JPS6185327A - 発癌遺伝子生成物に対する抗体 - Google Patents
発癌遺伝子生成物に対する抗体Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
〔産業上の利用分野〕
この発明は免疫学並びに癌の診断及び治療的用途に関す
る。さらに詳しくは、この発明は天然のプロト−発癌遺
伝子ではなく変異体発癌遺伝子の生成物に特異的な抗体
、これらの抗体から作られる免疫化学薬剤、並びにこれ
らの免疫化学薬剤を用いる診断及び治療方法に関する。 〔従来の技術〕 発癌遺伝子は細胞の新生物性形質転換に寄！ｊする細胞
性遺伝子である。一般にＷｅｉｎｂｅｒｙ， Ｒ． 、
リイエンティフィソク・アメリカン（ Ｓｃｉｅｎｔ
ｉｆｉｃ−Ａｍｅｒｉｃａｎ ）、 ｚｌｉＬ： １２
６−１４２（＋９８３）を参照のこと。 これらは正常な細胞性遺伝子の変化した形であり、そし
て広範囲のヒト腫瘍及び腫瘍セルラインにおいて検出さ
れている。発癌遺伝子は、ヒト腫瘍又は腫瘍セルライン
からのＤＮＡをＮｌ１１／３Ｔ３細胞として知られてい
るセルラインに１ヘランスフエクトするごとに検出され
た。トランスフェクトされたＤＮＡからの発癌遺伝子を
取り込めそして発現する細胞は形態学的に変化し、そし
て厚密なソオーカスとして増殖し始める。これらのフォ
ーカスからの細胞は、マウスにおいて増殖する場合、腫
瘍を形成することができる。（Ｌａｎｅ．Ｍ，Ａ， 、
Ｓａｉｔｅｎ 、＾．及びＣｏｏｐｅｒ 、 Ｇ．Ｍ
． 、プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミ−・オブ・勺イエンシス・オブ・す′・ユリーイ
テソ１゛・ステイク・オブ・アメリカ（４ｊｒ−ｏｃ，
ｊ４ａｔ↓．−Ａｃａｄ，−Ｓｃｉ，り達〉。 刊： ５１８５−５１１１９（ｂ９８１） ；並びに
Ｓｈｉｌｏ，Ｂ．及びＷｅｉｎｈｅｒｙ， ｌｉＡ．ネ
イチゴ，アー（ＮｐｔｕＨｅ）、？Ｅ１９ ； ６０７
６０９（ｂ９８＋） ）。 ｒｊｌｓプロ１−一発癌遣ＩＩｋ ’ｆ−族の構成員に
よりコードされるｐ２１（ｔｆ白質は、細胞質変異に、
１、り活１４化され培養中のある神の細胞の新生物ｔ’
ｌ形質転換を生じさせ、そり、 ’（ｉｌｉ々のヒ１癌
の発生に関与する。 ｒａｓ遺伝γ−がヒｌ− ＩＩＩｉｉ＆中で活Ｐｌ化さ
れる＜ｉｔ度は２０％又はそれより高いであろう。ｒａ
ｓ発癌遺伝子の構造の比較により、これらは、遺伝子ｘ
１−成物であるＰ２１蛋白質のアミノ酸配列がその１２
位又（、１６１位において変化する点変異により、それ
らの非形質転換性正常対応物と異ることが明らかになっ
た（Ｐａｒａｄａ、 Ｌ、Ｆ、等、ネイチュアー（Ｎａ
ｔｕｒｅ） ＋２９７；４７４−４７９（ｂ９８２）
； ５ａｎｔｏｓ、ＩＥ、等、ネイチュアー（Ｎａｔｕ
ｒｅ）２９８；３４３−３４７（ｂ９８２） ；−１ア
サ、Ｖｏ等、ネイチュアー（Ｎａｔｕｒｅ） 、３０３
； ７７５−７７９（ｂ９８２） ）。 ｒ＋２１蛋白質の発癌性活性化を導く最もしばしば観察
される変異は、該蛋白質の位置１２におけるアミノ酸残
基の他の幾つかのアミノ酸残基のいずれかへの変化をも
たらす。ＭａｒｓｈａｌＬ Ｃ，Ｔ、等、キャンサー・
→」′−へイス（ハ些肛Ｓ壓−！９ｙ声・）・主；１８
３−２１４ （ｂ９８４）。 ｐ２１蛋白質はＧＴＰに特異的に結合しそしてＧＴＰを
ＧＤＰと無機リン酸とに加水分解することが知られてい
る。５ｈｉｈ、Ｔ、Ｙ、等、ネイチュアー（Ｎａ Ｌｕ
ｒｅ） 、 ２８’し、 ６８１−６９１ （ｂ９８０
） ；ＭｃＧｒａｔｈ、Ｊ、Ｐ等、ネイチュアー（勘勺
皿）、ａｔｏ、５４４−６Ｊ９ｏｑ８ｏ）；及びＳｗｅ
ｌ、Ｒ，Ｗ、等、ネイチュア−（Ｎａｔｕｒｅ）３１１
；２７３−２７５（ｂ９８４）。位置５９にスレオニ
ン残基を含有するｐ２１蛋白質の形において、前記のリ
ン酸は自動リン酸化反応に、ｊ；ってこのスレオニ残基
に移行する。ＭｃＧｒａ ｔｈ等、０；］出；Ｇｉｂｂ
ｓ 、 Ｊ、１１．等、プロシーデインダス・オシ・ザ
・ナショナル・アカデミ−・オシ・サイエンシス・オシ
・ヂ・ユナイテッド・ステイク・オシ・アメリカ（Ｉｌ
、Ｎ４」」ｓＡ）、財、２６７４−２６７Ｆｌ（ｂ９８
４） ；及び５ｈｉｈ、Ｔ、’／、等ネイチュアー（ハ
判り） （じ１ンドン）飢７ ；６８６−６９］（ｂ９
８１）。 活性化されたｒ＋２１の形質転換能力にお＆Ｊるごれら
の活性の役割はまだ知られていない。しかしながら、位
Ｗ１２を包囲するｐ２１蛋白質の部分がｐ２＋蛋白質と
ＧＴＰとの相■作用に関与するであろうことが示唆され
ている。Ｇａｙ、Ｎ、Ｊ、等、ネイチュアー回ｕｒｃ）
１，３０４ ；２６２−２６４（＋９８３）；及びＷｅ
ｉｒｅｎｇａ、Ｒ，に、等、ネイチュアーリｌ阿朋）、
３０２；８４２−８４４（ｂ９８３） 、 Ｆａｒｔｔ
＋、Ｍ、等、ジャー −Ｊ−）Ｌｔ ・オシ・ヒロロジ
−（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、）、４３；２９４−３０４（ｂ９
８２）ば、種々のｐ２１決定基に対して向Ｕられたポリ
クローナル血清及びモノクローナル抗体の両者がＧＴＰ
結合を許容することを開示している。モノクローナル抗
体Ｙ］３−２５９は正常Ｐ２１蛋白質と活性化されたｐ
２１蛋白質を識別しない。 Ｃ１１ｎｓ等のヨーロッパ特許出願公開Ｎｏ １０８，
５６４は、悪性物の存在についての診断において、ｒａ
ｓ発癌遺伝子を包含するｃ −Ｏｎ ｃ、遺伝子の発現
生成物を検出するために抗体のごときプローブを使用す
る方法を開示している。この公開された方法はポリペプ
チドの野性タイプと変異形を区別しない。 Ｔ、Ｐａｐａｓ等のヒト新生物細胞におけるレトロウィ
ルス性ｍｙｃ遺伝子の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏ
ｆ Ｒａｔｒｏ−ν１ｒａｌ ｍｙｃ Ｇｅｎｅｓ ｉ
ｎ Ｈｕ＋ｍａｎ Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ （：ｅｌｌ
ｓ）と題する１９８２年４月１日に出願された米国特許
出願Ｎｏ ３６９，５１７は、ヒト腫瘍細胞を検出する
ための鳥類骨随球腫症ウィルス株（ＭＣ２９）のｌｌｌ
ｙｃ発癌遺伝子配列を含有する３２ｐブラヘルされたり
、ローン化組撰ＤＮＡプローブの使用を開示している。 種々の血液細胞がＭＣ２９のｍｙｃ遺伝子配列に相同な
ＲＮＡの増加した量を生産することが見出された。 検討される蛋白質の注目の領域のアミノ酸配列に正確に
対応するペプチドセグメントを化学合成することができ
、そしてこのペプチドを担体蛋白質に連結し゛（適当な
宿主に注射して抗体を得ることができることが知られて
いる。 Ａｌｅｘａｎｄａｒ等、ネイチノアー（棟！！
！些）、別（，６９７−６９り （＋ ９８３）は、１
個のアミノ酸のみを異にする２種類の白血球蛋白質（Ｔ
ｂｙ−１）、ｉＲｊびこの蛋白質に欠Ｉして特異的な抗
血清であって、前記配列が異る領域を含む短い化学合成
されたペプチドにより誘導されたものを記載している。 タムラＴ１等、セル（！；蛙！ ）、３４．５１１７−
５９６（ｂ９Ｂ３）は、ｐρ６０ｓｒｃの一次構造に対
応する合成オリゴペプチドに対する抗体の生成、及び、
、６ｏＳｒｃを免疫沈澱せしめるための該抗体の使用を
開示している。１．ｅｒｎｅｒ等、ブロンーデインダス
・オシ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブザ・サイエ
ンシス・オシ・ザ・ユナイテソド・ステイク・オシ・ア
メリカ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、 Ｓｃｉ。 ［ＩＳＡ、）、７８．３４０３−３４０７（ｂ９８１）
は、肝炎８表面抗原のごとき蛋白質のヌクレオチド配列
から予想されるアミノ酸配列に対応するペプチドのワク
チンとしての使用を開示している。さらに、ＷａｌＬｅ
ｒ、Ｇ。 等、プｌコシ−ディンゲス・オシ・ザ・ナショナル・ア
カデミ−・オプ・サイエンシス・オブ・ザ・ユナイテソ
Ｌ ステイク・オブ・アメリカ（Ｉｌ、Ｎ、＾。 Ｓ、ＵＳＡ、）７７−； ５１９７−５２００（ｂ９８
０）；及び１、ｅｒｎｅｒ、 Ｒ，Ａ、。 不イチュア−（勘↓倶」）、？γ］ ； ５９２−５
９６（ｂ９８２）を参＋１０のこと。ｐ２＋蛋白質に関
し、Ｗｅｉｎｂｅｒｙ等の１９８４年４７１１２日に公
開された＋１ Ｃ１’騙０／１１４１０１３８９はヒト
膀胱癌細胞からｆｉｔ ＃［された１１ Ｎ Ａの発癌
遺伝子とその対応するプロト−発癌遺伝子との間の相違
を開示している。１つのターｆブのγノセイにおいて、
血清学的試薬、例えば、発癌の検出のために使用するこ
とができるプロト−発癌１１１ｉ／又は発癌遺伝子から
発現されたｐ２１蛋白質に対し°（特異的な抗体・が記
載されている。検ま・１される１「常な又は変化したペ
プチド配列の？ｉ： １１の領域のアミノ酸配列に対応
する化学合成されたペプーｙ用セグメントを使用するご
とにより抗体を／ｌじさ口るごとができる。 １１ａｎｄ、１１１等、プロシーデインダス・オブ・ザ
・す〜ショナル・アカデミ−・オブ・す・Ｃエンシス・
オブ・ザ・ユナイテソト・ステイク・オブ・アメリカ
（Ｐ、Ｎ、八、≦、 ｏｓｎ、）８Ｌ５２２７−５２３
１（ｂ９８４）は、ｆｌｕ ｒａｓ ”’ ｉｌｌ伝
子イＬ成物載物ミノ酸荀ＷｌＯ−１７を反映する合成ペ
プチ］′を用いるモノクローナル抗体の生成を開示して
いる９この抗体はｒａｓ ｊｌ伝子生成載物２１と反応
することが示されたが、しかし正常ｐ２＋蛋白質ではな
く活性化されたｐ２１（旬間１２におい゛（変化してい
る）に対して特異的であることは示されなかった。 Ｇ３１１ｉｃｋ、［；４．告口、１９Ｆ＋３年９月４［
］に、ネズミ肉腫ウィルスの／！！度感受１ノ［変異株
により感染されたセルラインにおりる、合成νＩＩＩｏ
ｓペプナ１に幻し７て）Ｉ成Ｕ７た（ｂ°Ｌｔｉ１１
？へ′から精製された１ｇにの細胞質へのマイクロン１
人に、Ｌる形質転換１引害についでの講演の要約を公表
し７ｋ。細胞の形質転換はｐ８５ｖ＝’＋−−−ゝ融合
蛋白質により誘導された。このＩん体が粘１’ｌ化され
た（変異体）発癌遺（Ｉ、ｆ’１成吻に対し−（特異的
であるごとは小さ、？＋（いない６４− ヤンリー・レ
ターＯ：ａｎｃａｒ ！、（！ ｔ （ｅｒ）νｏ１９
において、鳥類及び咄乳頽し１・１１ウイルスの発癌遺
伝子／１−載物に対する士ツク［Ｉ−ナル抗体に月４る
研究についてのＮｒｌｌ ＲＦＰの促案の通知が存在す
る。 〔発明が解決しようとする問題点〕 ｐ２１蛋白質の位置１２における１個のアミノ酸の相違
に対して特異的な抗体を製造する場合の１つの困難性は
、所望の特定のアミノ酸エピトープ部位に抗体が結合す
ることを許容しない蛋白質の複雑な構造によるものであ
った。このような抗体を製造する場合の他の困難性は、
所与のペプチド断片が必要な抗体を生成せしめる際の免
疫原として有効であるか否かをあらかじめ予想すること
ができないことである。従って、適当な抗体を生しさせ
るために有効なペプチド免疫原の必要性、及び露出した
エピトープを有する変形されゆるめられた蛋白￥ｔ（こ
の露出したエピトープに抗体が結合することができその
結果１個のアミノ酸の相違を検出することができる）を
得る方法の必要性が当業界に存在する。さらに、ｐ２１
蛋白質の活性化の機作を決定して、該蛋白質の発癌効果
に対抗するために有効な療法剤を開発する必要性が存在
す〔問題点を解決するだめの手段〕 この発明は特に、発癌遺伝子生成物が、この発癌遺伝子
生成物の発癌活性に必要な細胞成分に結合するのを］用
害する方法に関し、この方法は、該発癌遺伝子生成物を
、該発癌遺伝子４Ｌ成物の特徴的マーカーエピ１−−プ
（このエピトープは対応するプロト−発癌遺伝７−１１
成物中には存在しない）を含有する該発癌遺伝子生成物
の領域に選択的に結合する阻害剤（この阻害剤は、発癌
遺伝子生成物と前記細１抱成分との結合に対して直接的
効果を有する）と接触せしめることを含んで成る。好ま
しい態様におい”ζは・、前記細胞成分はＧＴＰであり
、前記阻害剤は抗体であり、前記発癌遺伝子７Ｌ成物は
ｐ２１蛋白質の活性化された形であり、そして前記エピ
トープは該ｐ２１蛋白質の位置１２を含む。組成物とし
ての阻害剤もまたこの発明の範囲に含まれる。 この発明の他の態様は癌の処置方法であって、（＋４） この方法は、少なくとも部分的に癌のために機能する発
癌遺伝子生成物の特徴的マーカーエピトープ（このエピ
トープは対応するプｒ＋トー発癌遺伝子生成物中には存
在しない）に選択的に結合する抗体を含んで成る組成物
に、ｌ又は複数の癌性細胞を接触ゼしめることを含んで
成る。 この発明に従う１つの特定の具体例としての、ヒト細胞
中のＲＡＳ発癌遺伝子の生成物の検出は、１個のアミノ
酸を異にする蛋白質問を識別する幾つかの抗体の能力に
基礎を置いている。ｒａｓ遺伝子の正常な蛋白質（ｐ２
１蛋白質）と位置１２又は６１における１個のアミノ酸
の相異による変異体活性化形との間を識別することがで
きる抗体を用いて、免疫螢光法、免疫パーオキシダーゼ
染色法、免疫沈澱法、ＥＬＩＳＡ法又はウェスタンプロ
ット法のごとき標準的方法により、ｒａｓ発癌遺伝子生
成物を検出することができよう。 この明細書において使用する”エピＩ・−プ”なる語は
、この発明の抗体を認識する発癌遺伝子生成物の結合部
位を意味する。 この明細書におい゛ζ使用する“抗体“なるｍＡ ＋、
＋、ボリン１」−ノ′ル抗体及びモノクローナル抗体の
両者を意味する。さらに、この用詰番、ｌ全免疫グ１：
Ｊゾリン、及びその抗原結合性断片を包含する。ポリク
ローナル抗体１．Ｉ、宿主動物、例えばラビッ１、ラッ
ト、ヤギ、マウス、等に、天然蛋白質から変異体蛋白質
を区別するアミノ酸を１ｕ持する、発癌遺伝子により二
ｌ−ドされるペプチ］′セグメン１を注射することによ
って製造することができる。宿主動物から血ｌ＃を抽出
し、これをスクリーニングしてペプチド免疫原に特異的
なポリクローナル抗体を得る。モノクロ−ナル抗体は、
例えばマウスを上記のペプチドで免疫することにより製
造することができる。免疫原として有効な世のベプチ１
′をマウスにＩｌｉ腔内接種し、そして次に同様な量の
免疫原ペプチドにより追加免疫する。最終追加免疫の数
［１後に、免疫されたマウスから肺臓を集め、これから
細胞懸？ｒ：Ｊ？＆を工ｊ！製し、そして融合のために
使用する。 ハイブリドーマは、肺細胞とネズミ腫瘍バー１、ナーと
から、Ｋｏｈｌｅｒ、口、及びＭｉｌｓｔｐ、ｉｎ、Ｃ
，、ネイチュアー（メ部旦皿＞ （ｂ９７５）λ５飢
；４９５−４４１７の一般的体細胞ハイブリダイゼーシ
ョン技法を用いて調製することができる。このハイブリ
ダ・イゼーションにおいて４；１、人手可能なネズミ骨
髄腫セルライン、例えばツークイシスティテユ−１・、
セルディストリビューションセンター、ザンジェゴ、カ
リポルニア、米国から入手できるセルラインを使用する
ことができる。基本的に、この技法はポリエチレングリ
コールのごとき融合剤を用いて腫瘍細胞と肺細胞を融合
ゼしめることを含む。融合の後、融合媒体から細胞を分
離し、そして選択増殖培地、例えばｌ−Ｉ Ａ Ｔ培地
中で増殖−〇しめて未融合の親細胞を除去する。所望に
よりハイブリドーマを拡げ、そして抗原として免疫原を
使用する常用のイムノアッセイ法（例えば、ラジオイム
ノアッセイ、エンザイムイムノアソセイ、又は螢光イム
ノアッセイ）により上清液を測定することができる。陽
性クローンをさらに特徴付けてこれらがこの発明の抗体
の基準に合致するか否かを法定することかできる。 このような抗体を４Ｌ産するハイブリ１−マを公知の方
法を用いてインービＩ・口又はインービボで増殖−１し
める、二とができる。千ツクＩ＋−ナル抗体を、場合に
応して培地又は体液から、所望にＪ、り常用の免疫グ■
ゾリン精製法、例えば硫酸アンモニラＪ、ン尤澱、ゲル
゛市気泳動、透析、クロマ１グラフイー、及び限夕１濾
過により単Ｎ１することができる。 この明細ｉｕにおい”（、“部分的に変性されにパ蛋白
質と番、１、特徴的な未変性蛋白質中では露出していな
い特徴的Ｚ（−７−カーニビト−プ含有し、そしてこの
発明の抗体に対してエピＩ・−ブ部（ｂ）を露出するの
には十分であるがしかし同時に溶７合中で該抗体を！岬
（傷で月つ粘性に維持しそして抗ｌｌ１ｔＩｉｊ体結合
を実質り、 ｌｌｌ’ｌ害しない程度に部分的に変性さ
れ又口ゆるめられ°（いる蛋白質を意味する。この「１
的のために使用′４ることができる蛋白百度（’ｌ剤の
例には、尿素、デλ＝１−シコレーＩ−、グアニジン塩
酸塩、ドデシル硫酸すＩリウム、及びごれらに類（以す
るものが含まれる。 蛋白質への抗体の結合は、十分に高い濃度のアフィニテ
ィー精製された抗体を使用する場合に増強され得る。ア
フィニティー精製は当業界においてよく知られた技法で
あり、この方法においては免疫化のために使用されたの
とは異る石片ペプチドが担体に結合され、そして抗体が
精製のためにこの担体を通される。 ｐ２１に幻する抗体を血清学的に得るために使用されそ
し°ζそれ故に免疫原として有用なペプチドは、位置１
２における可変アミノ酸、抗体がそれに選択的に結合す
る特徴的マーカーエピトープを規定するのに十分な量の
フラン；１−ング残基、及び該ペプチドのＣ−末端へ２
番目の位置にあるシスティン残基を含有する。このペプ
チドは、宿主に注射するＯ；１に、前記システィン残基
を介して！μ体体内白質例えばキーホールリンペットヘ
モシーｆ−ン又はウシ血清アルブミンに接合され得る。 ペプチド断片は、検出される蛋白質セグメントのエピト
ープであるものを規定するために十分なアミノ酸残基を
有しな＋Ｊわばならないが、しかし検出される蛋白￥ｒ
０じ１ンホーメーシヨンと異る限定されたコンボーメ−
ジョンを有するほど大きくてはならない。ペプチド断片
が短か過ぎる場合、この断片は無関係の他の蛋白質の中
に存在することになろうし、そしてこれは免疫用１ｊ体
蛋白質中に物理的に埋没してしまうかもしれない。Ｃ−
末端へ２番「１に位置するシスティン残基は、ペプチド
断片にｌｌ１体蛋白質を連結するために使用される。 第１図は、ｐ２１蛋白質のための１つの有用な断Ｊ１を
示す。 この発明においで使用される発癌遺伝子生成物は、プロ
ト−発癌遺伝子生成物とは異る構造的に変形された（変
異体）発癌遺伝子生成物である。 このような発癌遺伝子生成物の例には、ｒａｓ発癌遺伝
子生成物（ｐ２１（−ＩＩ−ｒａｇ及びｐ２＋’−”−
””）から成る細胞性遺伝子生成物、ｍｙｃ発癌遺伝子
イト成物載物５８ｃｆｆｌｙ’ ） 、ｓｉｓ発癌遺伝
子４１：放物（ＰＩＩＧＦ ＩＩ−鎖）、及びこれら
に類偵するものが含まれる。ｌｉｒましく ｋ＋、この
発明にお＋−Ｊる発癌遺伝７−４Ｌ成物は活性化された
形のｐ２１蛋白質である。 蛋白質について適用される“活性化”なる語はＤＮＡに
おける変化を意味し、今度はこの変化が発癌形質転換を
生しさせるように蛋白質を変化せしめる。 この発明の抗体を代表するｐ２１蛋白質に対するペプチ
ド抗血清は次の方法により調製することができる。天然
ｐ２１蛋白質の位置１２に存在する正常なアミノ酸グリ
シンを、この位置のコドン中の１つの塩基の変化から生
ずることができる各可能性あるアミノ酸により置き換え
ることによって、ｐ２１Ｆ？Ａｓ遺伝子生成物のアミノ
酸５−１７に対応する６種類のペプチドを調製する。こ
れらのアミノ酸はセリン、アルギニン、システィン、バ
リン、−？ラニン、及びアスパラギン酸である。第１図
は、ｐ２１蛋白質の位置５−１７に対応する部分のアミ
ノ酸配列を示す。調製されるペプチドは、Ｃ−末端のセ
リンへ２番目の位置にある追加のシスティン残基を含有
しなければならないテトラデ力ペプチトであり、このシ
スティン残基はｌｌ１体蛋白質に結（２Ｉ） 合するであろう。持直１２における各アミノ酸の変化の
効果は右側の欄に示されている。このペプチドは、当業
界において知られておりそし０Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄに
より記載された同和合成法により合成することができ、
自動ＳＡＭペプチ１′シンセサイザー及び手動同相合成
装置“ペプチダー”を用いる合成を例１に示す。液体浅
化水素により合成に使用した樹脂からペプチ１゛を切断
し、そしてカラムクｒ１マドグラフィーにより精製する
。合成の後、ペブチ１を、Ｃ−末端のシスティン残基を
介して担体蛋白質、例えばキーホールリンベ・２トヘモ
シアニン（Ｋｌ、１１）又はウシ血清アルブミン（Ｏ５
＾）に共有結合により連結し、そしてラビノｉ・に注射
する。 抗体価はｌＥｌ、ｌｓ八へによ測定する。この方法にお
いては、イムロンプレーＩ・を、免疫用ベブチ］におい
て使用された担体蛋白質とは異る担体蛋白質に共有結合
により連結された各ペプチＩによりコートシ、こうして
抗体のスクリーニングができるようにする。位ｉ１２に
特異的な抗体の非特異的抗体からの分離は、ペプチドＢ
Ｓ Ａ ７１（合体が共有結合により結合されたアフ
ィニティーカラムに血清を通ずことにより達成される。 位置１２にセリンを有するペプチＦに対して化した１）
°シ血清の場合には、この位置にグリシンを有するアフ
ィニティーカラムを用いる。このアフィニティーカラム
に結合しない抗体が、ＥＬＩＳＡにより判定した場合位
置１２のセリンに対する特異性を有する。 ｐ２１蛋白質の部分的変性条件下での免疫沈澱を用いて
、全体蛋白質（Ｗｈｏｌｅ ｐｒｏｔａｉｎ）中の位置
１２におりるアミノ酸置換を識別するその能力について
、生成された抗−ペプチド抗体を試験する。 すなわち、抗体と蛋白質を混合し、そしてＳ ｌ） Ｓ
及び／又はデオキシコレートを含有する蛋白質変性剤緩
衝液の存在下でｐ１１７．５〜８．０にて０．５〜１時
間時間インキュトート。さらに−１ｌｎ的に番Ｊ、蛋白
質変性条件はよく知られているが、この発明の目的のた
めには生理的ｐｌ＋、例えばｐ２１については約７．５
〜９、好ましくは８のｐＨにおいて、約０．０５〜０．
１０重量％のＳＤＳ及び／又は約０．１〜１重量％、々
工ましくは０．５〜１重量％のチオ−１−シコレートの
ＩＮ度を用いて、０．５〜１時間にわたって行う。 これらの条（’ｌのすべては、例えば使用される特定の
発癌遺伝ｒ生載物及び抗体の純度に依存するであろう。 免疫沈澱の後、免疫初合体をプロティンＡセファロース
上に築め、洗浄し、そして５１１Ｓ−１１ＡＧＩ４によ
り分析する。 この発明におい゛（は、抗体を、治療及び診断の両目的
のための免疫化学物質として使用することができる。治
療的用途のためには、ｌｊ体に結合した抗体を腫瘍に導
入しその悪性効果を転換することができよう。 遺伝子」二載物（ｐ２１蛋白質）中の１個のアミノ酸の
相違によりＲＡ Ｓ発癌遺伝子をその正常対応物から識
別することができる抗体は、多くの臨床的状況においで
悪性細胞の診断的検出のために通用することができる。 例えば、ＲＡ Ｓ発癌遺伝子の存在は、特定のタイプの
癌の治療の方側の決定において予測的意義を有する。他
の状況において、悪性細胞中のＲＡ Ｓ発癌遺伝子の１
★出は、多数の正常細胞中の悪性細胞の検出を促進する
ことができ、そしてそれ故に疾患の経過を監視するため
及びその早期検出のための有用な手段である。抗−ｐ２
１抗体の一次的診断的用途は、ｃ−ｒａｓ変異が関与す
る癌を検出するために、又は血清マーカーとして免疫組
織化学的である。 最も重要なこの発明の抗体の免疫化学的誘導体はラベル
された（例えば放射性ラベル、酵素ラベル、又は螢光色
素ラベルされた）誘導体であり、この場合ラベルはラベ
ルされた抗体を含む免疫複合体の同定手段を提供する。 抗体がイムノＩ・キシンのごとき療法剤方式において機
能するか否かは抗原である蛋白質が何であるかに依存づ
゛る。 抗体のラベル部分を形成するために使用されるラベルに
は、直接検出することができる成分、例えば螢光色素及
び放射性ラベル、並びに検出のために反応するか又は誘
導体化しなＩＪればならない成分、例えば、酵素が含ま
れる。このようなラベルの例には：１２ｐ、 ＋２Ｊ
、３ｏ、＋４ｃ、フルオレソセイン及びそのＢＡＲ体、
ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロ
ン（ｕｍｂｅ ｌ Ｉ ｉ ｒｐ、ｒｏｎｅ）、ルシフ
ェリン、２．３−ジヒドロフタラジンジオン、ボースラ
ブイソシュバーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ
、β−ガラクトンダーゼ、リゾチーム、及びグルコース
−６−ボスフニトデヒビ「１ゲナーゼが含まれる。抗体
は、これらのラベルにより、公知の方法を用いて標識す
ることができる。例えば、前記の螢光ラベル、化学ルミ
ネッセントラベル及び酵素ラベルにより抗体を標識する
ためにカンブリング剤、例えばジアルデヒ１゛、カルボ
ジイミド、シマレイミド、ビス−イミデート、ビスージ
アヅ化ヘンジジン及びごれらにｔｆ１４１Ｊするものを
使用することができる。 抗体及びラベルされたＩｉｉ体は、種々のイムノアッセ
イ法におい°Ｃ、ヒトの患者において癌の存在を検出す
るため、又４Ｊずでに癌を有すると診断された患者にお
いて癌の状態を監視するために使用することができる。 このように監視ムごおいて番：Ｉ、定期的に一７ノセイ
が行われ、そしてその結果を比較するごとによって宿主
のＩｆｉｍの重荷が増加したか減少したかが決定される
。使用し得る一般的アノセ・イ法には直接アッセイ及び
間接アッセイが含まれる。直接アッセイには、宿主から
の組織サンプル又は細胞を１又は複数のラベルされた抗
体と共にインービボ又はイン−ビトロでインキュベート
することを含む。サンプルが癌細胞を含んでいれば、ラ
ベルされた抗体がそれらの細胞に結合するであろう。組
織又は細胞を洗浄して未結合抗体を除去した後、ｋＪＪ
織サンプルをラベルされた免疫複合体の存在について読
み取る。間接アッセイにおいては、組織又は細胞サンプ
ルを１又は複数のノ１ラベル抗体と共にインキュへ−１
する。次にこのサンプルを前記抗体に対するラベルされ
た抗体（例えば、ラベルされた抗−ラビット抗体で処理
し、洗浄し、そしてラベルされた３元複合体の存在につ
いて読み取る。 体液リーンプルにおいて癌を検出４゛るためのインービ
］・し１アツセイにおいては、′リンプルを、好ましく
は個体支持体に固定化されているラベルされていない１
ｊシ体（蛋白質にえ１して向春漬られている）とイン４
−ユヘ−１・する。このインキ１．ヘーシＪンの前、イ
ンキュヘーシジン中又はその後に、リンプルをラベルさ
れた他の抗体とイン、トヨ、・＼−１する。洗浄した後
、→ノンプルをラベルされた複合体について読み取る。 使用する２つの１ｉＬ体は両あともｐ２１（異なるエピ
トープ）にえ１して向＋）られたものでもよく、又は第
２ｔｉＬ体が第１抗体に対して向し」られてい′（も、
１、い。 さらに、競争的１？ＩＡ方式において抗体を使用するこ
ともできる。 診断的使用におい−（は、抗体は典型的には十ノドの形
で分配されるであろう。これらの−１’ 〕ｌは典型的
には、適当な容器中ラベルされた形又はラベルされてい
ない形の１種類又は複数種類の抗体、変性緩衝液、所望
によりインキュ・＼−ジョン用及び洗浄用試薬、並びに
ラベルの性質に依存して基質又は誘導体化剤を含んで成
るであろう。ヒ］癌抗原対１ｊ（ｂ及び指示書を含める
こともできる。さらに、キ、（−中のｊｉＬ原はアフィ
ニティー精製され°（（２日） いてもよい。 特定の発癌遺伝子生成物に対するこの発明の抗体の高い
特異性は、発癌遺伝子生成物の生化学的活性を調節する
その能力と相まって、これらの抗体を、発癌遺伝子生成
物の構造並びにインービＩ・口及びインービボの両方で
の発癌におけるその役割の研究のために非常に有用なプ
ローブにしている。潜在的には、これらの抗体は、イン
−ビトロ系において複合体中の発癌遺伝子生成物の活性
を制御するため及び発癌遺伝子生成物と他の細胞性成分
との相互作用を検知するために使用することができよう
。 この発明の抗体はまた、癌治療において使用することも
できる。例えば、これらは他の適当な医薬製剤又は薬剤
と同様に、発癌遺伝子生成物の発癌活性のために必要な
細胞性成分の発癌遺伝子生成物への結合を阻害する過程
における１徂害剤として使用することができる。このよ
うな過程において、前記のごとき発癌遺伝子生成物が阻
害剤と接触し、これが細胞性成分への発癌遺伝子生成物
の結合を阻害することができるにちがいない。使用され
る４）定の１１１１害剤＆、１、例えば発癌遺伝ｒ−１
成物及び関１ｊする細胞＋’ｌ成分に依存するであろう
。発癌遺伝子ノ１−載物がゾ１１１・−発癌遺伝子４１
−酸物の変異的であれば、阻害剤は月応するプｕ ｌ−
発癌遺伝子η酸物中には存在しない発癌遺伝−ｒ７Ｉ成
物の特異的マーカーエピトープに選ＩＪｅ的に結合する
であろう。この１１１害剤はまた、発癌遺伝子生成物へ
の細胞１／１成分の結合にえＩして直接的効果を発揮す
るにらがいない。この直接的効果は、細胞Ｐ［成分が発
癌遺伝子）１成物に結合する部位の少なくとも部分をエ
ピＩ・−ブが含むごとであるか、あるいは阻害剤がエピ
１−プから割れて結合又は作用しそして発癌遺伝ｒ１１
成物の３次構造を撹乱するごとにより結合性を変化−１
しめることであろう。この発明は、１徂害削が結合に対
していかに作用するかに関するある特定の理論に限定さ
れるものではない。 発癌遺伝Ｙη−成物載物能するために必要な細胞性成分
は例えば、蛋白質、脂質、炭水化物、核酸、代謝物、例
えばヌクレオチド、例えばＡＴＰ 、 ＣＴＩＩ、ＧＴ
Ｐ 、ｌｌＴ１１ 、及びこれらに類するものであろう
。 発癌遺伝子生成物が機能するために必要な細胞の特定の
成分は関与するその生成物に依存するであろう。例えば
、活性化されたｐ２１蛋白質については、細胞性成分は
ＧＴＰであってこれが活性化されたｐ２１蛋白質に結合
してそれを発癌性にするであろう。他の蛋白質は同一の
又番Ｊ異る細胞性成分に対して特異性を有するであろう
。 好ましくは、阻害剤は抗体であり、この抗体はアフィニ
ティー精製されたボリクＩ′Ｉ−ナル抗体であってよく
、そして発癌遺伝子生成物はその蛋白質の位置１２を含
む特異的マーカーエピトープを有する活性化されたｐ２
１ｉ白雪である。 この発明の抗体は癌を有する患、Ｈの処置方法のために
特に使用することができ、この方法においては、患者の
１又は複数の癌性細胞が癌のために少なくとも部分的に
機能する発癌遺伝ｒ生成物の特異的マーカーエピトープ
（このエピトープは対応するブ１：２１・−発癌遺伝子
生成物中には存在しない）に」Ｘ沢的に結合する抗体を
含んで成る組成物と接触する。抗体をマイクロ注入によ
って細胞と接触せしめることができ、あるいは注入を必
要としないで抗体が自由に細胞膜を通過するごとを可能
にするであろう担体分子に連結することができる。この
目的のためのｌｒＪ体分子は疎水性であること力（でき
、そして細胞１１情を通してリジンの７ｈ １１１八−
鎖を引き付けるリジンのＢ−鎖と類似しており、又はお
そらく同一であろう。好ましくは、この目的のための発
癌遺伝子生成物は、蛋白質の位置１２を含むマーカー：
［ヒト−ブを有するｐ２１（ｆｆ白質の活性化形である
。 次に、例に、１、りこの発明をさらに詳細に説明する。 特にことわらない限り、％は重量％であり、ｊべ°（の
温度番、１℃で示す。 例−１ Ａ、てくブチＩ′合Ｊ戊 第１１ス１の１・゛部εこ小ずう一１フデカペブチド（
式中、Ｘ ＩＪ：Ｂｌｙ ＋ｖａｌ 、 ｓｅｒ 、
ｔ＋ｒＢ 、 ｃｙｓ 、 ａｓｐ又ｉＪ’、 、１
ｌ ＋１であり、そし′（０未☆ｊＱｊ Ｓ （！ ｒ
へ２番目に追加のンスティン残基を含有する）を、自動
化ＳＡＭベブチドシンセ・リイザー（ビオサーチ社）、
及び手動同相合成装置“ベプタイダー”を用いて同相合
成法により合成した。 この発明において使用した同相合成法は、Ｍｉｒｒ−ｉ
ｆ＋ｅｌｄ、、Ｒ，Ｂ、、アドバンス・イン・エンチモ
ロジー；アンド・リレーテッド・エレアス・オプ・モレ
キュラー・バイオロジー（Ａｄｖ−坤ｚｙ−１ｌｌｏ
ｌ 、 Ｒｅ ｌ ａ↓。 紅組」娃ユ胆１ユ）、井： ２２１−２９６（ｂ９６９
） 、及び“ザ・ケミストリー・オブ・ポリペブチトス
（Ｔｈｅ Ｃｈｅｍ−ｓｔｒｙｏｒ Ｐｏ１ｙｐｅｐｔ
ｉｄｅｓ）”（Ｐ、Ｇ、Ｋａｔｓｏｙａｎｎｉｓ ［）
、３３６−３６１頁、プレナム、ニューヨーク（ｂ９７
３）に記載されている。この方法の実験室的観点はＳＬ
ｅｗａｒＬ、Ｊ、Ｍ、等、“ソリド・フェーズ・ペプチ
ド・シンセシス（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉ
ｄｅ ５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）”、フリーマン、ジンフラ
ンシスコ、カリホルニア（ｂ９（Ｔ９）に記載されてい
る。 この合成は、Ｃ−末端アミノ酸として、ベンジルエステ
ルによりポリスチレン樹脂に共有結合により連結されて
いるＮ−Ｌ−プチルオ；１−シカルボニルー■２−セリ
ン（０−ベンジルエーテル）（商業的に人手できる）を
用いて行った。この合成（，１、トリフルオ「ｌ酢酸に
よるα−アミノ基からの保護基の除去、シイツブ１゛ｌ
ピルエチルアミンによるトリフルオし１酢酸１！！の中
和及びカルボジイミ１′による次のＮ−１−ブヂルオキ
シ力ルボニル保護アミノ酸のカップリングから成る反復
循環法である。 すべてのアミノ酸誘導体及びすべての試薬は商業的に人
手可能である。 合成中、ずなわら各反応（脱保護、中和及びカップリン
グ）の後に、樹脂を十分に洗浄する必要があった。樹脂
を適当な有機ン容削、例えばジク１１０メタン、ジオル
（Ｊ・ン及びジメチルホルム了ミドにより洗浄した。 システィンはｐ２１蛋白質のアミノ末端から処置１６又
は１７位には天然には存在しないが、次にペブチ１を免
疫のためにａ・要な蛋白￥ｒ１！Ｌ体に連結することが
できるようにこれらの位置の間にシスティンを導入した
。 少量のアニソールと共に液体弗化水素にまり樹脂からペ
プチドを切断した。切断されたペプチドを、＋ｆｉｌ
ｌ１ｉｉから２Ｎ水性酢酸中に抽出し、そして凍結乾燥
した。１ｇの空気乾燥ペプチド−樹脂から３３９ｍｇの
ネ１１ペプチドが得られた。 精製のため、ペプチド（ｂ００ｍＢ）を５ｍｌの２ＮＩ
Ｉｉｌ酸中ジチオスレイトール（３０町）の溶液で処理
し、そし゛（２Ｎ酢酸中で１５０ｍ７！のヘノトボリウ
Ｊ、のｌ、１１セファデックスカラム−１＝でり［１マ
ドグラフ処理した。ペプチドの大部分を含有する両分を
一緒にし、そして凍結乾燥した。合計５６１１Ｉｇのペ
プチドが回収された。 アミノ酸の均一性を逆相１１ＰＬｃにより、及びペプチ
ドの加水分解物のアミノ酸組成により試験した。 これらのペプチドのキーボールリンベットヘモシアニン
（Ｋｌ、１１）への又はウシ血清アルジミン（ＩｉＳＡ
）への接合番、Ｉシスティン残基中のスルヒ］リル基を
介して行った。へテロ２官能架橋剤１−ヒト１」キシ−
２−二トに１ヘンゼン−４−スルホン酸り゛トリウム塩
のＮ−マレイミド−６−アミノカブｌ：ｌ ４ルエステ
ルを、次の方法により調製した。 ｌ；［ル当ｋｒｉ （２，２４ｇ）の４ ヒ１１１＝ｌ
−ノ ３ ニトロヘンビンスルボン酸（ＩＩＮｓＡ）−
ノ°１リウｌＪムを、２５ｍ１のジメチルホルＪ、アミ
Ｆ（［１り中１モルゝｌ１ｂｔ （２，０［ｉｇ）のノ
ックＩＩ−＼キシルカルボジイミＩ及びＪモル当−（２
，ｆｉｌｅ）のＮ ゛ンレイミ１−６７ミノカプロン酸
と室温において一夜混合した。シシクｒ１へ−１−シル
ＬＮ索の白色沈澱物が４１成した。沈澱を濾過し、イし
−’（３［１０ｍ ｅのジエチルエーテルを母液に加え
た。約１０分間〜４時間の後、ＩＩＪ Ｍからガム状固
形物が沈澱）１−成した。この固形物
る。さらに詳しくは、この発明は天然のプロト−発癌遺
伝子ではなく変異体発癌遺伝子の生成物に特異的な抗体
、これらの抗体から作られる免疫化学薬剤、並びにこれ
らの免疫化学薬剤を用いる診断及び治療方法に関する。 〔従来の技術〕 発癌遺伝子は細胞の新生物性形質転換に寄！ｊする細胞
性遺伝子である。一般にＷｅｉｎｂｅｒｙ， Ｒ． 、
リイエンティフィソク・アメリカン（ Ｓｃｉｅｎｔ
ｉｆｉｃ−Ａｍｅｒｉｃａｎ ）、 ｚｌｉＬ： １２
６−１４２（＋９８３）を参照のこと。 これらは正常な細胞性遺伝子の変化した形であり、そし
て広範囲のヒト腫瘍及び腫瘍セルラインにおいて検出さ
れている。発癌遺伝子は、ヒト腫瘍又は腫瘍セルライン
からのＤＮＡをＮｌ１１／３Ｔ３細胞として知られてい
るセルラインに１ヘランスフエクトするごとに検出され
た。トランスフェクトされたＤＮＡからの発癌遺伝子を
取り込めそして発現する細胞は形態学的に変化し、そし
て厚密なソオーカスとして増殖し始める。これらのフォ
ーカスからの細胞は、マウスにおいて増殖する場合、腫
瘍を形成することができる。（Ｌａｎｅ．Ｍ，Ａ， 、
Ｓａｉｔｅｎ 、＾．及びＣｏｏｐｅｒ 、 Ｇ．Ｍ
． 、プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミ−・オブ・勺イエンシス・オブ・す′・ユリーイ
テソ１゛・ステイク・オブ・アメリカ（４ｊｒ−ｏｃ，
ｊ４ａｔ↓．−Ａｃａｄ，−Ｓｃｉ，り達〉。 刊： ５１８５−５１１１９（ｂ９８１） ；並びに
Ｓｈｉｌｏ，Ｂ．及びＷｅｉｎｈｅｒｙ， ｌｉＡ．ネ
イチゴ，アー（ＮｐｔｕＨｅ）、？Ｅ１９ ； ６０７
６０９（ｂ９８＋） ）。 ｒｊｌｓプロ１−一発癌遣ＩＩｋ ’ｆ−族の構成員に
よりコードされるｐ２１（ｔｆ白質は、細胞質変異に、
１、り活１４化され培養中のある神の細胞の新生物ｔ’
ｌ形質転換を生じさせ、そり、 ’（ｉｌｉ々のヒ１癌
の発生に関与する。 ｒａｓ遺伝γ−がヒｌ− ＩＩＩｉｉ＆中で活Ｐｌ化さ
れる＜ｉｔ度は２０％又はそれより高いであろう。ｒａ
ｓ発癌遺伝子の構造の比較により、これらは、遺伝子ｘ
１−成物であるＰ２１蛋白質のアミノ酸配列がその１２
位又（、１６１位において変化する点変異により、それ
らの非形質転換性正常対応物と異ることが明らかになっ
た（Ｐａｒａｄａ、 Ｌ、Ｆ、等、ネイチュアー（Ｎａ
ｔｕｒｅ） ＋２９７；４７４−４７９（ｂ９８２）
； ５ａｎｔｏｓ、ＩＥ、等、ネイチュアー（Ｎａｔｕ
ｒｅ）２９８；３４３−３４７（ｂ９８２） ；−１ア
サ、Ｖｏ等、ネイチュアー（Ｎａｔｕｒｅ） 、３０３
； ７７５−７７９（ｂ９８２） ）。 ｒ＋２１蛋白質の発癌性活性化を導く最もしばしば観察
される変異は、該蛋白質の位置１２におけるアミノ酸残
基の他の幾つかのアミノ酸残基のいずれかへの変化をも
たらす。ＭａｒｓｈａｌＬ Ｃ，Ｔ、等、キャンサー・
→」′−へイス（ハ些肛Ｓ壓−！９ｙ声・）・主；１８
３−２１４ （ｂ９８４）。 ｐ２１蛋白質はＧＴＰに特異的に結合しそしてＧＴＰを
ＧＤＰと無機リン酸とに加水分解することが知られてい
る。５ｈｉｈ、Ｔ、Ｙ、等、ネイチュアー（Ｎａ Ｌｕ
ｒｅ） 、 ２８’し、 ６８１−６９１ （ｂ９８０
） ；ＭｃＧｒａｔｈ、Ｊ、Ｐ等、ネイチュアー（勘勺
皿）、ａｔｏ、５４４−６Ｊ９ｏｑ８ｏ）；及びＳｗｅ
ｌ、Ｒ，Ｗ、等、ネイチュア−（Ｎａｔｕｒｅ）３１１
；２７３−２７５（ｂ９８４）。位置５９にスレオニ
ン残基を含有するｐ２１蛋白質の形において、前記のリ
ン酸は自動リン酸化反応に、ｊ；ってこのスレオニ残基
に移行する。ＭｃＧｒａ ｔｈ等、０；］出；Ｇｉｂｂ
ｓ 、 Ｊ、１１．等、プロシーデインダス・オシ・ザ
・ナショナル・アカデミ−・オシ・サイエンシス・オシ
・ヂ・ユナイテッド・ステイク・オシ・アメリカ（Ｉｌ
、Ｎ４」」ｓＡ）、財、２６７４−２６７Ｆｌ（ｂ９８
４） ；及び５ｈｉｈ、Ｔ、’／、等ネイチュアー（ハ
判り） （じ１ンドン）飢７ ；６８６−６９］（ｂ９
８１）。 活性化されたｒ＋２１の形質転換能力にお＆Ｊるごれら
の活性の役割はまだ知られていない。しかしながら、位
Ｗ１２を包囲するｐ２１蛋白質の部分がｐ２＋蛋白質と
ＧＴＰとの相■作用に関与するであろうことが示唆され
ている。Ｇａｙ、Ｎ、Ｊ、等、ネイチュアー回ｕｒｃ）
１，３０４ ；２６２−２６４（＋９８３）；及びＷｅ
ｉｒｅｎｇａ、Ｒ，に、等、ネイチュアーリｌ阿朋）、
３０２；８４２−８４４（ｂ９８３） 、 Ｆａｒｔｔ
＋、Ｍ、等、ジャー −Ｊ−）Ｌｔ ・オシ・ヒロロジ
−（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、）、４３；２９４−３０４（ｂ９
８２）ば、種々のｐ２１決定基に対して向Ｕられたポリ
クローナル血清及びモノクローナル抗体の両者がＧＴＰ
結合を許容することを開示している。モノクローナル抗
体Ｙ］３−２５９は正常Ｐ２１蛋白質と活性化されたｐ
２１蛋白質を識別しない。 Ｃ１１ｎｓ等のヨーロッパ特許出願公開Ｎｏ １０８，
５６４は、悪性物の存在についての診断において、ｒａ
ｓ発癌遺伝子を包含するｃ −Ｏｎ ｃ、遺伝子の発現
生成物を検出するために抗体のごときプローブを使用す
る方法を開示している。この公開された方法はポリペプ
チドの野性タイプと変異形を区別しない。 Ｔ、Ｐａｐａｓ等のヒト新生物細胞におけるレトロウィ
ルス性ｍｙｃ遺伝子の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏ
ｆ Ｒａｔｒｏ−ν１ｒａｌ ｍｙｃ Ｇｅｎｅｓ ｉ
ｎ Ｈｕ＋ｍａｎ Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ （：ｅｌｌ
ｓ）と題する１９８２年４月１日に出願された米国特許
出願Ｎｏ ３６９，５１７は、ヒト腫瘍細胞を検出する
ための鳥類骨随球腫症ウィルス株（ＭＣ２９）のｌｌｌ
ｙｃ発癌遺伝子配列を含有する３２ｐブラヘルされたり
、ローン化組撰ＤＮＡプローブの使用を開示している。 種々の血液細胞がＭＣ２９のｍｙｃ遺伝子配列に相同な
ＲＮＡの増加した量を生産することが見出された。 検討される蛋白質の注目の領域のアミノ酸配列に正確に
対応するペプチドセグメントを化学合成することができ
、そしてこのペプチドを担体蛋白質に連結し゛（適当な
宿主に注射して抗体を得ることができることが知られて
いる。 Ａｌｅｘａｎｄａｒ等、ネイチノアー（棟！！
！些）、別（，６９７−６９り （＋ ９８３）は、１
個のアミノ酸のみを異にする２種類の白血球蛋白質（Ｔ
ｂｙ−１）、ｉＲｊびこの蛋白質に欠Ｉして特異的な抗
血清であって、前記配列が異る領域を含む短い化学合成
されたペプチドにより誘導されたものを記載している。 タムラＴ１等、セル（！；蛙！ ）、３４．５１１７−
５９６（ｂ９Ｂ３）は、ｐρ６０ｓｒｃの一次構造に対
応する合成オリゴペプチドに対する抗体の生成、及び、
、６ｏＳｒｃを免疫沈澱せしめるための該抗体の使用を
開示している。１．ｅｒｎｅｒ等、ブロンーデインダス
・オシ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブザ・サイエ
ンシス・オシ・ザ・ユナイテソド・ステイク・オシ・ア
メリカ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、 Ｓｃｉ。 ［ＩＳＡ、）、７８．３４０３−３４０７（ｂ９８１）
は、肝炎８表面抗原のごとき蛋白質のヌクレオチド配列
から予想されるアミノ酸配列に対応するペプチドのワク
チンとしての使用を開示している。さらに、ＷａｌＬｅ
ｒ、Ｇ。 等、プｌコシ−ディンゲス・オシ・ザ・ナショナル・ア
カデミ−・オプ・サイエンシス・オブ・ザ・ユナイテソ
Ｌ ステイク・オブ・アメリカ（Ｉｌ、Ｎ、＾。 Ｓ、ＵＳＡ、）７７−； ５１９７−５２００（ｂ９８
０）；及び１、ｅｒｎｅｒ、 Ｒ，Ａ、。 不イチュア−（勘↓倶」）、？γ］ ； ５９２−５
９６（ｂ９８２）を参＋１０のこと。ｐ２＋蛋白質に関
し、Ｗｅｉｎｂｅｒｙ等の１９８４年４７１１２日に公
開された＋１ Ｃ１’騙０／１１４１０１３８９はヒト
膀胱癌細胞からｆｉｔ ＃［された１１ Ｎ Ａの発癌
遺伝子とその対応するプロト−発癌遺伝子との間の相違
を開示している。１つのターｆブのγノセイにおいて、
血清学的試薬、例えば、発癌の検出のために使用するこ
とができるプロト−発癌１１１ｉ／又は発癌遺伝子から
発現されたｐ２１蛋白質に対し°（特異的な抗体・が記
載されている。検ま・１される１「常な又は変化したペ
プチド配列の？ｉ： １１の領域のアミノ酸配列に対応
する化学合成されたペプーｙ用セグメントを使用するご
とにより抗体を／ｌじさ口るごとができる。 １１ａｎｄ、１１１等、プロシーデインダス・オブ・ザ
・す〜ショナル・アカデミ−・オブ・す・Ｃエンシス・
オブ・ザ・ユナイテソト・ステイク・オブ・アメリカ
（Ｐ、Ｎ、八、≦、 ｏｓｎ、）８Ｌ５２２７−５２３
１（ｂ９８４）は、ｆｌｕ ｒａｓ ”’ ｉｌｌ伝
子イＬ成物載物ミノ酸荀ＷｌＯ−１７を反映する合成ペ
プチ］′を用いるモノクローナル抗体の生成を開示して
いる９この抗体はｒａｓ ｊｌ伝子生成載物２１と反応
することが示されたが、しかし正常ｐ２＋蛋白質ではな
く活性化されたｐ２１（旬間１２におい゛（変化してい
る）に対して特異的であることは示されなかった。 Ｇ３１１ｉｃｋ、［；４．告口、１９Ｆ＋３年９月４［
］に、ネズミ肉腫ウィルスの／！！度感受１ノ［変異株
により感染されたセルラインにおりる、合成νＩＩＩｏ
ｓペプナ１に幻し７て）Ｉ成Ｕ７た（ｂ°Ｌｔｉ１１
？へ′から精製された１ｇにの細胞質へのマイクロン１
人に、Ｌる形質転換１引害についでの講演の要約を公表
し７ｋ。細胞の形質転換はｐ８５ｖ＝’＋−−−ゝ融合
蛋白質により誘導された。このＩん体が粘１’ｌ化され
た（変異体）発癌遺（Ｉ、ｆ’１成吻に対し−（特異的
であるごとは小さ、？＋（いない６４− ヤンリー・レ
ターＯ：ａｎｃａｒ ！、（！ ｔ （ｅｒ）νｏ１９
において、鳥類及び咄乳頽し１・１１ウイルスの発癌遺
伝子／１−載物に対する士ツク［Ｉ−ナル抗体に月４る
研究についてのＮｒｌｌ ＲＦＰの促案の通知が存在す
る。 〔発明が解決しようとする問題点〕 ｐ２１蛋白質の位置１２における１個のアミノ酸の相違
に対して特異的な抗体を製造する場合の１つの困難性は
、所望の特定のアミノ酸エピトープ部位に抗体が結合す
ることを許容しない蛋白質の複雑な構造によるものであ
った。このような抗体を製造する場合の他の困難性は、
所与のペプチド断片が必要な抗体を生成せしめる際の免
疫原として有効であるか否かをあらかじめ予想すること
ができないことである。従って、適当な抗体を生しさせ
るために有効なペプチド免疫原の必要性、及び露出した
エピトープを有する変形されゆるめられた蛋白￥ｔ（こ
の露出したエピトープに抗体が結合することができその
結果１個のアミノ酸の相違を検出することができる）を
得る方法の必要性が当業界に存在する。さらに、ｐ２１
蛋白質の活性化の機作を決定して、該蛋白質の発癌効果
に対抗するために有効な療法剤を開発する必要性が存在
す〔問題点を解決するだめの手段〕 この発明は特に、発癌遺伝子生成物が、この発癌遺伝子
生成物の発癌活性に必要な細胞成分に結合するのを］用
害する方法に関し、この方法は、該発癌遺伝子生成物を
、該発癌遺伝子４Ｌ成物の特徴的マーカーエピ１−−プ
（このエピトープは対応するプロト−発癌遺伝７−１１
成物中には存在しない）を含有する該発癌遺伝子生成物
の領域に選択的に結合する阻害剤（この阻害剤は、発癌
遺伝子生成物と前記細１抱成分との結合に対して直接的
効果を有する）と接触せしめることを含んで成る。好ま
しい態様におい”ζは・、前記細胞成分はＧＴＰであり
、前記阻害剤は抗体であり、前記発癌遺伝子７Ｌ成物は
ｐ２１蛋白質の活性化された形であり、そして前記エピ
トープは該ｐ２１蛋白質の位置１２を含む。組成物とし
ての阻害剤もまたこの発明の範囲に含まれる。 この発明の他の態様は癌の処置方法であって、（＋４） この方法は、少なくとも部分的に癌のために機能する発
癌遺伝子生成物の特徴的マーカーエピトープ（このエピ
トープは対応するプｒ＋トー発癌遺伝子生成物中には存
在しない）に選択的に結合する抗体を含んで成る組成物
に、ｌ又は複数の癌性細胞を接触ゼしめることを含んで
成る。 この発明に従う１つの特定の具体例としての、ヒト細胞
中のＲＡＳ発癌遺伝子の生成物の検出は、１個のアミノ
酸を異にする蛋白質問を識別する幾つかの抗体の能力に
基礎を置いている。ｒａｓ遺伝子の正常な蛋白質（ｐ２
１蛋白質）と位置１２又は６１における１個のアミノ酸
の相異による変異体活性化形との間を識別することがで
きる抗体を用いて、免疫螢光法、免疫パーオキシダーゼ
染色法、免疫沈澱法、ＥＬＩＳＡ法又はウェスタンプロ
ット法のごとき標準的方法により、ｒａｓ発癌遺伝子生
成物を検出することができよう。 この明細書において使用する”エピＩ・−プ”なる語は
、この発明の抗体を認識する発癌遺伝子生成物の結合部
位を意味する。 この明細書におい゛ζ使用する“抗体“なるｍＡ ＋、
＋、ボリン１」−ノ′ル抗体及びモノクローナル抗体の
両者を意味する。さらに、この用詰番、ｌ全免疫グ１：
Ｊゾリン、及びその抗原結合性断片を包含する。ポリク
ローナル抗体１．Ｉ、宿主動物、例えばラビッ１、ラッ
ト、ヤギ、マウス、等に、天然蛋白質から変異体蛋白質
を区別するアミノ酸を１ｕ持する、発癌遺伝子により二
ｌ−ドされるペプチ］′セグメン１を注射することによ
って製造することができる。宿主動物から血ｌ＃を抽出
し、これをスクリーニングしてペプチド免疫原に特異的
なポリクローナル抗体を得る。モノクロ−ナル抗体は、
例えばマウスを上記のペプチドで免疫することにより製
造することができる。免疫原として有効な世のベプチ１
′をマウスにＩｌｉ腔内接種し、そして次に同様な量の
免疫原ペプチドにより追加免疫する。最終追加免疫の数
［１後に、免疫されたマウスから肺臓を集め、これから
細胞懸？ｒ：Ｊ？＆を工ｊ！製し、そして融合のために
使用する。 ハイブリドーマは、肺細胞とネズミ腫瘍バー１、ナーと
から、Ｋｏｈｌｅｒ、口、及びＭｉｌｓｔｐ、ｉｎ、Ｃ
，、ネイチュアー（メ部旦皿＞ （ｂ９７５）λ５飢
；４９５−４４１７の一般的体細胞ハイブリダイゼーシ
ョン技法を用いて調製することができる。このハイブリ
ダ・イゼーションにおいて４；１、人手可能なネズミ骨
髄腫セルライン、例えばツークイシスティテユ−１・、
セルディストリビューションセンター、ザンジェゴ、カ
リポルニア、米国から入手できるセルラインを使用する
ことができる。基本的に、この技法はポリエチレングリ
コールのごとき融合剤を用いて腫瘍細胞と肺細胞を融合
ゼしめることを含む。融合の後、融合媒体から細胞を分
離し、そして選択増殖培地、例えばｌ−Ｉ Ａ Ｔ培地
中で増殖−〇しめて未融合の親細胞を除去する。所望に
よりハイブリドーマを拡げ、そして抗原として免疫原を
使用する常用のイムノアッセイ法（例えば、ラジオイム
ノアッセイ、エンザイムイムノアソセイ、又は螢光イム
ノアッセイ）により上清液を測定することができる。陽
性クローンをさらに特徴付けてこれらがこの発明の抗体
の基準に合致するか否かを法定することかできる。 このような抗体を４Ｌ産するハイブリ１−マを公知の方
法を用いてインービＩ・口又はインービボで増殖−１し
める、二とができる。千ツクＩ＋−ナル抗体を、場合に
応して培地又は体液から、所望にＪ、り常用の免疫グ■
ゾリン精製法、例えば硫酸アンモニラＪ、ン尤澱、ゲル
゛市気泳動、透析、クロマ１グラフイー、及び限夕１濾
過により単Ｎ１することができる。 この明細ｉｕにおい”（、“部分的に変性されにパ蛋白
質と番、１、特徴的な未変性蛋白質中では露出していな
い特徴的Ｚ（−７−カーニビト−プ含有し、そしてこの
発明の抗体に対してエピＩ・−ブ部（ｂ）を露出するの
には十分であるがしかし同時に溶７合中で該抗体を！岬
（傷で月つ粘性に維持しそして抗ｌｌ１ｔＩｉｊ体結合
を実質り、 ｌｌｌ’ｌ害しない程度に部分的に変性さ
れ又口ゆるめられ°（いる蛋白質を意味する。この「１
的のために使用′４ることができる蛋白百度（’ｌ剤の
例には、尿素、デλ＝１−シコレーＩ−、グアニジン塩
酸塩、ドデシル硫酸すＩリウム、及びごれらに類（以す
るものが含まれる。 蛋白質への抗体の結合は、十分に高い濃度のアフィニテ
ィー精製された抗体を使用する場合に増強され得る。ア
フィニティー精製は当業界においてよく知られた技法で
あり、この方法においては免疫化のために使用されたの
とは異る石片ペプチドが担体に結合され、そして抗体が
精製のためにこの担体を通される。 ｐ２１に幻する抗体を血清学的に得るために使用されそ
し°ζそれ故に免疫原として有用なペプチドは、位置１
２における可変アミノ酸、抗体がそれに選択的に結合す
る特徴的マーカーエピトープを規定するのに十分な量の
フラン；１−ング残基、及び該ペプチドのＣ−末端へ２
番目の位置にあるシスティン残基を含有する。このペプ
チドは、宿主に注射するＯ；１に、前記システィン残基
を介して！μ体体内白質例えばキーホールリンペットヘ
モシーｆ−ン又はウシ血清アルブミンに接合され得る。 ペプチド断片は、検出される蛋白質セグメントのエピト
ープであるものを規定するために十分なアミノ酸残基を
有しな＋Ｊわばならないが、しかし検出される蛋白￥ｒ
０じ１ンホーメーシヨンと異る限定されたコンボーメ−
ジョンを有するほど大きくてはならない。ペプチド断片
が短か過ぎる場合、この断片は無関係の他の蛋白質の中
に存在することになろうし、そしてこれは免疫用１ｊ体
蛋白質中に物理的に埋没してしまうかもしれない。Ｃ−
末端へ２番「１に位置するシスティン残基は、ペプチド
断片にｌｌ１体蛋白質を連結するために使用される。 第１図は、ｐ２１蛋白質のための１つの有用な断Ｊ１を
示す。 この発明においで使用される発癌遺伝子生成物は、プロ
ト−発癌遺伝子生成物とは異る構造的に変形された（変
異体）発癌遺伝子生成物である。 このような発癌遺伝子生成物の例には、ｒａｓ発癌遺伝
子生成物（ｐ２１（−ＩＩ−ｒａｇ及びｐ２＋’−”−
””）から成る細胞性遺伝子生成物、ｍｙｃ発癌遺伝子
イト成物載物５８ｃｆｆｌｙ’ ） 、ｓｉｓ発癌遺伝
子４１：放物（ＰＩＩＧＦ ＩＩ−鎖）、及びこれら
に類偵するものが含まれる。ｌｉｒましく ｋ＋、この
発明にお＋−Ｊる発癌遺伝７−４Ｌ成物は活性化された
形のｐ２１蛋白質である。 蛋白質について適用される“活性化”なる語はＤＮＡに
おける変化を意味し、今度はこの変化が発癌形質転換を
生しさせるように蛋白質を変化せしめる。 この発明の抗体を代表するｐ２１蛋白質に対するペプチ
ド抗血清は次の方法により調製することができる。天然
ｐ２１蛋白質の位置１２に存在する正常なアミノ酸グリ
シンを、この位置のコドン中の１つの塩基の変化から生
ずることができる各可能性あるアミノ酸により置き換え
ることによって、ｐ２１Ｆ？Ａｓ遺伝子生成物のアミノ
酸５−１７に対応する６種類のペプチドを調製する。こ
れらのアミノ酸はセリン、アルギニン、システィン、バ
リン、−？ラニン、及びアスパラギン酸である。第１図
は、ｐ２１蛋白質の位置５−１７に対応する部分のアミ
ノ酸配列を示す。調製されるペプチドは、Ｃ−末端のセ
リンへ２番目の位置にある追加のシスティン残基を含有
しなければならないテトラデ力ペプチトであり、このシ
スティン残基はｌｌ１体蛋白質に結（２Ｉ） 合するであろう。持直１２における各アミノ酸の変化の
効果は右側の欄に示されている。このペプチドは、当業
界において知られておりそし０Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄに
より記載された同和合成法により合成することができ、
自動ＳＡＭペプチ１′シンセサイザー及び手動同相合成
装置“ペプチダー”を用いる合成を例１に示す。液体浅
化水素により合成に使用した樹脂からペプチ１゛を切断
し、そしてカラムクｒ１マドグラフィーにより精製する
。合成の後、ペブチ１を、Ｃ−末端のシスティン残基を
介して担体蛋白質、例えばキーホールリンベ・２トヘモ
シアニン（Ｋｌ、１１）又はウシ血清アルブミン（Ｏ５
＾）に共有結合により連結し、そしてラビノｉ・に注射
する。 抗体価はｌＥｌ、ｌｓ八へによ測定する。この方法にお
いては、イムロンプレーＩ・を、免疫用ベブチ］におい
て使用された担体蛋白質とは異る担体蛋白質に共有結合
により連結された各ペプチＩによりコートシ、こうして
抗体のスクリーニングができるようにする。位ｉ１２に
特異的な抗体の非特異的抗体からの分離は、ペプチドＢ
Ｓ Ａ ７１（合体が共有結合により結合されたアフ
ィニティーカラムに血清を通ずことにより達成される。 位置１２にセリンを有するペプチＦに対して化した１）
°シ血清の場合には、この位置にグリシンを有するアフ
ィニティーカラムを用いる。このアフィニティーカラム
に結合しない抗体が、ＥＬＩＳＡにより判定した場合位
置１２のセリンに対する特異性を有する。 ｐ２１蛋白質の部分的変性条件下での免疫沈澱を用いて
、全体蛋白質（Ｗｈｏｌｅ ｐｒｏｔａｉｎ）中の位置
１２におりるアミノ酸置換を識別するその能力について
、生成された抗−ペプチド抗体を試験する。 すなわち、抗体と蛋白質を混合し、そしてＳ ｌ） Ｓ
及び／又はデオキシコレートを含有する蛋白質変性剤緩
衝液の存在下でｐ１１７．５〜８．０にて０．５〜１時
間時間インキュトート。さらに−１ｌｎ的に番Ｊ、蛋白
質変性条件はよく知られているが、この発明の目的のた
めには生理的ｐｌ＋、例えばｐ２１については約７．５
〜９、好ましくは８のｐＨにおいて、約０．０５〜０．
１０重量％のＳＤＳ及び／又は約０．１〜１重量％、々
工ましくは０．５〜１重量％のチオ−１−シコレートの
ＩＮ度を用いて、０．５〜１時間にわたって行う。 これらの条（’ｌのすべては、例えば使用される特定の
発癌遺伝ｒ生載物及び抗体の純度に依存するであろう。 免疫沈澱の後、免疫初合体をプロティンＡセファロース
上に築め、洗浄し、そして５１１Ｓ−１１ＡＧＩ４によ
り分析する。 この発明におい゛（は、抗体を、治療及び診断の両目的
のための免疫化学物質として使用することができる。治
療的用途のためには、ｌｊ体に結合した抗体を腫瘍に導
入しその悪性効果を転換することができよう。 遺伝子」二載物（ｐ２１蛋白質）中の１個のアミノ酸の
相違によりＲＡ Ｓ発癌遺伝子をその正常対応物から識
別することができる抗体は、多くの臨床的状況においで
悪性細胞の診断的検出のために通用することができる。 例えば、ＲＡ Ｓ発癌遺伝子の存在は、特定のタイプの
癌の治療の方側の決定において予測的意義を有する。他
の状況において、悪性細胞中のＲＡ Ｓ発癌遺伝子の１
★出は、多数の正常細胞中の悪性細胞の検出を促進する
ことができ、そしてそれ故に疾患の経過を監視するため
及びその早期検出のための有用な手段である。抗−ｐ２
１抗体の一次的診断的用途は、ｃ−ｒａｓ変異が関与す
る癌を検出するために、又は血清マーカーとして免疫組
織化学的である。 最も重要なこの発明の抗体の免疫化学的誘導体はラベル
された（例えば放射性ラベル、酵素ラベル、又は螢光色
素ラベルされた）誘導体であり、この場合ラベルはラベ
ルされた抗体を含む免疫複合体の同定手段を提供する。 抗体がイムノＩ・キシンのごとき療法剤方式において機
能するか否かは抗原である蛋白質が何であるかに依存づ
゛る。 抗体のラベル部分を形成するために使用されるラベルに
は、直接検出することができる成分、例えば螢光色素及
び放射性ラベル、並びに検出のために反応するか又は誘
導体化しなＩＪればならない成分、例えば、酵素が含ま
れる。このようなラベルの例には：１２ｐ、 ＋２Ｊ
、３ｏ、＋４ｃ、フルオレソセイン及びそのＢＡＲ体、
ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロ
ン（ｕｍｂｅ ｌ Ｉ ｉ ｒｐ、ｒｏｎｅ）、ルシフ
ェリン、２．３−ジヒドロフタラジンジオン、ボースラ
ブイソシュバーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ
、β−ガラクトンダーゼ、リゾチーム、及びグルコース
−６−ボスフニトデヒビ「１ゲナーゼが含まれる。抗体
は、これらのラベルにより、公知の方法を用いて標識す
ることができる。例えば、前記の螢光ラベル、化学ルミ
ネッセントラベル及び酵素ラベルにより抗体を標識する
ためにカンブリング剤、例えばジアルデヒ１゛、カルボ
ジイミド、シマレイミド、ビス−イミデート、ビスージ
アヅ化ヘンジジン及びごれらにｔｆ１４１Ｊするものを
使用することができる。 抗体及びラベルされたＩｉｉ体は、種々のイムノアッセ
イ法におい°Ｃ、ヒトの患者において癌の存在を検出す
るため、又４Ｊずでに癌を有すると診断された患者にお
いて癌の状態を監視するために使用することができる。 このように監視ムごおいて番：Ｉ、定期的に一７ノセイ
が行われ、そしてその結果を比較するごとによって宿主
のＩｆｉｍの重荷が増加したか減少したかが決定される
。使用し得る一般的アノセ・イ法には直接アッセイ及び
間接アッセイが含まれる。直接アッセイには、宿主から
の組織サンプル又は細胞を１又は複数のラベルされた抗
体と共にインービボ又はイン−ビトロでインキュベート
することを含む。サンプルが癌細胞を含んでいれば、ラ
ベルされた抗体がそれらの細胞に結合するであろう。組
織又は細胞を洗浄して未結合抗体を除去した後、ｋＪＪ
織サンプルをラベルされた免疫複合体の存在について読
み取る。間接アッセイにおいては、組織又は細胞サンプ
ルを１又は複数のノ１ラベル抗体と共にインキュへ−１
する。次にこのサンプルを前記抗体に対するラベルされ
た抗体（例えば、ラベルされた抗−ラビット抗体で処理
し、洗浄し、そしてラベルされた３元複合体の存在につ
いて読み取る。 体液リーンプルにおいて癌を検出４゛るためのインービ
］・し１アツセイにおいては、′リンプルを、好ましく
は個体支持体に固定化されているラベルされていない１
ｊシ体（蛋白質にえ１して向春漬られている）とイン４
−ユヘ−１・する。このインキ１．ヘーシＪンの前、イ
ンキュヘーシジン中又はその後に、リンプルをラベルさ
れた他の抗体とイン、トヨ、・＼−１する。洗浄した後
、→ノンプルをラベルされた複合体について読み取る。 使用する２つの１ｉＬ体は両あともｐ２１（異なるエピ
トープ）にえ１して向＋）られたものでもよく、又は第
２ｔｉＬ体が第１抗体に対して向し」られてい′（も、
１、い。 さらに、競争的１？ＩＡ方式において抗体を使用するこ
ともできる。 診断的使用におい−（は、抗体は典型的には十ノドの形
で分配されるであろう。これらの−１’ 〕ｌは典型的
には、適当な容器中ラベルされた形又はラベルされてい
ない形の１種類又は複数種類の抗体、変性緩衝液、所望
によりインキュ・＼−ジョン用及び洗浄用試薬、並びに
ラベルの性質に依存して基質又は誘導体化剤を含んで成
るであろう。ヒ］癌抗原対１ｊ（ｂ及び指示書を含める
こともできる。さらに、キ、（−中のｊｉＬ原はアフィ
ニティー精製され°（（２日） いてもよい。 特定の発癌遺伝子生成物に対するこの発明の抗体の高い
特異性は、発癌遺伝子生成物の生化学的活性を調節する
その能力と相まって、これらの抗体を、発癌遺伝子生成
物の構造並びにインービＩ・口及びインービボの両方で
の発癌におけるその役割の研究のために非常に有用なプ
ローブにしている。潜在的には、これらの抗体は、イン
−ビトロ系において複合体中の発癌遺伝子生成物の活性
を制御するため及び発癌遺伝子生成物と他の細胞性成分
との相互作用を検知するために使用することができよう
。 この発明の抗体はまた、癌治療において使用することも
できる。例えば、これらは他の適当な医薬製剤又は薬剤
と同様に、発癌遺伝子生成物の発癌活性のために必要な
細胞性成分の発癌遺伝子生成物への結合を阻害する過程
における１徂害剤として使用することができる。このよ
うな過程において、前記のごとき発癌遺伝子生成物が阻
害剤と接触し、これが細胞性成分への発癌遺伝子生成物
の結合を阻害することができるにちがいない。使用され
る４）定の１１１１害剤＆、１、例えば発癌遺伝ｒ−１
成物及び関１ｊする細胞＋’ｌ成分に依存するであろう
。発癌遺伝子ノ１−載物がゾ１１１・−発癌遺伝子４１
−酸物の変異的であれば、阻害剤は月応するプｕ ｌ−
発癌遺伝子η酸物中には存在しない発癌遺伝−ｒ７Ｉ成
物の特異的マーカーエピトープに選ＩＪｅ的に結合する
であろう。この１１１害剤はまた、発癌遺伝子生成物へ
の細胞１／１成分の結合にえＩして直接的効果を発揮す
るにらがいない。この直接的効果は、細胞Ｐ［成分が発
癌遺伝子）１成物に結合する部位の少なくとも部分をエ
ピＩ・−ブが含むごとであるか、あるいは阻害剤がエピ
１−プから割れて結合又は作用しそして発癌遺伝ｒ１１
成物の３次構造を撹乱するごとにより結合性を変化−１
しめることであろう。この発明は、１徂害削が結合に対
していかに作用するかに関するある特定の理論に限定さ
れるものではない。 発癌遺伝Ｙη−成物載物能するために必要な細胞性成分
は例えば、蛋白質、脂質、炭水化物、核酸、代謝物、例
えばヌクレオチド、例えばＡＴＰ 、 ＣＴＩＩ、ＧＴ
Ｐ 、ｌｌＴ１１ 、及びこれらに類するものであろう
。 発癌遺伝子生成物が機能するために必要な細胞の特定の
成分は関与するその生成物に依存するであろう。例えば
、活性化されたｐ２１蛋白質については、細胞性成分は
ＧＴＰであってこれが活性化されたｐ２１蛋白質に結合
してそれを発癌性にするであろう。他の蛋白質は同一の
又番Ｊ異る細胞性成分に対して特異性を有するであろう
。 好ましくは、阻害剤は抗体であり、この抗体はアフィニ
ティー精製されたボリクＩ′Ｉ−ナル抗体であってよく
、そして発癌遺伝子生成物はその蛋白質の位置１２を含
む特異的マーカーエピトープを有する活性化されたｐ２
１ｉ白雪である。 この発明の抗体は癌を有する患、Ｈの処置方法のために
特に使用することができ、この方法においては、患者の
１又は複数の癌性細胞が癌のために少なくとも部分的に
機能する発癌遺伝ｒ生成物の特異的マーカーエピトープ
（このエピトープは対応するブ１：２１・−発癌遺伝子
生成物中には存在しない）に」Ｘ沢的に結合する抗体を
含んで成る組成物と接触する。抗体をマイクロ注入によ
って細胞と接触せしめることができ、あるいは注入を必
要としないで抗体が自由に細胞膜を通過するごとを可能
にするであろう担体分子に連結することができる。この
目的のためのｌｒＪ体分子は疎水性であること力（でき
、そして細胞１１情を通してリジンの７ｈ １１１八−
鎖を引き付けるリジンのＢ−鎖と類似しており、又はお
そらく同一であろう。好ましくは、この目的のための発
癌遺伝子生成物は、蛋白質の位置１２を含むマーカー：
［ヒト−ブを有するｐ２１（ｆｆ白質の活性化形である
。 次に、例に、１、りこの発明をさらに詳細に説明する。 特にことわらない限り、％は重量％であり、ｊべ°（の
温度番、１℃で示す。 例−１ Ａ、てくブチＩ′合Ｊ戊 第１１ス１の１・゛部εこ小ずう一１フデカペブチド（
式中、Ｘ ＩＪ：Ｂｌｙ ＋ｖａｌ 、 ｓｅｒ 、
ｔ＋ｒＢ 、 ｃｙｓ 、 ａｓｐ又ｉＪ’、 、１
ｌ ＋１であり、そし′（０未☆ｊＱｊ Ｓ （！ ｒ
へ２番目に追加のンスティン残基を含有する）を、自動
化ＳＡＭベブチドシンセ・リイザー（ビオサーチ社）、
及び手動同相合成装置“ベプタイダー”を用いて同相合
成法により合成した。 この発明において使用した同相合成法は、Ｍｉｒｒ−ｉ
ｆ＋ｅｌｄ、、Ｒ，Ｂ、、アドバンス・イン・エンチモ
ロジー；アンド・リレーテッド・エレアス・オプ・モレ
キュラー・バイオロジー（Ａｄｖ−坤ｚｙ−１ｌｌｏ
ｌ 、 Ｒｅ ｌ ａ↓。 紅組」娃ユ胆１ユ）、井： ２２１−２９６（ｂ９６９
） 、及び“ザ・ケミストリー・オブ・ポリペブチトス
（Ｔｈｅ Ｃｈｅｍ−ｓｔｒｙｏｒ Ｐｏ１ｙｐｅｐｔ
ｉｄｅｓ）”（Ｐ、Ｇ、Ｋａｔｓｏｙａｎｎｉｓ ［）
、３３６−３６１頁、プレナム、ニューヨーク（ｂ９７
３）に記載されている。この方法の実験室的観点はＳＬ
ｅｗａｒＬ、Ｊ、Ｍ、等、“ソリド・フェーズ・ペプチ
ド・シンセシス（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉ
ｄｅ ５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）”、フリーマン、ジンフラ
ンシスコ、カリホルニア（ｂ９（Ｔ９）に記載されてい
る。 この合成は、Ｃ−末端アミノ酸として、ベンジルエステ
ルによりポリスチレン樹脂に共有結合により連結されて
いるＮ−Ｌ−プチルオ；１−シカルボニルー■２−セリ
ン（０−ベンジルエーテル）（商業的に人手できる）を
用いて行った。この合成（，１、トリフルオ「ｌ酢酸に
よるα−アミノ基からの保護基の除去、シイツブ１゛ｌ
ピルエチルアミンによるトリフルオし１酢酸１！！の中
和及びカルボジイミ１′による次のＮ−１−ブヂルオキ
シ力ルボニル保護アミノ酸のカップリングから成る反復
循環法である。 すべてのアミノ酸誘導体及びすべての試薬は商業的に人
手可能である。 合成中、ずなわら各反応（脱保護、中和及びカップリン
グ）の後に、樹脂を十分に洗浄する必要があった。樹脂
を適当な有機ン容削、例えばジク１１０メタン、ジオル
（Ｊ・ン及びジメチルホルム了ミドにより洗浄した。 システィンはｐ２１蛋白質のアミノ末端から処置１６又
は１７位には天然には存在しないが、次にペブチ１を免
疫のためにａ・要な蛋白￥ｒ１！Ｌ体に連結することが
できるようにこれらの位置の間にシスティンを導入した
。 少量のアニソールと共に液体弗化水素にまり樹脂からペ
プチドを切断した。切断されたペプチドを、＋ｆｉｌ
ｌ１ｉｉから２Ｎ水性酢酸中に抽出し、そして凍結乾燥
した。１ｇの空気乾燥ペプチド−樹脂から３３９ｍｇの
ネ１１ペプチドが得られた。 精製のため、ペプチド（ｂ００ｍＢ）を５ｍｌの２ＮＩ
Ｉｉｌ酸中ジチオスレイトール（３０町）の溶液で処理
し、そし゛（２Ｎ酢酸中で１５０ｍ７！のヘノトボリウ
Ｊ、のｌ、１１セファデックスカラム−１＝でり［１マ
ドグラフ処理した。ペプチドの大部分を含有する両分を
一緒にし、そして凍結乾燥した。合計５６１１Ｉｇのペ
プチドが回収された。 アミノ酸の均一性を逆相１１ＰＬｃにより、及びペプチ
ドの加水分解物のアミノ酸組成により試験した。 これらのペプチドのキーボールリンベットヘモシアニン
（Ｋｌ、１１）への又はウシ血清アルジミン（ＩｉＳＡ
）への接合番、Ｉシスティン残基中のスルヒ］リル基を
介して行った。へテロ２官能架橋剤１−ヒト１」キシ−
２−二トに１ヘンゼン−４−スルホン酸り゛トリウム塩
のＮ−マレイミド−６−アミノカブｌ：ｌ ４ルエステ
ルを、次の方法により調製した。 ｌ；［ル当ｋｒｉ （２，２４ｇ）の４ ヒ１１１＝ｌ
−ノ ３ ニトロヘンビンスルボン酸（ＩＩＮｓＡ）−
ノ°１リウｌＪムを、２５ｍ１のジメチルホルＪ、アミ
Ｆ（［１り中１モルゝｌ１ｂｔ （２，０［ｉｇ）のノ
ックＩＩ−＼キシルカルボジイミＩ及びＪモル当−（２
，ｆｉｌｅ）のＮ ゛ンレイミ１−６７ミノカプロン酸
と室温において一夜混合した。シシクｒ１へ−１−シル
ＬＮ索の白色沈澱物が４１成した。沈澱を濾過し、イし
−’（３［１０ｍ ｅのジエチルエーテルを母液に加え
た。約１０分間〜４時間の後、ＩＩＪ Ｍからガム状固
形物が沈澱）１−成した。この固形物
【１５８％のン占
性ＩＩ Ｎ Ｓ Ａエステル及び４２％の）￥［１ＩＮ
Ｓ八を含イ１することが見出さ才′また。 分析は、少１ｊ１Ｑ）７Ｊ：帷をリン酸緩衝液（ｐｌ＋
７．０ ＞に溶解しそして４０ ［ｉ ｎ ｍにおｉ
Ｊる吸収を測定することから成り、この読めか＋１ Ｎ
Ｓ Ａエステル欅晶中のｌｌｉ染物質である未反λ１
−１遊１ａｌｌｌＮｓＡｖｉをもたらす。＋１常に少量
の１強塩ノル（例えば５Ｎ Ｎａ０ｌｌ）が形成された
エステルを激しく加水分解し、そして第２の読みが得ら
れる。第２の読ゐから第１の読みを引いたものが最初の
物質中のエステルの量をＩＩえる。次に、固形物をＤＭ
Ｆに溶解し、そしてＬ １１２０セフアデツクスカラ１
、−１−に置き、そし’ＣＤ Ｍ Ｆで溶出して７’ｉ
染遊ｊｌｌｌｌＮｓＡからエステルを分ＡＩ［する。精
製の進行を、りし１０ホルム、アセトン及び耐酸（６：
３：ＩＶ／Ｖ）から成る溶出剤を用イルｅＶ Ｉ（ｉ
りｔ：＋７トグラフイーにより監視した。？１成物を、
それとアミンとの反応により…ａｌ−ｓａｃ ｌｌＮ５
Ａエステルきしで陽性同定した。純粋なエステルの収・
ｌｉｔま理１余Ｍの約３０％であると算定され、精製さ
れた物質は９９％のエステルから成っζいた。 ごう＋７て得られたエステルは水に十分に溶解すること
が見出され、そして親核性物質が１４−えられなければ
数時間にわたって水中で安定であることが見出された。 ＩＮアンモニアに入れた場合、エステルは対応するアミ
ドを生成し、一部分は遊離酸に加水分解する。精製され
たエステルばデシケータ貯蔵した場合延長された期間に
わたっ゛（安定であることが見出された。 約０．５ｍｇの精製されたｍａ ｌ −５ａｃ−ｌｌＮ
５Ａエステルを１ｍｌの蒸留水に溶解した。この溶液の
１ｏｉｔＩ！のアリニ１−トを１ｍ７！の１０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐ１１７．０）中に溶解した。４０６ｎｍに
お番」る吸収を用い°ζ、１−記の、１−うにして１Ｈ
１ｌｕｓＡの？７４度を蟲１算した。 ５（ｌ ＩＩ ｌの４．８ Ｎ水酸化すＩ・リウム溶液
をエステルの稀釈されたアリコートに加えそして撹拌し
た場合、４０［ｉｎｍにおける溶液の吸収が有意に増加
し、水酸化物親核物質がエステルを構成酸と１ｎｌｉｉ
ｌｌｌｌＮｓＡ陰イＪン上に急速に加水分解したことが
示された。 Ｊ工！基で処理した後の遊＾旧ｌＮ５Ａ澹１度と最初の
遊離１１ＮｓＡ流度との差がｚｌ−ステルの濃度を示す
。 エステルとｉｌｆ白′ａアミノ基との実際の流度から、
所望の程度の：６換を達成するために蛋白質溶液に加え
るべきエステルｍをｄ１算することができる。 次に、精製さ相だＩＩ Ｎ Ｓ Ａエステルを次のよう
にし’（ＩＩ Ｓ八と反応−〇しめた（Ｋｌｌｌとの反
応はこのツノ法と同様Ｃあった）。 合１ｆｉ２２ｍ（Ｈ（２０！７＋１１０１（＋） （７
）ｔ３ｓＡ （分子量６６．２９（ｉ） を２． Ｏ
ｒｎ ｌの００１ｈリンＭ緩ｆ＋ｉ？（ｌ ｒｐｌ＋
７５）Ｇこ溶解してｌｈ、Ｒｊアミン淵濃度１． ＯＸ
１０ ′ｍｏｌ＋！／ ｅ（ａ１］リジン／ ｒ３
Ｓ Ａ分子と仮定Ｊる）とした。 １算されたｆｆｔ （Ｉｌｍｇ、２．３５ Ｘ １０−
５ｍｏｌｅ）の粉末状の上記のようにして調製されたｍ
ａｔ−ｓａｃ ｌｌＮ５Ａエステル（９７，７％純度）
を２、ＱｍＡの前記ＢＡＳ溶液に溶解した。室温にて反
応を行った。時間的間隔をおいて溶液からｌＯμｌのア
リコートを取り出し、そしてそれぞれをｌ、Ｑｍ７！の
Ｏ，０１Ｍリン酸緩衝液（ｐｌ＋ ７．０ ＞ に稀釈
した。各稀釈されたアリコートのスペクトルを、ヒユー
レット−パラカード分光光度計を用いて記録し、そして
４０６ｎｍにおける吸収を測定した。次に、合ｉ＋５０
ｐ １の４．８Ｎ Ｎａ０１ｌを各了りコートに力ｌ
え、各７リコートを混合し、そしてそのスペクトルを再
録し、そして４０６ｎｍにおける吸収を測定した。結果
を第１表に示す。 反応混合物について、塩基の添加の曲後の４０６＋＋Ｉ
１１における吸収から、残括エステルの濃度及び反応し
たエステルのパーセン１−を決定した。このＬｌは、反
応速度が１５分間にわたって実質」−直線的であること
示している。 反応時間の１５分間において、０．１ Ｍリン酸緩衝Ｗ
Ｅ （ｐＨ６，（ｂ）により平衡化したｐｎｔｏ脱塩セ
ファデックスＧ−２５カラＪ、（ファルマシア社）に反
応混合物を適用することにより反応を停市した。 ２．６ＸＩＯ−〜ｏｌｅ／ｊ！のエステルが反応してそ
してＢＳＡの２５．９％のＣ−７ミノ基がおそら＜置換
されたことが見出された。 ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｂ＋ｌｌ ６．０ ）により平
衡化されたｐｏｌｏ脱塩セファデンクスに−２５カラＪ
、に反応混合物を適用することにより、第１反応の７１
Ｅ成物ｍａｌ−ｓａｃ−ＲＡＳ（又はｍｏｉ−ｓａｃ−
Ｋｉｌｌ）を単離した。カラムを０． Ｉ Ｍ ＩＪン
酸緩衝液（ｐＨ６，０）に、１、り溶出し、１、Ｑｍ／
ずつの両分を１１だ。カラム溶出に続き吸収スペクトル
を監視し、そしてｍｏｌ−ｓａｃ ＩＩｓ＾を含有する
ビーク画分をプールした。上記のようにしく４０） て合成されたシステイン含有テトラデカペプチド１８ｍ
ｇを加え、そしてプールされた混合物を室温にて一夜攪
拌した。接合体を蒸留水に対して十分に透析しそして凍
結乾燥し、そしである場合にはアミノ酸ｋＪｌ成の変化
について分＋Ｒした。 Ｂ、抜血虚■里製 ニュージ−ランドホワイトラビットを、フロイント完全
アジュバント中ペプチドの１＜ １．、 Ｉ＋誘導体１
／２ｍｇの末梢リンパ節注射、及びそれに続く２週間後
のフロインド不完全アジュバント［旧７２ｍｇの皮下注
射（ｓｕｂ、ｑ、）により免疫した。３週間の間隔で３
回の追加の１／２Ｂ ｓｕｂ、ｑ、注射を行った。１箇
月後に１／２ｍｇずつの３回の静脈内追加免疫を４０間
隔で行い、そしてこれらの研究に使用する血ＩＮサンプ
ルを１１日後に採取した。 Ｃ０坑体価を測足工Ａ人竺■胚１鍾アノ詔並９６ウエル
イムロン■プレートを４℃にて、適切なＴ３ＳＡ−ペプ
チド接合体の２５０１’ｇ／ｒｒ＋２溶液５０μｐ （
ウェル当り）をコートした。ウェルをＰ ｒ３ Ｓ −
）ウィーンで洗浄した後、試験すべき抗血清の稀釈物を
添加し、そしてイン４” ｊ−ヘーンヨンを室温にて２
〜３時間行った。さらにＰＢＳ−トウィーン洗浄を行っ
た後、Ｉ／＋０００（吊釈のヤギ抗−ラビットｌ１（Ｇ
（パーオキシダーゼ接合体）をＪＪｌｌえ、そし”（室
温Ｇこ″Ｃ１時間インニドｊ、へ−１した。 １５ ｒ３ Ｓ −１ウイーンでさらに洗浄した後、パ
ーオキシダ−ゼジ、ｖ’＜ｃ＾ＩＩ ’ｒ Ｓ、シグマ
）をＪ川え、そして３０分間後によゾｔ１７７ＩｆｌＩ
った。 １）、抗体の７？−イ子ディ＝槓製 ペプチドＩＩｓへ接合体が共有結合的に連結され′ζい
るリアクチ−ゲル（ｌｌｅａｃｔｉ−Ｇｅｔ）アフィニ
ティーカラムに血清を通ずごとにより位置１２ 特異的
ｂ’ｃ体で非特異的抗体から分離した。（０置１２にセ
リンを有するベプチ１に対して生成した抗血ｌ＾“の場
合には、この位置にグリシノを有するペゾチ１゛をアフ
ィニティーカラムによ１いて使用した。このアフィニテ
ィーカラムに結合し４１′い抗体が４＋７ ：Ｒ１２の
セリンに幻する特異性を有′４るごとがＩｉｌ、ＩＳＡ
に、Ｌり判定された。このカラムからの’／ｋ Ｊｌ！
Ｉ ’ｌ勿を、位置１２にセリンを有するペプチｌが共
有結合的に連結されている第２カラＪ、に通した。この
カラＪ、に結合した抗体を５０１１ＩＭグリシン・Ｉｆ
ＣＩ！（ｐＨ２，５）で溶出し、Ｉ／２０Ｘリン酸緩衝
化塩溶液（ＰＢｓ）に対して透析し、そして真空下での
遠心によりｌ） Ｉ’３ Ｓ中１０ｍｇ／ｍ／の最終濃
度に濃縮した。 Ｅ、ｊｋ四鹸走洟−ｐｈｉ蛋口賢ｑ免咬沈澱ｒ＋２１蛋
白質を沈澱−〇しめるＩＪ）−ペプチド抗１ｆ１【清の
能力を第２図に示す。この図は５ｒｌＳ−ＰＡＧＥゲル
のオートラジオダラムである。 この例においては、位置１２にセリンを含有することが
知られている形のｐａｌ蛋白質を免疫沈澱・ｕしめるた
めに抗体を用いた。この蛋白質は［）。 ：トリ （旺ｃｏｌｊ）発現ｖ４ｉ−ｒａｓ ｐ ２＋
蛋白質であり、この蛋白質はＭ、 ｌｎｏｕｇｅ、す′
ニー、スト−ニーブローク、ニューヨークにより造成さ
れそしてここから人Ｔ’−したプラスミドｐｌＮ ＩＩ
Ｉ−ｒａｓを用いてｊｌＡＩ！！された。このプラスミ
ドにおいては転′りが１−〇プロモーターに、しり指令
される〔マツイ、Ｙ８等、エクスペリメンタル・マニピ
ュ１）−ソヨン・オシ・ジーン・エクスプレッション（
ｌｉｘ１＋ａｒｉｍｅｎＬａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉ
ｏｎ ｏｒ Ｇｅｎｅ ｌ１ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、Ｍ
、 ＩｎｏｕｇｅｌＪｊ、アカデミツク・プレス、ニュ
ーヨーク、＋５−３２１１（ｂ９８３）） 、 ２ ｍ
Ｍイソブ「Ｊピルチオガラク１シ１により培養物を処理
することによりこの蛋白質の発現を誘導ｊる。細胞ペレ
ットを、５０ＩＩＩＭグル：Ｊ−ス、２５ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ ・１ｌｃ１（ｐＨ８，ｏ） 、Ｉ ０ｍＭｌ０Ｔ
Ａ、２ ｍｇ／ｍ７！リヅチーム及び０．０１％アゾ［
１チニンを含む溶液中に再懸濁し、そして４°ににて３
０分間インキュへ−ｌした。トリトン に５分間にわたり１％濃度に加えた。１０分間１５、
００（ｌ ｘ （Ｈで回転した後、１−清をさらに２時
間１５０、０００ｘ ｇで回転して透明な細胞７容解物
を調製した。透明な細胞溶解物の１０μ！の１ノンプル
を、４０μＣｉ”Ｉ’ ｒ−ラベルグアノンン１ーリポ
スフェ−Ｌ （ＧＴｌｌ）と」（に３７°Ｃにて３０分
間イア ’Ｆ ｘ ヘ−１・した。ご４９らの抽出物の
２５μｐのアリ−１−１を、０． ２ １１ ｇのドに
記載する対照モノク＋：ｒ −−Ｊ”ル抗体Ｙ１３−２
５９、Ｉ（ｂ／Ｉｆの抗ｐ２１”’ 、Ｉ Ｏ ｐｌ！
θ月Ｊ’ｌ： ｐ２１”’ 、又はＩ Ｏ ／７ ７
！（！ＩＩＩＩＪＬｐ ２ｐｉ＋ ｙ（ ｉ多りのｆｉ
ｌｌ ン／；はそれぞれ×がバリン又はグリシンである
第１図のペプチドと同一のペプチドに対して４１．、成
したものである）とインキュへ一部シた。 このインキュベーションは、０．０５％ＳＤＳ、２ｍＭ
ジチオスレイトール、０．５％ＮＰ４０、５０ｆｆ１Ｍ
Ｔｒｉｓ・Ｉｔ（ｂ （ｐｌ＋８．０）、及び１２０
ｍＭ ＮａＣＩｌから成る部分的変性緩衝液の存在下
で行った。１時間後、免疫複合体を１０μｌのプロティ
ンＡセファロースビーズ−にに集めた。このビーズはＹ
］３−２５９及びラソ１− １ ｇ Ｇを用いる反応に
おいては、フプイニティー精製したヤギ抗ーラソトＩｇ
Ｇでプレコートしておいた。免疫複合体を０．５％ＮＰ
４０、ＩＭ Ｉ、ｊＣｌ、５ ０ｍＭ Ｔｒｉｓ ・
１１ Ｃｌ （ｐＨ８．０）及び＋２０ｍＭ Ｎａ
ＣＩｌを含む溶液で洗浄し、そしてＳＯＳ−ＰＡＧＥに
より分析した。こうして得られたゲルを紙Ｊ．＋１−．
で乾燥し、そして標準的オートラジオグラフ法によりフ
ィルムハ」二に置いて第２図を得た。この図はこれらの
分析の結果を示す。左側の対照は、この特定の形のｐ２
１蛋白質を免疫沈澱することが知られているモノクロー
ナル抗体ｙ＋３−２５９ （スローン・ケソタリンゲイ
システィテユート、ファーストアベ、二ュ−”ｌ−り、
Ｎ． Ｖ （Ｊ） Ｍａｒｋ Ｉ’ｕｒ Ｌｈから送ら
れたもの）に関する。Ｐｕｒｌｂ 、 Ｍ．等、ジャー
ナル・オシ・ビロロギーリュ■’Ｈ７ｑ１．）、 ４３
： ２９４ ３０４（ｂ９８２）。第２図は、３種の試
験した血ｔ＃の内、この形のｐ２目Ｈ白質と反応するの
はセリン含有ペプチドに対して生成した血清のめであっ
た。従って、この抗体（Ｊ蛋白質の１個のアミノ酸の変
化を識別するごとができる。 免疫沈澱についての他の実験において、バーヘイ（Ｉｌ
ａｒｖａｙ）肉腫ウィルスＤＮＡ（ｖ−１１ａ−ｒａｓ
）又は−トルステン（ＫｉｒｓＬｅｎ）肉腫ウィルスＤ
ＮＡ （ｖにｉ ｒａｓ）により形質転換された咄乳動
物細胞をｐ２１抗原の入手源とし°ζ使用した。前者の
細胞（ＫＰ６と称するＲａｔ−２線維４細胞系）はフメ
ックスーチュージキャン勺ーイシスティテユ−１・、７
７０１ハーポルムアへ、フィラデルフィア、ＰＡ １９
１１１のＭｉｋｅ Ｋｒｅｉｇｌｃｒ博士から贈られた
ものである。後者の細胞（にｈａｌｂ）はアメリカン・
タイプ・カルチュアー・二ルクソヨン、＋２３０１パー
クラウン１′ライブ、〔１ツクビル、Ｍ１１２０８５２
−１１１Ｇから八ＴＣＣ−ＣＣ１． １６３．３（Ｋ
２３４）としく４６） て人手したものであり、そしてクリステン不ズミ肉腫ウ
ィルス形質転換Ｂａ１ｂ／３Ｔ３、非生産株として記載
されている。後者のｌｊＺ養物にネズミ白血病ウィルス
のエコトロープ株を感染さ−ｌてシーＫ ｉ −ｒａｓ
ｐ２１の発現を増加した。これらの形質転換された細１
抱の車面を、５０ｍｍのプレーＩ−当り２μＣＩの無担
体無機リン酸により３７℃にて４時間代謝的にラベルし
、そして抽出物を、界面活性剤としての１％トリトン シ：Ｊ Ｉ／ − ト及びプロテアーゼＩｆｆｌ害剤と
しての０．０１％アプロチニンを含むＰＢＳ中に調製し
た。ｖ−１１ａ−ｒａｓ ｐ２１ （位置１２にアルギ
ニンを有する）又はシーＫｉ−νａｓｐ２１（位置１２
にセリンを有する）を含有するこれらの抽出物の了りニ
＋−１・を、室温にて１時間、０．２５μｇのうｙ Ｌ
ｌ ｌ； （Ｊ、５ｔｔｇの免疫Ａｉ■ラビット血？
Ｎ、又は５μｇのアフィニティー精製抗−ｐ２１″″′
抗血清〔ずなわら、位置１２にセリンを有するペプチド
に対してη−成しそして」二記のアフィニティークロマ
１グラソイ−（ここで、アフィニティーカラムに使用さ
れるペプチドはｐ２＋蛋白質の位；６１２に対応するア
ミノ酸としてグリシンを有する）により精製した抗−ｐ
２＋２′抗体〕と反応−ｌしめた。反応は、１；記と同
し部分的変性条件下で行ったが、ＳＦ）Ｓの使用量は０
．０５重量％では４ｆく０凹％とした。免疫複合体をプ
ロティンＡセファロース上に集め、洗浄し、そして第２
図に関してに記した標準的オートラジオグラフ法を用い
てＳＯＳ−ＰＡＧＥにより分析した。オートラジオダラ
ムである第３図において、最右レーン上の対照（ｂ分子
量標準であり、その次の対照レーンは免疫ｉ；ｉのラビ
ット血清に関するものであり、そして各群の左側の２本
のレーンはそれぞれ１−記のモノク１コーノール抗体Ｙ
］３−２５９及び対照としてのＲａｔ ＩｇＧに関する
。第３図はセリン含有ペブチｌ′に対して生じた血清＋
１位置１２にセリンを有するキルステン肉腫ウィルスの
ｐ２１を免疫沈澱せしめることができるが、この位置に
アルギニン残基を有するバー−・イ肉腫ウィルスのｐ２
１を免疫沈澱−〇しめることができないことを示してい
る。同しＩＡ血清が位置１２にグリシンを含有するｐ２
１蛋白質と反応することが見出されなかった。ＳＤＳ又
はデオキシコレートによる部分変性の非存在下では免疫
沈澱が生じなかった。 この結果は、位置１２のアミノ酸残基（セリン）がｆｊ
’ｃ−ｐ２１”’エピトープ中に含まれることを示して
いる。さらに、抗−ｐ２１ｓｅｒは、ユアツ、Ｙ等、ネ
イヂュアー（ＮａＬｕｒｅ）、３侃−、７７５−７７９
（ｂ９８３）により記載されたセルラインｈｓ ２４
２からの、位置】２にグリシンを含有するｐ２１（正常
ｐ２１）と反応しなかった。 抗−ｐ２＋ｓｏ’抗体はまた、インーヒトＩ−１実験に
おいてシーＫｉ−ｒａｓ発癌遺伝子生成物のオートホス
ホリレーシシンを阻害することが見出され、位置１２を
含むｒ．２１蛋白質の部分がｐ２１蛋白質とＧＴＰとの
相互作用に関与することが示された。 Ｅ．コリ発現ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ ｐ ２１の抽出物を、
」二記０：）ｂｃｐ２１ｓｌｌｒ抗体、又はＹ １３−
２５９モ／クロ一ナル抗体により免疫沈澱セしめ、そし
て得られた免疫複合体を１０μＣｉ”Ｐ γーラベルＧ
ＴＰと共に３７°Ｃにて３０分間インキュへ一部シた。 免疫複合体をプロティンＡセファロース上に集め、洗浄
し、Ｓ １１ Ｓ − ＩＩ Ａ Ｇ Ｉシで分析し、
そして−１−記の標準的オートラジオグラフ法にかＬＪ
た。この結果、ｔ＋’Ｌ ｐ２１”’免疫複合体におい
てはオートホスホリレーシジンが生しなかった。これに
対して、Ｙ １３−２５９モノクロ一ナル抗体により免
疫沈澱したＥ．コリ生産ｐ２＋は活発にリン酸化された
。両物質のオートクジオグラフである第４図へを参照の
こと。あらかしめラベルされたｐ ２１ Ｌｌ使用され
た条件ドで効率的に免疫沈澱した。すなわＩハオーＩ・
ホスホリレーシジンの欠７ｋ １；ｌ酵素活１’Ｊのｌ
ｕｌｌ害及び血清がｐ２１に結合したごとの結果ごあっ
た。 ■う．コリ発現Ｖ Ｋ１−ｒｎｓからの合ｉｊ１２５７
！ｅの抽出物をまずＩｏｏｍＭ Ｎａｆ：Ｉ！ 、５ｍ
Ｍ ＭｇＣ／！ 、及び５ （］ ｍＭ Ｔｒｉｓ
・ＩＩＣｉ２ （ｐｌ目（、０）に調整し、そして得
られた免疫複合体をＩｎ，ｕＣｉのＴ−ラベル（’，
”Ｆｌ）と共に３７℃にて３０分間イン−１−ユヘ−１
した。 次に、抗−ｐ２Ｉｓ″′又４．１． Ｙ Ｉ ３ ２５
９モノクｌ二ｒ−リール抗体との免疫沈澱を、上記と同
し条件下で行った。 この免疫沈澱物を５Ｏ５−ＰＡＧＥ上で移動せしめ、そ
し゛ζ上記のようにしてオートラジオグラフィーに力）
り第４図Ｂを得た。 第４図Ａは、Ｅ、コリにより生産されたｐ２１”’抗体
のＧＴＰ−依存オートホスホリレーションがＪｊＣ−ｐ
２１″″′抗体による免疫沈澱後に完全に除去されたこ
とを示している。これに対して、ｐ２＋蛋白質は、ｐ２
１蛋白質によるＧ Ｔ ｌ）の加水分解を阻害しないこ
とが知られている対照モノクローナル抗体Ｙ １３−２
５９による免疫性＆ｉ後に効率的にオートホスホリレー
トされた。しかしながら、免疫沈澱に先立ってｐ２１が
リン酸化された場合、両抗体はラベルされたｐ２１蛋白
質を効率的に沈澱−υしめることが認められた（第４図
Ｂ）。 従って、ｖ４ｉ−ｒａｓ ｐ ２１への抗−ｐ２１ｓｅ
ｒの結合がｐ２１オーｌボスホリレーションのＩＭＩ害
をもたらした。この結果のほとんど確実であると越えら
れる説明は、抗体が同し部位での結合に関してＧ Ｔ
Ｐと競争することである。 Ｇ、 坑ニーＰ−？」で！乏 免役−り！−７こり一ン
−（４髪擾９丁Ｉ゛粘合Φ１１１賓 ｌ１記の結果をｆ６認し、そして抗体が位置５９のスレ
オニンへのリン酸の移動ではなくむしろＧ′ＵＰの結合
をブロックすることを決定するために、発明者はモノク
［Ｉ−リ′ル抗体すンクドイムノアブヅープションアソ
セイにおいて、ｐ２＋蛋白質へのα−”ＰｄＧＴＰの結
合を直接ブロックする抗−ｒ＋２１”’抗体の能力を試
験した。 Ｅ、コリ中で生産されたｖ Ｋｉ−ｒａｓ ｐ２１を、
ピースケミカル社から１１１られるリアクチゲルビーズ
に連結された千ツク１−１−ナル抗体ＹＩ３．２５９２
μｌにより免疫沈澱−ロしめた。免疫複合体を、０．５
％Ｎ １１４０．５０ ｍＭＴｒｉｓ −ｌＩＣ１（ｐ
Ｈ８，０）、ＩＭＩ、ｉＣ／及び１２０ｍＭ ＮａＣ
７！の溶液により洗浄した。この洗浄された摺合体を、
０．５％トす［・ンＸ−１００，０，５％デオキシコレ
−１・、１５０ｍＭ Ｎａ（Ｊ！ 、５０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ ・１１ｃＬ！ （ｐＨ７，５）、５ ｍＭ
ＭＢ（Ｖ ｚ 、０．１ｍＭ Ａ Ｔ Ｐ及び２ｍＭＤ
ＴＴを含む溶液中で、４°Ｃにて１時間、抗−ｐ２１ｓ
ａ′抗体又は非免疫正常ラビノ１−免疫グ■プリンの添
加を伴ってインキュベートした。これらの免疫複合体を
洗浄し、そして］０００ｍＭＮａＣ１，２０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ ・ＩＩ（Ｊ （ｐＨ７，２）、５ｍＭ Ｍｇ
Ｃ１！ ｚ 、１％トリトンＸ−１００及びＯ，］ｍＭ
Ａ Ｔ Ｐから成るＧＴＰ結合緩衝液中に、４〜］０
ｘＩＣｉのα−ラベル３２ｐｄＧＴＰ （０，２〜０．
５２．１７Ｍ 、８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の添加を伴っ
て４℃にて３０分間再懸濁した。次に、免疫複合体をＧ
ＴＰ結合緩衝液中で洗浄し、そして液体シンチレーショ
ンカウンター中で１赦した。結果を第５図に示す。この
図は、各タイプの抗体対照（抗体無添加）について、ｐ
２１蛋白質へのＧＴＰの結合％を、各抗体の濃度の関数
として示したグラフである。データ点は、抗体を添加し
ない対照に対する５個の測定の平均を示す。 抗−ｐ２１″″′抗体で処理した後、免疫沈澱したｐ２
１蛋白質に結合するＧＴＰは５分の１に減少し、他方、
対照非免疫抗体については減少は見られなかった。これ
らの結果から、ｐ２１蛋白質上の抗−ｐ ２１”’結合
部位がＧＴＰ結合部位とオーハーラソプしているようで
ある。これに代る説明は、抗体４．１． Ｇ ’ｌ”
Ｉ’結合部（☆から幾らか餡れて結合するが、１■白質
の３次構成を撹乱するごとに、ＬってＧ ｉ’ ｌ）結
合を変化−１しめることである。第１の説明の力が確か
らしい。なぜなら、ｆｉｌ Ｐｕ５ｈ等、前掲、は、種
々のｐ２１決定基に対して向けら、？１だボリクＩ’ｌ
−ナル血清及びモノクＩ＋ −−ノ°ル抗体の両刃が
Ｇ ＴＩ１結合を許容することを見出しており、そして
ｌ＋１本発明者等は、Ａｉ ＱＮ度（ｂ（ｂｍＭ）のＧ
Ｔｌ）（ＬかしＡ ＴＩ）ではない）がρ２１蛋白質へ
の）九 ｐ２１ ＆ｏｒ抗体の結合を実？Ｊ、ＬＪｌ害
するごとを見出したからである。この発明はこれらの説
明のいかんにより限定されない。 これらの結果は、（装置１２のアミノ酸の変化がいかに
してｐ２１蛋白質を発癌的に活１／１化することができ
るかという問題に答えている。ｆ０置１２を認識すると
抗体によるＧ Ｔ Ｐ結合のブロックが、このアミノ酸
がｐ２１とＧＴＰとの相互作用に関１）すること、及び
この相互作用の変化が蛋白質の発癌能力に直接的に寄り
−するであろうことを強く示唆している。 （ａイ） （＋！！−−−ぺ− 」１記のように＾ＴＣＣからＮｏ ＡＴＣＣＣＣ１，１
６：（，３として得られたキルステン肉腫ウィルスによ
り形質転換された正常ラット腎（ＮＲＫ）細胞（Ｋ−２
３４）に、抗、２１ｓａｒを、アフィニティー精製した
抗体５ｍｇ／＋ｎｉ！？８液としてマイクロ注入した。 −１−ルステン肉腫ウィルスは、位置１２にセリンを有
するｐ２１の生産によって細胞を形質転換する。注入し
て１２時間後、注入された細胞は形態学的に変化し、そ
して今や正常な非形質転１＃！ＮＲＫ細１１（すに類似
することが認められた。３０時間後、細胞はその１−分
に形質転換された状態に復帰した。対照とし゛この非免
疫正常ラビット抗体は効果を有しなかった。 位置１２にアルギニンを有するｐ２１により形質転換さ
れた細胞への抗−ｐ２１”’抗体の１１人４）また効果
を有しなかった。このことは、抗−ｒ、２１′″″ｒが
、形質転換された表現型、ずなわら蛋白質の既知の生化
学的性質を１徂害し、他方、非免疫正常抗体はそうしな
いことを示している。 」１記のマイクロ注入実験を反復した。この新たな実験
においては、注入された細胞は注入後２４時間（第６図
ｂ）で形態学的に変化することが認められた（第６図ａ
は０時間における細胞を示す）。 注入後３６時間において、注入された細胞はなお一層変
化し、正常な非形質転換フラノ）、 Ｎ ＲＫ細胞に類
偵した。対照としての正常非免疫ラビット抗体は、第６
図ｄ−ｆに示すように、形質転換された細胞に影響を及
ぼさないことが見出された（ｄは０時間の状態を示し、
ｅは２４時間の状態を示し、そしてｒは３６時間の状態
を示す）。最後に、細１１：ｑ ｃ、＋その１−分に形
質転換された状態にｔＭ帰したが、それら番Ｊなお生存
していた。 要約４′れば、この発明は、蛋白質の１個のアミノ酸荀
；ｄにお番ｊるアミノ酸の置Ｉ負を識＞１ｌｌ−ｄるご
とかできる１１°Ｌ ベゾチ１抗而清（抗体）を提供す
る。 従ってこの抗体は、ヒ１の癌をｌｊ当する発癌遺伝子イ
１ニ載物の存７Ｉを検出′４るため、又番、■診断的用
途のために使用することができる。例えば抗 ｐ２＋Ｉ
Ｊ’ｌ： １１１１清中に抗体を４１．成するであろう
幾つかのペプチドを合成することにより抗体が調製され
、この＜５ｆｉ） ペプチドは正常ｐ２１蛋白質のアミノ酸５−１７を含有
し、但し位置１２のグリシンがバリン、セリン、アルギ
ニン、システィン、アスパラギン酸又はアラニンにより
置き換えられており、そしてＣ−末端へ２番目の位置に
システィン残基が挿入されている。前記の抗体を生成せ
しめるためには他のペプチドが必要であろう。抗体によ
り免疫沈澱されるべき蛋白質は一般に蛋白質のエピトー
プが露出するように部分的に変性されている。この蛋白
質と接触した抗体はｐ２１蛋白質へのその結合を強化す
るためにアフィニティー精製することができる。 抗−ｐ２１”’抗体は位置１２にセリンを有するｒ＋２
１蛋白質を免疫沈澱することが見出された。さらに、抗
体は、モノクローナル抗体イノ、ノアブゾープションア
ソセイにおいて、ＧＴＰを結合するｐ２１シーＫｉ−ｒ
ａｓの能力を非常に低下せしめる。従って、位置１２に
おける抗−ｐ２１”’結合部位はＧ Ｔ Ｐ結合部位の
部分を含むであろう。これらの結果は、ｐ２１のＧＴＰ
結合及び加水分解活性が発癌性活性化の過程で必須の役
割を演するとする概念を強く支持する。従って、抗−ｐ
２１Ｓｅｒ抗体（４１、インービボ及びインービｌ−Ｉ
Ｉにおりるｐ２１蛋白質の機能のωＩ究のための強力ｌ
ｒ手段として機能するであろう。 ４、 図面の籠１１ム゛説明 第１図は、Ｘで示ず位置１２を包囲するｐ２＋蛋白質の
アミノ酸配列の略図である。この蛋白質の位置１２はペ
プチＩ゛の位Ｗ８に相当する。アミノ酸５〜１７のベプ
チ１゛（位置１６と１７の間にシスティン残基が挿入さ
れている）を、この明細書の例の抗体を製造するために
免疫原として使用した。 第２図は、位置１２におけるｇｌｙ、 Ｓｅｒ 、又は
νａ１ に対して向りられたアフィニティー精製された
抗ｐ２１血ｌＲとＥ、コリ。（ｂ４−ｃｏｊｊ）により
発現されたセリン成分を含有するｖ４ｉ−ｒａｓ ｐ
２１蛋白質との免疫複合体の５１１Ｓ−１”ＡＧＥ分析
のオー１−ラジオグラムである。左のレーンは対照を示
す。 第３図は、位置１２にｓｅｒ及びａｒｇアミノ酸置換を
有する形質転換された吐乳類細胞由来の２種類のｐ２１
蛋白質であって、抗−ｒ）２１”″抗体に、１、り免疫
沈澱したものの５ＤＳ−１１ＡにＥ分析のオートラジオ
グラムである。各群の左の２つのレーンは対照であり、
そして最右側のレーンは分子￥標準である。免疫Ｏ；１
と表示された右から２番ｌ」のシー〉′は、注射１１；
１のラビット血清を免疫沈澱−〇しめたものである。 第４図は、Ｅ、コリ発現ｖ−Ｘｉ−ｒａｓ ｐ２１と抗
−ｐ２１”’又はｐ２＋蛋白質によるＧ Ｔ ｌ）の加
水分解を１徂害しないことが知られているモノクローナ
ル抗体Ｙ１３−２５９ （図中、１元−ｐ２１Ｍ／！ｌ
として示されている）のいずれかとの、Ｔラベルされた
ＧＴＩ）によりラベルされた免疫複合体の５１１８−１
１ＡＧＩＥ分析のオートラジオグラムである。Ａと表示
されたレーンはリン酸化前の免疫沈澱を表わし、そして
Ｂと表示されたレーンはリン酸化後の免疫沈澱を示す。 第５図は、ｐ２１蛋白質に結合するＧ ′ＦＰを対＋１
Ｑ（抗体を添加しない）に対する％として、Ｊ１′免疫
正常ラビット免疫グロブリン又は抗−ｐ２１ｓ′’抗体
（これらはＹ １３−２５９と共に免疫沈澱したシーＫ
ｉ−ｒａｓ ｐ２１に加えら相る）の−に対してゾＩＩ
Ｉノ１したものである。
性ＩＩ Ｎ Ｓ Ａエステル及び４２％の）￥［１ＩＮ
Ｓ八を含イ１することが見出さ才′また。 分析は、少１ｊ１Ｑ）７Ｊ：帷をリン酸緩衝液（ｐｌ＋
７．０ ＞に溶解しそして４０ ［ｉ ｎ ｍにおｉ
Ｊる吸収を測定することから成り、この読めか＋１ Ｎ
Ｓ Ａエステル欅晶中のｌｌｉ染物質である未反λ１
−１遊１ａｌｌｌＮｓＡｖｉをもたらす。＋１常に少量
の１強塩ノル（例えば５Ｎ Ｎａ０ｌｌ）が形成された
エステルを激しく加水分解し、そして第２の読みが得ら
れる。第２の読ゐから第１の読みを引いたものが最初の
物質中のエステルの量をＩＩえる。次に、固形物をＤＭ
Ｆに溶解し、そしてＬ １１２０セフアデツクスカラ１
、−１−に置き、そし’ＣＤ Ｍ Ｆで溶出して７’ｉ
染遊ｊｌｌｌｌＮｓＡからエステルを分ＡＩ［する。精
製の進行を、りし１０ホルム、アセトン及び耐酸（６：
３：ＩＶ／Ｖ）から成る溶出剤を用イルｅＶ Ｉ（ｉ
りｔ：＋７トグラフイーにより監視した。？１成物を、
それとアミンとの反応により…ａｌ−ｓａｃ ｌｌＮ５
Ａエステルきしで陽性同定した。純粋なエステルの収・
ｌｉｔま理１余Ｍの約３０％であると算定され、精製さ
れた物質は９９％のエステルから成っζいた。 ごう＋７て得られたエステルは水に十分に溶解すること
が見出され、そして親核性物質が１４−えられなければ
数時間にわたって水中で安定であることが見出された。 ＩＮアンモニアに入れた場合、エステルは対応するアミ
ドを生成し、一部分は遊離酸に加水分解する。精製され
たエステルばデシケータ貯蔵した場合延長された期間に
わたっ゛（安定であることが見出された。 約０．５ｍｇの精製されたｍａ ｌ −５ａｃ−ｌｌＮ
５Ａエステルを１ｍｌの蒸留水に溶解した。この溶液の
１ｏｉｔＩ！のアリニ１−トを１ｍ７！の１０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐ１１７．０）中に溶解した。４０６ｎｍに
お番」る吸収を用い°ζ、１−記の、１−うにして１Ｈ
１ｌｕｓＡの？７４度を蟲１算した。 ５（ｌ ＩＩ ｌの４．８ Ｎ水酸化すＩ・リウム溶液
をエステルの稀釈されたアリコートに加えそして撹拌し
た場合、４０［ｉｎｍにおける溶液の吸収が有意に増加
し、水酸化物親核物質がエステルを構成酸と１ｎｌｉｉ
ｌｌｌｌＮｓＡ陰イＪン上に急速に加水分解したことが
示された。 Ｊ工！基で処理した後の遊＾旧ｌＮ５Ａ澹１度と最初の
遊離１１ＮｓＡ流度との差がｚｌ−ステルの濃度を示す
。 エステルとｉｌｆ白′ａアミノ基との実際の流度から、
所望の程度の：６換を達成するために蛋白質溶液に加え
るべきエステルｍをｄ１算することができる。 次に、精製さ相だＩＩ Ｎ Ｓ Ａエステルを次のよう
にし’（ＩＩ Ｓ八と反応−〇しめた（Ｋｌｌｌとの反
応はこのツノ法と同様Ｃあった）。 合１ｆｉ２２ｍ（Ｈ（２０！７＋１１０１（＋） （７
）ｔ３ｓＡ （分子量６６．２９（ｉ） を２． Ｏ
ｒｎ ｌの００１ｈリンＭ緩ｆ＋ｉ？（ｌ ｒｐｌ＋
７５）Ｇこ溶解してｌｈ、Ｒｊアミン淵濃度１． ＯＸ
１０ ′ｍｏｌ＋！／ ｅ（ａ１］リジン／ ｒ３
Ｓ Ａ分子と仮定Ｊる）とした。 １算されたｆｆｔ （Ｉｌｍｇ、２．３５ Ｘ １０−
５ｍｏｌｅ）の粉末状の上記のようにして調製されたｍ
ａｔ−ｓａｃ ｌｌＮ５Ａエステル（９７，７％純度）
を２、ＱｍＡの前記ＢＡＳ溶液に溶解した。室温にて反
応を行った。時間的間隔をおいて溶液からｌＯμｌのア
リコートを取り出し、そしてそれぞれをｌ、Ｑｍ７！の
Ｏ，０１Ｍリン酸緩衝液（ｐｌ＋ ７．０ ＞ に稀釈
した。各稀釈されたアリコートのスペクトルを、ヒユー
レット−パラカード分光光度計を用いて記録し、そして
４０６ｎｍにおける吸収を測定した。次に、合ｉ＋５０
ｐ １の４．８Ｎ Ｎａ０１ｌを各了りコートに力ｌ
え、各７リコートを混合し、そしてそのスペクトルを再
録し、そして４０６ｎｍにおける吸収を測定した。結果
を第１表に示す。 反応混合物について、塩基の添加の曲後の４０６＋＋Ｉ
１１における吸収から、残括エステルの濃度及び反応し
たエステルのパーセン１−を決定した。このＬｌは、反
応速度が１５分間にわたって実質」−直線的であること
示している。 反応時間の１５分間において、０．１ Ｍリン酸緩衝Ｗ
Ｅ （ｐＨ６，（ｂ）により平衡化したｐｎｔｏ脱塩セ
ファデックスＧ−２５カラＪ、（ファルマシア社）に反
応混合物を適用することにより反応を停市した。 ２．６ＸＩＯ−〜ｏｌｅ／ｊ！のエステルが反応してそ
してＢＳＡの２５．９％のＣ−７ミノ基がおそら＜置換
されたことが見出された。 ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｂ＋ｌｌ ６．０ ）により平
衡化されたｐｏｌｏ脱塩セファデンクスに−２５カラＪ
、に反応混合物を適用することにより、第１反応の７１
Ｅ成物ｍａｌ−ｓａｃ−ＲＡＳ（又はｍｏｉ−ｓａｃ−
Ｋｉｌｌ）を単離した。カラムを０． Ｉ Ｍ ＩＪン
酸緩衝液（ｐＨ６，０）に、１、り溶出し、１、Ｑｍ／
ずつの両分を１１だ。カラム溶出に続き吸収スペクトル
を監視し、そしてｍｏｌ−ｓａｃ ＩＩｓ＾を含有する
ビーク画分をプールした。上記のようにしく４０） て合成されたシステイン含有テトラデカペプチド１８ｍ
ｇを加え、そしてプールされた混合物を室温にて一夜攪
拌した。接合体を蒸留水に対して十分に透析しそして凍
結乾燥し、そしである場合にはアミノ酸ｋＪｌ成の変化
について分＋Ｒした。 Ｂ、抜血虚■里製 ニュージ−ランドホワイトラビットを、フロイント完全
アジュバント中ペプチドの１＜ １．、 Ｉ＋誘導体１
／２ｍｇの末梢リンパ節注射、及びそれに続く２週間後
のフロインド不完全アジュバント［旧７２ｍｇの皮下注
射（ｓｕｂ、ｑ、）により免疫した。３週間の間隔で３
回の追加の１／２Ｂ ｓｕｂ、ｑ、注射を行った。１箇
月後に１／２ｍｇずつの３回の静脈内追加免疫を４０間
隔で行い、そしてこれらの研究に使用する血ＩＮサンプ
ルを１１日後に採取した。 Ｃ０坑体価を測足工Ａ人竺■胚１鍾アノ詔並９６ウエル
イムロン■プレートを４℃にて、適切なＴ３ＳＡ−ペプ
チド接合体の２５０１’ｇ／ｒｒ＋２溶液５０μｐ （
ウェル当り）をコートした。ウェルをＰ ｒ３ Ｓ −
）ウィーンで洗浄した後、試験すべき抗血清の稀釈物を
添加し、そしてイン４” ｊ−ヘーンヨンを室温にて２
〜３時間行った。さらにＰＢＳ−トウィーン洗浄を行っ
た後、Ｉ／＋０００（吊釈のヤギ抗−ラビットｌ１（Ｇ
（パーオキシダーゼ接合体）をＪＪｌｌえ、そし”（室
温Ｇこ″Ｃ１時間インニドｊ、へ−１した。 １５ ｒ３ Ｓ −１ウイーンでさらに洗浄した後、パ
ーオキシダ−ゼジ、ｖ’＜ｃ＾ＩＩ ’ｒ Ｓ、シグマ
）をＪ川え、そして３０分間後によゾｔ１７７ＩｆｌＩ
った。 １）、抗体の７？−イ子ディ＝槓製 ペプチドＩＩｓへ接合体が共有結合的に連結され′ζい
るリアクチ−ゲル（ｌｌｅａｃｔｉ−Ｇｅｔ）アフィニ
ティーカラムに血清を通ずごとにより位置１２ 特異的
ｂ’ｃ体で非特異的抗体から分離した。（０置１２にセ
リンを有するベプチ１に対して生成した抗血ｌ＾“の場
合には、この位置にグリシノを有するペゾチ１゛をアフ
ィニティーカラムによ１いて使用した。このアフィニテ
ィーカラムに結合し４１′い抗体が４＋７ ：Ｒ１２の
セリンに幻する特異性を有′４るごとがＩｉｌ、ＩＳＡ
に、Ｌり判定された。このカラムからの’／ｋ Ｊｌ！
Ｉ ’ｌ勿を、位置１２にセリンを有するペプチｌが共
有結合的に連結されている第２カラＪ、に通した。この
カラＪ、に結合した抗体を５０１１ＩＭグリシン・Ｉｆ
ＣＩ！（ｐＨ２，５）で溶出し、Ｉ／２０Ｘリン酸緩衝
化塩溶液（ＰＢｓ）に対して透析し、そして真空下での
遠心によりｌ） Ｉ’３ Ｓ中１０ｍｇ／ｍ／の最終濃
度に濃縮した。 Ｅ、ｊｋ四鹸走洟−ｐｈｉ蛋口賢ｑ免咬沈澱ｒ＋２１蛋
白質を沈澱−〇しめるＩＪ）−ペプチド抗１ｆ１【清の
能力を第２図に示す。この図は５ｒｌＳ−ＰＡＧＥゲル
のオートラジオダラムである。 この例においては、位置１２にセリンを含有することが
知られている形のｐａｌ蛋白質を免疫沈澱・ｕしめるた
めに抗体を用いた。この蛋白質は［）。 ：トリ （旺ｃｏｌｊ）発現ｖ４ｉ−ｒａｓ ｐ ２＋
蛋白質であり、この蛋白質はＭ、 ｌｎｏｕｇｅ、す′
ニー、スト−ニーブローク、ニューヨークにより造成さ
れそしてここから人Ｔ’−したプラスミドｐｌＮ ＩＩ
Ｉ−ｒａｓを用いてｊｌＡＩ！！された。このプラスミ
ドにおいては転′りが１−〇プロモーターに、しり指令
される〔マツイ、Ｙ８等、エクスペリメンタル・マニピ
ュ１）−ソヨン・オシ・ジーン・エクスプレッション（
ｌｉｘ１＋ａｒｉｍｅｎＬａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉ
ｏｎ ｏｒ Ｇｅｎｅ ｌ１ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、Ｍ
、 ＩｎｏｕｇｅｌＪｊ、アカデミツク・プレス、ニュ
ーヨーク、＋５−３２１１（ｂ９８３）） 、 ２ ｍ
Ｍイソブ「Ｊピルチオガラク１シ１により培養物を処理
することによりこの蛋白質の発現を誘導ｊる。細胞ペレ
ットを、５０ＩＩＩＭグル：Ｊ−ス、２５ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ ・１ｌｃ１（ｐＨ８，ｏ） 、Ｉ ０ｍＭｌ０Ｔ
Ａ、２ ｍｇ／ｍ７！リヅチーム及び０．０１％アゾ［
１チニンを含む溶液中に再懸濁し、そして４°ににて３
０分間インキュへ−ｌした。トリトン に５分間にわたり１％濃度に加えた。１０分間１５、
００（ｌ ｘ （Ｈで回転した後、１−清をさらに２時
間１５０、０００ｘ ｇで回転して透明な細胞７容解物
を調製した。透明な細胞溶解物の１０μ！の１ノンプル
を、４０μＣｉ”Ｉ’ ｒ−ラベルグアノンン１ーリポ
スフェ−Ｌ （ＧＴｌｌ）と」（に３７°Ｃにて３０分
間イア ’Ｆ ｘ ヘ−１・した。ご４９らの抽出物の
２５μｐのアリ−１−１を、０． ２ １１ ｇのドに
記載する対照モノク＋：ｒ −−Ｊ”ル抗体Ｙ１３−２
５９、Ｉ（ｂ／Ｉｆの抗ｐ２１”’ 、Ｉ Ｏ ｐｌ！
θ月Ｊ’ｌ： ｐ２１”’ 、又はＩ Ｏ ／７ ７
！（！ＩＩＩＩＪＬｐ ２ｐｉ＋ ｙ（ ｉ多りのｆｉ
ｌｌ ン／；はそれぞれ×がバリン又はグリシンである
第１図のペプチドと同一のペプチドに対して４１．、成
したものである）とインキュへ一部シた。 このインキュベーションは、０．０５％ＳＤＳ、２ｍＭ
ジチオスレイトール、０．５％ＮＰ４０、５０ｆｆ１Ｍ
Ｔｒｉｓ・Ｉｔ（ｂ （ｐｌ＋８．０）、及び１２０
ｍＭ ＮａＣＩｌから成る部分的変性緩衝液の存在下
で行った。１時間後、免疫複合体を１０μｌのプロティ
ンＡセファロースビーズ−にに集めた。このビーズはＹ
］３−２５９及びラソ１− １ ｇ Ｇを用いる反応に
おいては、フプイニティー精製したヤギ抗ーラソトＩｇ
Ｇでプレコートしておいた。免疫複合体を０．５％ＮＰ
４０、ＩＭ Ｉ、ｊＣｌ、５ ０ｍＭ Ｔｒｉｓ ・
１１ Ｃｌ （ｐＨ８．０）及び＋２０ｍＭ Ｎａ
ＣＩｌを含む溶液で洗浄し、そしてＳＯＳ−ＰＡＧＥに
より分析した。こうして得られたゲルを紙Ｊ．＋１−．
で乾燥し、そして標準的オートラジオグラフ法によりフ
ィルムハ」二に置いて第２図を得た。この図はこれらの
分析の結果を示す。左側の対照は、この特定の形のｐ２
１蛋白質を免疫沈澱することが知られているモノクロー
ナル抗体ｙ＋３−２５９ （スローン・ケソタリンゲイ
システィテユート、ファーストアベ、二ュ−”ｌ−り、
Ｎ． Ｖ （Ｊ） Ｍａｒｋ Ｉ’ｕｒ Ｌｈから送ら
れたもの）に関する。Ｐｕｒｌｂ 、 Ｍ．等、ジャー
ナル・オシ・ビロロギーリュ■’Ｈ７ｑ１．）、 ４３
： ２９４ ３０４（ｂ９８２）。第２図は、３種の試
験した血ｔ＃の内、この形のｐ２目Ｈ白質と反応するの
はセリン含有ペプチドに対して生成した血清のめであっ
た。従って、この抗体（Ｊ蛋白質の１個のアミノ酸の変
化を識別するごとができる。 免疫沈澱についての他の実験において、バーヘイ（Ｉｌ
ａｒｖａｙ）肉腫ウィルスＤＮＡ（ｖ−１１ａ−ｒａｓ
）又は−トルステン（ＫｉｒｓＬｅｎ）肉腫ウィルスＤ
ＮＡ （ｖにｉ ｒａｓ）により形質転換された咄乳動
物細胞をｐ２１抗原の入手源とし°ζ使用した。前者の
細胞（ＫＰ６と称するＲａｔ−２線維４細胞系）はフメ
ックスーチュージキャン勺ーイシスティテユ−１・、７
７０１ハーポルムアへ、フィラデルフィア、ＰＡ １９
１１１のＭｉｋｅ Ｋｒｅｉｇｌｃｒ博士から贈られた
ものである。後者の細胞（にｈａｌｂ）はアメリカン・
タイプ・カルチュアー・二ルクソヨン、＋２３０１パー
クラウン１′ライブ、〔１ツクビル、Ｍ１１２０８５２
−１１１Ｇから八ＴＣＣ−ＣＣ１． １６３．３（Ｋ
２３４）としく４６） て人手したものであり、そしてクリステン不ズミ肉腫ウ
ィルス形質転換Ｂａ１ｂ／３Ｔ３、非生産株として記載
されている。後者のｌｊＺ養物にネズミ白血病ウィルス
のエコトロープ株を感染さ−ｌてシーＫ ｉ −ｒａｓ
ｐ２１の発現を増加した。これらの形質転換された細１
抱の車面を、５０ｍｍのプレーＩ−当り２μＣＩの無担
体無機リン酸により３７℃にて４時間代謝的にラベルし
、そして抽出物を、界面活性剤としての１％トリトン シ：Ｊ Ｉ／ − ト及びプロテアーゼＩｆｆｌ害剤と
しての０．０１％アプロチニンを含むＰＢＳ中に調製し
た。ｖ−１１ａ−ｒａｓ ｐ２１ （位置１２にアルギ
ニンを有する）又はシーＫｉ−νａｓｐ２１（位置１２
にセリンを有する）を含有するこれらの抽出物の了りニ
＋−１・を、室温にて１時間、０．２５μｇのうｙ Ｌ
ｌ ｌ； （Ｊ、５ｔｔｇの免疫Ａｉ■ラビット血？
Ｎ、又は５μｇのアフィニティー精製抗−ｐ２１″″′
抗血清〔ずなわら、位置１２にセリンを有するペプチド
に対してη−成しそして」二記のアフィニティークロマ
１グラソイ−（ここで、アフィニティーカラムに使用さ
れるペプチドはｐ２＋蛋白質の位；６１２に対応するア
ミノ酸としてグリシンを有する）により精製した抗−ｐ
２＋２′抗体〕と反応−ｌしめた。反応は、１；記と同
し部分的変性条件下で行ったが、ＳＦ）Ｓの使用量は０
．０５重量％では４ｆく０凹％とした。免疫複合体をプ
ロティンＡセファロース上に集め、洗浄し、そして第２
図に関してに記した標準的オートラジオグラフ法を用い
てＳＯＳ−ＰＡＧＥにより分析した。オートラジオダラ
ムである第３図において、最右レーン上の対照（ｂ分子
量標準であり、その次の対照レーンは免疫ｉ；ｉのラビ
ット血清に関するものであり、そして各群の左側の２本
のレーンはそれぞれ１−記のモノク１コーノール抗体Ｙ
］３−２５９及び対照としてのＲａｔ ＩｇＧに関する
。第３図はセリン含有ペブチｌ′に対して生じた血清＋
１位置１２にセリンを有するキルステン肉腫ウィルスの
ｐ２１を免疫沈澱せしめることができるが、この位置に
アルギニン残基を有するバー−・イ肉腫ウィルスのｐ２
１を免疫沈澱−〇しめることができないことを示してい
る。同しＩＡ血清が位置１２にグリシンを含有するｐ２
１蛋白質と反応することが見出されなかった。ＳＤＳ又
はデオキシコレートによる部分変性の非存在下では免疫
沈澱が生じなかった。 この結果は、位置１２のアミノ酸残基（セリン）がｆｊ
’ｃ−ｐ２１”’エピトープ中に含まれることを示して
いる。さらに、抗−ｐ２１ｓｅｒは、ユアツ、Ｙ等、ネ
イヂュアー（ＮａＬｕｒｅ）、３侃−、７７５−７７９
（ｂ９８３）により記載されたセルラインｈｓ ２４
２からの、位置】２にグリシンを含有するｐ２１（正常
ｐ２１）と反応しなかった。 抗−ｐ２＋ｓｏ’抗体はまた、インーヒトＩ−１実験に
おいてシーＫｉ−ｒａｓ発癌遺伝子生成物のオートホス
ホリレーシシンを阻害することが見出され、位置１２を
含むｒ．２１蛋白質の部分がｐ２１蛋白質とＧＴＰとの
相互作用に関与することが示された。 Ｅ．コリ発現ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ ｐ ２１の抽出物を、
」二記０：）ｂｃｐ２１ｓｌｌｒ抗体、又はＹ １３−
２５９モ／クロ一ナル抗体により免疫沈澱セしめ、そし
て得られた免疫複合体を１０μＣｉ”Ｐ γーラベルＧ
ＴＰと共に３７°Ｃにて３０分間インキュへ一部シた。 免疫複合体をプロティンＡセファロース上に集め、洗浄
し、Ｓ １１ Ｓ − ＩＩ Ａ Ｇ Ｉシで分析し、
そして−１−記の標準的オートラジオグラフ法にかＬＪ
た。この結果、ｔ＋’Ｌ ｐ２１”’免疫複合体におい
てはオートホスホリレーシジンが生しなかった。これに
対して、Ｙ １３−２５９モノクロ一ナル抗体により免
疫沈澱したＥ．コリ生産ｐ２＋は活発にリン酸化された
。両物質のオートクジオグラフである第４図へを参照の
こと。あらかしめラベルされたｐ ２１ Ｌｌ使用され
た条件ドで効率的に免疫沈澱した。すなわＩハオーＩ・
ホスホリレーシジンの欠７ｋ １；ｌ酵素活１’Ｊのｌ
ｕｌｌ害及び血清がｐ２１に結合したごとの結果ごあっ
た。 ■う．コリ発現Ｖ Ｋ１−ｒｎｓからの合ｉｊ１２５７
！ｅの抽出物をまずＩｏｏｍＭ Ｎａｆ：Ｉ！ 、５ｍ
Ｍ ＭｇＣ／！ 、及び５ （］ ｍＭ Ｔｒｉｓ
・ＩＩＣｉ２ （ｐｌ目（、０）に調整し、そして得
られた免疫複合体をＩｎ，ｕＣｉのＴ−ラベル（’，
”Ｆｌ）と共に３７℃にて３０分間イン−１−ユヘ−１
した。 次に、抗−ｐ２Ｉｓ″′又４．１． Ｙ Ｉ ３ ２５
９モノクｌ二ｒ−リール抗体との免疫沈澱を、上記と同
し条件下で行った。 この免疫沈澱物を５Ｏ５−ＰＡＧＥ上で移動せしめ、そ
し゛ζ上記のようにしてオートラジオグラフィーに力）
り第４図Ｂを得た。 第４図Ａは、Ｅ、コリにより生産されたｐ２１”’抗体
のＧＴＰ−依存オートホスホリレーションがＪｊＣ−ｐ
２１″″′抗体による免疫沈澱後に完全に除去されたこ
とを示している。これに対して、ｐ２＋蛋白質は、ｐ２
１蛋白質によるＧ Ｔ ｌ）の加水分解を阻害しないこ
とが知られている対照モノクローナル抗体Ｙ １３−２
５９による免疫性＆ｉ後に効率的にオートホスホリレー
トされた。しかしながら、免疫沈澱に先立ってｐ２１が
リン酸化された場合、両抗体はラベルされたｐ２１蛋白
質を効率的に沈澱−υしめることが認められた（第４図
Ｂ）。 従って、ｖ４ｉ−ｒａｓ ｐ ２１への抗−ｐ２１ｓｅ
ｒの結合がｐ２１オーｌボスホリレーションのＩＭＩ害
をもたらした。この結果のほとんど確実であると越えら
れる説明は、抗体が同し部位での結合に関してＧ Ｔ
Ｐと競争することである。 Ｇ、 坑ニーＰ−？」で！乏 免役−り！−７こり一ン
−（４髪擾９丁Ｉ゛粘合Φ１１１賓 ｌ１記の結果をｆ６認し、そして抗体が位置５９のスレ
オニンへのリン酸の移動ではなくむしろＧ′ＵＰの結合
をブロックすることを決定するために、発明者はモノク
［Ｉ−リ′ル抗体すンクドイムノアブヅープションアソ
セイにおいて、ｐ２＋蛋白質へのα−”ＰｄＧＴＰの結
合を直接ブロックする抗−ｒ＋２１”’抗体の能力を試
験した。 Ｅ、コリ中で生産されたｖ Ｋｉ−ｒａｓ ｐ２１を、
ピースケミカル社から１１１られるリアクチゲルビーズ
に連結された千ツク１−１−ナル抗体ＹＩ３．２５９２
μｌにより免疫沈澱−ロしめた。免疫複合体を、０．５
％Ｎ １１４０．５０ ｍＭＴｒｉｓ −ｌＩＣ１（ｐ
Ｈ８，０）、ＩＭＩ、ｉＣ／及び１２０ｍＭ ＮａＣ
７！の溶液により洗浄した。この洗浄された摺合体を、
０．５％トす［・ンＸ−１００，０，５％デオキシコレ
−１・、１５０ｍＭ Ｎａ（Ｊ！ 、５０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ ・１１ｃＬ！ （ｐＨ７，５）、５ ｍＭ
ＭＢ（Ｖ ｚ 、０．１ｍＭ Ａ Ｔ Ｐ及び２ｍＭＤ
ＴＴを含む溶液中で、４°Ｃにて１時間、抗−ｐ２１ｓ
ａ′抗体又は非免疫正常ラビノ１−免疫グ■プリンの添
加を伴ってインキュベートした。これらの免疫複合体を
洗浄し、そして］０００ｍＭＮａＣ１，２０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ ・ＩＩ（Ｊ （ｐＨ７，２）、５ｍＭ Ｍｇ
Ｃ１！ ｚ 、１％トリトンＸ−１００及びＯ，］ｍＭ
Ａ Ｔ Ｐから成るＧＴＰ結合緩衝液中に、４〜］０
ｘＩＣｉのα−ラベル３２ｐｄＧＴＰ （０，２〜０．
５２．１７Ｍ 、８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の添加を伴っ
て４℃にて３０分間再懸濁した。次に、免疫複合体をＧ
ＴＰ結合緩衝液中で洗浄し、そして液体シンチレーショ
ンカウンター中で１赦した。結果を第５図に示す。この
図は、各タイプの抗体対照（抗体無添加）について、ｐ
２１蛋白質へのＧＴＰの結合％を、各抗体の濃度の関数
として示したグラフである。データ点は、抗体を添加し
ない対照に対する５個の測定の平均を示す。 抗−ｐ２１″″′抗体で処理した後、免疫沈澱したｐ２
１蛋白質に結合するＧＴＰは５分の１に減少し、他方、
対照非免疫抗体については減少は見られなかった。これ
らの結果から、ｐ２１蛋白質上の抗−ｐ ２１”’結合
部位がＧＴＰ結合部位とオーハーラソプしているようで
ある。これに代る説明は、抗体４．１． Ｇ ’ｌ”
Ｉ’結合部（☆から幾らか餡れて結合するが、１■白質
の３次構成を撹乱するごとに、ＬってＧ ｉ’ ｌ）結
合を変化−１しめることである。第１の説明の力が確か
らしい。なぜなら、ｆｉｌ Ｐｕ５ｈ等、前掲、は、種
々のｐ２１決定基に対して向けら、？１だボリクＩ’ｌ
−ナル血清及びモノクＩ＋ −−ノ°ル抗体の両刃が
Ｇ ＴＩ１結合を許容することを見出しており、そして
ｌ＋１本発明者等は、Ａｉ ＱＮ度（ｂ（ｂｍＭ）のＧ
Ｔｌ）（ＬかしＡ ＴＩ）ではない）がρ２１蛋白質へ
の）九 ｐ２１ ＆ｏｒ抗体の結合を実？Ｊ、ＬＪｌ害
するごとを見出したからである。この発明はこれらの説
明のいかんにより限定されない。 これらの結果は、（装置１２のアミノ酸の変化がいかに
してｐ２１蛋白質を発癌的に活１／１化することができ
るかという問題に答えている。ｆ０置１２を認識すると
抗体によるＧ Ｔ Ｐ結合のブロックが、このアミノ酸
がｐ２１とＧＴＰとの相互作用に関１）すること、及び
この相互作用の変化が蛋白質の発癌能力に直接的に寄り
−するであろうことを強く示唆している。 （ａイ） （＋！！−−−ぺ− 」１記のように＾ＴＣＣからＮｏ ＡＴＣＣＣＣ１，１
６：（，３として得られたキルステン肉腫ウィルスによ
り形質転換された正常ラット腎（ＮＲＫ）細胞（Ｋ−２
３４）に、抗、２１ｓａｒを、アフィニティー精製した
抗体５ｍｇ／＋ｎｉ！？８液としてマイクロ注入した。 −１−ルステン肉腫ウィルスは、位置１２にセリンを有
するｐ２１の生産によって細胞を形質転換する。注入し
て１２時間後、注入された細胞は形態学的に変化し、そ
して今や正常な非形質転１＃！ＮＲＫ細１１（すに類似
することが認められた。３０時間後、細胞はその１−分
に形質転換された状態に復帰した。対照とし゛この非免
疫正常ラビット抗体は効果を有しなかった。 位置１２にアルギニンを有するｐ２１により形質転換さ
れた細胞への抗−ｐ２１”’抗体の１１人４）また効果
を有しなかった。このことは、抗−ｒ、２１′″″ｒが
、形質転換された表現型、ずなわら蛋白質の既知の生化
学的性質を１徂害し、他方、非免疫正常抗体はそうしな
いことを示している。 」１記のマイクロ注入実験を反復した。この新たな実験
においては、注入された細胞は注入後２４時間（第６図
ｂ）で形態学的に変化することが認められた（第６図ａ
は０時間における細胞を示す）。 注入後３６時間において、注入された細胞はなお一層変
化し、正常な非形質転換フラノ）、 Ｎ ＲＫ細胞に類
偵した。対照としての正常非免疫ラビット抗体は、第６
図ｄ−ｆに示すように、形質転換された細胞に影響を及
ぼさないことが見出された（ｄは０時間の状態を示し、
ｅは２４時間の状態を示し、そしてｒは３６時間の状態
を示す）。最後に、細１１：ｑ ｃ、＋その１−分に形
質転換された状態にｔＭ帰したが、それら番Ｊなお生存
していた。 要約４′れば、この発明は、蛋白質の１個のアミノ酸荀
；ｄにお番ｊるアミノ酸の置Ｉ負を識＞１ｌｌ−ｄるご
とかできる１１°Ｌ ベゾチ１抗而清（抗体）を提供す
る。 従ってこの抗体は、ヒ１の癌をｌｊ当する発癌遺伝子イ
１ニ載物の存７Ｉを検出′４るため、又番、■診断的用
途のために使用することができる。例えば抗 ｐ２＋Ｉ
Ｊ’ｌ： １１１１清中に抗体を４１．成するであろう
幾つかのペプチドを合成することにより抗体が調製され
、この＜５ｆｉ） ペプチドは正常ｐ２１蛋白質のアミノ酸５−１７を含有
し、但し位置１２のグリシンがバリン、セリン、アルギ
ニン、システィン、アスパラギン酸又はアラニンにより
置き換えられており、そしてＣ−末端へ２番目の位置に
システィン残基が挿入されている。前記の抗体を生成せ
しめるためには他のペプチドが必要であろう。抗体によ
り免疫沈澱されるべき蛋白質は一般に蛋白質のエピトー
プが露出するように部分的に変性されている。この蛋白
質と接触した抗体はｐ２１蛋白質へのその結合を強化す
るためにアフィニティー精製することができる。 抗−ｐ２１”’抗体は位置１２にセリンを有するｒ＋２
１蛋白質を免疫沈澱することが見出された。さらに、抗
体は、モノクローナル抗体イノ、ノアブゾープションア
ソセイにおいて、ＧＴＰを結合するｐ２１シーＫｉ−ｒ
ａｓの能力を非常に低下せしめる。従って、位置１２に
おける抗−ｐ２１”’結合部位はＧ Ｔ Ｐ結合部位の
部分を含むであろう。これらの結果は、ｐ２１のＧＴＰ
結合及び加水分解活性が発癌性活性化の過程で必須の役
割を演するとする概念を強く支持する。従って、抗−ｐ
２１Ｓｅｒ抗体（４１、インービボ及びインービｌ−Ｉ
Ｉにおりるｐ２１蛋白質の機能のωＩ究のための強力ｌ
ｒ手段として機能するであろう。 ４、 図面の籠１１ム゛説明 第１図は、Ｘで示ず位置１２を包囲するｐ２＋蛋白質の
アミノ酸配列の略図である。この蛋白質の位置１２はペ
プチＩ゛の位Ｗ８に相当する。アミノ酸５〜１７のベプ
チ１゛（位置１６と１７の間にシスティン残基が挿入さ
れている）を、この明細書の例の抗体を製造するために
免疫原として使用した。 第２図は、位置１２におけるｇｌｙ、 Ｓｅｒ 、又は
νａ１ に対して向りられたアフィニティー精製された
抗ｐ２１血ｌＲとＥ、コリ。（ｂ４−ｃｏｊｊ）により
発現されたセリン成分を含有するｖ４ｉ−ｒａｓ ｐ
２１蛋白質との免疫複合体の５１１Ｓ−１”ＡＧＥ分析
のオー１−ラジオグラムである。左のレーンは対照を示
す。 第３図は、位置１２にｓｅｒ及びａｒｇアミノ酸置換を
有する形質転換された吐乳類細胞由来の２種類のｐ２１
蛋白質であって、抗−ｒ）２１”″抗体に、１、り免疫
沈澱したものの５ＤＳ−１１ＡにＥ分析のオートラジオ
グラムである。各群の左の２つのレーンは対照であり、
そして最右側のレーンは分子￥標準である。免疫Ｏ；１
と表示された右から２番ｌ」のシー〉′は、注射１１；
１のラビット血清を免疫沈澱−〇しめたものである。 第４図は、Ｅ、コリ発現ｖ−Ｘｉ−ｒａｓ ｐ２１と抗
−ｐ２１”’又はｐ２＋蛋白質によるＧ Ｔ ｌ）の加
水分解を１徂害しないことが知られているモノクローナ
ル抗体Ｙ１３−２５９ （図中、１元−ｐ２１Ｍ／！ｌ
として示されている）のいずれかとの、Ｔラベルされた
ＧＴＩ）によりラベルされた免疫複合体の５１１８−１
１ＡＧＩＥ分析のオートラジオグラムである。Ａと表示
されたレーンはリン酸化前の免疫沈澱を表わし、そして
Ｂと表示されたレーンはリン酸化後の免疫沈澱を示す。 第５図は、ｐ２１蛋白質に結合するＧ ′ＦＰを対＋１
Ｑ（抗体を添加しない）に対する％として、Ｊ１′免疫
正常ラビット免疫グロブリン又は抗−ｐ２１ｓ′’抗体
（これらはＹ １３−２５９と共に免疫沈澱したシーＫ
ｉ−ｒａｓ ｐ２１に加えら相る）の−に対してゾＩＩ
Ｉノ１したものである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、発癌遺伝子生成物の特徴的マーカーエピトープ（こ
のエピトープは対応するプロト−発癌遺伝子生成物中に
は存在しない）に選択的に結合する抗体。 ２、前記発癌遺伝子生成物がｐ２１蛋白質の活性化形で
ありそして前記エピトープがその位置１２を包含するこ
とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の抗体。 ３、位置１２のアミノ酸がバリン、セリン、アルギニン
、システイン、アスパラギン酸又はアラニンであること
を特徴とする特許請求の範囲第２項記載の抗体。 ４、免疫原として有用なペプチド断片であって、位置１
２の可変アミノ酸、エピトープを規定するのに十分な量
のフランキング残基、及び該断片のＣ−末端へ２番目の
位置にあるシステイン残基を有することを特徴とするペ
プチド断片。 ５、担体蛋白質と接合している特許請求の範囲第４項記
載のペプチド断片。 ６、患者の細胞性サンプル中のポリペプチド又は発癌遺
伝子生成物の検出方法であって、該ポリペプチドが特徴
的マーカーエピトープ（このエピトープは未変性ポリペ
プチド中では露出していない）を有し、該発癌遺伝子生
成物が特徴的マーカーエピトープ（このエピトープはプ
ロト−発癌遺伝子生成物中には存在せずそして未変性蛋
白質中では露出していない）を有し、そして該方法が：
（ａ）前記ポリペプチド又はサンプルを蛋白質変性剤（
この蛋白質変性剤は前記エピトープを露出せしめそして
抗原−抗体結合を実質上阻害しない）によって処理し； （ｂ）該ポリペプチド又はサンプルを抗体（この抗体は
、前記エピトープへの該抗体の結合を許容する条件下で
該エピトープに選択的に結合する）と共にインキュベー
トし、そして（ｃ）前記インキュベート混合物中での前
記エピトープと抗体との免疫複合体の存在を検出する； ことを特徴とする方法。 ７、発癌遺伝子生成物の特徴的マーカーエピトープ（こ
のエピトープは対応するプロト−発癌遺伝子生成物中に
は存在しない）に選択的に結合する抗体の製造方法であ
って、 （ａ）位置１２の可変アミノ酸、エピトープを規定する
のに十分な量のフランキング残基及びこの断片のＣ−末
端へ２番目の位置に挿入されたシステイン残基を含んで
成るペプチド断片により宿主動物を免疫し； （ｂ）血清を採取し；そして （ｃ）採取された血清を前記抗体についてスクリーニン
グする；ことを特徴とする方法。 ８、特徴的未変性蛋白質中では露出していない特徴的マ
ーカーエピトープを有する部分的に変性された蛋白質で
あって、該エピトープを露出するのに十分な程度に変性
されていることを特徴とする部分変性蛋白質。 ９、特徴的未変性蛋白質中では露出していない特徴的マ
ーカーエピトープを有し、該エピトープを露出するのに
十分な程度に変性されている部分変性蛋白質の製造方法
であって、該エピトープを十分に露出せしめるがしかし
抗原−抗体結合を実質上阻害しない条件下で前記未変性
蛋白質を蛋白質変性剤と接触せしめることを特徴とする
方法。 １０、次の要素 （ａ）発癌遺伝子生成物の特徴的マーカーエピトープ（
このエピトープは対応するプロト−発癌遺伝子生成物中
には存在しない）に選択的に結合する抗体であって、検
出可能なラベルによりラベルされたもの、 又はラベルされた抗体と結合するもの； （ｂ）変性緩衝剤；及び （ｃ）（ａ）における前記抗体がラベルされていない場
合には、（ａ）における該抗体と結合するラベルされた
抗体；を含むことを特徴とするキット。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US65275284A | 1984-09-19 | 1984-09-19 | |
| US652752 | 1984-09-19 | ||
| US661909 | 1984-10-17 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6185327A true JPS6185327A (ja) | 1986-04-30 |
Family
ID=24618015
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60205462A Pending JPS6185327A (ja) | 1984-09-19 | 1985-09-19 | 発癌遺伝子生成物に対する抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6185327A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0816679B2 (ja) * | 1988-04-22 | 1996-02-21 | オンコジーン・サイエンス・インコーポレーテッド | 体液および組織におけるｒａｓタンパクの検出、定量および分類 |
-
1985
- 1985-09-19 JP JP60205462A patent/JPS6185327A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0816679B2 (ja) * | 1988-04-22 | 1996-02-21 | オンコジーン・サイエンス・インコーポレーテッド | 体液および組織におけるｒａｓタンパクの検出、定量および分類 |
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