JPH0816679B2 - 体液および組織におけるｒａｓタンパクの検出、定量および分類 - Google Patents

体液および組織におけるｒａｓタンパクの検出、定量および分類

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JPH0816679B2 JP1504817A JP50481789A JPH0816679B2 JP H0816679 B2 JPH0816679 B2 JP H0816679B2 JP 1504817 A JP1504817 A JP 1504817A JP 50481789 A JP50481789 A JP 50481789A JP H0816679 B2 JPH0816679 B2 JP H0816679B2
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、体組織液または体液におけるras p21タン
パクの検出、定量および分類に関する。より詳しくは、
正常型rasタンパクおよび突然変異型rasタンパクを含む
全細胞性ras p21タンパクの検出および定量に関し、更
には全細胞性ras p21タンパクを、正常型rasタンパク、
突然変異型rasタンパク、ハーベイ（Harvey）rasタンパ
ク、カーステン（Kirsten）rasタンパクおよびN rasタ
ンパクのような個々の成分に同定し且つ定量することに
関する。
発明の背景 ハーベイrasタンパク（Ha−ras）、カーステンrasタ
ンパク（Ki−ras）およびN rasタンパク（Ｎ−ras）は
免疫学的に関連したタンパクであり、これらは集合的に
p21と呼ばれている。それらは、広範な有核哺乳類細胞
に見られるrasファミリー細胞遺伝子の生成物である。r
as遺伝子はしばしば、正常細胞を悪性に導き得る遺伝子
変異の標的となるように思える。ras発癌遺伝子は、広
範な前悪性細胞および悪性細胞の系列において同定され
ている。
p21タンパクは約188−189個のアミノ酸から構成され
ており、約21,000ダルトンの分子量を有する。ウイルス
性および細胞性のras遺伝子は、細胞膜結合タンパクを
コードし（Willingham et al.,Cell19;1005（198
0））、該タンパクはグアニンヌクレオチドに結合し［S
chlonick et al.,PNAS（USA）76:5355（1979）;Papageo
rge et al.,J.Virol.44:509（1982）；およびFine et a
l.,Cell 37:151（1984）］、且つ本質的なGTPase活性を
有している。［Mc Grath et al.,Nature 301:644（198
4）;Sweet et al.,Nature 311:273（1984）;Gibbs et a
l.,PNAS（USA）81:5704（1984）およびMann et al.,PNA
S 82:376（1985）］。
レシピエントとしてNIH3T3細胞を用いたDNA媒介トラ
ンスフェクション実験によって、ハーベイ（Ha−ras）
およびカーステン（Ki−ras）肉腫ウイルスのras遺伝子
に対して相同性の、活性化された形質転換遺伝子ファミ
リーが同定されている。N rasと称されるrasファミリー
の第３のメンバーが同定されているが、これに対応する
レトロウイルスは発見されていない。活性化された（突
然変異の）ras遺伝子は、その正常な相同体とは構造的
に異なっており、タンパク中の位置12,13または61にア
ミノ酸の置換を有している（Tabin et al.,Nature 300:
149（1982）;Bos et al.,Nature 315:716（1985）;Yuas
a et al.,Nature 303:775−779（1983）;Der et al.,Ce
ll 44:167−176（1986年１月17日））。Chem.Abstracts
CA 100（１）:1425nに掲載されたTaparowsky et al.,B
anbury Report,14:123−133（1983）には、Ha−ras p21
のＮ末端から12番目の残基におけるグリシンからバリン
への変化が、正常なタンパクを形質転換タンパクに変化
させるのに十分であることが教示されている。
Chem.Abstracts99（19）:1530936に掲載された、Shim
izu et al.,Nature 304:497−500（1983）には、ｖ−Ki
−ras遺伝子のヒト肺癌細胞ラインcalu−１ホモローグ
のアミノ酸12に、システン残基が存在することが教示さ
れている。Chem.Abstracts CA99（19）:153080vに掲載
されたFasano et al.,J.Mol.Appl.Genet.,2（２）:173
−180には、T24H−ras−１遺伝子産物が、ハーベイ肉腫
ウイルスによってコードされたｖ−Ｈ−ras p21形質転
換タンパクと略同一であることが教示されている。最近
の報告によれば、40乃至50％のヒト直腸結腸癌における
活性化されたras p21の存在、及びアデノーマ（adenom
a）と呼ばれる結腸の新生物発生前の病巣（preneoplast
ic lesions）の存在が示されている［Bos et al.,Natur
e 327:293（1987）,Forrester et al.,Nature 327:299
（1987）およびVolgelstein et al.,NEJM 319:525（198
8年９月）］。また、最近の研究では肺癌の20〜30％（R
odenhuis et al.,Cancer Ras.,48:5738（1988））およ
び膵臓癌の90％以上（Almoguera et al.,Cell 53:549
（1988））において、活性化されたras遺伝子および突
然変異ras p21タンパクの発現が示されている。急性骨
髄性白血病のような一定の形態の白血病、並びに一定の
前白血病状態（preleukemic state）において、活性化
されたras p21タンパクが記載されている。
これらの活性化されたras遺伝子および突然変異タン
パクはまた、原発性腫瘍および転移性腫瘍だけでなく、
確立された細胞ラインにおいても認められている。
Gambke et al.（Nature 307:476,1984）には、急性骨
髄性白血病（AML）の患者からの骨髄細胞中における形
質転換性Ｎ−ras遺伝子の存在が示されている。これと
は対照的に、同じ患者の繊維芽細胞由来のDNAは、形質
転換性ではなかった。
活性化されない形態の正常な形のp21rasタンパクは、
位置12および13にグリシン・アミノ酸を含み、また位置
61にグルタミン・アミノ酸を含んでいる。正常細胞中に
認められるp21rasタンパクは、アミノ酸配列５〜19につ
いて、次のような一次アミノ酸構造を有している:5Lysi
ne−leucine−valine−valine−valine−glysin−lysin
e−serine−alanine−leucine19。
従来の報告には、酵母および悪性細胞において、正常
かつ活性化された又は発癌性（突然変異性）のras p21
タンパクと反応する複数のラット・モノクローナル抗体
が記載されている（Robinson et al.,Br.J.Cancer 54:8
77−883（1986）;Furth et al.,J.Virol,43:294（198
2））。
EPO特許第85111824,0号明細書（1986年４月16日）お
よび欧州特許第85111823.2号明細書（1986年３月26日）
には、ras p21タンパクのアミノ酸５〜17からなるポリ
ペプチドであって、位置16と17の間に挿入されたシスチ
ン残基を含み、更に位置12にアミノ酸置換を含むポリペ
プチドが開示されている。アミノ酸のバリン，セリン，
アルギニン，システイン，アスパラギン酸またはアラニ
ンが、位置12に挿入された。これらのポリペプチドはキ
ャリアタンパクに結合され、ここで論じられた抗体の産
生を誘発する免疫原として使用された。この参照文献で
は更に、p21遺伝子産物中の一つのアミノ酸の相違に基
づいてras発癌遺伝子をそれらの正常な対応遺伝子から
区別できる抗体は、臨床における悪性細胞の診断検出に
適用可能なことが示されている。加えて、位置12または
位置61の一つのアミノ酸が相違する突然変異体ras p21
を正常なras p21から区別できるこのような抗体は、蛍
光免疫測定法（immunofluorescence）、ペルオキシダー
ゼによる酵素免疫測定法（immunoperoxidase stainin
g）、免疫沈降法（immunoprecipitation）、ELISAまた
はウエスタンブロティング法（western blotting）のよ
うな標準的な技術によって、ras発癌遺伝子産物を検出
するために使用されるであろうことを示している。
Carney et al.,PNAS（USA）83:7485−7489（1986）お
よびEPO公報No.019003（1986年８月６日発行）には、活
性化されたrasタンパクに特異的なモノクローナル抗体
が開示されている。このモノクローナル抗体は、位置12
においてグリシンの代わりにバリンをコードする突然変
異ras遺伝子のアミノ酸に対応した合成ペプチドに対し
て生成された。EPO公報No.019003には、モノクローナル
抗体DWPが、通常の診断方法による原発病巣および転移
病巣の診断に有効であることが示されている。また、そ
の診断はヒトの血液サンプルまたは他の体液サンプルの
分析のような通常のin vitro診断方法によって行われ得
ることが示されている。Chem.Abstracts,CA104:1665706
に掲載された、Carney et al.,UCLA Symp.Mol.Cell.Bio
l.,New Ser.1985には、ヒト癌との免疫反応を示す合成
のras関係ペプチドに対して発生されたモノクローナル
抗体が記載されている。Carney et alは、位置21におい
てグルタミン酸、アルギニンまたはバリンのアミ酸置換
を含む合成ペプチドに対して発生された一連のモノクロ
ーナル抗体を報告した（A Book of Abatracts from the
3d Annual Meeting on Oncogens held at HOOD Colleg
e,Fredrick,MD,1987年７月７−11日）。また、種々の方
法によって発生された他のモノクローナル抗体も、種々
の形態のras p21タンパクと反応することが報告されて
いる（Hand et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,Vol.81,pp.
5227−5231（1984）;Thor et al.,Nature,Vol.311,pp.5
62−565（1984）;Wong et al.,Cancer Research,Vol.4
6,pp.6029−6033（1986）；及びTanaka,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA,Vol.82,pp3400−3404（1985））。
幾つか科学報告書には、正常細胞が、位置13にグリシ
ンを有するrasタンパクを含むことが示されている。
1985年に、Bos等は、AML患者の細胞から分離されたDN
AがNIH3T3細胞を形質転換できることを明らかにした（N
ature 315:726 1985）。この結果は、発癌遺伝子の存在
を高い可能性で示唆するものである。これらの形質転換
遺伝子は、活性化されたras遺伝子であることが示され
た。これとは対照的に、正常組織に由来するDNAは非形
質転換性であり、従って活性化されたN rasを含んでい
なかった。これらの実験者は、オリゴヌクレオチドプロ
ーブを用いることにより、活性化されたN ras遺伝子中
に突然変異が存在するか否かを分析した。そして活性化
されたN ras遺伝子は、タンパクの位置13でアミノ酸置
換をもたらす突然変異を含んでいることを発見した。位
置13におけるこれらの突然変異は、正常なアミノ酸のグ
リシンではなく、アスパラギン酸またはバリンの何れか
であることが示された。
1987年の２つの報告書において、位置13にアルギニン
を有するras突然変異体が記載された、Nitta等は、ヒト
直腸癌から分離した活性化されたN ras p21において、
位置13のグリシンのアルギニンへのアミン酸置換を示し
ている（Jpn.J.Cancer Res.（Gann）,78:21−26（198
7））。Hirai等による報告書（Nature327−430 1987
年）には、脊髄形成異常症候群（mylodysplastic syndr
ome）の患者に由来する骨髄細胞中の、活性化されたN r
as遺伝子を示している。Hirai等のこの観察は、位置13
の突然変異をもつ活性化されたN ras遺伝子の存在愛
が、白血病の初期段階において重要であることを示唆し
ている。
E.Lui等による報告書（Nature 330:186,1987）によっ
て、脊髄形成異常病を持つ患者（急性白血病に進む1.5
年前）において、ras p21の位置13にアスパラギン酸突
然変異が存在することが示された。従って、位置13の突
然変異持つ活性化されたrasタンパクの存在について、
脊髄形成異常症候群の患者をモノクローナル抗体を用い
てスリーンするとは、脊髄形成異常病をもつ何れの患者
が急性白血病に進行する危険性が高いかを予測するのに
有効な試験である。
もっと最近になって、Wonder−Filipowicz等は、ヒト
Ｔ細胞性非ホジキン病性リンパ腫（non−Hodgkin′s ly
mphoma）における活性化されたN ras遺伝子の存在を報
告した（Oncogene,pp.457−461,Vol.1,Non.4（198
7））。これらの研究によって、位置13でのグリシンと
シスチンとの置換が示された。
多くの報告は、ras p21（H,KiおよびＮ）の188−189
アミノ酸の配列が、進化の期間に亘ってかなり保存され
ていることを示唆している。しかしながら、p21タンパ
ク類（H,KiおよびＮ）の間の最も重要な相違は、p21タ
ンパクのカルボキシ末端に位置した15−20アミノ酸を有
するセグメントに局在化されているらしい（Taparowsky
et al.,Nature 300:762（1982））。
更に、McGrath等（Nature,304:501−506,（1983））
およびシミズ等（Nature,304−497−500,（1983））
は、Ki遺伝子が、Ki4AおよびKi4Bと称する２つの別個の
タンパクをエンコードできる能力を有することを示し
た。Ki4AおよびKi4Bの用語は、Ki2AおよびKi2Bと互的に
用いられる。この可変領域は、ras p21のＣ末端アミノ
酸160−180の間に存在するので、理論的には、H ras p2
1、Ki4A ras p21、Ki4B ras p21およびN ras p21の夫々
に対して特異的に結合し得るモノクローナル抗体を発生
させることが可能である。複数の報告によって、急性骨
髄性白血病におけるN ras遺伝子のような特定のras遺伝
子の活性化（Bos et al.,Nature 315:726（1986））、
並びに特定のＨ−ras遺伝子の過剰発現（Spandidos et
al.,Anticancer Res.4:269（1984））はしばしは特定の
型の癌（乳癌）と関連することが示されているからであ
る。
1986年12月３日に公開された欧州特許出願86107244号
には、rasH、rasN、ras4KA及びras4KBのタンパクファミ
リーの可変領域に由来したアミノ酸配列を有するポリペ
プチドと、これらのポリペプチドが免疫原性キャリアに
共有結合的に結合している免疫原組成物と、このような
免疫原から産生されるras発癌遺伝子に特異的な抗体
（そのポリペプチド配列は該遺伝子に由来する）と、並
びにこれらの抗体を用いて個々のp21 ras発癌遺伝子フ
ァミリーを識別する免疫検定法が開示されている。開示
されたペプチド構造は、p21 H rasのアミノ酸171−186
及び170−189、p21 N rasのアミノ酸170−186、p21 Ki4
A rasのアミノ酸171−186、およびp21 Ki4B rasのアミ
ノ酸17−185に対応する。抗体は何れも寄託されなかっ
たようである。
米国特許第4,535,058号（発行1985,8,13、Weinberg e
t al.）には、ras p21タンパク又はペプチドの変異型
（該タンパクの位置12を包含する）に対するモノクロー
ナル抗体を生産するために、ハイブリドーマ技術を用い
る一般的概念が開示されている。特に注目すべき、４欄
６−15行、12欄33行から13欄29行、及び14欄40行から16
欄22行である。
米国特許第4,699,877号（発行1987,10,13、Cline et
al.）には、ヒト腫瘍を検出するための方法および組成
物が開示されている。レトロウイルス発癌遺伝子に存在
するRNAのペプチド発現生成物中の抗原性領域に対応し
た、一連のオリゴペプチドが５欄17−60行に開示されて
いる。このシリーズに含まれるのは、rasKiおよびrasHa
オリゴペプチドである。この文献は更に、これらハプテ
ン性オリゴペプチドが、適当なキャリアに結合させるこ
とによって、抗体形成を誘起するために用いられること
を開示している。ここに開示された方法は、悪性細胞の
存在可能性の診断として、mRNA又はその発現生成物のよ
うな細胞性生成物にたよるものである。
タナカ等（PNAS82:3400（1985））は、ras p21sの各
種の部分に対応した各種合成ペプチドに対する一連のウ
サギ血清の発生を報告した。タナカ等は、ｖ−Ha−ras
のアミノ酸160−179に対応したペプチドに対するウサギ
血清の製造を報告した。抗−p21血清は、このウサギ血
清をアフィニティー精製し、生化学的アッセイでその特
異性を評価して調製された。しかし、これらの試薬の特
異性には疑問がある。
Srivastava et alは、Molecular and Cellular Biolg
y5（11）:3316（1985）において、タンパクの各種セグ
メント（特に、H ras p21のアミノ酸161−176に対応す
るセグメント）に対応する合成ペプチドにに対する一連
のウサギ・ポリクローナル血清を報告した。
テラハラ等は、Jpn.J.Cancer Res.（Gann）77:517−5
22（1986）において、ｖ−Ha−p21の位置160−179に対
応する合成ペプチドに対して、ヒツジ抗−p21抗体が発
生することを開示した。
Bizub et al.は、Oncogene1:131−142（1987）におい
て、H ras、Ki rasおよびN rasにおける可変領域の各種
ペプチドに対して、マウス、ラット及びウサギの抗血清
を生じさせた。この報告に記載されたポリクローナル抗
体の幾つかは、H p21のアミノ酸171−189に対応するペ
プチド又はKi4B p21のアミノ酸171−186に対応するペプ
チドに対して生じた、アフィニティー精製ウサギ血清で
あった。この報告によると、ras p21sに対する追加の抗
体が、N.C.I.レポジトリ（Microbiological Assoc.In
c.,Bethesda,Maryland）で入手可能である。Bizub等の
報告で指摘された抗血清によって、N.C.I.で入手可能な
抗体は、ras p21sのアミノ酸配列157−180に関連するペ
プチド構造に対して生じることが示された。
Hand et al.は、JNCI,79（１）:59−65（July1987）
において、モノクローナル抗体Y13−259を用いる直結結
合液体競合試験（direct−binding liquid competition
assays）、並びに特異的なras点変異癌遺伝子（point
−mutated oncogene）もしくは癌原遺伝子の同定のため
のcDNAプローブと共働した免疫組織化学検定（immunohi
stochemical assays）が、ヒト癌腫および良性障害にお
けるras p21を定量するための可能な手段であり得るこ
とを開示した。上記のモノクローナル抗体Y13−259［Fu
rth et al.,J.Virol.43:294−304（1982）で議論されて
いる］は、ｖ−Ha−ras p21の天然型に対して発生した
ラット・モノクローナル抗体である。
同様にして、Ohuchi等は、Cancer Research 47:1413
−1420（March 1,1987）において、モノクローナル抗体
を用いた免疫検定およびin situハイブリダイゼーショ
ンによって定義された、ヒト胃腺癌におけるｃ−Ha−ra
s p21発現の増大を開示している。用いられたモノクロ
ーナル抗体の特異性は疑問である。
Caruso et al.は、Int.J.Cancer38:587−595（1986）
において、上述したモノクローナル抗体Y13−259及びY1
3−259（Ha−MuSVにエンコードされたras p21を選択的
に免疫沈降させたラット・モノクローナル抗体）を用い
た、哺乳類細胞におけるras p21の定量分析を開示して
いる。
Niman et al.は、PNAS（USA）82:7924−7928（1985）
において、抗ペプチド抗体を用いた、尿中の癌遺伝子関
連タンパクの検出を開示している。癌遺伝子関連タンパ
クの増加したレベルが、新形成および妊娠中に認められ
た。これらペプチドフラグメントが選択されたのは、そ
れらが癌遺伝子ファミリー（即ち、sis、ras及びfes）
の高度に保存された領域を示しているからである。この
rasペプチドは、ｖ−Ha−ras又はｖ−Ki−rasにエンコ
ードされたp21により自動リン酸化されたスレオニン残
基から下流の37−59アミノ酸に位置するHa ras配列であ
った。21,000ダルトンのタンパクの検出が報告された。
しかし、使用した試薬の特異生が疑問であるため、この
タンパクがras関連タンパクであるか否かは明らかでな
い。
国際公開番号WO85/00807（1985.2.28公開）のPCT出願
は、ポリペプチドに誘起された癌関連タンパクに対する
モノクローナル抗体の製造、並びに癌関連タンパクの存
在試験のための診断システムにおけるその使用を開示し
ている。
発明の要約 この発明の主題は、体液、組織もしくは細胞におい
て、全細胞ras p21、活性化ras p21、またはrasタンパ
クの個々のハーベイrasファミリー（Ha−ras）、カース
テンrasファミリー（Ki−ras）もしくはN rasファミリ
ー（Ｎ−ras）を検出、定量または分類するための免疫
検定法であって、 （ａ）p21タンパクを有すると推定される体液、組織ま
たは細胞を、固定化ras p21捕獲試薬と反応させる工程
であり、前記試薬が、（ｉ）抗−p21汎反応性抗体（pan
reactive antibody）、（ii）第12位置にアルギニン、
グルタミン酸、アスパラギン酸、セリンまたはシステイ
ンのアミノ酸置換を有する活性化rasタンパクのエピト
ープに特異的に結合し、かつ第12位置にグリシンを含む
エピトープには結合しないモノクローナル抗体、（ii
i）第13位置にアスパラギン酸またはバリンのアミノ酸
置換を有する活性化rasタンパクのエピトープに特異的
に結合し、かつ第13位置にグリシンを含有するエピトー
プには結合しないモノクローナル抗体、（iv）第61位置
にヒスチジン、リシン、ロイシンまたはアルギニンのア
ミノ酸置換を有する活性化rasタンパクのエピトープに
特異的に結合し、かつ第61位置にグルタミンを含有する
エピトープには結合しないモノクローナル抗体、（ｖ）
ハーベイrasタンパクに反応し、かつrasタンパクのカー
ステン2A、2BもしくはＮファミリーとは反応しないモノ
クローナル抗体、（vi）N rasタンパクに反応し、かつr
asタンパクのカーステン2A、2Bもしくはハーベイファミ
リーとは反応しないモノクローナル抗体、（vii）カー
ステン2A rasタンパクに結合し、かつrasタンパクのカ
ーステン2B、Ｎもしくはハーベイファミリーとは反応し
ないモノクローナル抗体、および（viii）カーステン2B
rasタンパクに反応し、かつrasタンパクのカーステン2
A、Ｎもしくはハーベイファミリーとは反応しないモノ
クローナル抗体からなる群より選ばれる少なくとも１種
の抗体である工程と、 （ｂ）工程（ａ）の生成物を、少なくとも１種の検出可
能に標識された抗体と反応させる工程であり、この抗体
が、（ｉ）抗−p21汎反応性モノクローナル抗体であっ
て、上述の標準条件を用いた、マイクロタイタープレー
トをベースとするELISAで試験する際に、この抗体のウ
ェル当り１〜10ngで約1.5〜約2.5の光学濃度を与える抗
体、（ii）第12位置にアルギニン、グルタミン酸、アス
パラギン酸、セリン、もしくはシステインのアミノ酸置
換を有する、活性化rasタンパクのエピトープに特異的
に結合し、かつ第12位置にグリシンを含むエピトープに
は結合しないモノクローナル抗体、（iii）第13位置に
アスパラギン酸もしくはバリンのアミノ酸置換を有す
る、活性化rasタンパクのエピトープに特異的に結合
し、かつ第13位置にグリシンを含むエピトープには結合
ないモノクローナル抗体、（iv）第61位置にヒスチジ
ン、リシン、ロイシンもしくはアルギニンのアミノ酸置
換を有する、活性化rasタンパクのエピトープに特異的
に結合し、かつ第61位置にグルタミンを含むエピトープ
には結合しないモノクローナル抗体、（ｖ）ハーベイra
sタンパクに反応し、かつrasタンパクのカーステン2A、
2BもしくはＮファミリーには反応しないモノクローナル
抗体、（vi）N rasタンパクに反応し、かつrasタンパク
のカーステン2A、2Bもしくはハーベイファミリーには反
応しないモノクローナル抗体、（vii）カーステン2A ra
sタンパクに反応し、かつrasタンパクのカーステン2B、
Ｎもしくはハーベイファミリーには反応しないモノクロ
ーナル抗体、および（viii）カーステン2B rasタンパク
に反応し、かつrasタンパクのカーステン2A、Ｎもしく
はハーベイファミリーには反応しないモノクローナル抗
体、からなる群より選ばれる抗体である工程と、 （ｃ）工程（ｂ）の生成物を検出し、定量し、または分
類する工程とを具備する免疫検定法である。
図面の簡単な説明 第１図は、前出のサンドイッチ免疫検定の様式を説明
する図、 第２図は、この発明の免疫検定を用いる、細胞株NIH3
T3およびNIH3T3（SW480）より得られた培養液に放出／
発散（shed）されたras p21タンパクの検出を示すグラ
フ、 第３図は、この発明に免疫検定を用いる、腫瘍を有す
るヌードマウスの血漿のおけるras p21タンパクの検出
を示すグラフ、 第４図は、この発明の免疫検定を用いる、腫瘍をする
PVS LM（EJ）およびNIH3T3（SW480）マウスの血漿にお
けるras p21タンパクの別の発現を示すグラフ、 第５図は、この発明の免疫検定を用いる、ヒト血漿中
のras p21タンパクの検出を示すグラフ、 第5A図は、この発明の免疫検定を用いる、ヒト血漿中
のras p21タンパクの検出を示すグラフ、 第６図は、この発明の免疫検定用いる、ヒトras遺伝
子を有する３種のマウス細胞系におけるras p21タンパ
クの検出を示すグラフ、 第７図は、ras p21標準曲線、 第８図は、この発明の免疫検定を用いる、正常ヒト乳
組織（breast tissue）およびヒト乳癌の10検体に検出
されたras p21タンパクレベルを示す棒グラフであり、
各棒は、タンパクμｇ当りのpgとして表現されたras p2
1の量を表わし、 第９図は、この発明の免疫検定を用いる、ヒト結腸癌
10検体におけるras p21タンパクの検出および定量を示
す棒グラフであり、各棒は、タンパクμｇ当りのpgとし
て表現されたras 21の量を表わし、 第10図は、この発明の免疫検定を用いる、腫瘍を有す
るヌードマウスから得られた血漿における、第12位置に
バリンを有する活性ras p21タンパクの検出を示すグラ
フ、 第11図は、この発明の免疫検定を用いる、第12位置に
アルギニンを有する組換えras p21タンパクにおける、
第12位置にアルギニンを有する活性ras p21タンパクの
検出を示すグラフ、 第12図は、この発明の免疫検定を用いる、細胞株AML
−１から得られる細胞溶解質における、第13位置にアス
パルギン酸を有する活性ras p21タンパクの検出を示す
グラフ、 第13図は、細胞株A2182およびNIH v−Ｈ−rasより得
られる細胞溶解質における、第12位置にアルギニンを有
するras p21の検出を示すグラフである。
発明の詳細な記述 本発明は細胞や体組織、或いは血液、血清、血漿、
尿、便、唾液または呼気のような体液、並びに汗のよう
な体分泌物中における、ras p21タンパク（ras p21 pro
teins）の検出、定量および分類に関する。
予期し得ず且つ驚くべきことに、細胞によって分泌ま
たは放出される正常p21、活性型p21またはrasファミリ
ー特異性p21、並びに細胞によって分泌または放出され
るが細胞膜のフラグメントに結合されたp21は、細胞性r
asと同様に、本発明の免疫検定を用いることにより体組
織および体液中において検出および定量され得る。ウイ
ルス性および細胞性のrasタンパクは原形質膜の内面に
局在化されていると信じられていたし、また体液中のra
s21タンパクの検出、定量および分類は、これまで誰に
よっても明白に示されていなかったから、この事実は驚
くべきことであり、且つ予期し得なかったことである。
全細胞性rasの用語は、p21の細胞質形、p21の膜結合
形、および／またはp21の分泌形を集合的に意味する。
この中には、（１）正常ras p21タンパク、（２）部位1
2にバリン、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン
酸、システイン、セリンまたはアラニンのアミノ酸置換
を有する活性型ras p21タンパク、（３）部位13にアス
パラギン酸またはバリンのアミノ酸置換を有する活性型
ras p21タンパク、（４）部位61にリシン、ロイシン、
ヒスチジンまたはアルギニンのアミノ酸置換を有する活
性型ras p21タンパク、並びに（５）ファミリー特異的
なハーベイー、カーステン−またはＮ−ras p21タンパ
クが含まれる。
ここでは、ＨおよびHaの略語が、ハーベイ−rasファ
ミリーを示すために互換的に用いられる。同様に、Ｋお
よびKiの略語がカーステン−rasファミリーを示すため
の互換的に用いられ、またK2AおよびK2Bの略語がK4Aお
よびK4Bと互換的に用いられる。
腫瘍原性、活性型および突然変異性の語は、互換的に
用いられる。
免疫沈殿および免疫濃縮の語は、互換的に用いられ
る。
抗体の語はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体
またはこれらの免疫反応性フラグメントを意味する。
本発明の実施に適切な抗体には、以下のもの又はこれ
らと等価のものが含まれる。
ポリクローナル抗体 正常型および活性型のras p21タンパクと反応するポ
リクローナル抗−p21汎反応性抗体は、本発明の実施に
使用され得る。ポリクローナル抗体を製造する技術は、
当業者には周知である。このような抗体は、精製された
細胞性ras p21タンパクまたは組替えras p21タンパクの
ような免疫原で、兎またはヤギを免疫することによって
生成される。例えば、バクテリア内で発現した組替えp2
1タンパクが使用され得る。これらの組替えタンパク
は、正常型または活性型のペプチド構造を有し得る。部
位12にアルギニンを有する大腸菌（Escherichia coil;
以下E.coilと記す）中で発現した組替えp21は、良好に
作用することが分かった。組替えタンパクを製造する技
術もまた周知である。部位12にアルギニンを有する組替
えp21タンパク合成を以下に説明する。このような合成
は、Feig et al.,Molecular Endocrinology,pp.127−13
6,Vol.1,No.2（1987）にも記載されている。
部位12にアルギニンを有する組替えras p21の合成 真正のウィルス性ハーベイ−ras p21の合成を指令す
るpXVRで示されるras発現ベクターが、以下のようにし
て構築された。
ウイルス性ハーベイ−ras遺伝子がコードするアミノ
酸のうち、最初の５個のアミノ酸を除く全てのアミノ酸
をコードする720塩基対の制限酵素フラグメントが、標
準的な操作によって、バクテリアのシャイン−ダルガノ
配列と、これに続く６塩基対のスペーサ及びウイルス性
ハーベイ−rasの最初の５個のコドンを有する32塩基対
の合成オリゴマーにライゲートされた。この物質に対し
て、複製開始部位およびpBR32由来のアンピシリン耐性
遺伝子と共にtacプロモータを含んだ、pTR1340由来のプ
ラスミド骨格がライゲートされた。前記pXVR構築体は、
lacリプレッサーを過剰に産生してtacプロモータを一部
抑制し、それによって細胞の生活力をを維持するE.coli
PR13−Ｑ株に形質転換された。
p21の産生を誘導するために、このE.coli細胞を、大
量のp21の合成を誘発するイソプロピルチオ−Ｂ−Ｄ−
ガラクトシド（IPTG）と共にインキュベートした。
より詳細には、E.coliはA590での光学密度（O.D.）が
0.25になるまで成長される。5MmのIPTGの添加によっ
て、p21が誘導される。１時間後、E.coliは遠心分離に
よって回収される。この細胞ペレットは、pH7.4のライ
シス緩衝液（25mM tris−HCL,0.7mM Na2HPO4,5mM KCl,
0.14M NaCl,5mM EDTA,10mM MgCl2,1％Triton X−100,25
％スクロース及び1mg/ml lysozyme）中に再度懸濁さ
れ、渦動された。この物質を２回だけ凍結／溶解し、こ
の抽出物をDNaseと共にインキュベートし、次いで10,00
0×ｇで15分間遠心した。このペレットを１％のTriton
X−100中で洗浄し、20mM MES 2（Ｎ−モルホリンエタン
スルホン酸）中の3.5Mグアニジン塩酸塩50μ（pH7.
0）に再度懸濁し、遠心分離によって粒状物を除去し
た。
以下に、部位61にロイシンを有する組替えp21（これ
は汎反応性ポリクローナル抗体の生成にも使用され得
る）の合成を説明する。
部位61にロイシンを有する組替えタンパクの合成 M13ベクター中における完全な長さのヒトrasu/ハーベ
イcDNAクローンを用いることにより、Der et al.,Cell,
p.167−176,Vol.44（January17,1986）に記載されてい
るイン・ビトロ突然変異によって、適切なコドン61置換
が誘導される。イン・ビトロ突然変異は、タンパクの機
能部位を決定し、生化学的および生物学的活性に関連付
けるために広く用いられている。ras発現ベクターは、
上記の方法を用いて構築される。この計画は、バクテリ
ア中で完全なrasタンパクを産生するために、J.P.McGra
th,Nature310:644,1984およびJ.C.Lacal,PNAS81:5305,1
984に記載された計画に類似している。
モノクローナル抗体 ハイブリドーマ方法論およびスクリーニングプロトコ
ールは、以下のサブセクション（ｅ）に記載される。こ
れらの方法は、キャリアタンパクに結合した以下に記載
のペプチドを用いることにより、以下に記載の抗体を生
成するために用いられる。
ａ）抗−p21モノクローナル抗体 抗−p21汎反応性モノクローナル抗体は、1987年７月
８日に出願された同時係属出願第071,175号の主題を構
成するもので、該同時係属出願の開示内容はこの明細書
中に参照として組み込まれる。その中に記載されている
抗−p21汎反応性モノクローナル抗体は、部位12におい
て、正常型Ha−ras p21タンパク中に存在するグリシン
の代りにアルギニンを有する組替えHa−rasu p21タンパ
クを用いて生成された。組替えタンパクの合成は、上記
で説明した通りである。これら抗−p21モノクローナル
抗体を分泌するハイブリドーマは、ras8、ras10、ras11
と表示される。これら全てのハイブリドーマは、ブタペ
スト条約の下に1987年５月12日にアメリカン・タイプ・
ティッシュ・カルチャー・コレクション（ATCC）に寄託
された。ハイブリドーマras8「HB9428」し命名され、ハ
イブリドーマras10は「HB9426」として命名され、ハイ
ブリドーマras11は「HB9427」として命名された。
これらの抗−p21汎反応性モノクローナル抗体は、以
下の標準条件下において、ELISAに基づいてマイクロ滴
定プレート中で試験されたとき、488nmにおける約1.5〜
約2.5の光学密度を与えた。
標準ELISA条件 このセクションで説明するELISAの目的は、抗−p21モ
ノクローナル抗体が正常型および突然変異性のras21タ
ンパクと反応するか否かを試験することである。500ng
の正常型または突然変異性の組替えヒトrasタンパクが
ウエル毎にコートされた；牛血清アルブミン（BSA）を
含む50μの燐酸緩衝生理食塩水（PBS）中の抗体また
は抗体フラグメント0.1〜1000ngを、試験サンプルとし
てウエル毎に添加した;37℃で一晩インキュベートし、
続いてBSA−PBSで洗浄した;BSA−PBS50μ中の、西洋
ワサビパーオキシダーゼに結合したヤギ抗−マウスIgG
抗体10ngを、検出試薬として添加した;37℃で60分間イ
ンキュベートした後、BSA−PBSで洗浄した;0.15％過酸
化水素を含むPBS中のｏ−フェニレンジアミン50μ
を、基質として添加した;10分間の酵素反応の後、停止
剤として50μの4.5M硫酸を添加した;488nmでの光学密
度を測定した。
ras8、ras10およびras11に加えて、他の４つの抗−p2
1パン反応性モノクローナル抗体があり、これらは上記
標準条件下にマイクロ滴定ベースのELISAで試験したと
き、488nmにおいて約1.5〜2.5の光学密度（OD）を与え
る。これらの抗体は、ras9,13,17,20である。ras9,13,1
7は、部位12にアルギニンを有する組替えハーベイrasタ
ンパクを用いて生成される。このタンパクの合成は、上
記に説明した通りである。ras20は、部位61にロイシン
を有する組替えハーベイrasタンパクを免疫原に用いて
生成される。このタンパクの合成も、上記に説明した通
りである。ハイブリドーマ細胞系であるRas9,13,17,20
は、1989年３月29日に、ブタペスト条約の下にATCCに寄
託された。
Ras9は、ATCC寄託名称「HB10058」に対応する。
Ras13は、ATCC寄託名称「HB10052」に対応する。
Ras17は、ATCC寄託名称「HB10054」に対応する。
Ras20は、ATCC寄託名称「HB10059」に対応する。
ここに記載した免疫検定に加えて、ハイブリドーマ細
胞系Ras9,13,17,20は、免疫ブロットおよびras p21タン
パクの免疫濃縮にも用いられ得る。
ｂ）第12位置で突然変異されたRasタンパクと反応性の
あるモノクローナル抗体 第12位置で突然変異されたグリシンの代わりにバリン
を有するp21に特異的で、DWPと呼ばれるモノクローナル
抗体は、上記参照された欧州特許出願（EPO公開公報No.
019003）に開示されている。このモノクローナル抗体お
よび第12位置にグルタミン酸またはアルギニン突然変異
を有するp21に特異的なモノクローナル抗体は、ここで
参照することにより組み込まれる1987年10月22日に出願
された出願番号111,315の同時継続の出願の主題を構成
する。この出願は、２つの先の先願（1985年１月29日出
願のU.S.S.N696,197および1986年10月１日出願のU.S.S.
N913,905）の一部分継続出願であり、それらの優先権を
主張する。バリン、グルタミン酸またはアルギニンを有
するp21タンパクと反応性のあるモノクローナル抗体を
分泌するハイブリドーマを、ブタペスト条約に従ってAT
CCに寄託した。
第12位置にバリンを有する突然変異ras p21タンパク
と反応性のあるモノクローナル抗体を分泌し、DWPと呼
ばれるハイブリドーマ細胞系は、1989年１月23日に寄託
され、ATTC指定番号HB8698が与えられた。
第12位置にグルタミン酸を有する突然変異ras p21タ
ンパクと反応性のあるモノクローナル抗体を分泌するハ
イブリドーマ細胞系を、E184およびE170と呼んだ。ハイ
ブリドーマE184は1986年９月11日に寄託され、ATTC指定
番号HB9194が与えられた。ハイブリドーマE170は1986年
９月11日に寄託され、ATTC指定番号HB9195が与えられ
た。
第12位置にアルギニンを有する突然変異ras p21タンパ
クと反応性のあるモノクローナル抗体を分泌し、R256と
呼ばれるハイブリドーマ細胞系は1986年９月11日に寄託
され、ATTC指定番号HB9196が与えられた。
バリン置換体に特異的なモノクローナルは、次のポリペ
プチド配列を含有する免疫原を用いて生成された:5リジ
ン−ロイシン−バリン−バリン−バリン−グリシン−ア
ラニン−バリン−グリシン−バリン−グリシン−リジン
16。
グルタミン酸に特異的なモノクローナルは、次のポリ
ペプチド配列を含有する免疫原を用いて生成された:5リ
ジン−ロイシン−バリン−バリン−バリン−グリシン−
アラニン−グルタミン酸−グリシン−バリン−グリシン
−リジン16。
本発明のアッセイに使用可能である他のモノクローナ
ル抗体は、第12位置にアスパラギン酸を有する活性化ra
s p21タンパクのエピトープに特異的に結合するが、第1
2位置にグリシンを有するエピトープには結合しないモ
ノクローナル抗体を含む。
突然変異ras p21タンパクと反応性のあるモノクロー
ナル抗体を、ハイブリドーマ細胞系D113,D205,およびD2
10によって製造した。これらの細胞系を、ブタペスト条
約に従ってATTCに寄託した。ハイブリドーマ細胞系D113
は1989年３月31日に寄託され、ATTC指定番号HB10086が
与えられた。ハイブリドーマ細胞系D205は1989年３月29
日に寄託され、ATTC指定番号HB10061が与えられた。ハ
イブリドーマ細胞系D210は、1989年３月31日に寄託さ
れ、ATTC指定番号HB10083が与えられた。
ハイブリドーマ細胞系D113,D205,およびD210は、ドデ
カペプチド５リジン−ロイシン−バリン−バリン−バリ
ン−グリシン−アラニン−アスパラギン酸−グリシン−
バリン−グリシン−リジン16を用いて、下記の手順に従
ってマウスを免疫化して製造した。上述のように、ハイ
ブリドーマ方法論およびスクリーニング・プロトコール
（screening protocol）は同様に下記説明する。モノク
ローナル抗体は、第12位置にアスパラギン酸を含有する
ペプチドとの反応性および第12位置にグリシンを含有す
るペプチドとの反応性の欠乏、すなわち、アスパラギン
酸陽性、グリシン陰性についてスクリーニングされた。
本発明のイムノアッセイに使用できるモノクローナル
抗体は、第12位置にセリンまたはシステインを有する活
性化ras p21タンパクのエピトープに特異的に結合する
が、第12位置にグリシンを有するエピトープには結合し
ないモノクローナル抗体も同様に含む。
第12位置にセリンを有する突然変異ras p21タンパク
と反応性のあるモノクローナル抗体を、ハイブリドーマ
細胞系S1107−8.3.により製造した。この細胞系をブタ
ペスト条約に従って1989年３月29日にATCC寄託した。ハ
イブリドーマ細胞系S1107−8.3.はATTC指定番号HB10060
が与えられた。ハイブリドーマ細胞系S1107−8.3.はド
デカペプチド ５リジン−ロイシン−バリン−バリン−
バリン−グリシン−アラニン−セリン−グリシン−バリ
ン−グリシン−リジン16を用いて、下記の手順に従って
マウスを免疫化して製造した。ハイブリドーマ方法論お
よびスクリーニング・プロトコールはまた下に記述す
る。モノクローナル抗体は、関心のあるペプチドとの反
応性、すなわち、セリン陽性、グリシン陰性について同
様にスクリーニングされた。
第12位置にシステインを有する突然変異されたras p2
1タンパクと反応性のあるモノクローナル抗体を、ハイ
ブリドーマ細胞系Ｃ−1119−９およびＣ−1119−10によ
って製造した。これらの細胞系を、ブタペスト条約に従
って1989年３月31日にATTCに寄託した。Ｃ−1119−10は
ATTC指定番号HB10088が与えられた。Ｃ−1119−９はATT
C指定番号HB10084が与えられた。
ハイブリドーマ細胞系Ｃ−1119−９およびＣ−1119−
10を、ドデカペプチド５リジン−ロイシン−バリン−バ
リン−バリン−グリシン−アラニン−システイン−グリ
シン−バリン−グリシン−リジン16を用いて、下記の手
順に従ってマウスに免疫化して製造した。ハイブリドー
マ方法論およびスクリーニング・プロトコールはまた下
に記述する。モノクローナル抗体は、関心のあるペプチ
ドとの反応性、すなわち、システイン陽性、グリシン陰
性について同様にスクリーニングされた。
ｃ）第13位置で突然変異されたRasタンパクと反応性の
あるモノクローナル抗体 ここで参照されることにより組込まれる1988年２月22
日に出願された出願番号158,730の同時継続の出願にお
いて論ぜられたモノクローナル抗体も、同様にこの出願
の視点の範囲内である。ここで論ぜられたモノクローナ
ルは、第13位置にアミノ酸置換体を有するras p21タン
パクと反応性がある。特に、アスパルギン酸およびバリ
ンは、通常存在するグリシンに代えて第13位置に置換さ
れた。
アスパラギン酸置換体に特異的なモノクローナル抗体
は、次のポリペプチド配列を含有する免疫原を用いて生
成された：システイン−５リジン−ロイシン−バリン−
バリン−バリン−グリシン−アラニン−グリシン−アス
パルギン酸−バリン−グリシン−リジン−セリン−アラ
ニン−ロイシン19。これらのモノクローナル抗体を分泌
するハイブリドーマを、D735−13（129）およびD736−1
3（146）と呼んだ。これらのハイブリドーマを、ブタペ
スト条約に従って1988年１月29日にATTC寄託した。ハイ
ブリドーマD735−13（129）はATTC指定番号HB9632が与
えられた。ハイブリドーマD736−13（146）はATTC指定
番号HB9633が与えられた。
バリン置換体に特異的なモノクローナルは、次のポリ
ペプチド配列を含有する免疫原を用いて生成される：シ
ステイン−５リジン−ロイシン−バリン−バリン−バリ
ン−グリシン−アラニン−グリシン−バリン−バリン−
グリシン−リジン−セリン−アラニン−ロイシン19。こ
のモノクローナル抗体を分泌するハイリドーマを、V647
−13と呼んだ。このハイブリドーマはブタペスト条約に
従って寄託され、ATTC指定番号HB9634が与えられた。
第13位置で突然変異されたrasタンパクと反応性のあ
る他のモノクローナルは、第13位置にアルギニンを有す
る活性化ras p21タンパクのエピトープに特異的に結合
するが、第13位置にグリシンを有するエピトープには結
合しないモノクローナル抗体を含む。
これらのモノクローナル抗体は、次のポリペプチド配
列を含有する免疫原を用いて下記の工程に従ってマウス
を免疫化することによって生成できる:5リジン−ロイシ
ン−バリン−バリン−バリン−グリシン−アラニン−グ
リシン−アルギニン−バリン−グリシン−リジン16。ハ
イブリドーマ方法論およびスクリーニング・プロトコー
ルまたは下に記述する。モノクローナル抗体は、関心の
あるペプチドとの反応性、すなわち、アルギニン陽性
（第13位置）、グリシン陰性（第13位置）について同様
にスクリーニングされる。
ｄ）第61位置で突然変異されたRasタンパクとの反応モ
ノクローナル抗体 アルギニン、ロイシンまたはヒスチジンを第61位置に
有するras p21タンパクのエピトープに特異的に結合す
るが、グルタミンを第61位置を有するエピトープには結
合しないモノクローナル抗体を、ブタペスト条約に従っ
てATCCに寄託した。
第61位置にアルギニンを有する突然変異ras p21タン
パクと反応性のあるモノクローナル抗体を製造するハイ
ブリドーマ細胞系は、ハイブリドーマ細胞系R61−1,R61
−2,R61−３およびR61−４により製造された。ハイブリ
ドーマ細胞系R61−１は1989年３月29日に寄託され、ATT
C指定番号HB10063が与えられた。ハイブリドーマ細胞系
61−２は1989年３月30日に寄託され、ATTC指定番号HB10
069が与えられた。ハイブリドーマ細胞系R61−３は1989
年３月30日に寄託され、ATTC指定番号HB10071が与えら
れた。ハイブリドーマ細胞系R61−４は1989年３月29日
に寄託され、ATTC指定番号HB10062が与えられた。
ハイブリドーマ細胞系R61−1,R61−2,R61−３およびR
61−４は、次の構造を有する11マー（11mer）ペプチド
（ウンデカペプチド）用いて、下記の手順に従ってマウ
スに免疫化して製造された:57アスパラギン酸−スレオ
ニン−アラニン−グリシン−アルギニン−グルタミン酸
−グラタミン酸−チロシン−セリン−アラニン66−チロ
シン。末端チロシン残基は、キャリアタンパクへの結合
を促進するために加えた。ハイブリドーマ方法論および
スクリーニング・プロトコールはまた下に記述する。モ
ノクローナル抗体は、関心のあるペプチドとの反応性、
すなわち、アルギニン陽性（第61位置）、グルシン陰性
（第61位置）について同様にスクリーニングされた。
第61位置にロイシンを有する突然変異ras p21タンパ
クと反応性のあるモノクローナル抗体を、ハイブリドー
マ細胞系L61−１およびL61−２によって製造した。ハイ
ブリドーマ細胞系L61−２はATTC指定番号HB10073が与え
られた。ハイブリドーマ細胞系L61−１はATTC指定番号B
H10068が与えられた。両細胞系ともに1989年３月30日に
寄託された。
ハイブリドーマ細胞系L61−１およびL61−２は、下記
手順に従い、マウスを免疫するための下記構造を有する
11マーペプチド（ウンデカペプチド）を用いて作成し
た。57アスパラギン酸−トレオニン−アラニン−グリシ
ン−ロイシン−グルタミン酸−グルタミン酸−チロシン
−セリン−アラニン66−チロシン。ハイブリドーマ方法
学およびスクリーニング・プロトコルはまた以下に記述
される。モノクローナル抗体は、関心のあるペプチドと
のそれらの反応性、ロイシン陽性（第61位置）、グルタ
ミン陰性（第61位置）に対してもスクリーニングされ
る。
第61位置にヒスチジンを有する突然変異ras p21タン
パクに反応するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ
細胞系H61−１、H61−２、H61−３、H61−４、およびH6
1−５によって作成した。ハイブリドーマ細胞系H61−１
は1989年３月30日に寄託され、ATCC識別番号HB10070が
与えられた。ハイブリドーマ細胞株H61−２は1989年３
月30日に寄託され、ATCC識別番号HB10092が与えられ
た。ハイブリドーマ細胞株H61−３は1989年３月30日に
寄託され、ATCC識別番号HB10089が与えられた。ハイブ
リドーマ細胞株H61−４は1989年３月30日に寄託され、A
TCC識別番号HB10087が与えられた。ハイブリドーマ細胞
株H61−５は1989年３月30日に寄託され、ATCC識別番号H
B10090が与えられた。
ハイブリドーマ細胞株H61−１、H61−２、H61−３、H
61−４、およびH61−５は、下記手順に従い、マウスを
免疫するための下記構造を有する11マーペプチド（ウン
デカペプチド）を用いて作成した。57アスパラギン酸−
トレオニン−アラニン−グリシン−ヒスチジン−グルタ
ミン酸−グルタミン酸−チロシン−セリン−アラニン66
−チロシン。ハイブリドーマ方法学およびスクリーニン
グ・プロトコルはまた下に記述される。このモノクロー
ナル抗体は、関心のあるペプチドに対するそれらの反応
性、ヒスチジン陽性（第61位置）、グルタミン陰性（第
61位置）に対してもスクリーニングされる。
第61位置にリシンを有する突然変異ras p21タンパク
に反応するモノクローナル抗体は、下記構造を有する11
マーペプチド（ウンデカペプチド）を用いて精製したハ
イブリドーマ細胞株によって作成した。57アスパラギン
酸−トレオニン−アラニン−グリシン−リシン−グルタ
ミン酸−グルタミン酸−チロシン−セリン−アラニン66
−チロシン。下記手順に従ってマウスを免疫する。モノ
クローナル抗体は、関心のあるペプチドに対するそれら
の反応性、リシン陽性（第61位置）、グルタミン陰性
（第61位置）もスクリーニングされる。
ｅ）個々のハーベイ、Ｎ−およびカーステン−族のRas
タンパクと反応性のモノクローナル抗体 Ha、Ｎ若しくはKi2A、Ki2B ras p21sに特異的なモノ
クローナル類は、1988年４月22日付け提出の同時係属米
国特許出願第07/185,194号に開示され、この出願は本明
細書に参照として組込まれると共に、米国特許出願第07
/185,582号と同時に提出されたものである。これらのモ
ノクローナル類はまた、同時提出の同時係属米国特許出
願（代理人Docket番号NN−0218−Ａ）に開示される。こ
こで述べられるモノクローナル類は、個々のHa、Ｎ若し
くはKi−ras族間において区別される。
Ｈ−rasに特異的なモノクローナル類を生成するハイ
ブリドーマは、Ｈ−770−1.1.4、Ｈ−784−4.7.7及びＨ
−873−3.5.3で指定され、ブタペスト条約の下に、1988
年３月25日付けでATCCに寄託された。ハイブリドーマＨ
−770−1.1.4は、ATCC指定番号HB9673のコードを付され
た。ハイブリドーマＨ−784−4.7.7は、ATCC指定番号BH
9675のコードを付された。ハイブリドーマＨ−873−3.
5.3は、ATCC指定番号HB9674のコードを付された。
Ｎ−rasに特異的なモノクローナル類を生成するハイ
ブリドーマはＮ−821−1.1.9及びＮ−838−1.1.6で指定
され、ブタペスト条約の下に、1988年３月25日付けでAT
CCに寄託された。ハイブリドーマＮ−821−1.1.9は、AT
CC指定番号HB9671のコードを付された。ハイブリドーマ
Ｎ−838−1.1.6は、ATCC指定番号BH9672のコードを付さ
れた。
Ki2Aに特異的なモノクローナルを生成するハイブリド
ーマ細胞系はK2A−１及びK2A−２で指定され、ブタペス
ト条約の下に、1989年３月30日付けでATCCに寄託され
た。K2A−１はATCC指定番号BH10072のコードを付され
た。K2A−２はATCC指定番号HB10065のコードを付され
た。
Ki2B rasに特異的なモノクローナル抗体を生成するハ
イブリドーマ細胞系はK2B−１、K2B−２、K2B−３、K2B
−４、K2B−５、K2B−６及びK2B−７で指定され、上記
ブタペスト条約の下に、ATCCに寄託された。K2B−１は1
989年３月30日付け寄託され、ATCC指定番号HB10064のコ
ードを付された。K2B−２は1989年３月29日付け寄託さ
れ、ATCC指定番号HB10065のコードを付された。K2B−３
は1989年３月30日付け寄託され、ATCC指定番号BH10066
のコードを付された。K2B−４は1989年３月31日付け寄
託され、ATCC指定番号HB10085のコードを付された。K2B
−５は1989年３月29日付け寄託され、ATCC指定番号HB10
056のコードを付された。K2B−６は1989年３月30日付け
寄託され、ATCC指定番号HB10067のコードを付された。K
2B−７は1989年３月31日付け寄託され、ATCC指定番号HB
10091のコードを付された。
免疫化 Mab H−770−1.1.4の場合において、Balb/c x C57B1/
6マウス＃4607は、Kagan等のグルタルアルデヒド法、Ho
rmone Radioimmunoassay法、pp.327−339（2d Ed.）（1
979）を介して、キャリアタンパクKeyhole Limpet Hema
cyanin（KLH）と組合わされたＨ−特異的ペプチドによ
って免疫化された。他でも述べられるが、Kagan法はこ
こで述べられる全ての組合わせ／接合にとって望まし
い。Ｈ−特異的ペプチドは、ras H p21のポジション163
−180に対応する18アミノ酸からなった。免疫化ペプチ
ドの構造は次の通りである。163イソロイシン−アルギ
ニン−グルタミン−ヒスチジン−リシン−ロイシン−ア
ルギニン−リシン−ロイシン−アスパラギン−プロリン
−プロリン−アスパラギン酸−グルタミン酸−セリン−
グリシン−プロリン−グリシン180。
Mab H−784−4.7.7の場合において、Balb/c x C57B1/
6マウス＃4615は、キャリアタンパクKLHと組合わされた
Ｈ−特異的ペプチドによって免疫化された。
Mab H−873−3.5.3の場合において、Balb/c x C57B1/
6マウス＃4606は、キャリアタンパクKLHと組合わされた
Ｈ−特異的ペプチドによって免疫化された。
Mab H−821−1.1.9の場合において、Balb/c x C57B1/
6マウス＃4486は、上述のキャリアタンパクBovine Thyr
oglobulin（BTG）と組合わされたＮ−特異的ペプチドに
よって免疫化された。
Mab H−838−1.1.6の場合において、Balb/c x C57B1/
6マウス＃4480は、BTGと組合わされたＮ−特異的ペプチ
ドによって免疫化された。Ｎ−特異的ペプチドは、N ra
s p21のポジション163−180に対応する18アミノ酸から
なった。N rasペプチドの構造は次の通りである。163イ
ソロイシン−アルギニン−グルタミン−チロシン−アル
ギニン−メチオニン−リシン−リシン−ロイシン−アス
パラギン−セリン−セリン−アスパラギン酸−アスパラ
ギン酸−スレオニン−グルタミン酸−グリシン180。
免疫化Ｎ及びＨ−特異的ペプチドは、ペプチドの免疫
原性を強化する為、キャリアタンパクKLH及びBTGと夫々
組合わされた。第１の接種は、Complete Freunds Adjuv
antと混合されたペプチドキャリア接合からなった。接
種されたタンパク総量は500μｇであった。次に接種は
２週間の間隔で付与された。融合（fusion）３日前、マ
ウスは適当な免疫原の腹腔内接種を付与された。
Mab K2A−１、K2A−２の場合において、Balb/c x C57
B1/6の幾つかのマウスは、アミノ酸163−180に対応する
ペプチドによって免疫化された。再び、ペプチドは接種
に先立ってキャリアタンパクと組合わされた。
アミノ酸163−180に対応するペプチドは18のアミノ酸
からなり、次の構造を有した。163イソロイシン−アル
ギニン−グルタミン−チロシン−アルギニン−ロイシン
−リシン−リシン−イソロイシン−セリン−セリン−グ
ルタミン酸−グルタミン酸−リシン−スレオニン−プロ
リン−グリシン−システイン180。
Ki ras p21のアミノ酸170−184に対応する他のペプチ
ドが免疫原として使用可能となる。それは下記の構造を
有する。170リシン−イソロイシン−セリン−リシン−
グルタミン酸−グルタミン酸−リシン−スレオニン−プ
ロリン−グリシン−システイン−バリン−リシン−イソ
ロイシン−リシン184。
K2B−１、K2B−２、K2B−３、K2B−４、K2B−５、K2B
−６及びK2B−７の場合において、Balb/c x C57B1/6の
マウスは、アミノ酸164−175に対応するペプチドによっ
て免疫化された。再び、ペプチドは接種に先立ってキャ
リアタンパクと組合わされた。
Ki2B ras p21のアミノ酸ポジション164−175に対応す
るペプチドは12のアミノ酸からなり、次の構造を有し
た。164アルギニン−リシン−ヒスチジン−リシン−グ
ルタミン酸−リシン−メチオニン−セリン−リシン−ア
スパラギン酸−グリシン−リシン175。
Ki2B ras p21のアミノ酸163−180及び168−183に対応
する２つの他のペプチドがまた使用可能となる。それら
は下記の構造を有する。163イソロイシン−アルギニン
−リシン−ヒスチジン−リシン−グルタミン酸−リシン
−メチオニン−セリン−リシン−アスパラギン酸−グリ
シン−リシン−リシン−リシン−リシン−リシン−リシ
ン180、及び168グルタミン酸−リシン−メチオニン−セ
リン−リシン−アスパラギン酸−グリシン−リシン−リ
シン−リシン−リシン−リシン−セリン−リシン−スレ
オニン183。
Ki2A及びKi2B−特異的ペプチドはペプチドの免疫原性
を強化する為、キャリアタンパクKLH若しくはBTGと組合
わされた。第１の接種は、Complete Freunds Adjuvant
と混合されたペプチドキャリア接合からなった。接種さ
れたタンパク総量は500μｇであった。次に接種は２週
間の間隔で付与された。融合（fusion）３日前、マウス
は適当な免疫原の腹腔内接種を付与された。
ハイブリドーマ方法論 腹腔内追加免疫の３日後、適当な免疫マウスの脾臓除
去され、非分泌ミエローマ細胞Sp2/0と融合された。脾
臓細胞懸濁は低血清DMEM−高グルコース媒体内で調製さ
れ、4:1の割合でミエローマ細胞と混合された。この細
胞混合物は、室温において、10分間、1200xgで遠心分離
された。上清を除去後、上記細胞は試験管を静かにタッ
ピングすることにより再び懸濁された。融合手続きは、
30秒間に亘って、37℃で45％w/vポリエチレングリコー
ル3350（Baker）を1.0ml添加することにより開始され
た。
上記細胞は、時々、90秒間ピペット先端で混合され、
３分間に亘って、5mlの低血清DMEM−高グルコール媒体
が添加された。続いて、10％のウシ胎仔血清、Ｌ−グル
タミン、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン
が補給されたDMEM−高グルコース14mlが添加された（HA
T媒体として言及する）。HAT媒体は１分間に亘って添加
された。
HAT媒体の適当な量が上記細胞に添加され、次に上記
細胞は室温において７分間800xgで遠心分離された。上
清は吸引され、細胞ペレットは、10mlのHAT媒体で分断
された。Balb/c x C57B1/6からの腹腔細胞が添加され、
最終的な体積は、20万の脾臓細胞が各ウエルに分配され
るように調整された。約14日後、ハイブリドーマコロニ
ーを含有するウエルからの組織培養上清が、キャリアタ
ンパクと接合されたペプチドとの所望の反応性の為に、
ELISEによってテストされた。
スクリーニング処理およびエリサプロトコル スクリーニングする目的で、上記Ｈ−特異的ペプチド
をBTGキャリアタンパクと接合する一方、Ｎ−特異性ペ
プチドをKLHキャリアタンパクと接合した。感作および
スクリーニングのためにペプチドが異なったキャリアタ
ンパクと結合する理論的根拠は、キャリアタンパクと反
応性のある抗体の選択を回避するためである。同様の理
論的根拠が、Ki2AおよびKi2B特異性タンパクと結合する
キャリアの選択にも当てはまる。
ハイブリドーマの上澄みをスクリーニングする前に、
接合したペプチド−キャリアを96のウェルのあるマイク
ロタイタープレートに投与し、37℃で一晩培養した。培
養後、プレートを洗浄し、プレート上の束縛の解かれた
位置を牛の血清アルブミン（BSA）でブロックした。
ハイブリドーマ上澄みをスクリーニングしたとき、流
体50μを、適切なペプチドキャリア接合を含むウェル
に添加した。ハイブリドーマ上澄みを、４℃で一晩培養
させておいた。上澄みを翌日除去し、ウェルをBSA溶液
によって洗浄した。続いて各ウェルに、西洋わさびペル
オキシターゼ（GAMHRP）に結合しBSAリン酸塩で緩衝さ
れたサーリン（PBS）中で希釈されたヤギのアンチ−ネ
ズミIgR抗体50μを受容させた。ウェルを37℃で60分
間培養させた。培養後GAMHRPを除去し、ウェルをPBS−B
SA混合物で３度洗浄した。バインドされたGAMHRPの存在
を、0.15％過酸化水素を含むリン酸塩緩衝液中の基質ｏ
−フェニレンジアミン（OPD）50μを添加することに
よって測定した。HRPをその基質OPDと組み合わせて、黄
色の生成物を得た。この黄色の生成物の成長は、室温に
おいて15分間で起こり得た。この酵素反応を、4.5％Ｍ
硫酸50μを添加することによって終結させた。最終的
な反応生成物の測定は、ナンクプレートリーダー（ナン
ク，インコーポレーティッド，ニューバリーパーク,C
A）において488nmでの光学濃度を測定することによって
なされた。前記ウェルにおける黄色の存在は、係る抗体
がハイブリドーマ上澄み中に存在することを示してい
る。培養流体中に抗体がより多く存在するほど、前記光
学濃度がより高くなる。
上記分析を使用して、マブ（Mab）Ｈ−770−1.1.4.,H
−784−4.7.7.およびＨ−873−4.7.7.が、キャリアタン
パクと結合したＨ−特異的ペプチドと反応性があり、キ
ャリアタンパクとも結合したN,Ki2AおよびKi2B−特異性
ペプチドとは反応性がないことが見出された。マブＮ−
821−1.1.9.およびＮ−838−1.1.6.は、キャリアタンパ
クと結合したN ras特異性ペプチドと反応性があり、キ
ャリアタンパクと結合したH,Ki2AおよびKi2B−特異性ペ
プチドとは反応性がないことが見出された。
マブKi2A−１およびKi2A−２は、Ki2A特異性ペプチド
と反応性があり、キャリアタンパクとも結合したH,N,Ki
2AおよびKi2B−特異性ペプチド（アミノ酸164−175）と
は反応性がないことが見出された。
マブKi2B−1,Ki2B−2,Ki2B−3,Ki2B−4,Ki2B−5,Ki2B
−６およびKi2B−７は、Ki2B特異性ペプチド（アミノ酸
164−175）と反応性があり、キャリアタンパクとも結合
したH,NおよびKi2A−ペプチドとは反応性がないことが
見出された。
問題のペプチドに対するマブの特異性 次の実験シリーズでは、アンチ−Ｎおよびアンチ−Ｈ
マブを、キャリアタンパクと結合していないペプチドと
の特異性についてテストし、該マブが問題のペプチドに
ついて特異性があり、そのペプチドに対して結合付着し
たキャリアタンパクとは反応性がないことを確証した。
表１は、H,N,Ki2AおよびKi2B特異性ペプチドに対してア
ンチ−Ｈおよびアンチ−ＮマブをテストしたELISAの結
果の概要を示す。
これらの結果は、Ｈ−ペプチドに対して培養されたマ
ブがそのペプチドについては特異性があり、Ｎペプチ
ド,Ki2AペプチドまたはKi2Bペプチドとは反応性がない
ことを示している。また結果は、Ｎペプチドに対して培
養されたマブがそのペプチドに対しては特異性があり、
H ras関連ペプチド、Ki2A ras関連ペプチドまたはKi2Br
as関連ペプチドとは反応性がないか、もしくは逆反応性
（cross−reactive）があることを証明している。
同様に、Ki2AおよびKi2Bに対するマブを、キャリアタ
ンパクと結合していないペプチドとの特異性についてテ
ストし、該マブが問題のペプチドについて特異性があ
り、そのペプチドに対して結合付着したキャリアタンパ
クとは反応性がないことを確証た。Ki2AおよびKi2Bマブ
は、問題のペプチドについて特異性があり、そのペプチ
ドに対して結合付着したキャリアタンパクとの反応性が
ないことが、信じられている。
細胞rasタンパクに対するアンチ−タンパクの反応性お
よび特異性 免疫沈降およびウェスタンブロッティングを使用し
て、ＨおよびN rasペプチドに対して培養されたマブ
が、細胞性ＨおよびN ras p21sと反応するか、および特
異性があるかどうかを測定した。実験は以下の四細胞株
を使用してなされた。
1.3T3−Hrasをデザインした（またPSV−13）細胞株はH
ras p21sを過剰発現した。
2.3T3−Nrasをデザインした細胞株はN ras p21sを過剰
発現した。
3.3T3−Ki2Aをデザインした細胞株（KNRK）はKi p21タ
ンパクのウィルス状態を発現した。
4.3T3−Ki2Bをデザインした細胞株（SW480）はKi rasタ
ンパクの細胞状態を発現した。
上記細胞の非放射性抽出物は、Ras10をデザインした
アンチ−Ｈマブ、アンチ−Ｎマブ、またはアンチ−p21
マブを用いて１時間培養された。前記Ras10アンチ−p21
マブは、上記のようにRas p21タンパクの通常および発
癌性状態と反応した。培養後、ウサギアンチ−ネズミ1g
の複合体を４℃において30分かけてタンパクＡセファロ
ースに添加し、アンチ−H,アンチ−N,およびアンチ−p2
1マブを捕えた。
１時間培養した後、前記サンプルを遠心分離し、得ら
れたペレットを洗浄した。最終洗浄後、ドデシル硫酸ナ
トリウム還元緩衝液50μをペレットに添加し、100℃
において５時間加熱した。その後この物質を12.5％ポリ
アクリルアミドゲルに適用した。細胞タンパクを、前記
ゲルに電流を流すことによって、分子量に従い分離し
た。この電気泳動処理の後、該タンパクは電気泳動的に
BSA5％を含有するPBSでブロックされたニトロセルロー
ス膜に転移した。アンチ−p21マブras10またはネガティ
ブコントロールを提供するネズミ血清の何れか用いて、
前記膜を１時間培養した。Ras10またはネガティブコン
トロール抗体での培養後、膜をPBS−NP−40を用いて３
回洗浄した。次いで、HRPまくをアンチ−ネズミに結合
した免疫グロブリンで１時間培養し、ネズミマブを発見
した。次いで、膜をPBS−NP−40を用いて３回洗浄し、
４−クロロ−１−ナフトール基質で培養し、反応を完了
させた。試験により、アンチ−Ｈマブが、免疫沈降し、
3T3−Hras細胞株から細胞性H ras p21を捕えることはで
きるが、N ras類、Ki2A類、またはKi2B類から細胞性p21
sと反応しないことが証明された。アンチ−N rasマブ
は、特異的に免疫沈降し、または細胞性N ras p21を捕
えたが、しかし他の細胞性H,Ki2A,およびKi2B p21タン
パク類とは反応しなかった。広く反応性のあるアンチ−
p21マブRaS10は、全ての細胞からp21タンパクと反応
し、一方ネガティブコントロール抗体は何れの細胞性ra
s p21sとも反応しなかった。これらの結果の概要を以下
の表２に示した。
別の実験系において、従来の免疫沈降を用いずに細胞
性ＨおよびN ras p21sを発見できるか否かについて、ア
ンチ−Ｈおよびアンチ−Ｎマブを評価した。これを行う
ために、細胞抽出物を12.5％のゲルに直接適用し、分離
したタンパクに電気泳動させた。タンパクはニトロセル
ロース膜に転移し、アンチ−H,アンチ−N,またはアンチ
−p21マブRas10の何れかと反応した。ネズミ抗体は上記
のように発見された。この結果、アンチ−Ｈマブは細胞
性H ras p21sとだけ反応し、一方アンチ−Ｎマブは細胞
性N ras p21sとだけ反応することが証明された。
本発明によれば、検出に使用され得る、以上で議論し
た抗体又は抗体の混合物は、レポーターによって又は通
常の技術を用いた特異的結合ペアの構成部分によって検
出可能にラベルされている。
特異的結合ペアは、免疫タイプでも非免疫タイプでも
よい。免疫特異的結合ペアは、ハプテン／抗−ナプテン
系という抗原−抗体系によって例証される。ここでは、
フルオレセイン／抗−フルオレセイン、ジニトロフェニ
ル／抗−ジニトロフェニル、ビチオン／抗−ビチオン、
ペプチド／抗−ペプチドなどに言及することができる。
特異的結合ペアの抗体部分は、当業者によく知られた慣
習的な方法により生産することができる。このような方
法は、動物を特異的結合ペアの抗体部分で免疫化するこ
とを含んでいる。特異的結合ペアの抗体部分が免疫的で
ない、例えばハプテンならば、それはキャリアタンパク
に対して共有結合的に結合させて免疫的にさせることが
できる。
非免疫結合ペアは、二成分が互いに自然の親和性を共
有するが、抗体ではないという系を含んでいる。具体的
な非免疫ペアは、ビオチン−ストレプトアジピン、内因
子−ビタミンB12、葉酸−葉酸エステル結合タンパクな
どである。
特異的結合ペアの構成部分によって抗体を共有結合的
にラベルするために、様々な方法を用いることができ
る。特異的結合ペアの構成部分の性質、要求される結合
のタイプ、及び各種の結合の化学構造に対する抗体の耐
性に基づいて、方法が選択される。市販品で得られる活
性誘導体を用いることにより、ビチオンは抗体に共有結
合的に結合することができる。これらのいくつかは、タ
ンパク上のアミノ基に結合するビオチン−Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミド；カルボジイミド結合を介してカルボ
ハイドレート部分、アルデヒド及びカルボキシル基に結
合するビオチンヒドラジド；スルホヒドリル基に結合す
るビオチンマレイミド及びアイオドアセチルビオチンで
ある。フルオレセインイソチオシアネートを用いること
により、フルオレセインをタンパクのアミノ基に結合す
ることができる。2,4−ジニトロベンゼンサルフェート
又は2,4−ジニトロフルオロベンゼンを用いることによ
り、ジニトロフェニル基をタンパクのアミノ基に結合す
ることができる。モノクローナル抗体を特異的結合ペア
（ジアルデヒド、カルボジイミド・カップリング、ホモ
二官能性架橋、及びヘテロ二官能性架橋を含む）に結合
するために、他の標準的な結合方法を用いることができ
る。カルボジイミド・カップリングは、一つの基質上の
カルボキシル基を他の基質上のアミノ基に結合させるた
めの有効な方法である。市販品で得られる試薬１−エチ
ル−３−（ジメチル−アミノプロピル）−カルボジイミ
ド（EDAC）を用いることにより、カルボジイミド・カッ
プリングは促進される。
ホモ二官能性架橋剤（二官能性イミドエステル及び二
官能性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを含む）
は、市販品で得られ、一つの基質上のアミノ基を他の基
質上のアミノ基に結合させるために用いられる。ヘテロ
二官能性架橋剤は、異なる官能基を有する試薬である。
最も一般的な市販品で得られるヘテロ二官能性架橋剤
は、一つの官能基としてアミン反応性のＮ−ヒドロキシ
スクシンイミドエステル、及び第２の官能基としてスル
ホヒドリル反応性の基を有している。最も一般的なスル
ホヒドリル反応性の基は、マレイミド、ピリジルジスル
フィド及び活性ハロゲンである。官能基の一つは、光照
射により様々な基と反応する、光活性のアリールナイト
レンでもよい。
抗体、複数の抗体、又は特異的結合ペアの構成部分
は、放射性アイソトープ、酵素、けい光発光性、化学発
光性又は電気化学的な物質でありうるレボーターと結合
される。二つの一般的に用いられる放射性アイソトープ
は、125I及び3Hである。標準的な放射性アイソトープの
ラベリング操作は、125Iに対するクロラミンＴ、ラクト
ペルオキシダーゼ及びボルトン−ハンター法、及び3Hに
対する還元メチル化を含む。
本発明において好適に用いられる酵素は、ホースラデ
ィッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性フォスファター
ゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、
ルシフェラーゼ、β−ラクトアマーゼ、ウレアーゼ及び
リソチームを含むが、これらに限定されない。抗体を特
異的結合ペアでラベリングするための前述したようなジ
アルデヒド、カルボジイミド・カップリング、ホモ二官
能性架橋剤、ヘテロ二官能性架橋剤を用いることによ
り、酵素ラベリングは促進される。
選択されるラベリング方法は、酵素上で利用できる官
能基とラベルされるべき物質、及び結合状態に対する両
者の耐性に依存する。本発明のおいて用いられるラベリ
ング方法は、現在使用されている通常の方法（Engvall
とPearlmann,Immunochemistry8,871（1971）;Avrameas
とTernynck,Immunochemistry8,1175（1975）;Ishikawa
ら,J.Immunoassay,4（３）:209−327（1983）；及びJab
lonski,Anal.Biochem.148:199（1985）によって記述さ
れた方法を含む）のいずれかでよいが、これらに限定さ
れない。
ラベリングは、スペーサー又は特異的結合ペアの他の
構成部分を用いるような間接法によって達成することが
できる。この一例は、ラベルされていないストレプトア
ビジンとビオチニル化された酵素を順次又は同時に加え
ることによる、ラベルされていないストレプトアビジン
とビオチニル化された酵素でビオチニル化された抗体の
検出である。このように、本発明によれば、検出のため
に用いられる抗体は、レボーターによって又は通常の技
術を用いた特異的結合ペアの第１の構成部分によって検
出可能にラベルされている。抗体が特異的結合ペアの第
１の構成部分によってラベルされると、抗体−特異的結
合ペアの第１の構成部分複合体を特異的結合ペアの第２
の構成部分（前述したようにラベルされるか又はラベル
されていない）と反応させることにより、検出が達成さ
れる。
更に、ラベルされていない抗体は、ラベルされていな
い抗体をラベルされていない抗体に対して特異的なラベ
ルされた抗体と反応させることにより検出することがで
きる。前述したアプローチのいずれかを用いて、直接的
又は間接的にこのような抗−抗体をラベルすることがで
きる。例えば、ビチオンによって抗−抗体をラベルする
ことができる。検出を促進するために、前述したストレ
プトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ系
が用いられる。
本発明の好ましい具体例の一つは、検出可能なラベル
としてビチオンを利用する。ビチオン化された抗体は、
今度はストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオ
キシダーゼ複合体と反応される。発色性の検出のため
に、オルソフェニレンジアミン又は４−クロロ−ナフト
ールを基質として用いることができる。
本発明を実施するための好ましい免疫分析形式は、フ
ォワード・サンドイッチ・アッセイ（このアッセイで
は、通常の技術を用いて、捕捉試薬が支持体の表面に固
定化されている）である。
分析に用いられる好適な支持体は、ポリプロピレン、
ポリスチレン、置換されたポリスチレン例えばアミノ化
又はカルボキシル化されたポリスチレン、ポリアクリル
アミド、ポリアミド、ポリ塩化ビニルなどのような合成
ポリマー支持体；ガラスビーズ；アガロース；ニトロセ
ルロースなどである。
免疫ブロットは通常の技術を用いて実施される。ras
p21タンパクは、ニトロセルロースフィルターへ輸送さ
れるに先立って免疫濃縮されるべきではない。
以下で論議される実施例は、本発明を説明することを
意図しており、限定と解釈すべきではない。
次の細胞系は、以下に議論される実施例に用いられ
た。
1.PSV−13−これは通常のハーベイ−Ras p21の過剰発現
によって形質転換されたNIH3T3細胞である。
2.NIH3T3−これは形質転換されていないが、不死のマウ
ス繊維芽細胞である。
3.NIN3T3（SW480）−これはヒト結腸癌腫細胞系SW480か
らDNAでトランスフェクト及び形質転換されたNIH3T3細
胞である。SW480細胞は、活性化Ki−ras遺伝子（これは
12位にバリンを有する活性化ras p21をエンコードす
る）を含んでいる。このようにNIH3T3（SW480）は12位
にバリンを有するこの活性化された細胞性ヒトp21を表
現する。
4.PSV−LMEJ又はLMEJ−これは12位にバリンを有する活
性化された細胞性Ha−ras p21でトランスフェクトさ
れ、そうして形質転換されたNIH3T3細胞である。NIH3T3
細胞中にトランスフェクトされたDNAはEJで表わされる
ヒト膀胱癌腫から誘導される。したがって、PSV−LMEJ
は12位にバリンを有する活性化されたp21を含んでい
る。
5.S−２−これは12位のグルタミン酸をエンコードする
活性化されたHa−ras p21でトランスフェクトされ、そ
うして形質転換されたNIH3T3細胞である。
6.3T3−Ｎ−ras又はNIH3T3（N ras）−これは活性化さ
れたＮ−ras遺伝子でトランスフェクトされ、形質転換
された細胞系である。
7.KNRK−これはウイルス性カーステンras遺伝子（これ
は12位にセリンを有する活性化されたp21をエンコード
する）で形質転換された通常のラット腎臓細胞からなる
細胞系である。
8.v−Ha−ras−これはウイルス性ハーベイras遺伝子
（これは12位にアルギニンを有する活性化されたp21を
エンコードする）で形質転換されたNIH3T3細胞である。
9.NIN−Zip Ras K−３−これは12位のグリシンをエンコ
ードする通常のKi−rs p21の過剰発現により形質転換さ
れたNIH3T3細胞である。
10.AML−１−これはヒト急性骨髄性白血病細胞系（これ
は13位にアスパルチン酸を含む活性化されたN ras p21
を含む）からDNAでトランスフェクトされたNIH3T3細胞
である。
11.T144−１−これはヒト胸部肉腫細胞系（HSO578t）
（これは12位にアスパルチン酸を含む活性化されたp21
を含む）からDNAでトランスフェクトされたNIH3T3細胞
である。
12.A2182−これは12位にアルギニンを有する活性化され
たp21を含むヒト癌腫細胞系である。
13.NIH3T3（cys−13）−これは活性化されたH ras遺伝
子（これは13位にシステインを有する活性化されたp21
をエンコードする）でトランスフェクトされ、そうして
形質転換されたNIH3T3細胞である。
14.A549−これは12位にセリンを含む活性化されたp21を
表現するめにレポートされたヒト肺癌腫細胞系である。
次の操作は、ヌードマウスに腫瘍を形成するために用
いられた：組織培養フラスコ中から細胞を採取し、遠心
分離してペレットを形成し、40〜80×106cells/mlの濃
度まで希釈した。0.25mlすなわち10〜40×106cellsをマ
ウスの臀部に皮下接種した。腫瘍の外観のためにマウス
を毎日観察した。腫瘍をサイズが２〜4cmになったとき
に切除した。EDTAでコートされた管に血液を収集するこ
とにより、血漿を調製した。
実施例１ 培養液中のRas p21の検出 ras p21の正常または活性化型を示す種々の腫瘍細胞
ラインを数日間培養フラスコにて培養し、ついで培養液
を取り除き、液中にras p21蛋白質の正常または活性化
型が存在するか否過判定した。
ras p21が細胞培養液中に放出されたか否かを判定す
るため２つの生化学的方法が用いられた。最初にras p
21が培養液から抗ｐ−21 pan反応性モノクローン抗体
（ras 10）を用いて免疫濃縮された。このras p21は
ついでウヱスターンブロットと呼ばれる免疫ブロット法
を用いて検出をおこなった。培養中の細胞から得られた
細胞培養液、たとえばPSV−13およびNIH3T3（SW480）ま
たは細胞培養媒体4mlを、抗ｐ−21モノクローン抗体（r
as 10）を用いて１時間培養した。培養後、ラビット抗
マウス免疫グロブリン蛋白質Ａセファロースの複合体を
培養液および抗ｐ−21モノクローン抗体を収容した試験
管に30−60分間加えた抗ｐ−21モノクローン抗体を捕捉
した。１時間の培養後、遠心分離しペレットを生成させ
た。このペレットをRIPA（1.0％のTriton X100、0.1％
のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、0.15Mナトリウムデ
オキシコレート、0.15M塩化ナトリウム、0.05TRIS−HC
l、およびプロ1tオアーゼ抑制剤である1mMフェニルメチ
ルスルホニルフロリド（PMSF）を含む緩衝液）で数回洗
浄した。最後に２−メルカプトエタノール（２−ME）を
含むドデシル硫酸ナトリウムで洗浄した。得られた物質
を100℃で５分間加熱した。このras p21を含む液体を1
2.5％のポリアクリルアミドゲルに適用した。
還元性緩衝液および加熱で処理し、培養液中に放出さ
れた細胞蛋白質を、ゲル中に電流を流すことにより分子
量に応じて分別した。ついで蛋白質を電気泳動的に、５
％のウシ血清アルブミン（BSA）を含むホスフェート緩
衝液（PBS）でブロッキングしたニトロセルロース膜に
移した。このras蛋白質含浸ニトロセルロースを抗p21pa
n反応性モノクローン抗体（ras 10）、モノクローン抗
体（DWP）または陰性コントロール抗体を用いて１時間
培養した。なお、特別の指示がない限り、陰性コントロ
ールとして、通常のマウス血清が用いられた。
ras 10、モノクローン抗体（DWP）または陰性コント
ロール抗体で培養した後、ニトロセルロース膜をPBS−N
P−40液で３回洗浄した。これらの膜をホウスラデッシ
ュペルオキシダーゼ（HRP）に結合させた抗マウス免疫
グロブリンで１時間培養し、マウス抗体の検出をおこな
った。抗マウス免疫グロブリン−HRP複合体はBio−Rad
試験場（Richmond カナダ）から購入したものである。
このニトロセルロース膜をPBS−NP−40液で３回洗浄
し、基財として４−クロロ−１−ナフトールを用い、培
養をおこない、反応を完了させた。
その結果、種々の細胞ラインからのras p21蛋白質が
ここで用いられた方法、（すなわち、12位にアルギニン
置換を有する再結合性Ha−ras p21（Ras 10）に対し
て生成された抗p21モノクローンを用いてras p21を免
疫濃縮し、をついで上述のようにモノクローン抗体を用
いたウエスターンブロットフォーマット中にて検出する
方法）を用い、培養液中で検出しうることが意外にも判
明した。さらに、12位にバリン置換を有する活性p21がD
WPのモノクローン抗体を用いNIH3T3（SW480）の培養液
中に検出しうることが判明した。
上記同様の実験がPSV−13から得られた培養液を用い
ておこなわれた。抗p21pan反応性モノクローン抗体（ra
s 10）を免疫濃縮試薬およびブロッテング試薬として
用い上記方法によりp21を検出した。DWPをブロッテング
試薬として用いたとき、PSV−13細胞ラインからp21をブ
ロットすることができなかった。なぜならば、PSV−13
は12位ではアミノ酸バリンを有する活性ras p21蛋白質
を示さないからである。
上述のPSV−LM−EJおよびNIH3T3（SW480）として認め
られた細胞ラインからの培養液を用い別の実験をおこな
った。ras 10をp21を免疫濃縮するために用いた。ras
10、DWPおよび陰性コントロールをブロッテング工程
において用いた。ras 10およびDWPはPSV−LM−EJおよ
びNIH3T3（SW480）培養液からのras p21蛋白質と反応
した。これに対し、陰性コントロールは突然変異のp21
蛋白質を含む培養液とは反応しなかった。すなわち、活
性p21は12位にバリンを有する活性ras p21蛋白質を示
すものとして知られている細胞ラインから得られた細胞
培養液中に検出された。
実施例２ 免疫ブロットを用いてのマウス血清中での活性および正
常p21の検出 約10−20×106PSV−LM−EJ細胞または約10−20×106P
SV−13細胞をヌードマウスに皮下注射により接種し、腫
瘍を形成した。腫瘍が発達したとき、これらマウスを殺
し、血液を採取した。この血液について、腫瘍の成長に
より血液中に混入したp21の存在について測定した。こ
の測定は上記免疫濃縮およびウエスターンブロッテング
法、さらに実施例３の免疫評価法を用いておこなわれ
た。
PSV−LM−EJ腫瘍を有するマウスからの血液はウエス
ターンブロットにてDWPと反応することが見出だされ
た。これはこの腫瘍保持マウスの血液中に12位にアミノ
酸バリンを有する突然変異p21蛋白質の存在を示すもの
である。PSV−13を注射したマウスの血液はDWPと反応し
なかったが、抗p21 pan反応性抗体、ras 10と反応し
た。これはマウス血液中に正常ras p21が存在すること
を示すものである。これらの意外な結果からPSV−LM−E
Jを注射したマウスの血液中に活性p21が検出されること
は腫瘍保持マウスの血液中に活性p21が検出されること
が実証された。さらに、正常ras p21蛋白質は正常ras
p21蛋白質を示すPSV−13を保持するマウスの血液中に
存在することが実証された。
実施例３ 免疫評価実験記録 この実施例は一般的免疫評価実験記録をしめすもので
ある。
マイクロタイタープレートのウエルを最初に上記抗体
または抗体のカクテルのすくなくとも一つで塗布した。
この抗体の量を炭酸塩緩衝液（ph.9.6）中にて約2,00
0ng−500ngとし、これをマイクロタイタープレートのウ
エルに移し、一昼夜、４℃で培養した。抗体をマイクロ
タイタープレートのウエル表面にて不働化したのち、余
分の液体を除去し、200μｌのブロッキング緩衝液を各
ウエルに加えた。この緩衝液は10％のラクトースと２％
のウシ血清アルブミンを含んでいた。ブロッキング緩衝
液は非特定的結合を防止するためのものである。余分の
ブロッキング緩衝液を除去した。200μｌのブロッキン
グ緩衝液をさらに各ウエルに加え、１時間培養した。つ
いで緩衝液を除去し、プレートを風乾した。
サンプル（細胞溶解物、腫瘍溶解物、または種々の培
養液空なる）を各ウエルに加え、室温で数時間ないし一
昼夜の間、培養した。各ウエルをりん酸塩緩衝液（PB
S）および0.05％のTween 20で６回洗浄した。さらにプ
レートを３回洗浄し、180度回転し、さらに３回洗浄し
た。
検出試薬は検出可能にラベルした抗体または抗体のカ
クテルであり、これを50％ラビット血清のウエル中に加
え、30分培養した。好ましくは検出抗体はビオチンに結
合させる。
プレートをPBSおよび0.05％のTweenで６回洗浄したの
ち、ステレプタビジン−ホウスラデッシ ペルオキシダ
ーゼを１％のウシ血清アルブミンの状態にて各ウエルに
加え、37℃で、30分間培養した。プレートをさらに６回
洗浄した後、クエン酸塩（ph 5.0）に溶解させたオル
トフェニレンジアミン（OPD）を37℃で、30分間、加
え、検出をおこなった。さらに4.5M硫酸を加え反応を終
了させた。
第１図は基本的サンドウイッチ免疫評価フォーマット
を示す図である。
実施例４ 細胞および組織抽出物からのras p21の検出および定量 マイクロタイタープレートのウエルを上記ras 11と
して示される抗p21モノクローン、またはHa又はＮ ras
p21たんぱく質に特異なモノクローン抗体で塗布し
た。
この実験に用いられた溶解物は上記のPSV−13、NIH3T
3、NIH3T3（SW480）、KNRK、およびNIH−（Ｎ−ras）の
細胞ラインからのものである。ヌードマウスの組織抽出
物から得られる細胞溶解物は従来の方法で得ることが出
来よう。培養により得られた細胞または培養細胞で接種
されたマウスに基づく腫瘍からの溶解物を抗p21pan反応
性ラビットポリクローン抗体で塗布されたプレートに加
え、一昼夜培養された。その後、プレートを洗浄し、未
反応の細胞溶解物を除去した。
プレート上に塗布された抗体に結合された細胞溶解物
に存在するp21はビチオニル化抗p21 ras 10モノクロ
ーンを用いて検出することができる。このビチオニル化
モノクローン抗体はついで基材としてステレプタビジン
−ホウスラデッシ ペルオキシダーゼおよびｏ−フェニ
レンジアミンを用いて色素原的に検出することができ
る。これらの結果から抗−Ｈモノクローン抗体で塗布さ
れたプレートはＨ ras p21たんぱく質のみを検出する
ことができ、Ki2A、Ki2B、またはＮ ras p21たんぱく
質を検出することはできない。抗−Ｎモノクローン抗体
で塗布されたプレートはＮ ras p21たんぱく質のみを
検出することができ、Ha、Ki2A、Ki2B ras p21たんぱ
く質を検出することはできない。ras 11として指定さ
れた抗p21モノクローンで塗布されたプレートは上述の
全ての細胞ラインからp21たんぱく質を検出することが
できる。この結果から、Ｈ rasおよびＮ ras p21は
本発明の免疫評価フォーマットを用いて検出することが
できることが明らかである。
実施例５ ラビットポリクローン抗体p21 pan反応性抗体をマイ
クロプレートの表面上に捕捉試薬として不働化した。NI
H3T3（SW480）およびNIH3T3細胞として指定された２つ
のマウス細胞ラインから得た培養上澄液を実施例３の方
法に従い不働化捕捉試薬と反応させた。培養後、プレー
トにビチオンでラベルした抗p21 ras 10を加え、実施
例３と同様にして免疫評価をおこなった。
結果を第２図に示す。Ｙ軸は光学的密度を示し、Ｘ軸
は上澄液の稀釈における一つを示している。この第２図
からras p21たんぱく質はNIH3T3の上澄液よりNIH3T3
（SW480）からの上澄液に高いレベルで存在することが
明らかとなった。
ras p21のレベルの違いは細胞成長速度の差にほとん
ど基づくものであると考えられる。NIH3T3（SW480）はN
IH3T3細胞に変形ことがあるがNIH3T3細胞は変形しな
い。
この様なことから、ras p21たんぱく質は培養液中に
放出され、この放出されたp21が上述の免疫評価フォー
マットにより検出されることが明らかとなった。この免
疫評価の結果は実施例１の生化学的分析の結果と一致す
る。
実施例６ 皮下腫瘍を保持するヌードマウスの血漿中のras p21の
検出 上記の免疫評価および生化学的分析の結果によればPS
V−13腫瘍細胞はPSV LM（EJ）細胞より、高いレベルの
p21を含む。したがって、PSV−13腫瘍を持つマウスから
の血漿はPSV LM（EJ）腫瘍を持つマウスからの血漿よ
り多い量のras 21を含む。
実施例３の免疫評価フォーマットにより３つのタイプ
のマイスからの血漿を評価した。すなわち、正常ヌード
マウスの血漿、PSV LM（EJ）腫瘍を持つヌードマウス
からの血漿、PSV−13腫瘍を持つマウスからの血漿を用
いて研究した。
親和性純化ラビット抗p21 pan反応生ポリクローン抗
体を捕捉試薬として用い、ビオチニル化ras 10を検出
試薬として用いた。
その結果を第３図に示す。正常マウスからの血漿には
低いレベルのp21が検出され、正常ras p21が通常、マ
ウス血漿中に存在することを示している。
高いレベルのp21はPSV LM（EJ）腫瘍およびPSV−13
腫瘍を持つマウスからの血漿に検出された。この双方の
場合、p21のレベルは正常マウスの血漿から検出される
レベルを越えていた。この免疫評価の結果は実施例２の
生化学的分析の結果と一致するものである。すなわち、
正常および活性化ras p21蛋白質の双方が本発明の免疫
評価法により検出された。
これらの結果はras p21たんぱく質がマウスの循環系
に放出され得ることのみならず、この放出されたras p
21たんぱく質が本発明の免疫評価法によりマウスの血漿
中にて検出され得ることを示している。
同じ捕捉および検出試薬を用いPSV LM（EJ）腫瘍お
よびPSV−13腫瘍を持つマウスからの血漿におけるras
p21の相対量を測定する免疫評価法がおこなわれた。
第４図はこの免疫評価法の結果を示している。これに
よれば、PSV LM（EJ）腫瘍を持つマウスからの血漿
に、NIH3T3（SW480）腫瘍を持つマウスからのものより
高いレベルのras p21が見出だされた。これらの結果は
実施例２の生化学的分析の結果と一致するものである。
第４図にはF1マウスの血漿中のras p21が本発明の免疫
評価法により検出されることを示している。
実施例７ ras p21たんぱく質の存在についてのヒト血清および血
漿の評価 血清４コのヒト血清試料（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）および４
コのヒト血漿試料（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）を正常な４人から
採取した。これらの試料をラビット抗p21 pan反応生ポ
リクローン抗体を捕捉試薬として、ビオチニル化ras 1
0を検出試薬として反応用いた。第５図はその結果を示
している。第5A図は血漿についての結果を示す。Ａ、
Ｂ、Ｃ、Ｄのヒト血清試料にはras p21は検出されなか
った。感度の向上により検出が可能か否かは明らかでな
い。しかし、ヒト血漿試料Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄにおいては種
々のレベルのras p21が検出された。
ヒト血漿試料中のras p21の存在、ヒト血清試料中の
ras p21の不存在を確認するため、免疫濃縮およびウエ
スターンブロットの方法が上述のようにしてなされた。
ヒト血清および血漿サンプルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄを抗p21
pan反応生ラビットポリクローン抗体で培養し、各サ
ンプルからのras p21たんぱく質を免疫濃縮した。この
方法は抗p21 pan反応性マウスモノクローン抗体の代わ
りに抗p21 pan反応性ラビットポリクローン抗体を使用
した以外は実施例１と同じである。免疫濃縮ののち、抗
p21 pan反応性ラビットポリクローン抗体とras p21た
んぱく質とからなる免疫複合体をヤギ抗ラビット免疫グ
ロブリンたんぱく質Ａの複合体と反応させ１時間に亘っ
て培養させた。結果物を遠心分離しペレットを形成さ
せ、これをRIPAで数回洗浄した。さらに２−メルカプト
エタノール（２−ME）を含むドデシル硫酸ナトリウム還
元性緩衝液を用いて最終的に洗浄した。得られた物質を
100℃で５分間加熱し、ras p21たんぱく質を含む液体
を得た。この液体を12.5％のポリアクリルアミドゲルに
適用した。この緩衝液および加熱により培養液中に放出
された細胞たんぱく質をゲル中に電流を流すことにより
分子量に応じて分別した。これらたんぱく質を電気泳動
的に５％ウシ血清アルブミンを含むPBSでブロックされ
たニトロセルロース膜に移した。
このras p21含浸ニトロセルロースフィルターを抗p2
1 pan反応性モノクローン抗体および陰性コントロール
（RPC−5:マイエロマたんぱく質）で１時間培養した。
このニトロセルロース膜をPBS−NP−40溶液で３回洗浄
した。ついでホウスラデッシペルオキシダーゼに結合し
た抗マウス免疫グロブリンで培養した。この膜をPBS−N
P−40溶液で３回洗浄し、基材として４−クロロ−１−
ナフトールで培養し、反応を完了させた。
この生化学的結果によりras p21たんぱく質はＡ、
Ｂ、Ｃ、Ｄのヒト血漿から免疫濃縮され、ウエスターン
ブロットにより可視化されたことが判明した。また、こ
の結果からras p21たんぱく質が上記免疫フォーマット
中のヒト血漿中に検出されたこと、また、ヒト血清中に
ras p21たんぱく質が検出されなかったことが確認され
た。
例 ８ ヒトラス遺伝子を含有する３種のマウスセルラインにお
けるラスp21蛋白質の検出および定量 例３に記載した免疫検定フォーマットを用いて、ヒト
ラス遺伝子を含有する３種のマウスセルライン中のラス
p21蛋白質の存在およびレベルを決定した。これらのセ
ルラインは、以下のものであった:S−２、PSV LM（E
J）、およびPSV−13。
先に説明したように、捕捉試薬は、抗p21汎反応性ウ
サギポリクローナル抗体であり、検出試薬は、ビチオニ
ル化ラス10であった。
上記例１で説明したウエスタンブロット研究は、Ｓ−
２セルラインが、PSV−13セルラインにより表現された
ラスp21レベルと比較したとき、より低いラスp21蛋白質
を表現したことを示した。PSV LM（EJ）セルライン
は、PSV−13により表現されたものより低く、Ｓ−２セ
ルラインにより表現されたものより高いレベルでラスp2
1蛋白質を表現した。
第６図は、ウエスタンブロット研究でなされた観察を
確証する免疫検定結果を示している。
12位にアルギニンを含有する組換え体Haラスp21蛋白
質を用いて標準曲線を作成することにより、定量分析を
おこなった。第７図は、種々の濃度の組換え体Ha−ラス
p21蛋白質を、固定化された抗p21汎反応性ウサギポリク
ローナル抗体と反応させ、捕捉されたp21をビオチニル
化抗p21汎反応性マウスモノクローナル抗体ラス10を用
いることによって検出することにより作成された標準曲
線を示している。免疫検定は、上記例３に記載した通り
であった。
得られた光学密度の値を、試験したラスp21蛋白質の
良に対してプロットした。結果は、以下の表３に示され
ている。この標準曲線を用いて、Ｓ−２セルラインが、
細胞蛋白質μｇ当り24.5pgのラスp21蛋白質を含有し、P
SV LM（EJ）セルラインが、細胞蛋白質μｇ当り71.3pg
のラスp21蛋白質を含有し、PSV−13セルラインが、細胞
蛋白質μｇ当り154.0pgのラスp21蛋白質を含有していた
ことが決定された。これらの結果は、ウエスタンブロッ
ト研究を用いてなされた定性的観察と一致した。
このことは、例３に記載した免疫検定フォーマットを
使用して、試料中に存在するラスp21の量を定量するた
めに標準曲線を作成できることが証明している。
例 ９ 正常胸部組織と胸部癌の評価 正常胸部組織の10個の使用と胸部癌の10個の試料は、
マサチューセッツ州ボストン所在のダナーファーバー・
キャンサー・インスチチュートのタニエル・ヘイズ（Da
niel Hayes）博士から入手した。これらの試料は、上
記例３に記載の免疫検定フォーマットを用いて分析し
た。抗p21汎反応性ウサギポリクローナル抗体を捕捉試
薬として用い、ビチオニル化ラス10を検出試薬として用
いた。
結果は、第８図に示されている。棒は、蛋白質μｇ当
りのp21のpgとして表現されたラスp21蛋白質の量を表わ
す。主として脂肪および結合組織と、非常にわずかな上
皮からなる正常胸部組織は、約2pgラスp21/μｇ蛋白質
を含有し、胸部癌使用の少なくとも５個、ナンバー31、
40、51、52および70は、約８ないし18pgラスp21/μｇ蛋
白質を含有していることが分かった。分析した10個のヒ
ト胸部癌試料の内、約80％の試料が、正常胸部組織より
高いラスp21の表現を示した。
例 10 結腸癌試料の評価 イリノイ州シカゴ所在のノーザーン大学のジェイムズ
・ラドセビッチ（James Radosevich）博士から入手した
ヒト結腸癌腫を、上記例３に記載した免疫検定フォーマ
ットを用いて評価した。抗p21汎反応性ポリクローナル
抗体を捕捉試薬として用い、ビオチニル化ラス10を検出
試薬として用いた。
結果は、第９図に示されている。ラスp21蛋白質レベ
ルが、約1.0pg/μｇ蛋白質から約3.5pg/μｇ蛋白質にわ
たることが分かった。
例10で示された結果は、ラスp21蛋白質が、上記免疫
検定フォーマットを用いて、ヒト結腸癌試料中で検出さ
れ、定量されたことを証明している。
例 11 ラスp21蛋白質の存在について以下のものを評価する
ために、例３に記載した免疫検定フォーマットを用い
た。
（１）正常ヌードマウスからの血漿、 （２）PSV LM（EJ）腫瘍を担持するマウスからの血
漿、 （３）PSV−13腫瘍を担持するマウスからの血漿、 （４）NIH3T3（Ｎラス）を担持するマウスからの血漿、
および （５）NIH Zip−ラスＫ−３腫瘍を担持するマウスから
の血漿。
抗p21汎反応性ウサギポリクローナル抗体を捕捉試薬
として用い、DWPと表示されるモノクローナル抗体を検
出抗体として用いた。DWPは、12位にバリンを含有する
活性化ラスp21蛋白質のエピトープに特異的に結合し、1
2位にグリシンを含有するエピトープには結合しない。
第10図に示されている結果は、ビオチニル化DWPは、P
SV LM（EJ）腫瘍担持マウスから得た血漿とのみ反応し
たことを示している。これは、結論的に、12位にバリン
を含有する活性化ラスp21蛋白質が、PSV LM（EJ）腫瘍
担持マウスの血漿中に放出／離脱（shed）され、および
この放出／離脱した、12位にバリンを含有する活性化ラ
スp21蛋白質がこの免疫検定フォーマットを用いて検出
できたことを証明した。それは、ウエスタンブロットに
より得られていた結果とも一致していた。
例 12 マイクロタイターウェルを抗p21汎反応性ウサギポリ
クローナル抗体でコートした。ついで、この固定化捕捉
試薬を12位にグリシン、アルギニン、またはアスパラギ
ン酸を含有する組換え体p21蛋白質と反応させた。この
例で使用した組換え蛋白質は、マサチューセッツ州ボス
トン所在のダナファーバー（Dana−Farber）・キャンサ
ー・インスチチュートのジオフリー・クーパー（Geoffr
ey Cooper）博士から入手した。
固定化された抗p21汎反応性ウサギポリクローナル抗
体−ラスp21蛋白質複合物を、モノクローナル抗体であ
るビオチン標識R256である検出試薬と反応させた。R256
は、上に説明されている。免疫検定結果は、ビオチニル
化R256が12位にアルギニンを含有する組換え体とのみ反
応したことを示した。すなわち、本発明の免疫検定フォ
ーマットを用いて、活性化ラスp21を検出することがで
きた。第11図は、R256が、12位にアルギニンを有する組
換え体p21のみを検出することを示すグラフである。
例 13 例３記載の免疫検定の、腫々の活性化ラスp21蛋白質
を測定する能力を例示するために、８つの異なるセルラ
インを用いて一連の実験をおこなった。
以下のセルラインを使用した：（ｉ）セルラインAML
−１、（ii）セルラインＴ 144−１、（iii）セルライ
ンNIH3T3（システイン−13）、（iv）セルラインPSV−1
3、（ｖ）セララインｖ−Ha−ラス、（vi）セルラインA
2182、（vii）セルラインPSV LM（EJ）、および（vii
i）セルラインA549。
抗p21汎反応性抗体をマイクロタイタープレートウェ
ル上に固定化した。固定化後、捕捉試薬を、上記の８つ
のセルラインの１つからの溶解物（lysate）とともにイ
ンキュベートした。得られた免疫複合物を、以下の異な
るビオチニル化抗体の１つと反応させることによって、
そのラスp21蛋白質の存在について検定した：抗p21汎反
応性抗体モノクローナル抗体（ラス10）、13位にアスパ
ラギン酸を有する活性化ラスp21蛋白質のエピトープに
特異的に結合し、13位にグリシンを有するエピトープに
結合しないモノクローナル抗体（モノクローナル抗体14
6）、12位にアスパラギン酸を有する活性化ラスp21蛋白
質のエピトープに特異的に結合し、12位にグリシンを有
するエピトープに結合しないモノクローナル抗体（モノ
クローナル抗体113）、12位にバリンを有する活性化ラ
スp21蛋白質のエピトープに特異的に結合し、12位にグ
リシンを有するエピトープに結合しないモノクローナル
抗体（DWP）、12位にアルギニンを有する活性化ラスp21
蛋白質のエピトープに特異的に結合し、12位にグリシン
を有するエピトープに結合しないモノクローナル抗体
（R256）、および12位にセリンを有する活性化ラスp21
蛋白質のエピトープに特異的に結合し、12位にグリシン
を有するエピトープに結合しないモノクローナル抗体
（S1107−8.3）。
モノクローナル抗体146は、セルラインAML−１によっ
て表現された13位にアスパラギン酸を含有する活性化ラ
スP21蛋白質を特異的に検出した。第12図は、本発明の
免疫検定においてMab146を用いて得られた結果を示して
いる。
モノクローナル抗体113は、セルラインＴ 144−１に
よって表現された12位にアスパラギン酸を含有する活性
化ラスP21蛋白質を特異的に検出した。
モノクローナル抗体DWPは、セルラインPSV LM（EJ）
によって表現された12位にバリンを含有するラスP21蛋
白質を特異的に検出した。
モノクローナル抗体R256は、セルラインA2182および
セルラインｖ−Ha−ラスによって表現された12位にアル
ギニンを含有するラスP21蛋白質を特異的に検出した。
モノクローナル抗体S1107−8.3は、セルラインA549に
よって表現された12位にセリンを含有するラスP21蛋白
質を特異的に検出した。
これは、結論的に、活性化ラスP21蛋白質を検出する
本発明の免疫検定フォーマットの能力を証明している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ ９１９５ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ ９１９６ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ１００８６ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ１００６１ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ１００８３ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ１００６０ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ１００８４ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ１００８８ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ ９６３２ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ ９６３３ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ ９６３４ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ１００６３ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ１００６９ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ１００７１ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ１００６２ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ１００６８ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ１００７３ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ１００７０ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ１００９２ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ１００８９ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ１００８７ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ１００９０ (56)参考文献 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，46, （1986），Ｐ．6029−6033 Ｊｏｕｒｎ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏ ｃｈｅｍ，32，（1986）Ｐ．207−214 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，83，（1986）Ｐ．7485−7489

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】血漿または血清サンプル中における活性化
    ras p21を検出するための免疫検定法であって、 （ａ）血漿または血清のサンプルを、捕獲試薬としての
    固定化された抗−p21汎反応性抗体と反応させて、血漿
    または血清のサンプル中に存在する何れかの活性化ras
    p21と前記汎反応性抗体との複合体を形成する工程と、 （ｂ）工程（ａ）で得られたサンプルを、活性化ras p2
    1のエピトープのうちの、前記捕獲試薬が反応するエピ
    トープとは異なり且つ正常なras p21には存在しないエ
    ピトープに結合することができる、（ｉ）検出可能にラ
    ベルされたモノクローナル抗体または（ii）ラベルされ
    ないモノクローナル抗体と反応させる工程と、 （ｃ）工程（ｂ）の反応生成物中において、（ｉ）前記
    ラベルされない抗体を、該抗体に対して特異的なラベル
    された抗体で検出するか、又は（ii）前記ラベルされた
    抗体を検出し、これによって血漿または血清サンプル中
    の活性化ras p21を検出する工程とを具備した方法。
  2. 【請求項２】複数の血漿または血清サンプルの夫々にお
    ける活性化ras p21を検出するための免疫検定法であっ
    て、複数の血漿または血清サンプルの夫々について、請
    求項１の工程（ａ）〜（ｃ）を行う免疫検定法。
  3. 【請求項３】請求項１に記載の免疫検定法であって、工
    程（ｂ）における前記モノクローナル抗体が、下記の
    （ｉ）〜（iii）からなる群から選択される方法： （ｉ）第12位置にアルギニン、グルタミン酸、アスパラ
    ギン酸、セリン、バリンまたはシステインのアミノ酸置
    換を有する活性化rasタンパクのエピトープに特異的に
    結合するが、第12位置にグリシンを含むエピトープには
    結合しないモノクローナル抗体； （ii）第13位置にアルギニン、アスパラギン酸またはバ
    リンのアミノ酸置換を有する活性化rasタンパクのエピ
    トープに特異的に結合するが、第13位置にグリシンを含
    有するエピトープには結合しないモノクローナル抗体； （iii）第61位置にヒスチジン、リシン、ロイシンまた
    はアルギニンのアミノ酸置換を有する活性化rasタンパ
    クのエピトープに特異的に結合するが、第61位置にグル
    タミンを含有するエピトープには結合しないモノクロー
    ナル抗体。
  4. 【請求項４】請求項１に記載の免疫検定法であって、工
    程（ｂ）における前記モノクローナル抗体が、下記の
    （ｉ）〜（iii）からなる群から選択される方法： （ｉ）ハイブリドーマDWP（ATCC受付番号HB8698）、 ハイブリドーマE184（ATCC受付番号HB9194）、 ハイブリドーマE170（ATCC受付番号HB9195）、 ハイブリドーマR256（ATCC受付番号HB9196）、 ハイブリドーマD113（ATCC受付番号HB10086）、 ハイブリドーマD205（ATCC受付番号HB10061）、 ハイブリドーマD210（ATCC受付番号HB10083）、 ハイブリドーマS1107−8.3（ATCC受付番号HB10060）、 ハイブリドーマＣ−1119−９（ATCC受付番号HB10084）
    及び ハイブリドーマＣ−1119−10（ATCC受付番号HB10088） からなる群から選択されるハイブリドーマによって産生
    されるモノクローナル抗体； （ii）ハイブリドーマD753−13（129）（ATCC受付番号H
    B9632）、 ハイブリドーマD765−13（146）（ATCC受付番号HB963
    3）及び ハイブリドーマV647−13（ATCC受付番号HB9634） からなる群から選択されるハイブリドーマによって産生
    されるモノクローナル抗体； （iii）ハイブリドーマR61−１（ATCC受付番号HB1006
    3）、 ハイブリドーマR61−２（ATCC受付番号HB10069）、 ハイブリドーマR61−３（ATCC受付番号HB10071）、 ハイブリドーマR61−４（ATCC受付番号10062）、 ハイブリドーマL61−１（ATCC受付番号HB10068）、 ハイブリドーマL61−２（ATCC受付番号HB10073）、 ハイブリドーマH61−１（ATCC受付番号HB10070）、 ハイブリドーマH61−２（ATCC受付番号HB10092）、 ハイブリドーマH61−３（ATCC受付番号10089）、 ハイブリドーマH61−４（ATCC受付番号10087）及び ハイブリドーマH61−５（ATCC受付番号HB10090）、 からなる群から選択されるハイブリドーマによって産生
    されるモノクローナル抗体。
  5. 【請求項５】血漿または血清サンプル中における活性化
    ras p21を検出するための免疫検定法であって、 （ａ）血漿または血清のサンプルを、捕獲試薬としての
    固定化された抗−p21汎反応性抗体と反応させて、血漿
    または血清のサンプル中に存在する何れかの活性化ras
    p21と前記汎反応性抗体との複合体を形成する工程と、 （ｂ）工程（ａ）で得られたサンプルを、夫々が活性化
    ras p21のエピトープのうちの、前記捕獲試薬が反応す
    るエピトープとは異なり且つ正常なras p21には存在し
    ないエピトープに結合することができる、（ｉ）検出可
    能にラベルされた複数のモノクローナル抗体または（i
    i）ラベルされない複数のモノクローナル抗体と反応さ
    せる工程と、 （ｃ）工程（ｂ）の反応生成物中において、（ｉ）前記
    ラベルされない複数の抗体を、該抗体に対して特異的な
    ラベルされた複数の抗体で検出するか、又は（ii）前記
    ラベルされた複数の抗体を検出し、これによって血漿ま
    たは血清サンプル中の活性化ras p21を検出する工程と
    を具備した方法。
  6. 【請求項６】複数の血漿または血清サンプルの夫々にお
    ける活性化ras p21を検出するための免疫検定法であっ
    て、複数の血漿または血清サンプルの夫々について、請
    求項５の工程（ａ）〜（ｃ）を行う免疫検定法。
  7. 【請求項７】請求項５に記載の免疫検定法であって、工
    程（ｂ）における前記モノクローナル抗体が、下記の
    （ｉ）〜（iii）からなる群から選択される方法： （ｉ）第12位置にアルギニン、グルタミン酸、アスパラ
    ギン酸、セリン、バリンまたはシステインのアミノ酸置
    換を有する活性化rasタンパクのエピトープに特異的に
    結合するが、第12位置にグリシンを含むエピトープには
    結合しないモノクローナル抗体； （ii）第13位置にアルギニン、アスパラギン酸またはバ
    リンのアミノ酸置換を有する活性化rasタンパクのエピ
    トープに特異的に結合するが、第13位置にグリシンを含
    有するエピトープには結合しないモノクローナル抗体； （iii）第61位置にヒスチジン、リシン、ロイシンまた
    はアルギニンのアミノ酸置換を有する活性化rasタンパ
    クのエピトープに特異的に結合するが、第61位置にグル
    タミンを含有するエピトープには結合しないモノクロー
    ナル抗体。
  8. 【請求項８】請求項５に記載の免疫検定法であって、工
    程（ｂ）における前記モノクローナル抗体が、下記の
    （ｉ）〜（iii）からなる群から選択される方法： （ｉ）ハイブリドーマDWP（ATCC受付番号HB8698）、 ハイブリドーマE184（ATCC受付番号HB9194）、 ハイブリドーマE170（ATCC受付番号HB9195）、 ハイブリドーマR256（ATCC受付番号HB9196）、 ハイブリドーマD113（ATCC受付番号HB10086）、 ハイブリドーマD205（ATCC受付番号HB10061）、 ハイブリドーマD210（ATCC受付番号HB10083）、 ハイブリドーマS1107−8.3（ATCC受付番号HB10060）、 ハイブリドーマＣ−1119−９（ATCC受付番号HB10084）
    及び ハイブリドーマＣ−1119−10（ATCC受付番号HB10088） からなる群から選択されるハイブリドーマによって産生
    されるモノクローナル抗体； （ii）ハイブリドーマD753−13（129）（ATCC受付番号H
    B9632）、 ハイブリドーマD765−13（146）（ATCC受付番号HB963
    3）及び ハイブリドーマV647−13（ATCC受付番号HB9634） からなる群から選択されるハイブリドーマによって産生
    されるモノクローナル抗体； （iii）ハイブリドーマR61−１（ATCC受付番号HB1006
    3）、 ハイブリドーマR61−２（ATCC受付番号HB10069）、 ハイブリドーマR61−３（ATCC受付番号HB10071）、 ハイブリドーマR61−４（ATCC受付番号10062）、 ハイブリドーマL61−１（ATCC受付番号HB10068）、 ハイブリドーマL61−２（ATCC受付番号HB10073）、 ハイブリドーマH61−１（ATCC受付番号HB10070）、 ハイブリドーマH61−２（ATCC受付番号HB10092）、 ハイブリドーマH61−３（ATCC受付番号10089）、 ハイブリドーマH61−４（ATCC受付番号10087）及び ハイブリドーマH61−５（ATCC受付番号HB10090）、 からなる群から選択されるハイブリドーマによって産生
    されるモノクローナル抗体。
  9. 【請求項９】血漿または血清サンプル中における活性化
    ras p21を検出するための免疫検定法であって、 （ａ）血漿または血清のサンプルを、活性化rasタンパ
    クのエピトープに特異的に結合するが正常なras蛋白の
    対応するエピトープには結合しない、捕獲試薬としての
    固定化されたモノクローナル抗体と反応させて、血漿ま
    たは血清のサンプル中に存在する何れかの活性化ras p2
    1と前記モノクローナル抗体との複合体を形成する工程
    と、 （ｂ）工程（ａ）で得られたサンプルを、活性化ras p2
    1のエピトープのうちの前記捕獲試薬が反応するエピト
    ープとは異なるエピトープに結合することができる、
    （ｉ）検出可能にラベルされた抗−p21汎反応性抗体ま
    たは（ii）ラベルされない抗−p21汎反応性抗体と反応
    させる工程と、 （ｃ）工程（ｂ）の反応生成物中において、（ｉ）前記
    ラベルされないモノクローナル抗体を、該抗体に対して
    特異的なラベルされた抗体で検出するか、又は（ii）前
    記ラベルされたモノクローナル抗体を検出し、これによ
    って血漿または血清サンプル中の活性化ras p21を検出
    する工程とを具備した方法。
  10. 【請求項１０】複数の血漿または血清サンプルの夫々に
    おける活性化ras p21を検出するための免疫検定法であ
    って、複数の血漿または血清サンプルの夫々について、
    請求項９の工程（ａ）〜（ｃ）を行う免疫検定法。
  11. 【請求項１１】請求項９に記載の免疫検定法であって、
    工程（ａ）における前記モノクローナル抗体が、下記の
    （ｉ）〜（iii）からなる群から選択される方法： （ｉ）第12位置にアルギニン、グルタミン酸、アスパラ
    ギン酸、セリン、バリンまたはシステインのアミノ酸置
    換を有する活性化rasタンパクのエピトープに特異的に
    結合するが、第12位置にグリシンを含むエピトープには
    結合しないモノクローナル抗体； （ii）第13位置にアルギニン、アスパラギン酸またはバ
    リンのアミノ酸置換を有する活性化rasタンパクのエピ
    トープに特異的に結合するが、第13位置にグリシンを含
    有するエピトープには結合しないモノクローナル抗体； （iii）第61位置にヒスチジン、リシン、ロイシンまた
    はアルギニンのアミノ酸置換を有する活性化rasタンパ
    クのエピトープに特異的に結合するが、第61位置にグル
    タミンを含有するエピトープには結合しないモノクロー
    ナル抗体。
  12. 【請求項１２】請求項９に記載の免疫検定法であって、
    工程（ａ）における前記モノクローナル抗体が、下記の
    （ｉ）〜（iii）からなる群から選択される方法： （ｉ）ハイブリドーマDWP（ATCC受付番号HB8698）、 ハイブリドーマE184（ATCC受付番号HB9194）、 ハイブリドーマE170（ATCC受付番号HB9195）、 ハイブリドーマR256（ATCC受付番号HB9196）、 ハイブリドーマD113（ATCC受付番号HB10086）、 ハイブリドーマD205（ATCC受付番号HB10061）、 ハイブリドーマD210（ATCC受付番号HB10083）、 ハイブリドーマS1107−8.3（ATCC受付番号HB10060）、 ハイブリドーマＣ−1119−９（ATCC受付番号HB10084）
    及び ハイブリドーマＣ−1119−10（ATCC受付番号HB10088） からなる群から選択されるハイブリドーマによって産生
    されるモノクローナル抗体； （ii）ハイブリドーマD753−13（129）（ATCC受付番号H
    B9632）、 ハイブリドーマD765−13（146）（ATCC受付番号HB963
    3）及び ハイブリドーマV647−13（ATCC受付番号HB9634） からなる群から選択されるハイブリドーマによって産生
    されるモノクローナル抗体； （iii）ハイブリドーマR61−１（ATCC受付番号HB1006
    3）、 ハイブリドーマR61−２（ATCC受付番号HB10069）、 ハイブリドーマR61−３（ATCC受付番号HB10071）、 ハイブリドーマR61−４（ATCC受付番号10062）、 ハイブリドーマL61−１（ATCC受付番号HB10068）、 ハイブリドーマL61−２（ATCC受付番号HB10073）、 ハイブリドーマH61−１（ATCC受付番号HB10070）、 ハイブリドーマH61−２（ATCC受付番号HB10092）、 ハイブリドーマH61−３（ATCC受付番号10089）、 ハイブリドーマH61−４（ATCC受付番号10087）及び ハイブリドーマH61−５（ATCC受付番号HB10090）、 からなる群から選択されるハイブリドーマによって産生
    されるモノクローナル抗体。
  13. 【請求項１３】血漿または血清サンプル中における活性
    化ras p21を検出するための免疫検定法であって、 （ａ）血漿または血清のサンプルを、活性化rasタンパ
    クのエピトープに特異的に結合するが正常なras蛋白の
    対応するエピトープには結合しない、捕獲試薬としての
    固定化された複数のモノクローナル抗体と反応させて、
    血漿または血清のサンプル中に存在する何れかの活性化
    ras p21と前記モノクローナル抗体との複合体を形成す
    る工程と、 （ｂ）工程（ａ）で得られたサンプルを、活性化ras p2
    1のエピトープのうちの前記捕獲試薬が反応するエピト
    ープとは異なるエピトープに結合することができる、
    （ｉ）検出可能にラベルされた抗−p21汎反応性抗体ま
    たは（ii）ラベルされない抗−p21汎反応性抗体と反応
    させる工程と、 （ｃ）工程（ｂ）の反応生成物中において、（ｉ）前記
    ラベルされないモノクローナル抗体を、該抗体に対して
    特異的なラベルされた抗体で検出するか、又は（ii）前
    記ラベルされたモノクローナル抗体を検出し、これによ
    って血漿または血清サンプル中の活性化ras p21を検出
    する工程とを具備した方法。
  14. 【請求項１４】複数の血漿または血清サンプルの夫々に
    おける活性化ras p21を検出するための免疫検定法であ
    って、複数の血漿または血清サンプルの夫々について、
    請求項13の工程（ａ）〜（ｃ）を行う免疫検定法。
  15. 【請求項１５】請求項13に記載の免疫検定法であって、
    工程（ａ）における前記モノクローナル抗体が、下記の
    （ｉ）〜（iii）からなる群から選択される方法： （ｉ）第12位置にアルギニン、グルタミン酸、アスパラ
    ギン酸、セリン、バリンまたはシステインのアミノ酸置
    換を有する活性化rasタンパクのエピトープに特異的に
    結合するが、第12位置にグリシンを含むエピトープには
    結合しないモノクローナル抗体； （ii）第13位置にアルギニン、アスパラギン酸またはバ
    リンのアミノ酸置換を有する活性化rasタンパクのエピ
    トープに特異的に結合するが、第13位置にグリシンを含
    有するエピトープには結合しないモノクローナル抗体； （iii）第61位置にヒスチジン、リシン、ロイシンまた
    はアルギニンのアミノ酸置換を有する活性化rasタンパ
    クのエピトープに特異的に結合するが、第61位置にグル
    タミンを含有するエピトープには結合しないモノクロー
    ナル抗体。
  16. 【請求項１６】請求項13に記載の免疫検定法であって、
    工程（ａ）における前記モノクローナル抗体が、下記の
    （ｉ）〜（iii）からなる群から選択される方法： （ｉ）ハイブリドーマDWP（ATCC受付番号HB8698）、 ハイブリドーマE184（ATCC受付番号HB9194）、 ハイブリドーマE170（ATCC受付番号HB9195）、 ハイブリドーマR256（ATCC受付番号HB9196）、 ハイブリドーマD113（ATCC受付番号HB10086）、 ハイブリドーマD205（ATCC受付番号HB10061）、 ハイブリドーマD210（ATCC受付番号HB10083）、 ハイブリドーマS1107−8.3（ATCC受付番号HB10060）、 ハイブリドーマＣ−1119−９（ATCC受付番号HB10084）
    及び ハイブリドーマＣ−1119−10（ATCC受付番号HB10088） からなる群から選択されるハイブリドーマによって産生
    されるモノクローナル抗体； （ii）ハイブリドーマD753−13（129）（ATCC受付番号H
    B9632）、 ハイブリドーマD765−13（146）（ATCC受付番号HB963
    3）及び ハイブリドーマV647−13（ATCC受付番号HB9634） からなる群から選択されるハイブリドーマによって産生
    されるモノクローナル抗体； （iii）ハイブリドーマR61−１（ATCC受付番号HB1006
    3）、 ハイブリドーマR61−２（ATCC受付番号HB10069）、 ハイブリドーマR61−３（ATCC受付番号HB10071）、 ハイブリドーマR61−４（ATCC受付番号10062）、 ハイブリドーマL61−１（ATCC受付番号HB10068）、 ハイブリドーマL61−２（ATCC受付番号HB10073）、 ハイブリドーマH61−１（ATCC受付番号HB10070）、 ハイブリドーマH61−２（ATCC受付番号HB10092）、 ハイブリドーマH61−３（ATCC受付番号10089）、 ハイブリドーマH61−４（ATCC受付番号10087）及び ハイブリドーマH61−５（ATCC受付番号HB10090）、 からなる群から選択されるハイブリドーマによって産生
    されるモノクローナル抗体。
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