含
有、サントリー社製）、ジホモ−γ−リノレン酸含有油
脂（ジホモ−γ−リノレン酸(20-3,n-6系PUFA) 23.2％,
γ−リノレン酸(18-3,n-6系PUFA) 9.86％含有、サント
リー社製）、及びミード酸含有油脂（ミード酸(20-3,n-
9系PUFA)12.24％、サントリー社製）のそれぞれに、本
発明の酵素、クロモバクテリウム由来のリパーゼ（Chro
mobacterium viscosum, 旭化成社製）、リゾプス由来の
リパーゼ（Rhizopus delemar, 生化学工業社製）、カン
ジダ由来のリパーゼ（Candida cylindracea, シグマ社
製）、アスペルギルス由来のリパーゼ（Aspergillus ni
ger, 商品名：リパーゼ−AP，天野製薬社製）及びシュ
ードモナス由来のリパーゼ（Pseudomonas sp.,商品名：
リパーゼ−AK，天野製薬社製）の各種市販リパーゼを加
水分解率が５から10％になるように添加し、基質特異性
分析法に述べた条件と同一の条件で反応後、遊離する脂
肪酸の組成を上記基質特異性分析法にて分析し、得られ
た各脂肪酸の遊離率を、添加したリパーゼ１単位当たり
の分解率（Hi/U）として図６〜図１０に示した。
【００４９】尚、図６は、基質がイカ油の場合であり、
図７は、基質がタラ肝油の場合であり、図８は、基質が
アラキドン酸含有油脂の場合であり、図９は、基質がジ
ホモ−γ−リノレン酸含有油脂の場合であり、図１０
は、基質がミード酸含有油脂の場合である。
図７は、基質がタラ肝油の場合であり、図８は、基質が
アラキドン酸含有油脂の場合であり、図９は、基質がジ
ホモ−γ−リノレン酸含有油脂の場合であり、図１０
は、基質がミード酸含有油脂の場合である。
【００５０】図６〜図１０で明らかなように、イカ油、
タラ肝油、アラキドン酸含有油脂、ジホモ−γ−リノレ
ン酸含有油脂、ミード酸含有油脂の場合の何れの基質に
おいても、本発明の酵素は、既存のリパーゼと比較し
て、EPA、DHA、アラキドン酸等のPUFAにおけるHi/U値が
著しく大きく、不飽和脂肪酸を含有する油脂の不飽和脂
肪酸部分に極めて速やかに作用することが明らかとなっ
た。
タラ肝油、アラキドン酸含有油脂、ジホモ−γ−リノレ
ン酸含有油脂、ミード酸含有油脂の場合の何れの基質に
おいても、本発明の酵素は、既存のリパーゼと比較し
て、EPA、DHA、アラキドン酸等のPUFAにおけるHi/U値が
著しく大きく、不飽和脂肪酸を含有する油脂の不飽和脂
肪酸部分に極めて速やかに作用することが明らかとなっ
た。
【００５１】試験例３ 大豆油〔パルミチン酸(18-0) 4.1％, オレイン酸(18-1)
23.8％,リノール酸(18-2) 53.9％, α−リノレン酸(18
-3,n-3系PUFA) 7.4％含有、和光純薬工業社製〕に、本
発明の酵素、クロモバクテリウム由来のリパーゼ（Chro
mobacterium viscosum,旭化成社製）、リゾプス由来の
リパーゼ（Rhizopus delemar,生化学工業社製）、カン
ジダ由来のリパーゼ（Candida cylindracea,シグマ社
製）、アスペルギルス由来のリパーゼ（Aspergillus ni
ger,商品名：リパーゼ−AP，天野製薬社製）及びシュー
ドモナス由来のリパーゼ（Pseudomonas sp.,商品名：リ
パーゼ−AK，天野製薬社製）の各種市販リパーゼを加水
分解率が５から10％になるように添加し、基質特異性分
析法に述べた条件と同一の条件で反応後、遊離する脂肪
酸の組成を上記基質特異性分析法にて分析し、パルミチ
ン酸（18-0）のF値を100とする相対値で示した。その結
果は図１１に示される。
23.8％,リノール酸(18-2) 53.9％, α−リノレン酸(18
-3,n-3系PUFA) 7.4％含有、和光純薬工業社製〕に、本
発明の酵素、クロモバクテリウム由来のリパーゼ（Chro
mobacterium viscosum,旭化成社製）、リゾプス由来の
リパーゼ（Rhizopus delemar,生化学工業社製）、カン
ジダ由来のリパーゼ（Candida cylindracea,シグマ社
製）、アスペルギルス由来のリパーゼ（Aspergillus ni
ger,商品名：リパーゼ−AP，天野製薬社製）及びシュー
ドモナス由来のリパーゼ（Pseudomonas sp.,商品名：リ
パーゼ−AK，天野製薬社製）の各種市販リパーゼを加水
分解率が５から10％になるように添加し、基質特異性分
析法に述べた条件と同一の条件で反応後、遊離する脂肪
酸の組成を上記基質特異性分析法にて分析し、パルミチ
ン酸（18-0）のF値を100とする相対値で示した。その結
果は図１１に示される。
【００５２】図１１から明らかなように、大豆油を基質
とし、生成する脂肪酸の各成分のF値において、本発明
の酵素で処理した場合は、α−リノレン酸、リノール酸
等の不飽和脂肪酸の値が飽和脂肪酸のパルミチン酸の値
よりはるかに大きく、一方、既存のリパーゼで処理した
場合には、飽和脂肪酸のパルミチン酸の値が、α−リノ
レン酸、リノール酸等の不飽和脂肪酸の値と同等若しく
はより大きいことが分かる。
とし、生成する脂肪酸の各成分のF値において、本発明
の酵素で処理した場合は、α−リノレン酸、リノール酸
等の不飽和脂肪酸の値が飽和脂肪酸のパルミチン酸の値
よりはるかに大きく、一方、既存のリパーゼで処理した
場合には、飽和脂肪酸のパルミチン酸の値が、α−リノ
レン酸、リノール酸等の不飽和脂肪酸の値と同等若しく
はより大きいことが分かる。
【００５３】即ち、上記試験例２及び３の結果から明ら
かなように、本発明の酵素は、既存の他のリパーゼと
は、作用及び基質特異性において明らかに異なっている
事が分かる。
かなように、本発明の酵素は、既存の他のリパーゼと
は、作用及び基質特異性において明らかに異なっている
事が分かる。
【００５４】それ故、本発明者が自然界からのスクリー
ニングにより得たシュードモナス・フルオッレセンス
（Pseudomonas fluorescens）3-80 FERM P-14166の生産
するリパーゼは、新規リパーゼといえるものである。
ニングにより得たシュードモナス・フルオッレセンス
（Pseudomonas fluorescens）3-80 FERM P-14166の生産
するリパーゼは、新規リパーゼといえるものである。
【００５５】試験例４ 更に、本発明者等は、PUFA含有油脂のイカ油を基質と
し、本発明の酵素と同様にPUFAに強く作用するところの
基質特異性を有するリパーゼを、シュードモナスに属す
るタイプカルチャーからスクリーニングした。
し、本発明の酵素と同様にPUFAに強く作用するところの
基質特異性を有するリパーゼを、シュードモナスに属す
るタイプカルチャーからスクリーニングした。
【００５６】
【表３】
【００５７】その結果、表３に示すシュードモナス・オ
バリス（Pseudomonas ovalis）、シュードモナス・アウ
レオファシエンス（Pseudomonas aureofaciens）、シュ
ードモナス・クロロラフィス（Pseudomonas chlororaph
is）等のシュードモナスに属する広範囲の菌株がシュー
ドモナス・フルオッレセンス（Pseudomonas fluorescen
s）3-80（FERM P-14166）と同様にPUFAに強く作用する
特徴を有する酵素を産生することを明かにした。
バリス（Pseudomonas ovalis）、シュードモナス・アウ
レオファシエンス（Pseudomonas aureofaciens）、シュ
ードモナス・クロロラフィス（Pseudomonas chlororaph
is）等のシュードモナスに属する広範囲の菌株がシュー
ドモナス・フルオッレセンス（Pseudomonas fluorescen
s）3-80（FERM P-14166）と同様にPUFAに強く作用する
特徴を有する酵素を産生することを明かにした。
【００５８】本発明の酵素をPUFA含有油脂に作用させる
場合の作用条件は、本発明の酵素が、その活性を維持で
きる条件で有れば特に限定されないが、本発明の酵素
は、低加水分解条件下においてもよくPUFAを遊離するこ
とを特徴としている。従って、本発明においては、本発
明の酵素をPUFA含有油脂に作用させることによって、夾
雑物の少ないPUFAを高純度に取得することができる。
尚、試験例５で明らかなように、本発明の酵素は、高加
水分解率においても、市販の酵素〔例えば、シュードモ
ナス由来のリパーゼ（Pseudomonas sp.,商品名：リパー
ゼ−AK，天野製薬社製）〕と同等、又はそれ以上にPUFA
を遊離することができる。
場合の作用条件は、本発明の酵素が、その活性を維持で
きる条件で有れば特に限定されないが、本発明の酵素
は、低加水分解条件下においてもよくPUFAを遊離するこ
とを特徴としている。従って、本発明においては、本発
明の酵素をPUFA含有油脂に作用させることによって、夾
雑物の少ないPUFAを高純度に取得することができる。
尚、試験例５で明らかなように、本発明の酵素は、高加
水分解率においても、市販の酵素〔例えば、シュードモ
ナス由来のリパーゼ（Pseudomonas sp.,商品名：リパー
ゼ−AK，天野製薬社製）〕と同等、又はそれ以上にPUFA
を遊離することができる。
【００５９】試験例５ ミード酸含有油脂（ミード酸(20-3,n-9系PUFA)12.24
％、サントリー社製）及びイカ油〔DHA(22-6) 17.7％,
EPA(20-5) 15.8％含有、理研ビタミン社製〕を本発明の
酵素及び市販のリパーゼの一例としてシュードモナス由
来のリパーゼ（Pseudomonas sp., 商品名：リパーゼ−A
K，天野製薬社製）でそれぞれ加水分解し、反応液を経
時的にサンプリングし、油脂組成と遊離した脂肪酸画分
中のミード酸、EPA及びDHAの含量を分析した。即ち、ミ
ード酸含有油脂及びイカ油３g、0.1MPIPES-NaOH緩衝液
（pH7.0）３ml、100 mM塩化カルシウム0.5 ml、リパーゼ
3000U、ガラスビーズ30個（直径５mm）を100 ml容三角
フラスコに入れ、窒素ガスで置換後密栓して、30℃で振
盪し（150ストローク/min、ピッチ３cm）反応させ、各
時間の反応液の油分をクロロホルム−メタノール（２：
１，V/V）にて抽出し、油脂成分をイヤトロスキャンTH-
10にて定量し、一方、抽出した油分をシリカゲル薄層ク
ロマトグラフィー（20cm×20cm、展開溶媒n-ヘキサン：
ジエチルエーテル：ギ酸＝70:30:１,V/V）にて展開し、
遊離脂肪酸画分をかきとり、10％塩酸メタノールにてメ
チルエステル化してミード酸、EPA及びDHAの含量をガス
クロマトグラフィーにより定量した。遊離されたPUFA量
は、加水分解前油脂中に含有された各PUFA量に対する割
合で示した。その結果、図１２〜図１４より明らかなよ
うに、本発明の酵素は、低加水分解率において、ミード
酸、EPA及びDHA等のPUFAを良く遊離し、高加水分解率に
おいても市販のリパーゼと同等、又は、それ以上にPUFA
を遊離できる。
％、サントリー社製）及びイカ油〔DHA(22-6) 17.7％,
EPA(20-5) 15.8％含有、理研ビタミン社製〕を本発明の
酵素及び市販のリパーゼの一例としてシュードモナス由
来のリパーゼ（Pseudomonas sp., 商品名：リパーゼ−A
K，天野製薬社製）でそれぞれ加水分解し、反応液を経
時的にサンプリングし、油脂組成と遊離した脂肪酸画分
中のミード酸、EPA及びDHAの含量を分析した。即ち、ミ
ード酸含有油脂及びイカ油３g、0.1MPIPES-NaOH緩衝液
（pH7.0）３ml、100 mM塩化カルシウム0.5 ml、リパーゼ
3000U、ガラスビーズ30個（直径５mm）を100 ml容三角
フラスコに入れ、窒素ガスで置換後密栓して、30℃で振
盪し（150ストローク/min、ピッチ３cm）反応させ、各
時間の反応液の油分をクロロホルム−メタノール（２：
１，V/V）にて抽出し、油脂成分をイヤトロスキャンTH-
10にて定量し、一方、抽出した油分をシリカゲル薄層ク
ロマトグラフィー（20cm×20cm、展開溶媒n-ヘキサン：
ジエチルエーテル：ギ酸＝70:30:１,V/V）にて展開し、
遊離脂肪酸画分をかきとり、10％塩酸メタノールにてメ
チルエステル化してミード酸、EPA及びDHAの含量をガス
クロマトグラフィーにより定量した。遊離されたPUFA量
は、加水分解前油脂中に含有された各PUFA量に対する割
合で示した。その結果、図１２〜図１４より明らかなよ
うに、本発明の酵素は、低加水分解率において、ミード
酸、EPA及びDHA等のPUFAを良く遊離し、高加水分解率に
おいても市販のリパーゼと同等、又は、それ以上にPUFA
を遊離できる。
【００６０】それ故、本発明は、本発明の酵素をPUFA含
有油脂に作用させることにより、PUFA含有油脂からアラ
キドン酸、ミード酸、EPA及びDHA等のPUFAを夾雑物を少
なく、高純度に取得する方法、或いは、本発明の酵素及
び市販のリパーゼをPUFA含有油脂に作用させることによ
って、PUFAを取得する方法を提供するものである。更に
又、本発明は、本発明の酵素と市販のリパーゼとを組み
合わせて使用することによって、PUFA含有油脂から複数
のPUFAをより効率良く分別取得する方法をも提供するも
のである。
有油脂に作用させることにより、PUFA含有油脂からアラ
キドン酸、ミード酸、EPA及びDHA等のPUFAを夾雑物を少
なく、高純度に取得する方法、或いは、本発明の酵素及
び市販のリパーゼをPUFA含有油脂に作用させることによ
って、PUFAを取得する方法を提供するものである。更に
又、本発明は、本発明の酵素と市販のリパーゼとを組み
合わせて使用することによって、PUFA含有油脂から複数
のPUFAをより効率良く分別取得する方法をも提供するも
のである。
【００６１】試験例６ 次に、本発明者等は、本発明の酵素及び市販の３種リパ
ーゼ〔クロモバクテリウム由来のリパーゼ（C. viscosu
m.,商品名：リパーゼ−TOYO，旭化成社製）、カンジダ
由来のリパーゼ（Candida cylindracea,シグマ社製）〕
及び〔シュードモナス由来のリパーゼ（Pseudomonas s
p.,商品名：リパーゼ−AK，天野製薬社製）を用い、グ
リセリンとオレイン酸、EPA、DHAの各遊離脂肪酸とでグ
リセリド合成を行ない、各種リパーゼのグリセリド合成
能を比較した。尚、用いた遊離脂肪酸のうちEPAとDHA
（何れもNIPPON CHEMICAL FEED Co.,Ltd.社製）は、各
エチルエステルから定法（脂質分析法入門、157頁、藤
野安彦著、学会出版センター社出版）に従い調製したも
のを用いて行った。即ち、グリセロール４g、各脂肪酸
0.3g、100 mM 塩化カルシウム0.1 ml、0.1M PIPES-NaOH
緩衝液（pH7.0）に溶解した各酵素１ml（500 u）、直径
２ cmのスターラーバーを30ml容サンプル瓶（内径2.5c
m、高さ5.5cm）に入れ、窒素ガスにて空気を置換後密栓
し、30℃にて１時間攪拌し（500ppm）反応を行ない、反
応後アセトン−エタノール混液（１：１）を10ml加え反
応を停止し、フェノールフタレン溶液を加え、0.1Nエタ
ノール性水酸化カリウム溶液にて滴定した。そして、オ
レイン酸に対する合成率を100％とした相対活性で、各
酵素のそれぞれの遊離脂肪酸に対する合成率を求めた。
その結果は、表４に示される。
ーゼ〔クロモバクテリウム由来のリパーゼ（C. viscosu
m.,商品名：リパーゼ−TOYO，旭化成社製）、カンジダ
由来のリパーゼ（Candida cylindracea,シグマ社製）〕
及び〔シュードモナス由来のリパーゼ（Pseudomonas s
p.,商品名：リパーゼ−AK，天野製薬社製）を用い、グ
リセリンとオレイン酸、EPA、DHAの各遊離脂肪酸とでグ
リセリド合成を行ない、各種リパーゼのグリセリド合成
能を比較した。尚、用いた遊離脂肪酸のうちEPAとDHA
（何れもNIPPON CHEMICAL FEED Co.,Ltd.社製）は、各
エチルエステルから定法（脂質分析法入門、157頁、藤
野安彦著、学会出版センター社出版）に従い調製したも
のを用いて行った。即ち、グリセロール４g、各脂肪酸
0.3g、100 mM 塩化カルシウム0.1 ml、0.1M PIPES-NaOH
緩衝液（pH7.0）に溶解した各酵素１ml（500 u）、直径
２ cmのスターラーバーを30ml容サンプル瓶（内径2.5c
m、高さ5.5cm）に入れ、窒素ガスにて空気を置換後密栓
し、30℃にて１時間攪拌し（500ppm）反応を行ない、反
応後アセトン−エタノール混液（１：１）を10ml加え反
応を停止し、フェノールフタレン溶液を加え、0.1Nエタ
ノール性水酸化カリウム溶液にて滴定した。そして、オ
レイン酸に対する合成率を100％とした相対活性で、各
酵素のそれぞれの遊離脂肪酸に対する合成率を求めた。
その結果は、表４に示される。
【００６２】
【表４】
【００６３】表４より明らかなように、本発明の酵素
は、市販の各リパーゼに比較し、EPA、DHA、アラキドン
酸、ミード酸等の高度不飽和遊離脂肪酸の合成能が高い
ことが分かる。
は、市販の各リパーゼに比較し、EPA、DHA、アラキドン
酸、ミード酸等の高度不飽和遊離脂肪酸の合成能が高い
ことが分かる。
【００６４】試験例７ なお更に、本発明者等は、本発明の酵素を用い、トリオ
レインと各遊離脂肪酸とでアシドリシス反応を行い、ト
リオレインへの各遊離脂肪酸の取り込み量の検討をも試
みた。即ち、トリオレイン100μmole、遊離脂肪酸100μ
mole、固定化リパーゼ（精製した本発明の酵素を2,000
U/mlになるように10mMリン酸緩衝液（pH7.0）にて希釈
し、この酵素液２mlにセライト545 ２gを用いてスラリ
ー状にし、室温にて20時間真空乾燥して調製した）100m
g、n-ヘキサン３ml、水５μlを30ml容サプル瓶（内径2.
5cm、高さ5.5cm）に入れ、窒素ガスにて空気を置換後密
栓し、20℃にて振盪して（振幅３cm、150ストローク）
反応を行った。用いた遊離脂肪酸は、DHA、EPA（何れも
NIPPON CHEMICAL FEED Co.,Ltd.社製）、アラキドン
酸、ジホモ−γ−リノレン酸、ミード酸（何れもサント
リ−社製）の各エチルエステルから定法（脂質分析法入
門、157頁、藤野安彦著、学会出版センター社出版）に
従い調製したものを用いて行った。反応後、反応液の30
0μlを取りシリカゲル薄層クロマトグラフィー（20cm×
20cm、展開溶媒n-ヘキサン：ジエチルエーテル：ギ酸＝
70：30：１V/V）にて展開し、トリグリセリド画分をか
きとり10％塩酸−メタノールにてメチルエステル化して
トリグリセリド画分中の各脂肪酸の含量をガスクロマト
グラフィーにより定量し、トリオレインへの各脂肪酸の
取り込み量（mol％）を検討した。その結果は、図１５
に示される。図１５から明らかなように、本発明の酵素
は、何れの高度不飽和脂肪酸をも効率よく取り込むこと
が分かる。
レインと各遊離脂肪酸とでアシドリシス反応を行い、ト
リオレインへの各遊離脂肪酸の取り込み量の検討をも試
みた。即ち、トリオレイン100μmole、遊離脂肪酸100μ
mole、固定化リパーゼ（精製した本発明の酵素を2,000
U/mlになるように10mMリン酸緩衝液（pH7.0）にて希釈
し、この酵素液２mlにセライト545 ２gを用いてスラリ
ー状にし、室温にて20時間真空乾燥して調製した）100m
g、n-ヘキサン３ml、水５μlを30ml容サプル瓶（内径2.
5cm、高さ5.5cm）に入れ、窒素ガスにて空気を置換後密
栓し、20℃にて振盪して（振幅３cm、150ストローク）
反応を行った。用いた遊離脂肪酸は、DHA、EPA（何れも
NIPPON CHEMICAL FEED Co.,Ltd.社製）、アラキドン
酸、ジホモ−γ−リノレン酸、ミード酸（何れもサント
リ−社製）の各エチルエステルから定法（脂質分析法入
門、157頁、藤野安彦著、学会出版センター社出版）に
従い調製したものを用いて行った。反応後、反応液の30
0μlを取りシリカゲル薄層クロマトグラフィー（20cm×
20cm、展開溶媒n-ヘキサン：ジエチルエーテル：ギ酸＝
70：30：１V/V）にて展開し、トリグリセリド画分をか
きとり10％塩酸−メタノールにてメチルエステル化して
トリグリセリド画分中の各脂肪酸の含量をガスクロマト
グラフィーにより定量し、トリオレインへの各脂肪酸の
取り込み量（mol％）を検討した。その結果は、図１５
に示される。図１５から明らかなように、本発明の酵素
は、何れの高度不飽和脂肪酸をも効率よく取り込むこと
が分かる。
【００６５】以下、実施例により本発明の内容を更に具
体的に説明するが、本発明は、これらの実施例により何
等限定されるものではない。
体的に説明するが、本発明は、これらの実施例により何
等限定されるものではない。
【００６６】
実施例１ ポリペプトン1.0％、酵母エキス0.3％、デキストリン1.
0％、グリセロール0.2％、K2HPO4 0.2％、MgSO4・7H2O
0.05％、アデカノールLG126 0.05％からなる前培養培地
（pH7.0）80mlにシュードモナス・フルオッレセンス（P
seudomonas fluorescens）3-80（FERM P-14166）を接種
し、28℃で17時間シェカー培養して種培養を調製した。
次に、あらかじめ常法により殺菌した、肉エキス2.0
％、酵母エキス0.3％、グリセロール0.2％、K2HPO4 0.2
％、MgSO4・7H2O 0.05％、タラ肝油1.0％、アデカノール
LG126 0.05％からなる本培養培地（pH7.0）３Ｌに上記
種培養 80mlを接種し、28℃で２日間通気攪拌（0.75VV
m,500rpm）培養した。培養後、遠心分離し、リパーゼ活
性として、10.0u/mlの除菌液2.8Ｌを得た。
0％、グリセロール0.2％、K2HPO4 0.2％、MgSO4・7H2O
0.05％、アデカノールLG126 0.05％からなる前培養培地
（pH7.0）80mlにシュードモナス・フルオッレセンス（P
seudomonas fluorescens）3-80（FERM P-14166）を接種
し、28℃で17時間シェカー培養して種培養を調製した。
次に、あらかじめ常法により殺菌した、肉エキス2.0
％、酵母エキス0.3％、グリセロール0.2％、K2HPO4 0.2
％、MgSO4・7H2O 0.05％、タラ肝油1.0％、アデカノール
LG126 0.05％からなる本培養培地（pH7.0）３Ｌに上記
種培養 80mlを接種し、28℃で２日間通気攪拌（0.75VV
m,500rpm）培養した。培養後、遠心分離し、リパーゼ活
性として、10.0u/mlの除菌液2.8Ｌを得た。
【００６７】次に、この除菌液を限外濾過（分画分子量
6000）により濃縮し、アルコールを加えて有機溶媒沈澱
させ、この沈澱を10mM Tris-HCl 緩衝液（pH7.5）に溶
解し、同緩衝液で透析後、同緩衝液で平衡化したDEAE-
トヨパールカラムに供した。吸着した酵素は、食塩濃度
を上昇させる直線的濃度勾配法にて溶出し、活性画分を
限外濾過により濃縮した。この濃縮液を0.2M食塩を含む
50mMリン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化したトヨパールHW-
50カラムに供し、ゲル濾過を行った。
6000）により濃縮し、アルコールを加えて有機溶媒沈澱
させ、この沈澱を10mM Tris-HCl 緩衝液（pH7.5）に溶
解し、同緩衝液で透析後、同緩衝液で平衡化したDEAE-
トヨパールカラムに供した。吸着した酵素は、食塩濃度
を上昇させる直線的濃度勾配法にて溶出し、活性画分を
限外濾過により濃縮した。この濃縮液を0.2M食塩を含む
50mMリン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化したトヨパールHW-
50カラムに供し、ゲル濾過を行った。
【００６８】次に、この酵素液に0.5Mまで硫酸アンモニ
ウムを添加し、0.5M 硫酸アンモニウムを含む50 mM リ
ン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化したフェニル−スパーロ
ースカラム（FPLC）に供し、硫酸アンモニウムの濃度を
直線的に下降させる濃度勾配法にて溶出させた。さらに
得られた酵素活性画分を５mMリン酸緩衝液（pH7.0）で
透析し、同緩衝液で平衡化したヒドロキシアパタイトカ
ラムに供した。リン酸濃度を0.5M まで直線濃度勾配法
で上昇させ、目的酵素を溶出し、脱塩濃縮した。そして
濃縮した酵素をクロマトフォーカシングにて分画し、精
製酵素標品を得た。
ウムを添加し、0.5M 硫酸アンモニウムを含む50 mM リ
ン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化したフェニル−スパーロ
ースカラム（FPLC）に供し、硫酸アンモニウムの濃度を
直線的に下降させる濃度勾配法にて溶出させた。さらに
得られた酵素活性画分を５mMリン酸緩衝液（pH7.0）で
透析し、同緩衝液で平衡化したヒドロキシアパタイトカ
ラムに供した。リン酸濃度を0.5M まで直線濃度勾配法
で上昇させ、目的酵素を溶出し、脱塩濃縮した。そして
濃縮した酵素をクロマトフォーカシングにて分画し、精
製酵素標品を得た。
【００６９】実施例２ 肉エキス２％、酵母エキス0.5％、グリセロール1.2％、
K2HPO4 0.2％、MgSO4・7H2O 0.05％、アデカノールLG126
0.05％からなる液体培地（pH7.0）３Ｌを５Ｌジャーフ
ァーメンターに入れ、121℃、30分間加圧滅菌した後、
予め同培地で18時間振盪培養したシュードモナス・フル
オッレセンス（Pseudomonas fluorescens）3-80（FERM
P-14166）の前培養液を接種し、28℃、16時間（0.75VV
m,500rpm）通気培養した。培養液を遠心分離した上清の
リパーゼ活性は40u/mlであった。
K2HPO4 0.2％、MgSO4・7H2O 0.05％、アデカノールLG126
0.05％からなる液体培地（pH7.0）３Ｌを５Ｌジャーフ
ァーメンターに入れ、121℃、30分間加圧滅菌した後、
予め同培地で18時間振盪培養したシュードモナス・フル
オッレセンス（Pseudomonas fluorescens）3-80（FERM
P-14166）の前培養液を接種し、28℃、16時間（0.75VV
m,500rpm）通気培養した。培養液を遠心分離した上清の
リパーゼ活性は40u/mlであった。
【００７０】得られた培養液液の遠心上清を限外ろ過
（分画分子量6000）により濃縮し、0.5Ｍになるように
硫酸アンモニウムを加え0.5Ｍ硫酸アンモニウムを含む2
0mMリン酸緩衝液（pH7.0）にて平衡化したブチル−トヨ
パール ゲル200mlを加え、未吸着画分を除去し、同緩
衝液でゲルを洗浄後、10％ショ糖、0.1％トリトンX-100
を含む10mMリン酸緩衝液にてリパーゼを溶出した。得ら
れたリパーゼ画分を限外濃縮後、10％ショ糖、0.1％ト
リトンX-100を含む10mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）に
対し、透析し、同緩衝液で平衡化したDEAE−トヨパール
（２×17cm）に注入した。カラムを同緩衝液で洗浄後、
0.5Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液の直線的濃度勾配
法にて溶出し、リパーゼ画分を限外ろ過により濃縮し
た。
（分画分子量6000）により濃縮し、0.5Ｍになるように
硫酸アンモニウムを加え0.5Ｍ硫酸アンモニウムを含む2
0mMリン酸緩衝液（pH7.0）にて平衡化したブチル−トヨ
パール ゲル200mlを加え、未吸着画分を除去し、同緩
衝液でゲルを洗浄後、10％ショ糖、0.1％トリトンX-100
を含む10mMリン酸緩衝液にてリパーゼを溶出した。得ら
れたリパーゼ画分を限外濃縮後、10％ショ糖、0.1％ト
リトンX-100を含む10mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）に
対し、透析し、同緩衝液で平衡化したDEAE−トヨパール
（２×17cm）に注入した。カラムを同緩衝液で洗浄後、
0.5Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液の直線的濃度勾配
法にて溶出し、リパーゼ画分を限外ろ過により濃縮し
た。
【００７１】この濃縮液を0.2Ｍ食塩、10％ショ糖を含
む50mMリン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化したSuperdex200
HR10/30カラム（ファルマシア製FPLC使用）によりゲル
ろ過を行い、活性画分を限外ろ過により濃縮して精製リ
パーゼを得た。こうして得られた精製リパーゼの比活性
は9844単位/mg、SDS電気泳動法において単一バンドを示
し、その分子量は約64,000であった。
む50mMリン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化したSuperdex200
HR10/30カラム（ファルマシア製FPLC使用）によりゲル
ろ過を行い、活性画分を限外ろ過により濃縮して精製リ
パーゼを得た。こうして得られた精製リパーゼの比活性
は9844単位/mg、SDS電気泳動法において単一バンドを示
し、その分子量は約64,000であった。
【００７２】実施例３ 実施例１と同じ前培養培地80 ml にシュードモナス・オ
バリス（Pseudomonasovalis ）No.111 AKU 820 を接種
し、28℃で18 時間シェカー培養して種培養を調製し
た。次に、あらかじめ常法により殺菌した、ポリペプト
ン 0.5％、酵母エキス0.5％、グリセロール1.0％、K2HP
O4 0.2％、MgSO4・7H2O 0.05％、アデカノールLG126 0.0
5％からなる本培養培地（pH7.0）３Lに上記種培養 80ml
を接種し、28℃で24時間通気攪拌（0.75VVm,500rpm）培
養した。培養後、遠心分離し、リパーゼ活性として4.5u
/mlの除菌液2.8Ｌを得た。次に、この除菌液を実施例１
と同様の精製方法を行って、精製酵素標品を得た。
バリス（Pseudomonasovalis ）No.111 AKU 820 を接種
し、28℃で18 時間シェカー培養して種培養を調製し
た。次に、あらかじめ常法により殺菌した、ポリペプト
ン 0.5％、酵母エキス0.5％、グリセロール1.0％、K2HP
O4 0.2％、MgSO4・7H2O 0.05％、アデカノールLG126 0.0
5％からなる本培養培地（pH7.0）３Lに上記種培養 80ml
を接種し、28℃で24時間通気攪拌（0.75VVm,500rpm）培
養した。培養後、遠心分離し、リパーゼ活性として4.5u
/mlの除菌液2.8Ｌを得た。次に、この除菌液を実施例１
と同様の精製方法を行って、精製酵素標品を得た。
【００７３】実施例４ 実施例１と同じ前培養培地80 mlにシュードモナス・オ
ウレオファシエンス（Pseudomonas aureofaciens ）IFO
3521 を接種し、28℃で18時間シェカー培養して種培養
を調製し、その種培養液80mlを実施例２記載の本培養培
地３Ｌに接種し、28℃で24時間通気攪拌（0.75VVm,500r
pm）培養した。培養後、遠心分離し、リパーゼ活性とし
て9.8u/mlの除菌液2.8Ｌを得た。次に、この除菌液を実
施例１と同様の精製方法を行って、精製酵素標品を得
た。
ウレオファシエンス（Pseudomonas aureofaciens ）IFO
3521 を接種し、28℃で18時間シェカー培養して種培養
を調製し、その種培養液80mlを実施例２記載の本培養培
地３Ｌに接種し、28℃で24時間通気攪拌（0.75VVm,500r
pm）培養した。培養後、遠心分離し、リパーゼ活性とし
て9.8u/mlの除菌液2.8Ｌを得た。次に、この除菌液を実
施例１と同様の精製方法を行って、精製酵素標品を得
た。
【００７４】実施例５ 実施例１と同じ前培養培地80mlにシュードモナス・クロ
ロラフィス（Pseudomonas chlororaphis ）IFO 3904 を
接種し、28℃で18時間シェカー培養して種培養を調製
し、この種培養液80mlを実施例１記載の本培養培地３Ｌ
に接種し、28℃で２日間通気攪拌（0.75VVm,500rpm）培
養した。培養後、遠心分離し、リパーゼ活性として6.2u
/mlの除菌液 2.8Ｌを得た。次に、この除菌液を実施例
１と同様の精製方法を行って、精製酵素標品を得た。
ロラフィス（Pseudomonas chlororaphis ）IFO 3904 を
接種し、28℃で18時間シェカー培養して種培養を調製
し、この種培養液80mlを実施例１記載の本培養培地３Ｌ
に接種し、28℃で２日間通気攪拌（0.75VVm,500rpm）培
養した。培養後、遠心分離し、リパーゼ活性として6.2u
/mlの除菌液 2.8Ｌを得た。次に、この除菌液を実施例
１と同様の精製方法を行って、精製酵素標品を得た。
【００７５】実施例６ 精製イカ油〔DHA(22-6) 17.7％, EPA(20-5) 15.8％含
有、理研ビタミン社製〕、30 g、0.1M PIPES-NaOH緩衝液
（pH7.0）30 ml、100 mM 塩化カルシウム５ ml、実施例
２に準じて得られた本発明の酵素30,000 Uを200 ml容メ
ジューム瓶に入れ窒素ガスで置換後密栓して、30℃で１
時間攪拌し（500rpm）反応させ（加水分解率は24.4
％）、反応後、森岡等の方法〔油化学、36巻816−820
（1987）〕により反応液からリパーゼ反応で遊離した脂
肪酸を抽出し、溶媒を除去後、常法に従い尿素付加法及
びそれに続く低温分別法〔何れの方法も、W.W.Christi
e,"Lipid Analysis",Pergamon Press,146-147頁（197
3）に記載されている。〕を行うことにより濃縮 EPA
（液中含量56.6％）1.1 gを得た。
有、理研ビタミン社製〕、30 g、0.1M PIPES-NaOH緩衝液
（pH7.0）30 ml、100 mM 塩化カルシウム５ ml、実施例
２に準じて得られた本発明の酵素30,000 Uを200 ml容メ
ジューム瓶に入れ窒素ガスで置換後密栓して、30℃で１
時間攪拌し（500rpm）反応させ（加水分解率は24.4
％）、反応後、森岡等の方法〔油化学、36巻816−820
（1987）〕により反応液からリパーゼ反応で遊離した脂
肪酸を抽出し、溶媒を除去後、常法に従い尿素付加法及
びそれに続く低温分別法〔何れの方法も、W.W.Christi
e,"Lipid Analysis",Pergamon Press,146-147頁（197
3）に記載されている。〕を行うことにより濃縮 EPA
（液中含量56.6％）1.1 gを得た。
【００７６】そして、未分解グリセリドを含むヘキサン
層にエタノールを等量加え、ヘキサン層を取る操作を数
回繰り返すことによって、未分解のジグリセリド及びモ
ノグリセリドを除去した。こうして得られたトリグリセ
リド10.6 gに0.1M PIPES-NaOH緩衝液（pH7.0）30 ml、1
00 mM 塩化カルシウム５ ml、市販のシュードモナス由
来のリパーゼ（Pseudomonas sp.,商品名：リパーゼ−A
K，天野製薬社製）10,000 Uを200 ml容メジューム瓶に
入れ窒素ガスで置換後密栓して、30℃で５時間攪拌し
（500rpm）反応させ（加水分解率は57.8％）、反応後、
森岡等の方法〔油化学、36巻816−820（1987）〕により
反応液からリパーゼ反応で遊離した脂肪酸を抽出し、溶
媒を除去後、常法に従い尿素付加法及びそれに続く低温
分別法〔何れの方法も、W.W.Christie,"Lipid Analysi
s",Pergamon Press,146-147頁（1973）に記載されてい
る。〕を行うことにより濃縮 DHA（液中含量61.5％）0.
96 gを得た。
層にエタノールを等量加え、ヘキサン層を取る操作を数
回繰り返すことによって、未分解のジグリセリド及びモ
ノグリセリドを除去した。こうして得られたトリグリセ
リド10.6 gに0.1M PIPES-NaOH緩衝液（pH7.0）30 ml、1
00 mM 塩化カルシウム５ ml、市販のシュードモナス由
来のリパーゼ（Pseudomonas sp.,商品名：リパーゼ−A
K，天野製薬社製）10,000 Uを200 ml容メジューム瓶に
入れ窒素ガスで置換後密栓して、30℃で５時間攪拌し
（500rpm）反応させ（加水分解率は57.8％）、反応後、
森岡等の方法〔油化学、36巻816−820（1987）〕により
反応液からリパーゼ反応で遊離した脂肪酸を抽出し、溶
媒を除去後、常法に従い尿素付加法及びそれに続く低温
分別法〔何れの方法も、W.W.Christie,"Lipid Analysi
s",Pergamon Press,146-147頁（1973）に記載されてい
る。〕を行うことにより濃縮 DHA（液中含量61.5％）0.
96 gを得た。
【００７７】実施例７ グリセロール４g、EPA 0.3g、100 mM 塩化カルシウム0.
1 ml、0.1M PIPES-NaOH緩衝液（pH7.0）に溶解した実施
例２に準じて得られた本発明の酵素１ml（500u）、直径
２ cmのスターラーバーを30ml容サンプル瓶（内径2.5c
m、高さ5.5cm）に入れ、窒素ガスにて空気を置換後密栓
し、30℃にて１時間攪拌し（500ppm）反応を行った。反
応後アセトン−エタノール混液（１：１）を10ml加え反
応を停止し、フェノールフタレン溶液を加え、0.1Nエタ
ノール性水酸化カリウム溶液にて滴定し、本発明の酵素
のオレイン酸に対する合成率を100％とし、EPAに対する
合成率を求めたところ104.2％であった。
1 ml、0.1M PIPES-NaOH緩衝液（pH7.0）に溶解した実施
例２に準じて得られた本発明の酵素１ml（500u）、直径
２ cmのスターラーバーを30ml容サンプル瓶（内径2.5c
m、高さ5.5cm）に入れ、窒素ガスにて空気を置換後密栓
し、30℃にて１時間攪拌し（500ppm）反応を行った。反
応後アセトン−エタノール混液（１：１）を10ml加え反
応を停止し、フェノールフタレン溶液を加え、0.1Nエタ
ノール性水酸化カリウム溶液にて滴定し、本発明の酵素
のオレイン酸に対する合成率を100％とし、EPAに対する
合成率を求めたところ104.2％であった。
【００７８】実施例８ グリセロール４g、DHA 0.3g、100 mM 塩化カルシウム0.
1 ml、0.1M PIPES-NaOH緩衝液（pH7.0）30 ml、に溶解
した実施例１に準じて得られた本発明の酵素１ml（500
u）、直径２ cmのスターラーバーを30ml容サンプル瓶
（内径2.5cm、高さ5.5cm）に入れ、窒素ガスにて空気を
置換後密栓し、30℃にて１時間攪拌し（500ppm）反応を
行った。反応後アセトン−エタノール混液（１：１）を
10ml加え反応を停止し、フェノールフタレン溶液を加
え、0.1Nエタノール性水酸化カリウム溶液にて滴定し、
本発明の酵素のオレイン酸に対する合成率を100％と
し、DHAに対する合成率を求めたところ57.4％であっ
た。
1 ml、0.1M PIPES-NaOH緩衝液（pH7.0）30 ml、に溶解
した実施例１に準じて得られた本発明の酵素１ml（500
u）、直径２ cmのスターラーバーを30ml容サンプル瓶
（内径2.5cm、高さ5.5cm）に入れ、窒素ガスにて空気を
置換後密栓し、30℃にて１時間攪拌し（500ppm）反応を
行った。反応後アセトン−エタノール混液（１：１）を
10ml加え反応を停止し、フェノールフタレン溶液を加
え、0.1Nエタノール性水酸化カリウム溶液にて滴定し、
本発明の酵素のオレイン酸に対する合成率を100％と
し、DHAに対する合成率を求めたところ57.4％であっ
た。
【００７９】実施例９ まず、精製した本酵素及び市販の３種リパーゼ〔クロモ
バクテリウム由来のリパーゼ（C. viscosum.,商品名：
リパーゼ−TOYO，旭化成社製）、カンジダ由来のリパー
ゼ（Candida cylindracea,シグマ社製）〕及び〔シュー
ドモナス由来のリパーゼ（Pseudomonas sp.,商品名：リ
パーゼ−AK，天野製薬社製）を5,000 U／mlになるよう
に10 mMリン酸緩衝液（pH7.0）にて希釈又は溶解し、こ
の酵素液２mlにセライト545 ２gを加え乳鉢を用いてス
ラリー状にし、室温にて20時間真空乾燥し各固定化リパ
ーゼを調製した。次いで、トリオレイン271.2μmole、
遊離脂肪酸271.2μmole、固定化リパーゼ100mg、n-ヘキ
サン4.56ml、あらかじめ求めた各酵素の最適水分量であ
る水、それぞれ５μl，10μl，５μl，10μlを30ml容サ
ンプル瓶（内径2.5cm、高さ5.5cm）に入れ、窒素ガスに
て空気を置換後密栓し、10℃,30℃にて24時間振盪して
（振幅３cm、150ストローク）反応を行った。用いた遊
離脂肪酸は、DHA、EPA（何れもNIPPON CHEMICAL FEED C
o.,Ltd.社製）エチルエステルから定法（脂質分析法入
門、157頁、藤野安彦著、学会出版センター社出版）に
従い調製したものを用いて行った。反応後、反応液の30
0μlを取りシリカゲル薄層クロマトグラフィー（20cm×
20cm、展開溶媒n-ヘキサン：ジエチルエーテル：ギ酸＝
70：30：１V/V）にて展開し、トリグリセリド画分をか
きとり10％塩酸−メタノールにてメチルエステル化して
トリグリセリド画分中の各脂肪酸の含量をガスクロマト
グラフィーにより定量し、トリオレインへの各脂肪酸の
取り込み量（mol％）を検討した。その結果、10℃及び3
0℃反応でのEPAの取り込みは図１６に、そして10℃反応
でのDHAの取り込みは図１７にそれぞれ示される。
バクテリウム由来のリパーゼ（C. viscosum.,商品名：
リパーゼ−TOYO，旭化成社製）、カンジダ由来のリパー
ゼ（Candida cylindracea,シグマ社製）〕及び〔シュー
ドモナス由来のリパーゼ（Pseudomonas sp.,商品名：リ
パーゼ−AK，天野製薬社製）を5,000 U／mlになるよう
に10 mMリン酸緩衝液（pH7.0）にて希釈又は溶解し、こ
の酵素液２mlにセライト545 ２gを加え乳鉢を用いてス
ラリー状にし、室温にて20時間真空乾燥し各固定化リパ
ーゼを調製した。次いで、トリオレイン271.2μmole、
遊離脂肪酸271.2μmole、固定化リパーゼ100mg、n-ヘキ
サン4.56ml、あらかじめ求めた各酵素の最適水分量であ
る水、それぞれ５μl，10μl，５μl，10μlを30ml容サ
ンプル瓶（内径2.5cm、高さ5.5cm）に入れ、窒素ガスに
て空気を置換後密栓し、10℃,30℃にて24時間振盪して
（振幅３cm、150ストローク）反応を行った。用いた遊
離脂肪酸は、DHA、EPA（何れもNIPPON CHEMICAL FEED C
o.,Ltd.社製）エチルエステルから定法（脂質分析法入
門、157頁、藤野安彦著、学会出版センター社出版）に
従い調製したものを用いて行った。反応後、反応液の30
0μlを取りシリカゲル薄層クロマトグラフィー（20cm×
20cm、展開溶媒n-ヘキサン：ジエチルエーテル：ギ酸＝
70：30：１V/V）にて展開し、トリグリセリド画分をか
きとり10％塩酸−メタノールにてメチルエステル化して
トリグリセリド画分中の各脂肪酸の含量をガスクロマト
グラフィーにより定量し、トリオレインへの各脂肪酸の
取り込み量（mol％）を検討した。その結果、10℃及び3
0℃反応でのEPAの取り込みは図１６に、そして10℃反応
でのDHAの取り込みは図１７にそれぞれ示される。
【００８０】図１６及び図１７から明らかなように、本
発明の酵素の場合、市販の酵素がほとんど作用しない
か、或いは僅かにしか作用しない低温度においても非常
に速やかにEPAやDHA等のPUFAとアシドリシス反応を行う
ことができる。従って、本発明の酵素は高温度下で酸化
されやすい特徴を有するPUFAを含有するトリグリセリド
をアシドリシス反応で合成する場合極めて有利である。
発明の酵素の場合、市販の酵素がほとんど作用しない
か、或いは僅かにしか作用しない低温度においても非常
に速やかにEPAやDHA等のPUFAとアシドリシス反応を行う
ことができる。従って、本発明の酵素は高温度下で酸化
されやすい特徴を有するPUFAを含有するトリグリセリド
をアシドリシス反応で合成する場合極めて有利である。
【００８１】
【発明の効果】本発明の酵素は、既存のリパーゼに比し
て PUFAに高い活性を示す。それ故、魚油などのPUFA含
有トリグリセリドの油脂の加水分解や改質、又長鎖或い
は、高度不飽和脂肪酸を調製するに際して、そのエステ
ル合成反応、エステル交換反応、アシドリシス、および
アルコリシス等をより効率的に行うために有利に使用さ
れうる。
て PUFAに高い活性を示す。それ故、魚油などのPUFA含
有トリグリセリドの油脂の加水分解や改質、又長鎖或い
は、高度不飽和脂肪酸を調製するに際して、そのエステ
ル合成反応、エステル交換反応、アシドリシス、および
アルコリシス等をより効率的に行うために有利に使用さ
れうる。
【図１】本発明の酵素の基質特異性を示す。
【図２】本発明の酵素の至適pHを示す。
【図３】本発明の酵素の至適温度を示す。
【図４】本発明の酵素の温度安定性を示す。
【図５】本発明の酵素のpH安定性を示す。
【図６】本発明の酵素と既存のリパーゼとをイカ油に作
用させた場合の酵素１単位当たりの脂肪酸エステルの分
解率を示す。
用させた場合の酵素１単位当たりの脂肪酸エステルの分
解率を示す。
【図７】本発明の酵素と既存のリパーゼとをタラ肝油に
作用させた場合の酵素１単位当たりの脂肪酸エステルの
分解率を示す。
作用させた場合の酵素１単位当たりの脂肪酸エステルの
分解率を示す。
【図８】本発明の酵素と既存のリパーゼとを高アラキド
ン酸含有油脂に作用させた場合の酵素１単位当たりの脂
肪酸エステルの分解率を示す。
ン酸含有油脂に作用させた場合の酵素１単位当たりの脂
肪酸エステルの分解率を示す。
【図９】本発明の酵素と既存のリパーゼとをジホモ−γ
−リノレン酸含有油脂に作用させた場合の酵素１単位当
たりの脂肪酸エステルの分解率を示す。
−リノレン酸含有油脂に作用させた場合の酵素１単位当
たりの脂肪酸エステルの分解率を示す。
【図１０】本発明の酵素と既存のリパーゼとをミード酸
含有油脂に作用させた場合の酵素１単位当たりの脂肪酸
エステルの分解率を示す。
含有油脂に作用させた場合の酵素１単位当たりの脂肪酸
エステルの分解率を示す。
【図１１】本発明の酵素と既存のリパーゼとを大豆油に
作用させた場合の脂肪酸に対する特異性を示す。
作用させた場合の脂肪酸に対する特異性を示す。
【図１２】本発明の酵素と既存のリパーゼとをミード酸
含有油脂に作用させた場合の加水分解率と遊離ミード酸
量との関係を示す。
含有油脂に作用させた場合の加水分解率と遊離ミード酸
量との関係を示す。
図中の黒丸は、本発明の酵素を用いた場合であり、白四
角は市販のシュードモナス由来のリパーゼ（Pseudomona
s sp.，商品名リパーゼ−AK，天野製薬社製）を用いた
場合である。
角は市販のシュードモナス由来のリパーゼ（Pseudomona
s sp.，商品名リパーゼ−AK，天野製薬社製）を用いた
場合である。
【図１３】本発明の酵素と既存のリパーゼとをイカ油に
作用させた場合の加水分解率と遊離EPA量との関係を示
す。
作用させた場合の加水分解率と遊離EPA量との関係を示
す。
図中の黒丸は、本発明の酵素を用いた場合であり、白四
角は市販のシュードモナス由来のリパーゼ（Pseudomona
s sp.，商品名リパーゼ−AK，天野製薬社製）を用いた
場合である。
角は市販のシュードモナス由来のリパーゼ（Pseudomona
s sp.，商品名リパーゼ−AK，天野製薬社製）を用いた
場合である。
【図１４】本発明の酵素と既存のリパーゼとをイカ油に
作用させた場合の加水分解率と遊離DHA量との関係を示
す。
作用させた場合の加水分解率と遊離DHA量との関係を示
す。
図中の黒丸は、本発明の酵素を用いた場合であり、白四
角はシュードモナス由来のリパーゼ（Pseudomonas s
p.，商品名リパーゼ−AK，天野製薬社製）を用いた場合
である。
角はシュードモナス由来のリパーゼ（Pseudomonas s
p.，商品名リパーゼ−AK，天野製薬社製）を用いた場合
である。
【図１５】本発明の酵素を用いたアシドリシス反応によ
る、トリオレインへの各脂肪酸の取り込み量を示すもの
である。
る、トリオレインへの各脂肪酸の取り込み量を示すもの
である。
【図１６】本発明の酵素と市販の酵素を比較して用いた
場合のアシドリシス反応による、トリオレインへのEPA
の取り込みを示すものである。
場合のアシドリシス反応による、トリオレインへのEPA
の取り込みを示すものである。
【図１７】本発明の酵素及び市販の酵素を比較して用い
た場合のアシドリシス反応による、トリオレインへのDH
Aの取り込みを示すものである。
た場合のアシドリシス反応による、トリオレインへのDH
Aの取り込みを示すものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:38）
Claims (7)
- 【請求項１】下記の理化学的性質を有する新規リパー
ゼ。 (a) 作用：高度不飽和脂肪酸含有油脂によく作用し、高
度不飽和脂肪酸を効率的に生成する。 (b)基質特異性：炭素数18の飽和及び不飽和脂肪酸含有
油脂に作用させたとき、炭素鎖18-0の飽和脂肪酸よりも
炭素鎖18-1,18-2及び18-3の各種不飽和脂肪酸含有トリ
グリセリドに良く作用し、又、炭素数20及び炭素数22の
各種不飽和脂肪酸含有トリグリセリドに対しても良く作
用する。 (c) 至適pH：約７〜９付近 (d) 至適温度：約50℃付近 (e) 等電点：約4.7付近 - 【請求項２】請求項１記載の新規リパーゼ生産能を有す
るシュードモナス属菌を培養して、該リパーゼを生産
し、これを採取することを特徴とする新規リパーゼの製
造法。 - 【請求項３】高度不飽和脂肪酸含有油脂に請求項１記載
の新規リパーゼを作用させて高度不飽和脂肪酸を遊離さ
せ、これを抽出、回収せしめることを特徴とする高不飽
和脂肪酸高度含有油脂からの高度不飽和脂肪酸の取得方
法。 - 【請求項４】高度不飽和脂肪酸含有油脂に請求項１記載
の新規リパーゼと市販のリパーゼとを組み合わせること
により、種々の高度不飽和脂肪酸を分別し、抽出し、回
収せしめることを特徴とする高不飽和脂肪酸高度含有油
脂からの高度不飽和脂肪酸の分別取得方法。 - 【請求項５】グリセロールと高度不飽和脂肪酸とを請求
項１記載の新規リパーゼ存在下で反応させて高度不飽和
脂肪酸のグリセロールエステルを生成せしめることを特
徴とする高度不飽和脂肪酸含有グリセリドの合成法。 - 【請求項６】トリグリセリドと遊離の高度不飽和脂肪酸
とにおいて、請求項１記載の新規リパーゼを用いるアシ
ドリス反応によって、トリグリセリド中に高度不飽和脂
肪酸を取り込ましめること特徴とする高度不飽和脂肪酸
含有グリセリドの生成法。 - 【請求項７】トリグリセリドと遊離の高度不飽和脂肪酸
とにおいて、請求項１記載の新規リパーゼを用いるアシ
ドリス反応を20℃以下で行うことによって、トリグリセ
リド中に高度不飽和脂肪酸を取り込ましめること特徴と
する高度不飽和脂肪酸含有グリセリドの生成法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP07058995A JP3676841B2 (ja) | 1994-03-03 | 1995-03-02 | 新規リパーゼ、その製造法及びその用途 |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6003794 | 1994-03-03 | ||
| JP6-60037 | 1994-10-06 | ||
| JP6-270497 | 1994-10-06 | ||
| JP27049794 | 1994-10-06 | ||
| JP07058995A JP3676841B2 (ja) | 1994-03-03 | 1995-03-02 | 新規リパーゼ、その製造法及びその用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08154674A true JPH08154674A (ja) | 1996-06-18 |
| JP3676841B2 JP3676841B2 (ja) | 2005-07-27 |
Family
ID=27297073
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP07058995A Expired - Fee Related JP3676841B2 (ja) | 1994-03-03 | 1995-03-02 | 新規リパーゼ、その製造法及びその用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3676841B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2020080851A (ja) * | 2018-11-27 | 2020-06-04 | 台湾中油股▲ふん▼有限公司ＣＰＣ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔａｉｗａｎ | 米ぬかリパーゼの調製方法 |
-
1995
- 1995-03-02 JP JP07058995A patent/JP3676841B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2020080851A (ja) * | 2018-11-27 | 2020-06-04 | 台湾中油股▲ふん▼有限公司ＣＰＣ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔａｉｗａｎ | 米ぬかリパーゼの調製方法 |
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|---|---|
| JP3676841B2 (ja) | 2005-07-27 |
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