JPH0817700B2 - アルカリプロテアーゼの製造法 - Google Patents

アルカリプロテアーゼの製造法

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JPH0817700B2
JPH0817700B2 JP1029872A JP2987289A JPH0817700B2 JP H0817700 B2 JPH0817700 B2 JP H0817700B2 JP 1029872 A JP1029872 A JP 1029872A JP 2987289 A JP2987289 A JP 2987289A JP H0817700 B2 JPH0817700 B2 JP H0817700B2
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【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、アルカリプロテアーゼの製造法に関する。
〔従来の技術〕
従来、黄麹菌の１種であるアスペルギルス・オリゼー
（Aspergillus orzae）由来のアルカリプロテアーゼ遺
伝子の構造については、全く未知であり、また、該遺伝
子の単離すらされていないのが実情である。
アルカリプロテアーゼは、蛋白質又はその部分加水分
解物に作用して、ペプタイド結合を分解する加水分解酵
素であって、医薬、飲食品、洗剤等広範に用いられてい
る。
〔発明が解決しようとする課題〕
本発明は、アルカリプロテアーゼの製造法を提供する
ことを目的とするものである。
〔課題を解決するための手段〕
そこで、本発明者等は、先にアスペルギルス・オリゼ
ー由来のアルカリプロテアーゼ遺伝子について種々検討
した結果、アスペルギルス・オリゼー由来のアルカリプ
ロテアーゼ遺伝子及びプレプロ型アルカリプロテアーゼ
遺伝子を初めて単離及び構造決定することに成功し、特
許出願を行なった（特願昭63-51777号及び特願昭63-279
401号並びに特願昭63-170018号及び特願昭63-280370号
特許出願明細書）。
その後、本発明者等は、プレプロ型アルカリプロテア
ーゼ遺伝子を用い、アルカリプロテアーゼを効率よく生
産すべく種々検討した結果、アスペルギルス・オリゼー
由来のプレプロ型アルカリプロテアーゼ遺伝子をプラス
ミドベクターDNAに挿入した組み換え体DNAを含み、アル
カリプロテアーゼ生産能を有するチゴサッカロマイセス
・ルーキシー（Zygossaccharomyces rouxii）を培地に
培養すれば、該酵母菌体外に効率よくアルカリプロテア
ーゼが分泌生産されること等の知見を得、本発明を完成
した。
すなわち、本発明は、下記に示されるアミノ酸配列を
コードするプレプロ型アルカリプロテアーゼ遺伝子をベ
クターDNAに挿入した組み換え体DNAを含み、アルカリプ
ロテアーゼ生産能を有するチゴサッカロマイセス属に属
する微生物を培地に培養し、培養物よりアルカリプロテ
アーゼを採取することを特徴とするアルカリプロテアー
ゼの製造法である。
以下、本発明を詳細に説明する。
先ず、本発明に用いられるアルカリプロテアーゼ遺伝
子のドナーとして用いられるアスペルギルス・オリゼー
としては、例えば、アスペルギルス・オリゼー（ATCC 2
0386）等が挙げられる。
次いで、上記微生物を、特公昭48-38873号公報記載の
方法と全く同様にして培養し、培養物を得、該培養物か
ら常法、例えば、濾過、遠心分離処理等によりアスペル
ギルス・オリゼーの菌体を得る。
上記アスペルギルス・オリゼーの菌体よりｍ−RNAを
調製するには、例えば、菌体の破砕の際、ガラスビーズ
及びフェノールを用いる以外は、例えば、「モレキュラ
ー・クローニング」（Molecular Cloning）、第196頁、
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold
Spring Harbor Laboratory）（1982）及び「分子遺伝
学実験法」、小関治男、志村令郎、第66〜67頁（1983）
記載の方法等により得ることができる。
得られたｍ−RNAよりアルカリプロテアーゼをコード
するｍ−RNA（以下、アルカリプロテアーゼｍ−RNAとい
う）を濃縮するには、例えば、「バイオメディカル・リ
サーチ（Biomedical Research）」第３巻、第534〜540
頁（1982）記載の方法により行うことができる。
なお、この際、アルカリプロテアーゼに対する抗アル
カリプロテアーゼ血清を使用するのであるが、該血清
は、例えば、「免疫化学」、山村雄一、第43〜50頁（19
73）記載の方法により得ることができる。
アルカリプロテアーゼｍ−RNAよりｃ−DNAを合成する
には、例えば、「モル・セル・バイオル」（Mol.Cell B
iol.）、第２巻、第161頁（1982）及び「ジーン」（Gen
e）、第25巻、第263頁（1983）記載の方法により行うこ
とができる。
次いで、このようにして得られたｃ−DNAをベクターD
NA、例えば、プラスミドpUC119DNA（宝酒造社製）等に
組み込み、種々の組み換え体プラスミドDNAを得、該DNA
を用いて例えば、大腸菌（E.coli）DH1（ATCC 3384
9）、大腸菌（E.coli）HB101（ATCC 33694）等をハナハ
ン（Hanahan）の方法〔「ディーエヌエイ・クローニン
グ」（DNA Cloning）、第１巻、第109〜135頁（198
5）〕により形質転換し、種々の形質転換株を得る。
上記の種々な形質転換株よりアルカリプロテアーゼを
コードするｃ−DNA（以下、アルカリプロテアーゼｃ−D
NAという）を検出するには、ハイブリダイゼーション・
セレクション〔「モレキュラー・クローニング」（Mole
cular Cloning）、第329〜333頁及び第344〜349頁、コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold S
pring Habor Laboratory）（1982年）〕により検出する
ことができる。
次いで、不完全なアルカリプロテアーゼｃ−DNAを32P
を用いニックトランスレーション法〔「モレキュラー・
クローニング」（Molecular Cloning）、第109〜112
頁、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
（Cold Spring Habor Laboratory）（1982年）、及び
「ジェイ・モル・バイオル」（J.Mol.Biol.）、第113
巻、第237〜251頁（1977）〕により標識したのち、該ｃ
−DNAをプローブとしてコロニーハイブリダイゼーショ
ン法〔「蛋白質・核酸・酵素」、第26巻、第575〜579頁
（1981）〕によりプラスミドpUC119DNAをベクターとし
て作成したｃ−DNAのジーンバンクのライブラリーより
1.5Kbのアルカリプロテアーゼｃ−DNAを含有するプラス
ミドDNAを得ることができる。
そして、このようにして得られた組み換え体ブラスミ
ドDNAよりアスペルギルス・オリゼー由来のアルカリプ
ロテアーゼをコードする遺伝子においてプレプロ領域を
有するもの（以下、プレプロ型アルカリプロテアーゼ遺
伝子という）を含有するDNAを得るには、該プラスミドD
NAに、制限酵素、例えばEcoRＩを温度30〜40℃、好まし
くは37℃で１〜24時間、好ましくは２時間作用させ、得
られた反応終了液を、アガロースゲル電気泳動法〔「モ
レキュラー・クローニング」（Molecular Cloning）、
第150頁、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラト
リー（Cold Spring Harbor Laboratory）（1982）記
載〕によりアスペルギルス・オリゼー由来のプレプロ型
アルカリプロテアーゼ遺伝子を含有するDNAを得ること
ができる。
そして、このプレプロ型アルカリプロテアーゼ遺伝子
の塩基配列の決定を実施例の項目11に示すような方法に
よって行ない（第５図に塩基配列を示す）、次いで、前
記塩基配列を有する遺伝子によって翻訳されるポリペプ
タイドのアミノ酸配列を確定する（第６図参照）。
次いで、後記実施例の項目12に記載と同様にし、例え
ば種々のベクターDNAに、制限酵素EcoRI,PstI,SalI,Pvu
II及びSspＩ（いずれも宝酒造社製）を温度30〜40℃、
好ましくは37℃で１〜16時間、好ましくは２時間作用さ
せて、該ベクターDNAを切断したものに、上記のように
して得たプレプロ型アルカリプロテアーゼ遺伝子を含有
するDNA及びT4DNAリガーゼ（宝酒造社製）等のDNAガー
ゼを添加して常法により連結されて組み換え体DNAを得
る。
また、発現ベクターDNAとしては如何なるものでもよ
く、例えば、後記実施例の項目12記載の組み換え体プラ
スミドpSRT303P及びpGAG41DNAを組み換えることにより
得られる組換え体プラスミドpZAP101ADNAによりプレプ
ロ型アルカリプロテアーゼ遺伝子部分を取り除き連結し
て得られるプラスミドベクター等が挙げられる。
そして、このようにして得られた組み換え体DNAを用
いて、チゴサッカロマイセス属に属する微生物例えば、
チゴサッカロマイセス・ルーキシー（IFO 1876）等を、
木村の方法〔組み換えDNA実験技術，第243〜253頁（198
5）〕により形質転換して、プレプロ型アルカリプロテ
アーゼ遺伝子をベクターDNAに挿入した組み換え体DNAを
含みアルカリプロテアーゼ分泌生産能を有するチゴサッ
カロイマイセス属に属する微生物を得る。
このようにして得たチゴサッカロマイセス属に属する
微生物より、純化された新規な組換え体DNAを得るに
は、例えばプロク・ナトル・アカド・サイ（Proc.Natl.
Acad.Sci）第62巻、第1159〜1166頁（1969）記載の方法
等により得ることができる。
次いで、上記微生物を培地に培養し、培養物よりアル
カリプロテアーゼを採取するのである。
培地としては、例えば、チゴサッカロマイセス属に属
する微生物の培養に用いられるものであれば、如何なる
ものでもよく、例えば、グルコース、ポリペプトン、酵
素エキスからなるYPD培地にゲンチシン（Geneticin）
〔ギブコ・ラボラトリー（GIBCO Laboratories）製、抗
生物質G418硫酸塩の商標名〕を含有させた培地等が挙げ
られる。
また、培養温度は、例えば、25〜35℃、好ましくは30
℃程度で、培養時間は、例えば、６〜100時間、好まし
くは72時間程度である。
そして、培養物を、例えば、3,000r.p.m.で２分間程
度の遠心分離処理又はメンブランフィルター処理し、培
養液及び菌体を得、得られた培養液は、粗酵素液として
用いることができ、また、得られた菌体を、例えば、ガ
ラスビーズと共に、ボルテックスミキサーにより３分間
程度撹拌して破砕し、粗酵素液を得る。
そして、夫々の粗酵素液は、そのままでも使用可能で
あるが、必要により硫安分画，イオン交換クロマトグラ
フ法（例えば、DEAE−バイオゲルＡ等による）ゲル濾過
法（例えば、ウルトロゲルAcA34等による）により精製
して、純化されたアルカリプロテアーゼを得る。
このようにして得られたアルカリプロテアーゼの理化
学的性質は、「アグル・バイオル・ケム」（Agr.Biol.C
hem.）、第37巻、第2685〜2694頁（1973年）に記載され
たものと全く同様である。
〔発明の効果〕
上述したことから明らかな如く、本発明によれば、プ
レプロ型アルカリプロテアーゼ遺伝子の組み込まれた組
み換え体DNAを含む、チゴサッカロマイセス属に属する
微生物を培地に培養することにより、極めて短期間のう
ちに、アルカリプロテアーゼを効率よく分泌生産させる
ことができるので、本発明は、産業上極めて有用てあ
る。
〔実施例〕
以下、本発明を実施例を挙げて更に詳細に説明する。
実施例 黄麹菌アスペルギルス・オリゼー（ATCC 20386）由来
のプレプロ型アルカリプロテアーゼｃ−DNAのクローニ
ング 1.菌体の取得 黄麹菌アスペルギルス・オリゼー（ATCC 20386）の胞
子（1.2×108個）を、アルカリプロテアーゼ生産培地
〔３％（W/V）加熱、加圧膨化処理した脱脂大豆、３％
（W/V）KH2PO4〕50mlに接種し、恒温振盪機（大洋科学
工業社製、Ｍ−100n）を用いて120r.p.m、温度30℃で45
時間振盪培養を行ない培養物を得、常法によりこの培養
物を濾過して菌体10gを得た。
2.m−RNAの取得 項目１で得られた菌体10gを、20mlのグアニジンイソ
チオシアネート溶液〔6Mグアニジンイソチオシアネート
/37.5mMクエン酸ナトリウム（pH7.0）/0.75％（W/V）Ｎ
−ラウロイルザルコシンナトリウム/0/15M β−メルカ
プトエタノール〕に添加したものを、カップ型ブレンダ
ー（日本精機製作所社製）に入れ、更に、10gのガラス
ビーズ（直径0.5mm）を添加し、10,000r.p.m.で５分間
処理したのち、また更に、10mlの水飽和フェノールを添
加し、10.000r.p.m.で10分間処理して菌体を破砕処理
し、破砕物を得た。
このようにして得られた破砕物を冷却遠心機（日立工
機社製、18PR-52）を用いて5,000r.p.m.で10分間遠心分
離処理して、菌体破砕液20mlを得た。
次いで、超遠心分離機用チューブ（日立工機社製）４
本に、予め1.2mlの5.7Mの塩化セシウム溶液を夫々重層
し、その上に、上記菌体破砕液を重層するように夫々分
注し、超遠心分離機（日立工機社製、SCP55H）を用いて
温度15℃、30,000r.p.m.で16時間遠心分離して沈澱物を
得た。
得られた沈澱物を、冷70％（V/V）エタノールを用い
て洗浄したものを、10mMトリス緩衝液〔10mMトリス−塩
酸緩衝液（pH7.4）/5mM EDTA/1％ドデシル硫酸ナトリウ
ム〕4mlに懸濁したものに、同量のｎ−ブタノール及び
クロロフォルムを４対１（容量比）となる如く混合した
ものを添加して抽出し、常法により3,000r.p.m.で10分
間遠心分離し、水層及び有機溶媒層に分離し、この有機
溶媒層に上記10mMトリス緩衝液4mlを添加し、上記抽出
及び分離操作を行う操作を２回繰り返して得られた水層
に、1/10層の3M酢酸ナトリウム（pH5.2）及び２倍量の
冷エタノールを添加したものを温度−20℃で２時間放置
したのち、常法により8,000r.p.m.で20分間遠心分離
し、RNAを沈澱させ、得られたRNAを4mlの水に溶解し、
上記エタノール沈澱操作を行ない、得られたRNAを1mlの
水に溶解し、12mgのRNAを得た。
このRNA中よりｍ−RNAを選択するために、12mgのRNA
を、オリゴ（dT）−セルロース（ニューイングランドバ
イオラボ社製）カラムクロマトグラフィーにかけた。
カラムとして2.5mlテルモシリンジ（テルモ社製）を
用い、樹脂0.5gは、溶出緩衝液〔10mMトリス−塩酸緩衝
液（pH7.6）/1mM EDTA/0.1％（W/V）ドデシル硫酸ナト
リウム〕で膨潤させたのち、カラムに充填し、結合緩衝
液〔10mMトリス−塩酸（pH7.6）/1mM EDTA/0.4M NaCl/
0.1％ドデシル硫酸ナトリウム〕で平衡化したものであ
る。
12mgのRNAに、同量の緩衝液〔10mMトリス−塩酸（pH
7.6）/1mM EDTA/0.8M NaCl/0.1％ドデシル硫酸ナトリウ
ム〕を添加し、温度65℃で10分間加熱処理し、氷中で急
冷し、オリゴ（dT）−セルロースカラムにかけたのち、
結合緩衝液で樹脂を洗浄し、未結合のｒ−RNA及びｔ−R
NAを完全に洗浄し、更に、溶出緩衝液でｍ−RNAを溶出
し、90μｇのｍ−RNAを得た。
3.アルカリプロテアーゼｍ−RNAの濃縮 次に、ショ糖密度勾配遠心分離法によりアルカリプロ
テアーゼｍ−RNAを濃縮した。
10〜25％（W/V）のショ糖密度勾配は、ベックマン社
製のローターSW41用ポリアロマチューブに40％（W/V）
ショ糖液〔50mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）/20mM NaC
l/1mM EDTA/40％（W/V）ショ糖〕0.5mlを入れ、その上
に2.4mlずつ25％（W/V）、20％（W/V）、15％（W/V）及
び10％（W/V）のショ糖液を重層し、温度４℃で24時間
放置することにより作製した。このショ糖密度勾配に、
項目２で得たｍ−RNA50μｇを重層し、ベックマン社製
のSW41ローターを用い、常法により30,000r.p.m.、温度
18℃で18時間遠心分離を行った。遠心分離操作ののち、
0.5mlずつ分画し、エタノール沈澱法によりｍ−RNAを回
収し、10μｌの水に溶解した。
次に、ｍ−RNAコードされている蛋白質を調べること
により、アルカリプロテアーゼｍ−RNAが濃縮されてい
る画分の同定を行なった。分画したｍ−RNA1μｌ、ウサ
ギ網状赤血球ライセート（アマシャム社製）９μｌ及び
〔35S〕メチオニン１μｌ（アマシャム社製）を混合
し、温度30℃で30分間反応させたものに、150μｌのNET
緩衝液〔150mM NaCl/5mM EDTA/0.02％（W/V）NaN3/20mM
トリス−塩酸緩衝液（pH7.4）/0.05％（W/V）ノニデッ
トＰ−40（ベセスダリサーチラボラトリー社製、界面活
性剤）〕を添加し、更に、１μｌの抗アルカリプロテア
ーゼ血清（後述のようにして調製したもの。）を添加
し、温度４℃で18時間放置したものに、10mgのプティン
Ａセファロース（ファルマシア社製）を添加し、温度20
℃で30分間放置したものを、常法より12,000r.p.m.で１
分間遠心分離処理し、樹脂、すなわち、上記プロティン
Ａセファロースを回収した。
回収した樹脂を、200μｌのNET緩衝液で３回洗浄し、
この樹脂に、40μｌのSDS−PAGE用サンプル緩衝液〔62.
5mMトリス−塩酸緩衝液（pH6.8）/10％（V/V）グリセロ
ール/2％（W/V）ドデシル硫酸ナトリウム/5％（V/V）メ
ルカプトエタノール/0.02％（W/V）ブロムフェノールブ
ルー〕を添加し、温度100℃で３分間煮沸し、常法によ
り12,000r.p.m.で１分間遠心分離処理し、上清を回収
し、全量を12％（W/V）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリ
アクリルアミドゲルに乗せた。
ゲル電気泳動は、ラエムリ（Laemmli）の方法〔「ネ
ーチュアー」Nature）、第227頁、第680頁（1970）〕で
行ない、泳動したのちのゲルは、10％（V/V）の酢酸に3
0分間浸漬し、蛋白質を固定したのち、水に30分間浸漬
し、更に、1Mサリチル酸ナトリウム溶液に30分間浸漬
し、乾燥して乾燥ゲルを得、Ｘ線フィルム（フジ写真フ
ィルム社製、RX）を用いてフルオログラフィーを行っ
た。
以上の操作により、アルカリプロテアーゼｍ−RNAの
存在する画分のｍ−RNAを用いた場合にのみ、アルカリ
プロテアーゼ蛋白質のバンドがＸ線フィルム上に認めら
れ、アルカリプロテアーゼｍ−RNAの濃縮されている画
分が同定できた。
4.アルカリプロテアーゼ血清の調製 精製アルカリプロテアーゼに対するウサギの抗アルカ
リプロテアーゼ血清は、以下の方法により調製した。
40mg/ml濃度のアルカリプロテアーゼ溶液0.7mlを、等
量のフロインド（Freund）完全アジュバントで懸濁した
もの28mgを、抗原として体重2kgの日本白色種ウサギの
視床部に投与し、飼育２週間経過したのち、初回と同量
の抗原を背部皮内へ投与し、更に、飼育１週間経過した
のち、同様の操作を行い、また更に、飼育１週間後全採
血を行った。
そして、得られた血液を、温度４℃で18時間放置した
ものを、常法により3,000r.p.m.で15分間遠心分離し、
上清として抗アルカリプロテアーゼ血清を得た。
5.c−DNAの合成 ｃ−DNAの合成は、アマシャム社製キットを用いて行
ったものである。
上述の如くして得られたｍ−RNA1.6μｇを用いてアマ
シャム社の指示する「モル・セル・バイオル」（Mol.Ce
ll Biol.）、第２巻、第161頁（1982）及び「ジーン」
（Gene）、第25巻、第263頁（1983）記載の方法に従い
実施した結果、160ngの２本鎖ｃ−DNAが得られた。
このようにして得たｃ−DNA 160ngに、アマシャム社
製ｃ−DNAクローニングキッドを用い、アマシャム社の
指示する方法により制限酵素EcoRI切断部位のメチル化
を行い、更にｃ−DNAの両端にEcoRIリンカーを付着させ
た。
6.c−DNAバンクの作製 プラスミドpUC119DNA（宝酒造社製）100ngを、８μｌ
の水に溶解したものに、１μｌのMed緩衝液〔100mMトリ
ス−塩酸緩衝液（pH7.5）/100mMMgCl2/10mMジチオスレ
イトール/500mM NaCl〕を添加したのち、更に、これ
に、10ユニット（１μｌ）の制限酵素EcoRI（宝酒造社
製）を添加し、温度37℃で２時間切断処理を行った。
次いで、この切断処理物に、１μｌの1Mトリス−塩酸
緩衝液（pH8.0）及び0.3ユニット（１μｌ）のアルカリ
フォスファターゼ（宝酒造社製）を添加し、温度65℃で
１時間酵素反応処理し、切断処理物の両端の脱リン酸化
を行い、これに、12μｌの水飽和フェノールを添加して
除蛋白を行ったのち、回収した水層に、１μｌの3M酢酸
ナトリウム（pH5.8）及び26μｌの冷エタノールを夫々
添加し、温度−70℃で15分間放置し、微量遠心機
〔（株）トミー精工、MRX−150〕を用い、12,000r.p.m.
で５分間遠心分離処理を行いDNAを回収した。
このようして得られた制限酵素EcoRIで切断し、かつ
両端を脱リン酸化したプラスミドベクターpUC119DNA 10
0ngと、項目５で調製したｃ−DNA 160ngを混合したもの
を、８μｌの水に懸濁したのち、これに、１μｌのX10
ライゲーション緩衝液〔200mM MgCl2/660mM トリス−
塩酸緩衝液（pH7.6）/10mM ATP/150mM ジチオスレイト
ール〕を添加したものに、１ユニット（１μｌ）のT4 D
NAリガーゼ（宝酒造社製））を添加し、温度16℃で16時
間放置し、上記プラスミドベクターDNA及びｃ−DNAのラ
イゲーションを行ない反応物を得た。
こ反応物を用いて、ハナハン（Hanahan）の方法
〔「ディーエヌエイ・クローニング」（DNA Clonin
g）、第１巻、第109〜135頁（1985）〕により大腸菌DH1
株（ATCC 33849）を形質転換し、プラスミドpUC119DNA
をベクターとしてｃ−DNAバンクを作製した。
7.アルカリプロテアーゼｃ−DNAの断片の検索 ハイブリダイゼーション・セレクション〔「モレキュ
ラー・クローニング」（Molecular Cloning）、第329
頁、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
（1982）〕に従ってアルカリプロテアーゼｃ−DNAの検
索を行った。以下に、詳述する。
項目６で得られたｃ−DNAバンクより任意な大腸菌70
株を選び夫々について以下の操作を行った。「モレキュ
ラー・クローニング」（Molecular Cloning）、第86
頁、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
（1982）記載の方法により、ｃ−DNAバンク中の大腸菌
から組み換え体プラスミドDNA500μｇを夫々得た。この
うち100μｇを、水200μｌに溶解し、温度100℃で10分
間放置したのち、氷中に移して急冷したものに、200μ
ｌの1M水酸化ナトリウムを添加し、室温にて20分間放置
し、組み換え体プラスミドDNAの変性液を得た。
次いで、このようにして得た変性液に、200μｌの中
和液〔1M塩化ナトリウム/0.3Mクエン酸ナトリウム/0.5M
トリス−塩酸緩衝液（pH8.0）/1M塩酸〕をすばやく添
加、混和したのち、氷中へ移して急冷した。この溶液
を、直径5mmの円形ニトロセルロースフィルター（ミリ
ポア社製、カタログナンバーHAWP 025 00）を用いて濾
過し、変性した組み換え体プラスミドDNAをニトロセル
ロースフィルター上に吸着させたものを、常法により風
乾したのち、６×SSC（0.9M塩化ナトリウム/0.09Mクエ
ン酸ナトリウム）を用いて洗浄し、更に常法により風乾
したのち、温度80℃に保った真空オーブン中で２時間放
置し、組み換え体プラスミドDNAをニトロセルロースフ
ィルターへ固定させた。
次いで、10μｌのハイブリダイゼーション溶液〔100
μg/ml m−RNA（項目２で調製したもの）/65％（V/V）
脱イオン化したホルムアミド/20mM1,4−ピペラジンジエ
タンスルホン酸（pH6.4）/0.2％ドデシル硫酸ナトリウ
ム/0.4M塩化ナトリウム/100μg/ml酵母ｔ−RNA〕に、上
記の如くして得た組み換え体プラスミドDNAを固定した
ニトロセルロースフィルターを浸し、温度50℃にて３時
間放置し、フィルター上の組み換え体プラスミドDNAと
ｍ−RNAとのハイブリダイゼーションを行った。反応終
了したフィルターを取り出し1mlの洗浄液Ｉ〔10mMトリ
ス−塩酸緩衝液（pH7.6）/0.15M塩化ナトリウム/1mM ED
TA/0.5％ドデシル硫酸ナトリウム〕で９回洗浄したの
ち、1mlの洗浄液II〔10mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.6）
/0.15M塩化ナトリウム/1mM EDTA〕にて２回洗浄を行
い、フィルター上に固定したプラスミドDNAとハイブリ
ダイズしていないｍ−RNAを除去した。
次いで、このニトロセルロースフィルターを、100μ
ｌの水中へ移し、10μｇの酵母ｔ−RNAを添加して、１
分間100℃の湯中へ放置し、ドライアイスで冷却したエ
タノール中へ移したのち、室温中で放置し溶解した。こ
のようにしてハイブリダイズしたｍ−RNAをニトロセル
ロースフィルターより剥離した。得られた水溶液に、10
μｌの3M酢酸ナトリウム（pH5.2）及び300μｌの冷エタ
ノールを添加し、温度−70℃にて１時間放置し、エタノ
ール沈澱を行ったのち、微量遠心機〔（株）トミー精
工、MRX−150〕を用いて12,000r.p.m.で５分間遠心分離
処理して上記ハイブリダイズしたｍ−DNAを回収した。
次いで、項目３に記載したと同様にして、回収した上
記ｍ−RNAにコードされている蛋白質を合成し、項目４
で得られた抗アルカリプロテアーゼ血清を用いて、合成
した蛋白質がアルカリプロテアーゼか否かを分析した。
その結果70株中１株についてポジティブな結果が得ら
れた。この株の保有する組み換え体プラスミドDNA（pOA
P３と命名）にはアスペルギルス・オリゼー（ATCC 2038
6）由来のアルカリプロテアーゼｃ−DNAの断片が挿入さ
れていると結論できる。
次いで、組み換え体プラスミドpOAP3DNA1μｇを項目
６に記載の方法により制限酵素EcoRIで処理しアガロー
スゲル電気泳動法により移動度パターンを分析し、得ら
れたパターンとプラスミドpBR322DNA（宝酒造社製）を
制限酵素AluＩにより消化して得られたDNA断片の標準パ
ターンと対比することにより、組み換え体プラスミドpO
AP3DNAに挿入されているアルカリプロテアーゼｃ−DNA
断片の大きさは750bpであることが判明した。
8.大きなアルカリプロテアーゼｃ−DNAの検索 項目７で得られたアガロースゲルより750bpのアルカ
リプロテアーゼｃ−DNA断片を含むアガロースゲルを切
りだし、透析チューブに入れたものに、500μｌのTE緩
衝液〔10mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）/1mM EDTA）〕
を添加したのち、透析チューブをシールし、電気泳動に
より、ゲル中より緩衝液中にDNAを溶出した得た溶液
に、等容量の水飽和フェノールを添加して撹拌し、水層
を回収し、常法に従ってエタノール沈澱により100ngの
アルカリプロテアーゼのｃ−DNAを回収した。この100ng
のアルカリプロテアーゼｃ−DNAを、〔α−32P〕dCTP
（アマシャム社製）を用いてニックトランスレーション
法により標識した。ニックトランスレーションは、宝酒
造社の指示する「ジェイ・モル・バイオル」（J.Mol.Bi
ol.）、第113巻、第237〜251頁（1977）及び「モレキュ
ラー・クローニング」（MolecularCloning）、第109〜1
12頁（1982）記載の方法に従った。このようにして調製
した32Pで標識したアルカリプロテアーゼｃ−DNA断片を
プローブとして用い、項目６で得たｃ−DNAバンクに対
しコロニーハイブリダイゼーション法〔「蛋白質・核酸
・酵素」、第26巻、第575〜579頁（1981）〕より検索
し、アルカリプロテアーゼｃ−DNAを有するコロニーを
得た。そのうち１個のコロニーの有する組み換え体プラ
スミドDNAをpOAP5と命名し、項目７に従い組み換え体プ
ラスミドDNAを調製した。
該組み換え体プラスミドDNAを含有する大腸菌を大腸
菌（E.coli）DH1（pOAP 5）と命名した。なお、該形質
転換株は、工業技術院微生物工業技術研究所に、微工研
菌寄第9870号（FERM P−9870）として寄託されている。
組み換え体プラスミドpOAP5DNAを項目６に記載の方法
と同様にして制限酵素EcoRIで処理し、アガロースゲル
電気泳動を行ったところ、挿入DNA断片の大きさは1,100
bpであることが判明した。そして、項目８記載の方法と
同様にししてこの1,100bpのアルカリプロテアーゼｃ−D
NAを含むDNA断片0.1μｇを分離、精製した。組み換え体
プラスミドpOAP5DNAを制限酵素AflII、EcoRＩ、KpnＩ、
SalＩ及びXmnＩの単一または二重消化を行い、項目７に
記載したと同じ方法にて、現われた断片の大きさを分析
することにより、組み換え体プラスミドpOAP5DNAの制限
酵素地図を作製し、該地図を第１図に示した。
9.アルカリプロテアーゼｃ−DNAの塩基配列の決定 項目８で得られた夫々のアルカリプロテアーゼｃ−DN
A断片を、同一又は同一ののりしろの制限酵素により切
断したプラスミドpUC18及びpUC19DNA（宝酒造社製）に
クローニングした。シークエンシングは、プラスミドDN
Aの榊の方法〔「ベクターDNA」、第70頁、講談社（1986
年）〕に従ってアルカリ変性させたのち、M13シークエ
ンスキット（宝酒造社製）を用いて常法によりダイデオ
キシ・チェーン・ターミネーション法で行った。
このようにしてアスペルギルス・オリゼー（ATCC2038
6）由来のアルカリプロテアーゼｃ−DNA断片の塩基配列
を決定し、得られた塩基配列のうち、マチュアーなアル
カリプロテアーゼに対応する遺伝子の塩基配列を第２図
に、また、前記第２図に示す塩基配列を有する遺伝子か
ら翻訳されるポリペプタイドのアミノ酸配列を第３図に
夫々示した。
このDNA塩基配列より推測されるアミノ酸配列のＮ末
端には精製したアルカリプロテアーゼのＮ末端のアミノ
酸配列16個（Gly Leu Thr Thr Glu Lys Ser Ala Pro Tr
p Gly Leu Gly Ser Ile Ser）が確認された（第３図下
線部）。
以上の知見より第２図に示した塩基配列は、マチュア
ーなアルカリプロテアーゼのＮ末端部分よりＣ末端部分
迄をコードしていると結論できる。
10.アルカリプロテアーゼ完全長ｃ−DNAの検索 項目９での塩基配列決定の結果、項目８で得られた組
み換え体プラスミドpOAP５はマチュアーなアルカリプロ
テアーゼのＮ末端部分よりＣ末端部分迄をコードしてい
たが、それより上流にあると考えられるプレプロ領域が
欠如していた。そこで、項目８と同様に組み換え体プラ
スミドpOAP５のアルカリプロテアーゼｃ−DNA断片を単
離した後、ニックトランスレーション法により32Pで標
識し、これをプローブとして項目６で得たｃ−DNAバン
クに対して再度コロニーハイブリダイゼーション法によ
り検索し、更に長いアルカリプロテアーゼｃ−DNAを有
するコロニーを得た。そのうち１個のコロニーの有する
組み換え体プラスミドをpOAP10と命名し、該組み換え体
プラスミドを有する大腸菌を大腸菌（E.coli）DH1（pOA
P10）と命名した。項目７に従い、純化された組み換え
体プラスミドpOAP10DNA,100μｇを調製した。
組み換え体プラスミドpOAP10DNAを項目７に記載の方
法と同様にして制限酵素EcoRIで処理し、アガロースゲ
ル電気泳動を行ったところ、挿入DNA断片の大きさは1,5
00bpであることが判明した。更に組み換え体プラスミド
pOAP10DNAを制限酵素AflII、EcoRI、KpnＩ、SalＩ、Xmn
Ｉ、BglII、HindIIIの単一または二重消化を行い、項目
７に記載したと同じ方法にて、現れた断片の大きさを分
析することにより、組み換え体プラスミドpOAP10DNAの
制限酵素地図を作製し、該地図を第４図に示した。
11.アルカリプロテアーゼ完全長ｃ−DNAの塩基配列の決
定 項目10で得られた組み換え体プラスミドpOAP10から現
れたアルカリプロテアーゼｃ−DNA断片を項目９と同様
に、同一又は同一ののりしろの制限酵素により切断した
プラスミドpUC18およびpUC19DNAにクローニングした。
シークエンシングは項目９と同様にダイデオキシ・チェ
ーンターミネーション法で行った。
このようにしてアスペルギルス・オリゼ（ATCC2038
6）由来のアルカリプロテアーゼｃ−DNAの塩基配列を決
定し、第５図は、実施例項目11に記載の完全長アルカリ
プロテアーゼ（プレプロ型）に対応する遺伝子の塩基配
列を示す。また、前記第５図に示す塩基配列を有する遺
伝子から翻訳されるポリペプタイドのアミノ酸配列を第
６図に夫々示した。図中、塩基番号53（Ａ）〜415
（Ｔ）がプレプロ領域を、塩基番号416（Ｇ）〜1261
（Ｔ）がマチュアーなアルカリプロテアーゼ遺伝子領域
を示す。
前記第５図に示す塩基配列から翻訳されるポリペプタイ
ドは403アミノ酸からなり、精製したアルカリプロテア
ーゼのＮ末端のアミノ酸配列16個（Gly Leu ThrThr Glu
Lys Ser Ala Pro Trp Gly Leu Gly Ser Ile Ser）は12
2番目からのアミノ酸配列に一致した（第６図下線
部）。したがって、Ｎ末端から121番目までのアミノ酸
配列は、アルカリプロテアーゼの分泌に必要なプレプロ
領域であり、122番目から403番目までのアミノ酸配列は
マチュアーなアルカリプロテアーゼをコードする領域で
ある。
以上の知見より第５図に示した塩基配列は、プレプロ
領域までを含んだアルカリプロテアーゼの全ポリペプタ
イドをコードしていると結論できる。
12.組み換え体プラスミドpZAP101ADNAの構築 チゴサッカロマイセス・ルーキシーにおける組み換え
体プラスミドpZAP101ADNAを構築するために、先ずアン
ピシリン耐性を有するプラスミドpUC19DNA（宝酒造社
製）１μｇを制限酵素EcoRI及びPstＩ（いずれも宝酒造
社製）を用いて、温度37℃で16時間反応し、完全切断さ
せた。その完全切断物全量を0.7％アガロースゲル電気
泳動により、EcoRI−PstＩによるアンピリシン耐性遺伝
子を含む長いDNA断片と耐性遺伝子を含まない短いDNA断
片とに分離した。アンピシリン耐性遺伝子を含むEcoRI
−PstＩによるDNA断片をゲルから抽出し、常法によりフ
ェノール処理及びエタノール沈澱を行った。
同様にして、チゴサッカロマイセス・ルーキシーのグ
リセロアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（以下GAPD
Hという）のプロモーター配列を有するプラスミドpTI41
DNA（広島大学 工学部醗酵工学科 東江昭夫氏より入
手）１μｇを前記と同様にしてEcoRI及びPstＩで完全切
断し、0.7kbpのGAPDHのプロモーターを含むEcoRI−Pst
ＩによるDNA断片を得た。
先のプラスミドpUC19DNAのアンピシリン耐性遺伝子を
含むEcoRI−PstＩによるDNA断片と、pTI41DNA由来のGAP
DHプロモーターを含むEcoRI−PstＩによるDNA断片と混
合し、T4DNAリガーゼ（宝酒造社製）を加え、温度16℃
で16時間放置し、両断片の連結を行った。
この反応物を用い、ハナハン（Hanahan）の方法
〔「ディーエヌエイ・クローニング」（DNA Clonin
g）、第１巻 第109〜135頁（1985）〕により大腸菌DHI
株（ATCC 33849）を軽質転換し、得られた軽質転換株よ
りアルカリ法〔リコンビナント・ディーエヌエイ・テク
ニックス（Recombinant DNA Techniques）、第50〜51頁
（1983）〕にてプラスミドDNAを抽出し、プラスミドpUC
19DNAのEcoRI−PstＩによるDNA断片中に、プラスミドpT
I141DNAのEcoRI−RstＩによるDNA断片が挿入されている
プラスミドDNAをpUG41と命名した。
このプラスミドpUG41DNA1μｇを前述のようにしてEco
RIで切断し、この切断処理物にアルカリフォスファター
ゼを添加し、温度65℃で１時間酵素反応処理し、切断処
理物の両端の脱リン酸化を行った。その後、常法により
フェノール処理及びエタノール沈澱を行い、両端を脱リ
ン酸化したプラスミドpUG41DNAのEcoRIによるDNA断片を
得た。
一方で、項目10で得られ、麹菌アルカリプロテアーゼ
ｃ−DNAを含む組換え体pOAP10DNA1μｇを前述の如くし
てEcoRIで切断し、0.7％アガロースゲル電気泳動で1.5k
bpの麹菌アルカリプロテアーゼｃ−DNAを含むEcoRIによ
るDNA断片を分離、抽出し、常法によりフェノール処理
及びエタノール沈澱を行い、先のプラスミドpUG41DNAの
EcoRI断片と混合した。
これに前述の方法でT4DNAリガーゼを添加し、連結し
たのち、大腸菌DH1（ATCC 33849）を、前記ハナハンの
方法により形質転換し、得られた形質転換株より、前述
のアルカリ法にてプラスミドを抽出して、SphＩ及びBg1
II（いずれも宝酒造社製）による２重切断DNAパターン
を夫々アガロースゲル電気泳動法を用いて分析した。こ
の分析によりGAPDHプロモーターに対して順方向にアル
カリプロテアーゼｃ−DNAが組み込まれた組み換え体プ
ラスミドDNAを選択し、この組み換え体プラスミドDNAを
pGAP41と命名した。
得られた組み換え体プラスミドpGAP41DNA1μｇを前述
の如くして制限酵素SspＩ（宝酒造社製）で切断し、常
法によりフェノール処理及びエタノール沈澱を行った。
一方、抗生物質G418耐性遺伝子を有するプラスミドpAT1
36DNA（広島大学工学部醗酵工学科 東江昭夫氏より入
手）１μｇを前述の如くして制限酵素PvuII（宝酒造社
製）で切断し、0.7％アガロースゲル電気泳動で分離、
抽出したのち、フェノール処理及びエタノール沈澱を行
って1.7kbpのG418耐性遺伝子を含むPvuIIによるDNA断片
を得た。このPvuIIによるDNA断片と先の組換え体プラス
ミドpGAP41DNAのSspＩによるDNA断片を混合し、前述の
方法でT4DNAリガーゼにより連結したのち、これを用い
大腸菌DH1（ATCC 33849）株を形質転換し、得られたカ
ナマイシン耐性形質転換株より前述のアルカリ法でプラ
スミドDNA抽出し、組換え体プラスミドpGAP41DNAのSsp
Ｉ部位にプラスミドpAT136のG418耐性遺伝子を含むPvuI
IによるDNA断片が挿入された組換え体プラスミドpGAG41
DNAを得た。
次いで、プラスミドpUC19DNA（宝酒造社製）１μｇを
前述の如くしてSspＩで切断し、フェノール処理及びエ
タノール沈澱し、PstＩリンカー（宝酒造社製）と混合
してT4DNAリガーゼで連結して、前記大腸菌DH1株を形質
転換したのち、得られた形質転換株より前記アルカリ法
でプラスミドDNAを抽出し、プラスミドpUC19DNAのSspＩ
によるDNA断片部位にPstＩリンカーが挿入したプラスミ
ドpUCP19DNAを得た。このpUCP19DNA1μｇを制限酵素Sal
Ｉ（宝酒造社製）で切断し、フェノール処理及びエタノ
ール沈澱によりプラスミドpUCP19DNAのSalＩによるDNA
断片を得た。一方、プラスミドpSRT303D（大阪大学 工
学部 醗酵工学科 大嶋泰治氏より入手）DNA1μｇをSa
lＩで切断し、0.7％アガロースゲル電気泳動で分離、抽
出したのち、フェノール処理及びエタノール沈澱を行な
いチゴサッカロマイセス・ルーキシーの自己増殖プラス
ミドpSR1〔ゼイ・モル・バイオル「J.Mol.Biol.」第182
巻，第191〜203頁（1985）」の塩基配列を含むSalＩ断
片を得た。得られたプラスミドpSRT303DDNAのSalＩによ
るDNA断片及び先のプラスミドpUCP19DNAのSalＩによるD
NA断片をT4DNAリガーゼにより連結したのち、前記大腸
菌DH1株を形質転換し、得られた形質転換株より前記ア
ルカリ法でプラスミドDNAを抽出し、プラスミドpSRT303
DDNAのSaalＩによるDNA断片部位にプラスミドpUCP19DNA
が挿入された組換え体プラスミドpSRT303PDNAを得た。
得られたpSRT303PDNAを前記PstＩで切断し、0.7％ア
ガロース電気泳動で分離及び抽出したのち、フェノール
処理及びエタノール沈澱を行ないプラスミドpSR1DNAの
塩基配列を含むPstＩによるDNA断片を得た。
更に前述した組換え体プラスミドpGAG41DNAを同様にP
stＩで切断し、前述の方法でアルカリフォスファターゼ
処理し、両末端のリン酸を除去したのち、フェノール処
理及びエタノール沈澱して、両端が脱リン酸化されたpG
AG41DNAのPstＩ断片を得た。この断片及び先の組換え体
プラスミドpSRT303PDNANのPstＩによる断片とを混合
し、T4DNAリガーゼにより連結したのち、前記大腸菌DH1
株を形質転換し、得られた形質転換株よりアルカリ法で
プラスミドを抽出し、pSRT303PDNAのpSR1DNAの塩基配列
を含むPstＩによるDNA断片とpGAG41DNAのPstＩによる断
片が連結した組換え体プラスミドDNAをpZAP101Aと命名
し、該pZAP101AプラスミドDNAの制限酵素地図を第７図
に示した。
13.組み換え体プラスミドpZAP101ADNAによる酵母の形質
転換 組み換え体プラスミドpZAP101ADNAを用い、チゴサッ
カロマイセス、ルーキシー（IFO 1876）を前記木村の方
法により形質転換し、形質転換株、チゴサッカロマイセ
ス・ルーキシー〔（Zygosaccharomyces rouxii）IFO 18
76（pZAP101A）〕を得た。
なお、チゴサッカロマイセス・ルーキシー（Zygosacc
haromyces rouxii）IFO 1876（pZAP101A）〕は、工業術
院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第10514号（FEPM
P-10514）として寄託されている。
14.形質転換株チゴサッカロマイセス・ルーキシー〔（Z
ygosaccharomyces rouxii）IFO 1876（pZAP101A）によ
るアルカリプロテアーゼの生産 チゴサッカロマイセス・ルーキシー〔（Zygosaccharo
myces rouxii）IFO 1876（pZAP101A）（FERM P-1051
4）〕を抗生物質G418硫酸塩（100μg/ml）を含むYPD培
地（グルコース20g/l、ポリペプトン20g/l及び酵母エキ
ス10g/l）10mlに接種し、温度30℃で、72時間振盪培養
し、得られた培養物5mlを、0.45μｍメンブランフィル
ターで除菌し、培養濾液を得た。
得られた培養濾液についてアンソン−萩原変法〔ワイ
・フクシマ（Y.Fukushima）アグリック・バイオル・ケ
ル（Agric.Biol.chem.）第49巻、第1643〜1648頁（198
5）〕を用いてアルカリプロテアーゼ活性を測定したと
ころ、アルカリプロテアーゼ活性は、70P.U./mlであっ
た。なお、比較のため対照としてプラスミドベクターpS
RT303Dを有するチゴサッカロマイセス・ルーキシー株
〔（チゴサッカロマイセス・ルーキシー（IFO 1876）及
び前記マプラスミドベクターpSRT303Dを用い、前記木村
の方法により形質転換された菌株である。）〕を用い、
上記と同様にして培養及びプロテアーゼ活性の測定を行
なったところ、0.1P.U./mlであった。
以上より明らかな如く、本発明により得られる培養液
は、対照に比し、プロテアーゼ活性が著しく増加してい
るため、本発明に従い上記したチゴサッカロマイセス属
に属する酵母菌体を培養することにより、培地中にアル
カリプロテアーゼが大量分泌生産されていることが判明
した。
【図面の簡単な説明】
第１図は、組み換え体プラスミドpOAP5DNAの制限酵素地
図を示す図であり、第２図は、実施例の９項目に記載の
マチュアーなアルカリプロテアーゼに対応する遺伝子の
塩基配列を示す図であり、また、第３図は、第２図に示
す塩基配列を有する遺伝子から翻訳されるポリペプタイ
ドのアミノ酸配列を示す図である。 第４図は、組み換え体プラスミドpOAP10DNAの制限酵素
地図である。 第５図は、実施例11項目に記載の完全長アルカリプロテ
アーゼ（プレプロ型）に対応する遺伝子の塩基配列を示
す。図中、塩基番号53（Ａ）〜415（Ｔ）がプレプロ領
域を、塩基番号416（Ｇ）〜1261（Ｔ）がマチュアーな
マアルカリプロテアーゼ遺伝子領域を示す。 第６図は、第５図に示す塩基配列を有する遺伝子から翻
訳されるポリペプタイドのアミノ酸配列を示す。 第７図は、組み換え体プラスミドpZAP101ADNAの制限酵
素地図を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:69） Ｃ１２Ｒ 1:69）

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記に示されるアミノ酸配列をコードする
    プレプロ型アルカリプロテアーゼ遺伝子をベクターDNA
    に挿入した組み換え体DNAを含み、アルカリプロテアー
    ゼ生産能を有するチゴサッカロマイセス属に属する微生
    物を培地に培養し、培養物よりアルカリプロテアーゼを
    採取することを特徴とするアルカリプロテアーゼの製造
    法。
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