JPH08173176A - 血管新生阻害剤 - Google Patents
血管新生阻害剤Info
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- JPH08173176A JPH08173176A JP31967494A JP31967494A JPH08173176A JP H08173176 A JPH08173176 A JP H08173176A JP 31967494 A JP31967494 A JP 31967494A JP 31967494 A JP31967494 A JP 31967494A JP H08173176 A JPH08173176 A JP H08173176A
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- JP
- Japan
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- borrelidin
- angiogenesis
- cancer
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- salt
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- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 新規血管新生阻害物質を提供する。
【構成】 微生物の培養液を原料として、血管新生阻害
物質をスクリーニングし精製の結果、ボレリジン（Borr
elidin) であることを確認した。 【効果】 血管新生の異常増殖を伴う各種疾患の予防お
よび治療剤として期待される。
物質をスクリーニングし精製の結果、ボレリジン（Borr
elidin) であることを確認した。 【効果】 血管新生の異常増殖を伴う各種疾患の予防お
よび治療剤として期待される。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は血管新生の異常増殖を伴
う各種疾患に対する予防および治療に有効な血管新生阻
害剤に関する。
う各種疾患に対する予防および治療に有効な血管新生阻
害剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】血管新生は胎児期の血管樹形成や各臓器
の形態的、 機能的発達時に不可欠な生物学的現象である
が、成熟個体では女性性周期においてのみに生じる。し
かし成熟個体において、血管新生の病的増加が様々な疾
患の発症あるいは進行過程に関与していることが知られ
ている。具体的には癌、リウマチ性関節炎、アテローム
性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、血管腫、乾せんなどが
血管新生の異常を伴う疾患として挙げられる（Marsha
A. et al., Biotechnology, 9, 630, 1991)。特に固形
癌の増殖は血管新生に依存することが報告されているこ
とから（Folkman J., J. Natl. Cancer Inst., 82, 4 ,
1990）血管新生阻害剤は難治性固形癌に対する新しい治
療薬になると期待されている。
の形態的、 機能的発達時に不可欠な生物学的現象である
が、成熟個体では女性性周期においてのみに生じる。し
かし成熟個体において、血管新生の病的増加が様々な疾
患の発症あるいは進行過程に関与していることが知られ
ている。具体的には癌、リウマチ性関節炎、アテローム
性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、血管腫、乾せんなどが
血管新生の異常を伴う疾患として挙げられる（Marsha
A. et al., Biotechnology, 9, 630, 1991)。特に固形
癌の増殖は血管新生に依存することが報告されているこ
とから（Folkman J., J. Natl. Cancer Inst., 82, 4 ,
1990）血管新生阻害剤は難治性固形癌に対する新しい治
療薬になると期待されている。
【０００３】これまでいくつかの血管新生阻害物質に関
する報告はあるが、いまだ実用化に耐える有効な物質は
見い出されていない（公開特許公報 平３−１０９３２
４、公開特許公報 平３−２３６３２４、公開特許公報
平３−２１８４）。
する報告はあるが、いまだ実用化に耐える有効な物質は
見い出されていない（公開特許公報 平３−１０９３２
４、公開特許公報 平３−２３６３２４、公開特許公報
平３−２１８４）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は血管新生阻害
活性を有する新規物質を単難し、血管新生の異常増殖を
伴う各種疾患に対する予防および治療剤を提供すること
にある。
活性を有する新規物質を単難し、血管新生の異常増殖を
伴う各種疾患に対する予防および治療剤を提供すること
にある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】上記現状に鑑み、本発明
者らは微生物培養液を原料として、阻害活性がより強力
で副作用の少ない新しい血管新生阻害物質の探索スクリ
ーニングを開始した。その結果、ストレプトミセス属に
属する微生物の培養液中に血管新生阻害物質が産生され
ることを見い出した。この活性物質を単離し、構造解析
の結果、ボレリジン（Borrelidin) が血管新生阻害活性
を有することを初めて見い出し、本発明を完成するに至
った。
者らは微生物培養液を原料として、阻害活性がより強力
で副作用の少ない新しい血管新生阻害物質の探索スクリ
ーニングを開始した。その結果、ストレプトミセス属に
属する微生物の培養液中に血管新生阻害物質が産生され
ることを見い出した。この活性物質を単離し、構造解析
の結果、ボレリジン（Borrelidin) が血管新生阻害活性
を有することを初めて見い出し、本発明を完成するに至
った。
【０００６】すなわち本発明は、ボレリジンまたはその
塩を有効成分として含有してなる血管新生阻害剤および
抗固形癌剤に関するものである。また、本発明は、スト
レプトミセス・ロチェイ (Streptomyces rochei) Mer-N
7167（FERM P-14670）を栄養培地中で培養し、その培養
液からボレリジンを採取することを特徴とするボレリジ
ンの製造方法に関するものである。
塩を有効成分として含有してなる血管新生阻害剤および
抗固形癌剤に関するものである。また、本発明は、スト
レプトミセス・ロチェイ (Streptomyces rochei) Mer-N
7167（FERM P-14670）を栄養培地中で培養し、その培養
液からボレリジンを採取することを特徴とするボレリジ
ンの製造方法に関するものである。
【０００７】ボレリジンはストレプトミセス属の微生物
の培養液から抗生物質として1949年単離構造決定された
化合物である（Berger J. et al., Arch. Biochem. Bio
phys., 22, 476, 1949）。化学式は２［７−cyano −
８，16−dihydroxy −９，11，13，15−tetramethyl −
18−oxooxacyclooctadeca −４，６−dien−２−yl］cy
clopenta−carboxylic acid であり、構造式は下記式
（Ｉ）で表されるものである。
の培養液から抗生物質として1949年単離構造決定された
化合物である（Berger J. et al., Arch. Biochem. Bio
phys., 22, 476, 1949）。化学式は２［７−cyano −
８，16−dihydroxy −９，11，13，15−tetramethyl −
18−oxooxacyclooctadeca −４，６−dien−２−yl］cy
clopenta−carboxylic acid であり、構造式は下記式
（Ｉ）で表されるものである。
【０００８】
【化１】
【０００９】ボレリジンは抗菌作用の他に抗ウイルス作
用および抗腹水癌（Krebs ascitestumor) 作用を有す
ることが知られている（Dickinson L., et al., Natur
e，206, 265，1965）。しかし、血管新生阻害作用とい
う全く予期されない作用を有することを本発明者らが初
めて見い出したものであり、ボレリジンが各種固形癌に
対し予防および治療剤として期待されるものである。
用および抗腹水癌（Krebs ascitestumor) 作用を有す
ることが知られている（Dickinson L., et al., Natur
e，206, 265，1965）。しかし、血管新生阻害作用とい
う全く予期されない作用を有することを本発明者らが初
めて見い出したものであり、ボレリジンが各種固形癌に
対し予防および治療剤として期待されるものである。
【００１０】ボレリジンが腹水癌（Krebs ascites tumo
r)の増殖を抑制する作用を有するとの報告はあるが、リ
ンパ系の腹水癌と固形癌は形態的に全く異物のものであ
る。固形癌とは例えば胃癌、膵癌、大腸癌、肺癌など異
常な血管新生を伴う、固形の癌を意味し、腹水癌などリ
ンパ系の癌は含まれない。
r)の増殖を抑制する作用を有するとの報告はあるが、リ
ンパ系の腹水癌と固形癌は形態的に全く異物のものであ
る。固形癌とは例えば胃癌、膵癌、大腸癌、肺癌など異
常な血管新生を伴う、固形の癌を意味し、腹水癌などリ
ンパ系の癌は含まれない。
【００１１】以下に本発明を詳細に説明する。ボレリジ
ンの抽出原料である微生物培養液の微生物種としては、
ストレプトミセス属を選び、すでに報告されているよう
に Streptomyces albovinaceus，Streptomyces rochei
およびStreptomyces sp. C 2989 などボレリジンを産生
する能力を有する微生物であればいずれも使用すること
ができる（Singh S.K. et al.,Antimicrob. Agents. Ch
emother. 27，239, 1985 ；Berger J., et al., Arch.B
iochem. Biophys.，22，476, 1949 ；Lumb M. et al.,
Nature, 206 ，263,1965) 。
ンの抽出原料である微生物培養液の微生物種としては、
ストレプトミセス属を選び、すでに報告されているよう
に Streptomyces albovinaceus，Streptomyces rochei
およびStreptomyces sp. C 2989 などボレリジンを産生
する能力を有する微生物であればいずれも使用すること
ができる（Singh S.K. et al.,Antimicrob. Agents. Ch
emother. 27，239, 1985 ；Berger J., et al., Arch.B
iochem. Biophys.，22，476, 1949 ；Lumb M. et al.,
Nature, 206 ，263,1965) 。
【００１２】その例としては、たとえばストレプトミセ
ス・ロチェイ (Streptomyces rochei) ATCC10739などが
挙げられるが、特にボレリジンの生産力が高く好適な菌
株として、本発明者らが石垣島土壌より分離した放線菌
Mer-N 7167株が挙げられる。本菌は以下の菌学的性質を
有する。 形態；分岐し良く伸長する基生菌糸と、同じく良く伸長
する気中菌糸とからなり、気中菌糸の先端は胞子化す
る。胞子鎖は10〜50個連なり、ゆるやかなラセン状を呈
するが、曲状のものも見られる。胞子の表面は平滑で大
きさは直径１μm ×１〜２μm 程度である。 菌体成分；ジアミノピメリン酸としては、LL−型を含
み、糖はガラクトース、グルコース、マンノース、リボ
ースを含む。
ス・ロチェイ (Streptomyces rochei) ATCC10739などが
挙げられるが、特にボレリジンの生産力が高く好適な菌
株として、本発明者らが石垣島土壌より分離した放線菌
Mer-N 7167株が挙げられる。本菌は以下の菌学的性質を
有する。 形態；分岐し良く伸長する基生菌糸と、同じく良く伸長
する気中菌糸とからなり、気中菌糸の先端は胞子化す
る。胞子鎖は10〜50個連なり、ゆるやかなラセン状を呈
するが、曲状のものも見られる。胞子の表面は平滑で大
きさは直径１μm ×１〜２μm 程度である。 菌体成分；ジアミノピメリン酸としては、LL−型を含
み、糖はガラクトース、グルコース、マンノース、リボ
ースを含む。
【００１３】各種培地上での生育； ISP-１ 生育は中程度で、薄く白色の気中菌糸を産す
る。培養裏面はわずかに黄色になる。 ISP-２ 生育は良好で、白色の気中菌糸上に灰色ないし
灰白色（Light grayishreddish brown ）の胞子を多量
に産する。培養裏面はわずかに黄褐色を呈する。 ISP-３ 生育は良好で、胞子の色は灰紫色（Grayish pu
rple）、他はISP-２と同様 ISP-４ 胞子の色は灰色（Medium gray)他はISP-２と同
様 ISP-５ 生育は弱く、白色の気中菌糸を少し産する。 改変チロシン培地 メラニン色素は産生しない。 なお、いずれの培地でも可溶性色素はほとんど見られな
い。
る。培養裏面はわずかに黄色になる。 ISP-２ 生育は良好で、白色の気中菌糸上に灰色ないし
灰白色（Light grayishreddish brown ）の胞子を多量
に産する。培養裏面はわずかに黄褐色を呈する。 ISP-３ 生育は良好で、胞子の色は灰紫色（Grayish pu
rple）、他はISP-２と同様 ISP-４ 胞子の色は灰色（Medium gray)他はISP-２と同
様 ISP-５ 生育は弱く、白色の気中菌糸を少し産する。 改変チロシン培地 メラニン色素は産生しない。 なお、いずれの培地でも可溶性色素はほとんど見られな
い。
【００１４】糖資化性； （＋）グルコース、イノシトール、フラクトース、ラム
ノース、マンノース、アラビノース （±）キシロース （−）ラフィノース、シュクロース （＋）；良く資化する （−）；資化しない （±）；
その中間 同定；本株の性状を同時に実施した Streptomyces roch
ei type strain IFO 12908の性状と比較すると、表１に
示すような相違点が見られる。
ノース、マンノース、アラビノース （±）キシロース （−）ラフィノース、シュクロース （＋）；良く資化する （−）；資化しない （±）；
その中間 同定；本株の性状を同時に実施した Streptomyces roch
ei type strain IFO 12908の性状と比較すると、表１に
示すような相違点が見られる。
【００１５】
【表１】
【００１６】このような相違はあるものの、種が異なる
ほどの差ではなく、ストレプトミセス・ロチェイ(Strep
tomyces rochei) の種内変動の範囲であるので、本発明
者らは本菌株をストレプトミセス・ロチェイ (Streptom
yces rochei) Mer-N 7167 と命名した。なお、本菌株
は、平成６年11月28日付で工業技術院生命工学工業技術
研究所にFERM P-14670として寄託されている。
ほどの差ではなく、ストレプトミセス・ロチェイ(Strep
tomyces rochei) の種内変動の範囲であるので、本発明
者らは本菌株をストレプトミセス・ロチェイ (Streptom
yces rochei) Mer-N 7167 と命名した。なお、本菌株
は、平成６年11月28日付で工業技術院生命工学工業技術
研究所にFERM P-14670として寄託されている。
【００１７】血管新生阻害活性のスクリーニング法とし
て、ラット大動脈片をコラーゲンゲル内にて培養した場
合に観察される管腔形成の阻害度を指標とした（ Nicos
ia R.F., Lab. Invest., 63, 115, 1990）。また、ヒト
大腸癌 WiDr 細胞株を用いてマウス皮下での血管新生阻
害活性をも併せてスクリーニング法として使用した。
て、ラット大動脈片をコラーゲンゲル内にて培養した場
合に観察される管腔形成の阻害度を指標とした（ Nicos
ia R.F., Lab. Invest., 63, 115, 1990）。また、ヒト
大腸癌 WiDr 細胞株を用いてマウス皮下での血管新生阻
害活性をも併せてスクリーニング法として使用した。
【００１８】ストレプトミセス属の微生物を通常の適切
な培養条件にて培養後、培養液を清澄濾過したのちブタ
ノールまたはメチルイソブチルケトンなどの有機溶媒を
加え抽出し、有機溶媒層を減圧下濃縮する。次いでメタ
ノールにて抽出し、石油エーテル（light petroleum)な
どで処理し粗抽出物を得る。次いでシリカゲルなどを用
いる吸着クロマトグラフィー、LH 20 ゲルクロマトグラ
フィ、分配クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィ
ー、ペーパークロマトグラフィーなどを適宜利用して分
画し、活性スクリーニングにより活性画分を確認する。
上記手法を適宜組み合わせることにより活性物質を単離
することができる。吸着クロマトグラフィーに使用する
溶媒としては、クロロホルム、メタノール、アセトン、
ヘキサン、トルエンなど通常使用される有機溶媒を用
い、適宜濃度を選択、組み合わせて使用することができ
る。結晶化の溶媒としてはクロロホルムとヘキサン、ま
たはクロロホルムと四塩化炭素などを用いることができ
る。一つの手法として M. Lumbらの方法がある。（Natu
re, 206, 263, 1965）。単離した化合物の構造解析は、
元素分析、GC-MS、 NMR、融点など常法の手法によって行
うことができる。
な培養条件にて培養後、培養液を清澄濾過したのちブタ
ノールまたはメチルイソブチルケトンなどの有機溶媒を
加え抽出し、有機溶媒層を減圧下濃縮する。次いでメタ
ノールにて抽出し、石油エーテル（light petroleum)な
どで処理し粗抽出物を得る。次いでシリカゲルなどを用
いる吸着クロマトグラフィー、LH 20 ゲルクロマトグラ
フィ、分配クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィ
ー、ペーパークロマトグラフィーなどを適宜利用して分
画し、活性スクリーニングにより活性画分を確認する。
上記手法を適宜組み合わせることにより活性物質を単離
することができる。吸着クロマトグラフィーに使用する
溶媒としては、クロロホルム、メタノール、アセトン、
ヘキサン、トルエンなど通常使用される有機溶媒を用
い、適宜濃度を選択、組み合わせて使用することができ
る。結晶化の溶媒としてはクロロホルムとヘキサン、ま
たはクロロホルムと四塩化炭素などを用いることができ
る。一つの手法として M. Lumbらの方法がある。（Natu
re, 206, 263, 1965）。単離した化合物の構造解析は、
元素分析、GC-MS、 NMR、融点など常法の手法によって行
うことができる。
【００１９】単離した化合物は公知物質であるボレリジ
ンであることが判明したが、驚くべきことにボレリジン
が強力な血管新生阻害活性を有することを見い出した。
前記の如く、各種疾患において異常な血管新生が観察さ
れていることから、それら疾患、例えばリウマチ性関節
炎、固形癌、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜
症、血管腫、乾せんなどの予防剤として、また治療薬と
して期待されるものであり、特に抗固形癌剤として有効
である。
ンであることが判明したが、驚くべきことにボレリジン
が強力な血管新生阻害活性を有することを見い出した。
前記の如く、各種疾患において異常な血管新生が観察さ
れていることから、それら疾患、例えばリウマチ性関節
炎、固形癌、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜
症、血管腫、乾せんなどの予防剤として、また治療薬と
して期待されるものであり、特に抗固形癌剤として有効
である。
【００２０】該化合物を各種疾患治療・予防剤として投
与する場合、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、シロッ
プ剤などとして経口的に投与してもよいし、また噴霧
剤、坐剤、注射剤、外用剤、点滴剤として非経口的に投
与してもよい。投与量は症状の程度、年齢、肝疾患の種
類などにより著しく異なるが、通常成人１日当たり約 1
mg〜100mg を１日１〜数回にわけて投与する。
与する場合、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、シロッ
プ剤などとして経口的に投与してもよいし、また噴霧
剤、坐剤、注射剤、外用剤、点滴剤として非経口的に投
与してもよい。投与量は症状の程度、年齢、肝疾患の種
類などにより著しく異なるが、通常成人１日当たり約 1
mg〜100mg を１日１〜数回にわけて投与する。
【００２１】製剤化の際は通常の製剤担体を用い、常法
により製造する。すなわち、経口用固形製剤を調製する
場合は、主薬に賦形剤、更に必要に応じて結合剤、崩壊
剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤などを加えた後、常法
により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤など
とする。これらの錠剤、顆粒剤には糖衣、ゼラチン衣、
その他必要により適宜コーティングすることは勿論差し
支えない。注射剤を調製する場合には、主薬に必要によ
りpH調整剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤などを添加
し、常法により皮下、筋肉内、静脈内用注射剤とする。
により製造する。すなわち、経口用固形製剤を調製する
場合は、主薬に賦形剤、更に必要に応じて結合剤、崩壊
剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤などを加えた後、常法
により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤など
とする。これらの錠剤、顆粒剤には糖衣、ゼラチン衣、
その他必要により適宜コーティングすることは勿論差し
支えない。注射剤を調製する場合には、主薬に必要によ
りpH調整剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤などを添加
し、常法により皮下、筋肉内、静脈内用注射剤とする。
【００２２】
【実施例】以下の実施例によりさらに詳細に説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。尚、例
中の％は特記しない限り重量基準である。
が、本発明はこれらに限定されるものではない。尚、例
中の％は特記しない限り重量基準である。
【００２３】実施例１．ボレリジンの精製と構造確認 種培地として、グリセロール 2.0％、グルコース 2.0
％、大豆粉 2.0％、酵母エキス0.5 ％、塩化ナトリウム
0.25％、炭酸カルシウム0.32％及び微量金属溶液（硫酸
銅0.25％、塩化マンガン0.25％及び硫酸亜鉛0.25％の溶
液を予め調製）0.2 ％の組成からなる培地を用いた。生
産培地としては、種培地のグリセロール 2.0％のかわり
にポテト澱粉 2.0％とし、他の組成は同じものを用い
た。ジャー培養に際しては、消泡剤0.05％を添加した。
殺菌前pHを 7.4に調整して使用した。前記の種培地 100
mlを分注した 500ml容三角フラスコを 120℃で15分間殺
菌し、これにMer-N 7167株の斜面寒天培養の１白金耳を
接種し、28℃で３日間振盪培養して種培養とした。生産
培地15Ｌを、各30Ｌ容ジャー・ファーメンター２基に分
注して 120℃、30分間殺菌し、種培養を各 100mlずつ接
種し、28℃で５日間通気（0.5vvm）、攪拌（300rpm）培
養した。培養終了後遠心分離して上清を集め、pH７に調
整して、HP-20 カラム（３Ｌ）に吸着させ、水洗浄、20
％メタノール洗浄後、80％アセトンで溶出させた。溶出
液約３Ｌを、減圧下で濃縮してアセトンを除去し、水を
加えて約１Ｌにして、酢酸エチル１Ｌで２回抽出した。
抽出液を減圧下で濃縮乾固し、黒褐色の油状物質を得
た。この油状物質を少量のメタノールに溶解しセファデ
ックス LH-20（400ml ）の上部に載せ、メタノールで展
開し、活性画分を濃縮乾固した。次に少量のクロロホル
ム：メタノール＝50：１に溶解し、シリカゲル（Kiesel
gel 60）カラム（150ml)の上部に載せ、クロロホルム：
メタノール＝50：１、20：１及び10：１、各 500mlで溶
出させた。クロロホルム：メタノール＝50：１〜20：１
で溶出される活性画分を集め、濃縮乾固した。次に少量
のアセトンに溶解し、シリカゲル（Kieselgel 60）と混
ぜ、減圧下で濃縮乾固させ、シリカゲル（Kieselgel 6
0）カラム（150ml)の上部に載せ、ヘキサン：アセトン
＝３：１、２：１及び１：２、各 500mlで溶出させた。
溶出しきれない画分はメタノールで押し出した。ヘキサ
ン：アセトン＝３：１〜２：１で溶出される活性画分を
集めた。純化されていない画分は少量のトルエン: アセ
トン＝５：１に溶解し、シリカゲル（Kieselgel 60）カ
ラム（50ml）の上部に載せ、トルエン：アセトン＝５：
１、４：１及び２：１、各 200mlで溶出させた。トルエ
ン：アセトン＝５：１で溶出される活性画分を集め、前
の活性画分と併せ、611.2mg の精製物を得た。本精製物
をクロロホルム約30mlに溶かして、ヘキサンで結晶化
し、結晶420.0mg を得た。
％、大豆粉 2.0％、酵母エキス0.5 ％、塩化ナトリウム
0.25％、炭酸カルシウム0.32％及び微量金属溶液（硫酸
銅0.25％、塩化マンガン0.25％及び硫酸亜鉛0.25％の溶
液を予め調製）0.2 ％の組成からなる培地を用いた。生
産培地としては、種培地のグリセロール 2.0％のかわり
にポテト澱粉 2.0％とし、他の組成は同じものを用い
た。ジャー培養に際しては、消泡剤0.05％を添加した。
殺菌前pHを 7.4に調整して使用した。前記の種培地 100
mlを分注した 500ml容三角フラスコを 120℃で15分間殺
菌し、これにMer-N 7167株の斜面寒天培養の１白金耳を
接種し、28℃で３日間振盪培養して種培養とした。生産
培地15Ｌを、各30Ｌ容ジャー・ファーメンター２基に分
注して 120℃、30分間殺菌し、種培養を各 100mlずつ接
種し、28℃で５日間通気（0.5vvm）、攪拌（300rpm）培
養した。培養終了後遠心分離して上清を集め、pH７に調
整して、HP-20 カラム（３Ｌ）に吸着させ、水洗浄、20
％メタノール洗浄後、80％アセトンで溶出させた。溶出
液約３Ｌを、減圧下で濃縮してアセトンを除去し、水を
加えて約１Ｌにして、酢酸エチル１Ｌで２回抽出した。
抽出液を減圧下で濃縮乾固し、黒褐色の油状物質を得
た。この油状物質を少量のメタノールに溶解しセファデ
ックス LH-20（400ml ）の上部に載せ、メタノールで展
開し、活性画分を濃縮乾固した。次に少量のクロロホル
ム：メタノール＝50：１に溶解し、シリカゲル（Kiesel
gel 60）カラム（150ml)の上部に載せ、クロロホルム：
メタノール＝50：１、20：１及び10：１、各 500mlで溶
出させた。クロロホルム：メタノール＝50：１〜20：１
で溶出される活性画分を集め、濃縮乾固した。次に少量
のアセトンに溶解し、シリカゲル（Kieselgel 60）と混
ぜ、減圧下で濃縮乾固させ、シリカゲル（Kieselgel 6
0）カラム（150ml)の上部に載せ、ヘキサン：アセトン
＝３：１、２：１及び１：２、各 500mlで溶出させた。
溶出しきれない画分はメタノールで押し出した。ヘキサ
ン：アセトン＝３：１〜２：１で溶出される活性画分を
集めた。純化されていない画分は少量のトルエン: アセ
トン＝５：１に溶解し、シリカゲル（Kieselgel 60）カ
ラム（50ml）の上部に載せ、トルエン：アセトン＝５：
１、４：１及び２：１、各 200mlで溶出させた。トルエ
ン：アセトン＝５：１で溶出される活性画分を集め、前
の活性画分と併せ、611.2mg の精製物を得た。本精製物
をクロロホルム約30mlに溶かして、ヘキサンで結晶化
し、結晶420.0mg を得た。
【００２４】このようにして精製された活性物質の物理
化学的性質は次に示す通りである。 １）EI Mass スペクトル 活性物質の m/z489 に関する高分解能 EI Massスペクト
ル解析の結果、m/z489にＭ+ が観測され、分子式はＣ28
Ｈ43ＮＯ6 であると決定した。結果を表２に示す。
化学的性質は次に示す通りである。 １）EI Mass スペクトル 活性物質の m/z489 に関する高分解能 EI Massスペクト
ル解析の結果、m/z489にＭ+ が観測され、分子式はＣ28
Ｈ43ＮＯ6 であると決定した。結果を表２に示す。
【００２５】
【表２】
【００２６】 ２）紫外線吸収スペクトル：測定結果を図１に示した。 ３）赤外線吸収スペクトル：測定結果を図２に示した。 ４）1H核磁気共鳴スペクトル：測定結果を表３に示し
た。
た。
【００２７】
【表３】
【００２８】５）13Ｃ核磁気共鳴スペクトル：測定結果
を表４に示した。
を表４に示した。
【００２９】
【表４】
【００３０】以上の結果から本物質はボレリジンである
ことが確認された。
ことが確認された。
【００３１】実施例２．血管新生阻害活性 ラット大動脈片をコラーゲンゲル内にて培養し、観察さ
れる管腔形成の阻害度を血管新生阻害活性とした。すな
わち、Sprague-Dawley系雌ラット(８〜12週齢)より摘出
した大動脈をハンクス液で洗浄しながら周辺の脂肪組織
を丁寧に除去した。大動脈を切開し２mm角の切片を作成
した後、24ウエルプレート内へ内皮細胞面を上にして静
置する。次に、中性化したタイプＩコラーゲンゲル（Ce
llmatrixtype Ｉ−Ａ：新田ゼラチン）500 μl を各ウ
エルへ注ぎクリーンベンチ内で室温下約20分間放置して
ゲルを固まらせた。ゲルが固まったことを確認した後 5
00μl の MCDB 131 （クロレラ工業社製）培地を各ウエ
ルに加えCO2 インキュベーター（５％CO2)で 37 ℃下培
養した。翌日ボレリジンを含むMCDB 131培地と培養液を
交換し、さらに培養４日目に再度ボレリジン含有のMCDB
131培地と交換して培養を続けた。そして、ボレリジン
添加後７日目の時点で、大動脈の周囲に形成された毛細
血管数を顕微鏡を用いて測定した。その結果は表５に示
した。表５から明らかなごとく、ボレリジンは濃度依存
的に血管新生阻害作用を示し、そのＩＣ50値は約 0.5 n
g/mlであった。尚、阻害活性はボレリジン無添加群の毛
細血管数との比較で表わしてある。
れる管腔形成の阻害度を血管新生阻害活性とした。すな
わち、Sprague-Dawley系雌ラット(８〜12週齢)より摘出
した大動脈をハンクス液で洗浄しながら周辺の脂肪組織
を丁寧に除去した。大動脈を切開し２mm角の切片を作成
した後、24ウエルプレート内へ内皮細胞面を上にして静
置する。次に、中性化したタイプＩコラーゲンゲル（Ce
llmatrixtype Ｉ−Ａ：新田ゼラチン）500 μl を各ウ
エルへ注ぎクリーンベンチ内で室温下約20分間放置して
ゲルを固まらせた。ゲルが固まったことを確認した後 5
00μl の MCDB 131 （クロレラ工業社製）培地を各ウエ
ルに加えCO2 インキュベーター（５％CO2)で 37 ℃下培
養した。翌日ボレリジンを含むMCDB 131培地と培養液を
交換し、さらに培養４日目に再度ボレリジン含有のMCDB
131培地と交換して培養を続けた。そして、ボレリジン
添加後７日目の時点で、大動脈の周囲に形成された毛細
血管数を顕微鏡を用いて測定した。その結果は表５に示
した。表５から明らかなごとく、ボレリジンは濃度依存
的に血管新生阻害作用を示し、そのＩＣ50値は約 0.5 n
g/mlであった。尚、阻害活性はボレリジン無添加群の毛
細血管数との比較で表わしてある。
【００３２】
【表５】
【００３３】実施例３．in vivo 血管新生阻害活性 マウスを用いた上記作用の検討をdorsal air sac法（Sa
kamoto et al., Cancer J.，1, 55-57, 1986）を一部改
良した方法を用いて行った。Millipore ring（日本ミリ
ポア社製）を0.22μm のmembrane filter (HAWPO：日本
ミリポア社製）でシールして chamberを作成する。この
chamber内へ PBSで懸濁した１×107 個のヒト大腸癌 W
iDr 細胞を封入した。次に、６〜８週齢のBalb／c(nu／
nu）雌マウスの背側皮下に空気のうを作製し、先のcham
ber を移植した。移植が完了してから６時間後にボレリ
ジンを腹腔内へ投与し、以後１日１回３日間連投した。
Chamber 移植４日後に51Crラベルしたマウス赤血球を尾
静脈より注入し、５分後にマウスを屠殺した。次に、ch
amber に接した部分の皮フを切除し凍結した後に chamb
erに接した部分のみを正確に切り離し、γ−counter に
よって血液量を測定した。PBS を封入した chamberを移
植した場合の血液量を前記の血液量より差し引いた値を
血管新生量（血液量）とした。尚、実験はコントロール
（CT) は１群10匹、ボレリジン投与群は１群５匹で行っ
た。図３に結果を示すが、1.8 および６mg／kg投与群で
血管新生阻害作用を示した。ただし、６mg／kg投与群で
は毒性も現われ２匹のマウスが死亡した。
kamoto et al., Cancer J.，1, 55-57, 1986）を一部改
良した方法を用いて行った。Millipore ring（日本ミリ
ポア社製）を0.22μm のmembrane filter (HAWPO：日本
ミリポア社製）でシールして chamberを作成する。この
chamber内へ PBSで懸濁した１×107 個のヒト大腸癌 W
iDr 細胞を封入した。次に、６〜８週齢のBalb／c(nu／
nu）雌マウスの背側皮下に空気のうを作製し、先のcham
ber を移植した。移植が完了してから６時間後にボレリ
ジンを腹腔内へ投与し、以後１日１回３日間連投した。
Chamber 移植４日後に51Crラベルしたマウス赤血球を尾
静脈より注入し、５分後にマウスを屠殺した。次に、ch
amber に接した部分の皮フを切除し凍結した後に chamb
erに接した部分のみを正確に切り離し、γ−counter に
よって血液量を測定した。PBS を封入した chamberを移
植した場合の血液量を前記の血液量より差し引いた値を
血管新生量（血液量）とした。尚、実験はコントロール
（CT) は１群10匹、ボレリジン投与群は１群５匹で行っ
た。図３に結果を示すが、1.8 および６mg／kg投与群で
血管新生阻害作用を示した。ただし、６mg／kg投与群で
は毒性も現われ２匹のマウスが死亡した。
【００３４】実施例４．ヒト大腸癌株 WiDr 細胞に対す
る抗腫瘍活性 ３×106 個のヒト大腸癌 WiDr 細胞をBalb／c(nu／nu)
マウスの皮下に移植し、翌日よりボレリジンを一日一
回、週５回のスケジュ−ルで５週間にわたり腹腔内投与
した。ボレリジンは各濃度を１％ NaHCO3 水に溶解して
使用した。また経時的に腫瘍サイズを測定し、相対的腫
瘍体積を算出した。その結果、表６に示されるように、
ボレリジンは抗腫瘍作用を示すとともに長期連投が可能
な化合物であることが判明した。
る抗腫瘍活性 ３×106 個のヒト大腸癌 WiDr 細胞をBalb／c(nu／nu)
マウスの皮下に移植し、翌日よりボレリジンを一日一
回、週５回のスケジュ−ルで５週間にわたり腹腔内投与
した。ボレリジンは各濃度を１％ NaHCO3 水に溶解して
使用した。また経時的に腫瘍サイズを測定し、相対的腫
瘍体積を算出した。その結果、表６に示されるように、
ボレリジンは抗腫瘍作用を示すとともに長期連投が可能
な化合物であることが判明した。
【００３５】
【表６】
【００３６】実施例５. ヒト前立腺癌株PC−３細胞に対
する抗腫瘍活性 ３×106 個のPC−３細胞をBalb／c(nu／nu) マウス（対
照群６匹、実験群６匹）の皮下に移植し、10日後よりボ
レリジンを１日１回腹腔内へ投与した。ボレリジンは１
％NaHCO3水に溶解し、1.8 mg／kgを投与した。その結
果、図４に示されるように明らかな抗腫瘍作用を示し
た。
する抗腫瘍活性 ３×106 個のPC−３細胞をBalb／c(nu／nu) マウス（対
照群６匹、実験群６匹）の皮下に移植し、10日後よりボ
レリジンを１日１回腹腔内へ投与した。ボレリジンは１
％NaHCO3水に溶解し、1.8 mg／kgを投与した。その結
果、図４に示されるように明らかな抗腫瘍作用を示し
た。
【００３７】実施例６．自然転移抑制作用 ５×105 個のマウスB16BL6X ラノーマ細胞をマウス（対
照群10匹、実験群５匹）のfoot padへ皮下移植し、６日
後よりボレリジンを１日１回10日間腹腔内へ投与した。
移植後21日目に原発巣のある後肢を切断し、移植後26日
目より再びボレリジンを７日間投与した。移植後33日目
に肺への転移数を測定した。その結果、表７に示される
ように1.8 mg／kg投与群マウスで顕著な転移抑制効果を
示した。
照群10匹、実験群５匹）のfoot padへ皮下移植し、６日
後よりボレリジンを１日１回10日間腹腔内へ投与した。
移植後21日目に原発巣のある後肢を切断し、移植後26日
目より再びボレリジンを７日間投与した。移植後33日目
に肺への転移数を測定した。その結果、表７に示される
ように1.8 mg／kg投与群マウスで顕著な転移抑制効果を
示した。
【００３８】
【表７】
【図１】 実施例１で得られたボレリジンの紫外線吸収
スペクトルである。
スペクトルである。
【図２】 実施例１で得られたボレリジンの赤外線吸収
スペクトルである。
スペクトルである。
【図３】 実施例３で行ったマウス皮下におけるヒト大
腸癌WiDr細胞株の血管新生能に対するボレリジンの効果
を示す図である。
腸癌WiDr細胞株の血管新生能に対するボレリジンの効果
を示す図である。
【図４】 実施例５で行ったマウスの皮下におけるヒト
前立腺癌株PC-3細胞に対するボレリジンの抗腫瘍活性効
果を示す図である。
前立腺癌株PC-3細胞に対するボレリジンの抗腫瘍活性効
果を示す図である。
【手続補正書】
【提出日】平成８年１月８日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００８】
【化１】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 成瀬 庸彰 茨城県牛久市南７−55−５ (72)発明者 横山 由美 茨城県新治郡新治村大畑1510−38 (72)発明者 渡辺 吉雄 神奈川県藤沢市藤が岡２−22−３ (72)発明者 岡村 和彦 神奈川県藤沢市白旗３−９−26
Claims (3)
- 【請求項１】 ボレリジン（Borrelidin）またはその塩
を有効成分として含有してなる血管新生阻害剤。 - 【請求項２】 ボレリジン（Borrelidin）またはその塩
を有効成分として含有してなる抗固形癌剤。 - 【請求項３】 ストレプトミセス・ロチェイ (Streptom
yces rochei) Mer-N 7167(FERM P-14670）を栄養培地中
で培養し、その培養液からボレリジンを採取することを
特徴とするボレリジンの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31967494A JPH08173176A (ja) | 1994-12-22 | 1994-12-22 | 血管新生阻害剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31967494A JPH08173176A (ja) | 1994-12-22 | 1994-12-22 | 血管新生阻害剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08173176A true JPH08173176A (ja) | 1996-07-09 |
Family
ID=18112930
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31967494A Pending JPH08173176A (ja) | 1994-12-22 | 1994-12-22 | 血管新生阻害剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08173176A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001009113A3 (en) * | 1999-08-02 | 2001-06-14 | Gyogyszerkutato Intezet | Heterocyclic compounds inhibiting angiogenesis |
| US7560252B2 (en) | 2002-12-27 | 2009-07-14 | Biotica Technology Limited | Borrelidin-producing polyketide synthase and its use |
| JP2014224102A (ja) * | 2013-04-19 | 2014-12-04 | 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 | ジャガイモそうか病抑制剤 |
-
1994
- 1994-12-22 JP JP31967494A patent/JPH08173176A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001009113A3 (en) * | 1999-08-02 | 2001-06-14 | Gyogyszerkutato Intezet | Heterocyclic compounds inhibiting angiogenesis |
| US6815465B1 (en) | 1999-08-02 | 2004-11-09 | IVAX International GmbH | Heterocyclic compounds inhibiting angiogenesis |
| US7560252B2 (en) | 2002-12-27 | 2009-07-14 | Biotica Technology Limited | Borrelidin-producing polyketide synthase and its use |
| JP2014224102A (ja) * | 2013-04-19 | 2014-12-04 | 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 | ジャガイモそうか病抑制剤 |
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