JPH08182500A

JPH08182500A - ペルオキシダーゼ様活性測定法

Info

Publication number: JPH08182500A
Application number: JP33865894A
Authority: JP
Inventors: Takeyoshi Urata; 武義浦田; Toshio Imai; 利夫今井
Original assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Current assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Priority date: 1994-12-29
Filing date: 1994-12-29
Publication date: 1996-07-16

Abstract

(57)【要約】（修正有）【目的】本発明は、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）様活性
測定のための安定な発色系の提供を目的とする。安定な
発色系の提供により、バックグランドの低下、呈色安定
性の改善が実現できる。本発明はまた、アジ化ナトリウ
ムにより反応停止可能な発色系の提供を目的とする。【構成】本発明は、下記一般式１で示されるジアミノジ
フェニルメチレン誘導体またはその塩を用いるＰＯＤ様
活性測定法、ならびに測定組成物である。本発明は、こ
の化合物によるバックグランド低下方法と、呈色安定化
方法も合わせて提供する。【化１】【効果】本発明のＰＯＤ様活性の測定法により、特に免
疫学的測定におけるＰＯＤ標識の測定において、感度と
精度を大きく改善することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ペルオキシダーゼ（以
下ＰＯＤと省略する）に代表される、ペルオキシダーゼ
様活性の分析技術に関するものである。ＰＯＤ(EC1.11.
1.7)は、水素受容体の存在下で水素供与体の酸化反応を
触媒する酵素である。このような触媒活性はたとえばヘ
モグロビンのような非酵素物質においても観察され、ペ
ルオキシダーゼ様活性などと総称されている。ＰＯＤの
触媒活性は、微量でも高感度に検出しやすいので幅広い
分野で分析用試薬として利用されている。あるいはま
た、ＰＯＤ様活性そのものが検出対象物の指標として利
用される。分析用試薬としての具体的な例は、ＰＯＤを
標識物質として用いた各種結合分析系が挙げられる。結
合分析系には、抗原抗体反応を利用した免疫学的測定
法、相補的核酸の親和性を利用した核酸ハイブリダイゼ
ーションアッセイ法、その他にアビジン−ビオチン、ホ
ルモン−ホルモン受容体、糖−レクチンというような特
異的な親和性を備えた物質同士の結合を利用した分析系
等が知られている。これらの結合分析系においてＰＯＤ
を標識物質として利用すれば、最終的に結合した（また
はしなかった）物質の量を追跡することが可能になる。
ＰＯＤを標識物質として利用する技術は、それまで代表
的な標識物質であったラジオアイソトープに比べて特殊
な設備を要求しない点、被爆の危険が無いこと等の利点
から広く普及している。特に免疫学的測定法におけるＰ
ＯＤの役割は大きく、広い範囲の物質に対して標識成分
として活用されている。ＰＯＤ標識した各種免疫成分に
は多くの市販品が用意され、検査施設、研究施設を問わ
ず一般的な試薬成分として利用されている。一方、ＰＯ
Ｄ様活性そのものを検出対象物の指標とする例として、
便や尿に含まれる潜血の検出を挙げることができる。潜
血、すなわちヘモグロビンはＰＯＤ様活性を持ってお
り、このＰＯＤ様活性を追跡すればヘモグロビンの有無
を確認することができる。

【０００２】

【従来技術の問題点】一般にＰＯＤ様活性のような酵素
活性の測定には、比色反応がよく利用される。比色反応
とは酵素の触媒活性によって色素を生成させる反応で、
一定の時間内における色素の生成量、あるいは生成速度
を測定すれば酵素活性を決定することができる。ＰＯＤ
様活性の測定には、過酸化水素を水素受容体とし水素供
与体を発色させるいわゆるトリンダー試薬が、古くから
利用されていた。以下に代表的な発色系として機能する
水素供与体を示す。・テトラアルキルベンチジン誘導体（以下ＴＭＢ誘導体
と省略する）・２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリ
ン−６−スルフォニックアシッド）（2,2'-Azino-Bis(3
-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)；以下ＡＢＴ
Ｓと省略する）・ｏ−フェニレンジアミン（o-phenylenediamine；以下
ＯＰＤと省略する）・３，３’−ジアミノベンチジン（3,3'-Diaminobenzid
ine；以下ＤＡＢと省略する）

【０００３】これらの発色系は、適当な条件さえ与えれ
ばある程度の感度と精度を期待できる。ところがこれら
の発色系の中にはＰＯＤ様活性の無い状態、あるいはＰ
ＯＤ様活性による反応を停止した状態でも発色が進行
し、試薬ブランクが大きくなるものがありＰＯＤ標識の
活性測定においてはバックグランドの上昇という問題を
生じていた。バックグランドの高い発色系による標準曲
線は低濃度域の定量性に欠け、感度の低下につながりや
すく好ましいものではない。

【０００４】また従来の発色系には、発色後の呈色安定
性に問題を持つものも有る。酵素反応により生成する色
素の光学特性が安定しなければ高精度な結果を得ること
はできない。たとえばＯＰＤによる発色系の場合、反応
停止剤で反応停止した後にも放置時間にしたがって退色
する現象が観察される。呈色安定性が不十分な場合に
は、光学測定の条件が著しく限定されるという問題点も
ある。まず時間的な条件を厳密に管理しなければならな
い。反応停止後に退色や、あるいは発色の進むような状
況では、反応開始から光学測定にいたる時間を厳密に管
理しなければ精度を高められない。また酵素活性の測定
には、１点レート法、２点レート法、時間レート法等の
さまざまな測定系が提案されているが、呈色安定性が不
十分な場合には測定系を制限せざるをえない。呈色を安
定化させるためには、たとえばＯＰＤを発色系に用いた
場合に色素の非酵素的な反応による生成を防ぐために遮
光するというような努力が要求され、多量の検体を処理
するには不利である。

【０００５】呈色安定性の問題は、主に発色系の安定性
に問題が有ることが原因である。つまり、発色系が不安
定であるためにＰＯＤ様活性の機能しない状態でも発色
反応が進行してしまうのである。発色系が不安定である
ことは、操作上の不利益にもつながる。すなわち、発色
成分であるＯＰＤをＰＯＤの基質である過酸化水素と共
存させておくことが困難なため２試薬系を採用せざるを
得ないという問題である。せめて反応直前の混合を許容
する程度の安定性を期待できれば、分注操作を１回少な
くすることができる。しかしたとえばＯＰＤの場合、反
応直前であってもあらかじめ過酸化水素と共存させてし
まうと無視できない発色を生じてしまう。このような不
利益を解消するために、ＯＰＤをホスホン酸キレートと
共存させて安定化する試みが報告されている（特公平５
−２９４２）。しかしこの技術は試薬の保存安定性の改
善を目的とするものであり、発色後の呈色安定性の改善
については効果を期待できない。

【０００６】バックグランドの上昇や不十分な呈色安定
性は、標識であるＰＯＤの測定における問題点である。
ＰＯＤの測定を確実に行わない限り、結合反応がいかに
高い特異性と感度を備えていてもそれを十分に生かすこ
とはできない。したがって結合分析系においてＰＯＤを
標識成分として活用していくためには、これらの問題を
解消する技術の提供が強く望まれる。

【０００７】更に発色系の反応停止剤にも問題が有っ
た。免疫学的測定法にＰＯＤを標識として利用した場
合、酵素反応を停止後に光学測定する方法が一般的であ
る。公知のＰＯＤ発色反応を確実に停止するためには、
１〜４規定の硫酸や塩酸のようなきわめて強い酸、ある
いはシアン、イオウ、フッ素のような扱いにくい成分が
要求されていたため分析機器の腐蝕や実験廃液の処理に
注意をはらう必要が有った。また分析に必要な試薬をセ
ットした試薬キットとして供給する場合には、反応停止
剤として利用する酸が危険物であるために流通上の問題
も無視できない。反応停止は、極めて多数の試料を同時
に処理していくときに反応時間を厳密に制御するために
必要な操作である。またごく微量のＰＯＤ様活性の測定
にあたっては、通常のレート法では十分な感度を得にく
いことがあるので、この点からも反応停止剤の必要性が
生じる。つまり通常のレート法では少なくとも２回の光
学測定が要求され、しかも高い感度を得るためには複数
の測定値の差を大きくする必要が有る。ごく微量のＰＯ
Ｄ活性による発色反応において十分な測定値の差を得る
には非常に長い反応時間が要求されるが、実際の分析現
場ではあまりにも長時間にわたる光学測定は現実的では
ない。このような背景から特に小さいＰＯＤ活性を測定
対象とすることが多い免疫学的測定法においては、一般
に反応停止剤が利用されている。反応停止剤として酸で
はなくアジ化物を利用可能な発色剤として、テトラメチ
ルベンチジン（以下ＴＭＢと省略する）が知られてい
る。しかしＴＭＢは水溶性に乏しいので高い濃度で使用
することができず、高感度な測定が困難である。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の第一の課題
は、安定性に優れたＰＯＤ様活性の測定技術を提供する
ことである。ＰＯＤ様活性の測定系に有用な安定な発色
系を提案し、バックグランド値を抑制することができる
技術を提供することにある。バックグランドを低く抑
え、高い感度を実現しうる技術の提供が本発明の大きな
課題のひとつである。また安定性に優れたＰＯＤ様活性
測定のための技術は、操作性の改善をも実現するもので
ある。本発明の第二の課題は、安定性に優れたＰＯＤ様
活性の測定技術により呈色安定性を改善することであ
る。ＰＯＤ様活性測定用の発色系の呈色安定性を改善
し、感度と精度の向上をはかることが本発明の第二の課
題である。更に本発明は、反応停止剤として酸を要求し
ない新規なＰＯＤ様活性測定用の発色系の提供を課題と
する。分析機器の腐食、流通上の危険性の増大、あるい
は廃液処理の問題につながる酸ではなく、より穏やかな
条件で反応停止することが可能な発色系を提供するもの
である。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明の課題は、下記一
般式を持つジアミノジフェニルメチレン誘導体またはそ
の塩を発色剤として用いるペルオキシダーゼ様活性測定
法により解決される。

【００１０】

【化７】

【００１１】この一般式において、Ｒは低級アルキル基
を示す。Ｒについて好ましい置換基を具体的に挙げれ
ば、メチル基、エチル基、プロピル基、およびブチル基
を示すことができる。これら本発明において利用するこ
とができる前記一般式に含まれる化合物について、具体
的な構造を以下に示す。これらの化合物のうち特に化合
物Ｂ（Ｒが同時にｎ−プロピル基）は、最も高い感度を
得ることができる好ましい化合物として挙げられる。

【００１２】化合物Ａ：ビス｛４−（Ｎ−エチル−Ｎ−
スルホプロピル）アミノ-２，６−ジメチルフェニル｝
メタン（Bis[4-(N-ethyl-N-sulfopropyl)amino-2,6-dim
ethylphenyl]methane）

【００１３】

【化８】

【００１４】化合物Ｂ：ビス｛４−（Ｎ−プロピル−Ｎ
−スルホプロピル）アミノ-２，６−ジメチルフェニ
ル｝メタン（Bis[4-(N-propyl-N-sulfopropyl)amino-2,
6-dimethylphenyl]methane）

【００１５】

【化９】

【００１６】化合物Ｃ：ビス｛４−（Ｎ−ブチル−Ｎ−
スルホプロピル）アミノ-２，６−ジメチルフェニル｝
メタン（Bis[4-(N-butyl-N-sulfopropyl)amino-2,6-dim
ethylphenyl]methane）

【００１７】

【化１０】

【００１８】化合物Ｄ：ビス｛４−（Ｎ−メチル−Ｎ−
スルホプロピル）アミノ-２，６−ジメチルフェニル｝
メタン（Bis[4-(N-methyl-N-sulfopropyl)amino-2,6-di
methylphenyl]methane）

【００１９】

【化１１】

【００２０】これらのジアミノジフェニルメチレン誘導
体またはその塩は、過酸化水素の発色系として報告され
た化合物である(Chem.Pharm.Bull.,41-3,620-623,199
3)。出発材料となるアニリン誘導体のアミノ基にスルホ
アルキル基を導入し、ついで２分子を脱水結合すれば必
要な化合物を結晶として得ることができる。具体的には
例えば化合物Ａであれば、原料となる２．０g（６．８
２mmol）のＮ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−
３，５−ジメチルアニリン（N-ethyl-N-(3-sulfopropy
l)-3,5-dimethylaniline ;Anal.Chim.Acta.136,121,198
2）のナトリウム塩を１２mlの水に加え、更に窒素雰囲
気下で３７%のホルムアルデヒド０．２８ml、および９
０%の葉酸０．０３mlを加える。４０℃で４時間加温
後、反応液にアセトン２００mlを加える。沈殿を集め水
で再結晶させて１．０５gの化合物Ａの結晶を得ること
ができる。その他の化合物についても、出発材料となる
アニリン誘導体を選べば同様の操作により必要な化合物
を得ることができる。このような方法で得られる化合物
はＮａ塩であるが、本発明においてはこの種の塩であっ
ても同じように利用することができる。

【００２１】本発明の測定対象であるペルオキシダーゼ
様活性とは、ＰＯＤと同様の酵素様活性を意味する。す
なわち、水素受容体の存在下で水素供与体を酸化すると
いう触媒活性を持つものであれば本発明による測定法を
適用することができる。測定すべきペルオキシダーゼ様
活性を備えた物質の中で最も重要なものがＰＯＤであ
る。特に結合分析系において標識物質として用いられる
ＰＯＤの活性測定に本発明は好適である。ＰＯＤには、
ホースラディッシュ由来のＰＯＤ（以下ＨＲＰと省略す
る）、アルスロマイセス属のような微生物に由来するＰ
ＯＤ、乳由来のラクトペルオキシダーゼ、白血球に由来
するミエロペルオキシダーゼ等が知られているが、本発
明の測定法はいずれのＰＯＤ活性の測定にも応用するこ
とができる。ＰＯＤにより標識が可能な物質には、抗
原、抗体、核酸、アビジン、およびビオチン等の各種親
和性物質が挙げられる。抗原や抗体のような免疫学的活
性物質は、既に幅広い分野で活用されている物質であ
る。

【００２２】つづいて実際の測定操作について更に具体
的に説明する。すなわち本発明のペルオキシダーゼ様活
性の測定法は、好ましくは次のような工程1）〜2）によ
り実施される。 1)ペルオキシダーゼ様活性を持つ物質に水素受容体と前
記一般式で示されるジアミノジフェニルメチレン誘導体
またはその塩を加える工程 2)ペルオキシダーゼの触媒作用によって生成する色素を
光学測定する工程

【００２３】本発明の発色系のＰＯＤによる発色反応を
反応式として次に示す。

【化１２】

【００２４】工程1)において、基質である水素受容体と
前記一般式で示されるジアミノジフェニルメチレン誘導
体またはその塩は、予想されるペルオキシダーゼ様活性
物質の量に対して大過剰となるように用いるべきであ
る。このような条件とすることにより、色素の生成量が
ペルオキシダーゼ様活性に律速され定量的な測定が可能
となる。なお代表的な水素受容体として、過酸化水素を
挙げられる。過酸化水素は直接供給しても良いし、酵素
反応等によって間接的に供給することも可能である。過
酸化水素の供給が可能な反応系としては、各種オキシダ
ーゼによる酸化反応等を挙げることができる。このよう
な方法で過酸化水素を供給する場合にも、量的に不足す
ることがないよう所定の反応条件の元で充分な量の過酸
化水素を供給できるように配慮する必要がある。本発明
の水素受容体としては、この他にも有機ヒドロペルオキ
シド等を利用することができる。たとえば抗原−抗体反
応における標識物質としてのＰＯＤを測定するのであれ
ば、反応系に加えたＰＯＤの全てを測定可能な量の基質
を用意しておくのが好ましい。測定対象となるＰＯＤ様
活性物質の性状や反応条件にも左右されるため一般的な
条件を定めることは困難であるが、以下に代表的なＰＯ
Ｄ様活性物質であるＨＲＰを用いた場合の条件について
例示する。

【００２５】ＨＲＰの活性測定にあたっては、至適条件
であるｐＨ５〜８、反応温度２０〜４０℃において、５
〜３０分間程度反応させるとして、必要な基質の量は過
酸化水素でＨＲＰ１mUあたりおよそ０．１mM以上、好ま
しくは１mM以上とする。過酸化水素濃度が高すぎると発
色反応に対して阻害的な作用を与える場合があるので、
１０mM以上の過酸化水素は好ましくない。なおここで１
Uとは、１μmoleのＡＢＴＳをｐＨ５．０・２５℃で１
分間に酸化することができるＰＯＤ活性を意味する。一
方前記一般式で示されるジアミノジフェニルメチレン誘
導体またはその塩は、同じくＨＲＰ１mUあたりおよそ
０．５mM以上、好ましくは１mM以上とする。高い濃度で
も発色反応に影響は与えないが、１mM以上の濃度では得
られる吸光度に差が生じないし、５mMを越える濃度では
化合物自身の溶解性の問題もあるため、１−３mM程度が
好ましい濃度範囲である。一般に結合分析系においては
反応系に存在する標識ＨＲＰの量の上限をあらかじめ知
ることができるので、このような基準に基づいて必要な
基質類の量を設定することが可能である。

【００２６】工程2)において生成する色素の光学測定に
は、生成速度をレート法により動的に測定する方法が一
般的である。レート法には、基本的に１点レート法、２
点レート法、および時間レート法の３つの原理が知られ
ている。以下に各原理について簡単に説明する。・１点レート法発色系を加えてから一定時間経過後に生成した色素量を
測定し、単位時間当りの生成量を求める。光学測定が１
回のみで良いので簡便であるが、試薬ブランクが低くし
かも安定していなければ誤差を生じ易い。発色反応を完
全に停止することができれば、光学測定のタイミングを
任意とすることが可能である。つまり、反応を終了後、
たとえば翌日に光学測定してもかまわない。・２点レート法発色系を加えた後の所定の時間内に生成する色素量を測
定し、単位時間当りの生成量を求める。光学測定が少な
くとも２回必要となるが、あるていどの試薬ブランクの
影響は無視できるようになる。しかし呈色安定性が低い
場合にはやはり誤差につながる。また単位時間当たりの
色素生成量が少ない時には、長時間にわたって変化を追
跡しなければ十分な感度を得ることができない。・時間レート法発色系を加えてから一定量の色素が生成されるまでの時
間を測定し、単位時間当りの生成量を求める。呈色安定
性の影響を受け易く、また試料によって必要な反応時間
が異なるので自動化には不向きである。

【００２７】抗原−抗体反応をはじめとする結合分析系
は、酵素やその基質を測定対象とする生化学的な分析に
比べインキュベーション時間を長くとる必要がある。純
粋な酵素反応に比べて結合反応のための長い反応時間が
要求されるためである。このような特徴から自動化にあ
たっては大量の試料を同時に反応させる方法が効率的
であり、他方最終的な光学測定にあたっては反応時間の
厳密な制御のために反応を停止後に順次測定する方法が
好ましい。本発明によるペルオキシダーゼ様活性の測定
法において利用することができる反応停止剤には、アジ
化物、硫酸、塩酸のような公知の反応停剤を挙げられ
る。特にアジ化物は分析機器を腐食しないので好ましい
反応停止剤といえる。アジ化物には、アジ化ナトリウ
ム、アジ化カリウム等が知られており、いずれの化合物
も反応停止剤として有効である。アジ化物は、たとえば
ナトリウム塩の場合には反応溶液中で少なくとも０．０
０２%、好ましくは０．００５%以上の濃度となるように
添加することにより、ＰＯＤの酵素反応を確実に停止す
る。

【００２８】本発明は、前述のペルオキシダーゼ様活性
測定法によって、バックグランド抑制方法、そして呈色
安定化方法をも提供するものである。すなわちＰＯＤ様
活性の測定にあたり、前記一般式を持つジアミノジフェ
ニルメチレン誘導体またはその塩を発色剤として用いる
ことによりバックグランドの抑制と呈色安定性の改善を
可能にした。本発明におけるバックグランドとは、先に
説明したとおり測定対象であるＰＯＤ様活性物質の有無
とは無関係に非特異的に発色成分が色素を生成してしま
う現象を意味する。また呈色安定性とは、ＰＯＤ様活性
により生成した色素の光学特性の安定性を意味する。生
成した色素が、少なくとも一定の時間内において光学特
性が変動しない状態を呈色安定性が高いという。本発明
のバックグランド抑制方法、あるいは呈色安定化方法の
好ましい条件は、前記一般式を持つジアミノジフェニル
メチレン誘導体またはその塩の種類、使用条件、応用範
囲等においてすべて本発明のＰＯＤ様活性測定法と共通
とすることができる。

【００２９】本発明は、前記ＰＯＤ活性測定法、ならび
にＰＯＤ様活性測定法におけるバックグランド抑制方
法、あるいは呈色安定化のための試薬組成物をも提供す
るものである。本発明によるペルオキシダーゼ様活性測
定用組成物は、過酸化水素、または過酸化水素を反応系
に供給することができる成分、および前記一般式を持つ
ジアミノジフェニルメチレン誘導体またはその塩により
構成される。

【００３０】本発明のＰＯＤ様活性測定用組成物は、前
記ＰＯＤ様活性測定法に必要な環境を与えるように構成
する。具体的には、測定すべきＰＯＤ様活性を備えた物
質の量に対して過剰となる充分な量の過酸化水素と前記
一般式を持つジアミノジフェニルメチレン誘導体または
その塩を反応系に供給できる組成とする。過酸化水素
と、前記一般式を持つジアミノジフェニルメチレン誘導
体またはその塩とは、共存させて１試薬系としても良い
し、分離した状態で２試薬系として保存しておくことも
できる。２試薬系とした方が保存上は有利である。一
方、操作性の面からは１試薬系である方が好ましいこと
は言うまでもなく、したがって保存条件により１試薬系
と２試薬系を使い分けるようにするとよい。また２試薬
系であっても、使用時に混合して１試薬系とすることも
可能である。

【００３１】過酸化水素にかえて、過酸化水素を生成す
る反応系を組み合せる場合にはこの反応系が分離される
ように配慮すれば保存上有利な態様となる。具体的に
は、グルコースとグルコースオキシダーゼとの反応によ
り過酸化水素を供給しようとするのであれば、両者が保
存時に接触しない剤形を選択する。このとき前記一般式
を持つジアミノジフェニルメチレン誘導体またはその塩
に影響を与えない成分は共存させておくことができる。
この例ではグルコースにしろ、グルコースオキシダーゼ
にしろなんら影響を与えない成分であるので、どちらの
成分を前記一般式を持つジアミノジフェニルメチレン誘
導体またはその塩に共存させておいても問題は無い。本
発明のＰＯＤ様活性測定組成物は安定性に優れているた
め、たとえば過酸化水素と前記一般式の化合物を共存さ
せた状態で少なくとも５〜１０時間程度の保存が可能で
ある。この安定性は、１度調製した試薬組成物を１日の
間を通じて使用することを保証するものであり、利便性
と精度の向上に貢献する。本発明の試薬組成物において
は、過酸化水素に代わる水素受容体として有機ヒドロペ
ルオキシドや、尿素過酸化水素付加物（Urea hydrogen
peroxide）等を利用することができる。

【００３２】本発明の組成物には、好ましい反応条件を
与えるその他の成分、あるいは試薬の保存性を改善する
成分等を加えておくことができる。このような成分とし
ては、適当なｐＨを与える緩衝剤や過酸化水素の安定化
剤等を挙げられる。ＰＯＤ様活性を持つ物質としてＨＲ
Ｐを測定する場合、至適ｐＨは５．０〜８．０であるの
で、緩衝剤としてはクエン酸、リン酸、トリス−塩酸、
およびＧＯＯＤ緩衝液等を用いることができる。特にＧ
ＯＯＤ緩衝剤の中にはＰＯＤ様活性の測定に有用なもの
が多く含まれる。以下にＧＯＯＤ緩衝剤を例示する。ＧＯＯＤ緩衝剤２−モルホリノエタンスルホン酸（2-(N-Morpholino)et
hanesulfonic acid、ＭＥＳと省略する）ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキ
シメチル）メタン（Bis(2-hydroxyethyl)iminotris(hyd
roxymethyl)methane、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓと省略する）（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸
（N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid、ＡＣ
ＥＳと省略する）ピペラジン−ビス（２−エタンスルホン酸）（Piperazi
ne-N,N'-bis(2-ethanesulfonic acid)、ＰＩＰＥＳと省
略する）３−（モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン
酸（3-(N-Morpholino)-2-hydroxypropanesulfonic acid
、ＭＯＰＳＯと省略する）ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスル
ホン酸（N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoehtanesulfo
nic acid、ＢＥＳと省略する）３−（モルホリノ）プロパンスルホン酸（3-(N-Morphol
ino)propanesulfonic acid、ＭＯＰＳと省略する）トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノメタン
スルホン酸（N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoeth
anesulfonic acid、ＴＥＳと省略する）ヒドロキシエチルピペラジン−２−エタンスルホン酸
（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic a
cid 、ＨＥＰＥＳと省略する）３−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒ
ドロキシプロパンスルホン酸（3-[N,N-Bis(2-hydroxyet
hyl)amino]-2-hydroxypropanesulfonic acid、ＤＩＰＳ
Ｏと省略する）トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−ヒドロキシ−
３−アミノプロパンスルホン酸（N-Tris(hydroxymethy
l)methyl-2-hydroxy-3-aminopropanesulfonic acid、Ｔ
ＡＰＳＯと省略する）２−ヒドロキシエチルピペラジン−２−ヒドロキシプロ
パン−３−スルホン酸（N-2-Hydroxyethylpiperazine-
N'-2-hydroxypropane-3-sulfonic acid、ＨＥＰＰＳＯ
と省略する）ピペラジン−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン
酸）（Pioerazine-N,N'-bis(2-hydroxypropanesulfonic
acid)、ＰＯＰＳＯと省略する）２−ヒドロキシエチルピペラジン−３−プロパンスルホ
ン酸（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-3-propanesulfo
nicacid、ＥＰＰＳと省略する） N-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulfonic
acid 、ＴＡＰＳと省略する）これらのＧＯＯＤ緩衝剤のうち、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒ
ｉｓ、ＡＣＥＳ、ＰＩＰＥＳ、およびＭＯＰＳを特に好
ましい例として挙げることができる。中でもＭＥＳは好
適な緩衝剤であり、１０〜２００mMで用いられる。緩衝
剤濃度は最終的な反応液において必要な濃度を与えられ
るように設定すると良い。また、本発明を標識酵素であ
るＰＯＤの活性測定に応用する場合には、結合反応の場
に必要な緩衝液と共用できるような条件を選択すれば有
利である。他方過酸化水素の安定化剤としては、ピロリ
ン酸や遷移金属をマスクする各種キレート剤等が知られ
ている。ピロリン酸は、０．００１〜０．００５%てい
どの濃度で過酸化水素に対する安定化作用を示す。キレ
ート剤としてはジエチレンアミン５酢酸や１，３−ジア
ミノ−２−ヒドロキシプロパン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−
四酢酸等が知られている。これらのキレート剤は、０．
００１〜０．１%ていどの濃度で過酸化水素に対する安
定化作用を示す。

【００３３】本発明の組成物は、溶液状態で供給するこ
とができる。また前記一般式を持つジアミノジフェニル
メチレン誘導体またはその塩については、凍結乾燥して
供給することも可能である。過酸化水素にかえて過酸化
水素を生成する反応系を利用する態様、あるいは水素受
容体として有機ヒドロペルオキシドや尿素過酸化水素付
加物（Urea hydrogen peroxide）を利用する態様であれ
ば、すべての試薬成分を凍結乾燥することが可能であ
る。凍結乾燥にあたっては、グルコースやシュークロー
ス等の糖、ウシ血清アルブミン等の不活性蛋白のような
賦形剤を組み合せることができる。

【００３４】本発明のＰＯＤ様活性測定組成物は、過酸
化水素のような適当な水素受容体と反応停止剤を組み合
せてペルオキシダーゼ様活性測定用キットとすることが
できる。水素受容体や反応停止剤としては先に述べたも
のを組み合わせれば良い。あるいは、更にペルオキシダ
ーゼ標識による免疫学的な分析のための試薬を組み合せ
て免疫学的測定用キットを構成することができる。免疫
学的な分析のための試薬とは、ＰＯＤ様活性を持つ物質
で標識された免疫学的活性成分、付加的に必要な抗体試
薬、および標準品等で構成される。以下に免疫学的な分
析の原理について簡単に述べる。これらの原理に基づく
免疫学的な分析のための試薬は、ＰＯＤ様活性を持つ物
質を標識に用いているかぎり本発明のＰＯＤ様活性測定
用組成物と組み合せることができる。

【００３５】反応原理１：競合法抗体に対してＰＯＤ標識抗原と検体中の被分析抗原とを
競合的に反応させる。この場合、抗体は固相化されてい
てもよいし、あるいは第２抗体を使ってＢ／Ｆ分離され
るものであってもかまわない。抗体と結合するＰＯＤ標
識抗原の量は、被分析抗原の量と逆比例の関係を示す。
競合法の原理を応用した結合阻止反応法と呼ばれる原理
も知られている。この原理では、抗体に対してまず被測
定抗原を結合させ、次いで標識抗原を反応させる。競合
法の場合と同じように標識抗原の結合量は被測定抗原の
量に逆比例する。なお、いずれの原理においても抗原と
抗体を入れ換えると抗体の分析も可能である。

【００３６】反応原理２：サンドイッチ法固相抗体と反応した被測定抗原に対してＰＯＤ標識抗体
を反応させる。被測定抗原が、少なくとも２つの結合サ
イトを持つことが条件となる。最終的に＜固相抗体＞＋
＜被測定抗原＞＋＜ＰＯＤ標識抗体＞というサンドイッ
チ状の複合体が形成され、結合したＰＯＤ標識抗体の量
は被測定抗原の量と比例関係にある。サンドイッチ法で
は、固相抗体とＰＯＤ標識抗体を抗原と同時に反応させ
る１ステップ法、固相抗体かＰＯＤ標識抗体のいずれか
と反応後にもう一方との反応を行わせる２ステップ法、
更に固相抗体と被測定抗原を反応させ洗浄した後にＰＯ
Ｄ標識抗体を接触させる方法等が知られている。サンド
イッチ法には抗原の測定の他、固相化した抗原に対して
被測定抗体を反応させ、これをＰＯＤ標識した抗体を認
識する抗体により検出する方法も含まれる。

【００３７】反応原理は問わずいずれの場合であって
も、なんらかの手段により結合した（または、しなかっ
た）ＰＯＤ標識成分を分離し、ＰＯＤ活性を測定するこ
とによって分析は完了する。このＰＯＤ活性の測定にあ
たり、本発明によるＰＯＤ様活性測定組成物を利用すれ
ばよいのである。

【００３８】これらの反応原理による免疫学的な測定に
おいて、ＰＯＤで標識が可能な物質は抗原、抗体、ある
いはそれらの活性断片を含むものである。すなわち、抗
原の抗原決定基を含むドメイン・ペプチド、あるいはＦ
（ａｂ’）２やＦａｂ’等の抗体の抗原結合部位であっ
てもよい。また抗体にはモノクローナル抗体を用いるこ
ともできる。ＰＯＤと免疫学的活性物質との結合につい
ては、多くの方法が知られている。（臨床病理、臨時増
刊・特集第５３号、P39-42,1983等）なお説明の都合上抗原−抗体反応を例としたが、本発明
がその他の各種結合分析系に応用できることは言うまで
もない。すなわち抗原−抗体反応を相補的な配列を持つ
核酸の親和性を利用したハイブリダイゼーションアッセ
イに置き換えれば、核酸の分析にも応用することができ
る。核酸分子のＰＯＤによる標識方法も公知である。

【００３９】

【作用】本発明の前記一般式で示されるジアミノジフェ
ニルメチレン誘導体またはその塩は、ＰＯＤ様活性の測
定において過酸化水素とともに発色系として用いること
によってバックグランドの抑制と、呈色安定性の改善と
いう効果を与える。

【００４０】前記一般式で示されるジアミノジフェニル
メチレン誘導体またはその塩は、過酸化水素のための発
色系として提案された化合物である(Chem.Pharm.Bull.,
41-3,620-623,1993)。過酸化水素のための発色反応とＰ
ＯＤ様活性のための発色反応とは、構成要素の点で同一
である。しかし分析対象となる物質が、過酸化水素では
なくＰＯＤ様活性である点で本発明は新規である。一般
に反応を構成する要素が同一であるからといって直ちに
測定系を転用できるとはいえない。公知技術である過酸
化水素の発色反応においては、充分量のＰＯＤとジアミ
ノジフェニルメチレン誘導体により定量的な発色を得る
ことができる。一方本発明のＰＯＤ様活性の測定におい
ては充分量の過酸化水素とジアミノジフェニルメチレン
誘導体により発色を得ることになるが、ＰＯＤ様活性に
より定量的な発色を得られるかどうかは予測できない。
ましてこれらの化合物によりＰＯＤ様活性のための発色
系を構成した場合に、バックグランドの抑制、そして呈
色安定性の改善というまったく新たな効果を得られるこ
とは予想外の知見である。言いかえれば、ＰＯＤ様活性
の測定において前記一般式で示されるジアミノジフェニ
ルメチレン誘導体またはその塩を発色剤に用いた時に、
ＰＯＤ活性が発色反応を律速するかどうかはまったく不
明である。むしろ高感度な発色系（すなわち反応性に優
れる発色系）であることを考慮すれば、ＰＯＤ活性の大
小にかかわらず発色反応が進行し、結果として低濃度域
の定量性を損なう可能性が高いものと思われる。本発明
者らは、前記一般式で示される化合物により意外にも広
い範囲のＰＯＤ活性に対して定量的な発色を得られるこ
とを確認し本発明を完成したものである。

【００４１】更に本発明のＰＯＤ様活性測定法は、従来
の反応停止剤である酸に代えてアジ化物による反応停止
を可能とする。硫酸や塩酸を反応停止剤に用いた場合、
分析機器の腐食や流通上の問題が避けられないが、本発
明によればより取り扱いの容易なアジ化物による反応停
止が可能となる。つづいて実施例に基づいて本発明を更
に詳細に説明する。

【００４２】

【実施例】

１．本発明によるＰＯＤ活性測定前記一般式の化合物のうち、化合物Ａ（Ｒ＝エチル基：
以下Ｃ２と省略する）、化合物Ｂ（Ｒ＝プロピル基：以
下Ｃ３と省略する）、および化合物Ｃ（Ｒ＝ブチル基：
以下Ｃ４と省略する）を用い、ＰＯＤの活性測定を試み
た。これらの化合物は、公知文献(Chem.Pharm.Bull.,41
-3,620-623,1993)と同じ方法により合成したものであ
る。ＰＯＤには市販のＨＲＰ（ＳＩＧＭＡ製）を用い
た。測定操作は次のとおりである。なお以下に示す濃度
は、特に断らない限り全て最終的な反応液中における値
で示したものである。

【００４３】マイクロプレートのウエルにＰＯＤを０−
０．００５U（１００μl）となるように分注し、これに
Ｃ２、Ｃ３、およびＣ４のいずれかを２mM（１００μ
l）、過酸化水素を１mM（１００μl）加えた。３７℃で
３０分間インキュベート後、６６０nmにおける吸光度を
イムノリーダーで測定した。なお各溶液は全て１００mM
のＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）とした。対照としてＣ
２、Ｃ３、およびＣ４にかえてＡＢＴＳ（測定波長は４
１５nm）を２mM用いた区を用意し、結果を比較した。結
果は図１に示すとおりである。図１から明らかなよう
に、Ｃ２、Ｃ３、そしてＣ４によりＰＯＤ活性の測定が
可能である。特にＣ２、Ｃ３では、ＡＢＴＳよりも高い
感度でＰＯＤを測定できることがわかる。

【００４４】２．本発明によるＰＯＤ活性測定の反応条
件の検討Ｃ２、Ｃ３、およびＣ４を使ったＰＯＤ活性の測定に好
適な条件を検討した。検討した条件は、緩衝液の種類、
反応時間、基質濃度（Ｃ２、Ｃ３、およびＣ４）、およ
び基質濃度（過酸化水素）の４点である。各条件の詳細
は以下のとおりとし、その他の条件は１にしたがった。

【００４５】２−ａ：緩衝液の種類緩衝液として、以下の６種類を用意し、１で最も高い感
度を示したＣ３（化合物Ｂ）について発色反応に及ぼす
影響を観察した。緩衝液・ＭＥＳ緩衝液（１００mM、ｐＨ５、５．５、６）・クエン酸緩衝液（１００mM、ｐＨ５、５．５、６）・リン酸緩衝液（１００mM、ｐＨ５、５．５、６、７）・トリス−塩酸緩衝液（１００mM、ｐＨ６．５、７．
０、７．５）・ＨＥＰＥＳ緩衝液（１００mM、ｐＨ７．０）結果は図２に示すように、リン酸緩衝液に比べ、他の緩
衝液で高い吸光度が得られることを確認した。また至適
ｐＨについては、緩衝液の選択により５．５−７にわた
る広い範囲でＰＯＤ活性の定量が可能である。

【００４６】２−ｂ：反応時間ＰＯＤを０．００１２５Uに固定した他は、１と同じ条
件でＣ２、Ｃ３、およびＣ４について反応のタイムコー
スを追跡した。結果は図３に示すとおりである。いずれ
の化合物においても反応開始後２０〜３０分で吸光度は
プラトーに達し、その後の吸光度がきわめて安定してい
ることが確認された。Ｃ２、Ｃ３、およびＣ４をＰＯＤ
活性の測定に用いた場合、高い呈色安定性を実現するこ
とが明らかである。

【００４７】２−ｃ：基質濃度（Ｃ２、Ｃ３、およびＣ
４）の検討ＰＯＤ濃度を０．００１６U、過酸化水素濃度を１mMに
固定し、Ｃ２、Ｃ３、およびＣ４の濃度を０−５mMに変
化させて吸光度に及ぼす影響を観察した。その他の条件
は１と同じ条件とした。結果は図４に示すとおり、Ｃ３
とＣ４においては０．６２５mM以上１．２５mM付近まで
でほぼ吸光度が安定する。この実験より、ＰＯＤ１mUの
測定にはおよそ０．５mM以上のジアミノジフェニルメチ
レン誘導体が有れば充分であることを確認した。

【００４８】２−ｄ：基質濃度（過酸化水素）の検討ＰＯＤ濃度を０．００１６U、Ｃ２、Ｃ３、およびＣ４
の濃度を２．５mMに固定し、過酸化水素の濃度を０．０
３−１００mMに変化させて吸光度に及ぼす影響を観察し
た。その他の条件は１と同じ条件とした。結果は図５に
示すとおり、Ｃ３とＣ４においては過酸化水素０．１２
５−３．１３mMで高い吸光度を得られる。Ｃ２では、
０．５−１mMで最も高い吸光度を得ることができる。こ
の実験より、ＰＯＤ１mUの測定にはおよそ０．１−５mM
の過酸化水素が有れば充分であることを確認した。また
１０mMを越える濃度では発色反応の阻害が起こるので、
不必要に高い過酸化水素濃度を避けるべきであることも
わかった。

【００４９】３．本発明のＰＯＤ測定法における基質類
の単独での安定性本発明のＰＯＤ活性測定法に用いるジアミノジフェニル
メチレン誘導体の安定性について調査した。１で最も高
い感度を示したＣ３をＭＥＳ緩衝液（１００mM、ｐＨ
５．５）に２mMとなるように溶解し、２０℃と３７℃で
放置して発色のようすを観察した。比較のためＡＢＴＳ
とＯＰＤについても同じ条件で発色のようすを観察し
た。測定波長は、Ｃ３：６６０nm、ＡＢＴＳ：４１５n
m、ＯＰＤ：４５０nmである。

【００５０】結果は、図６（２０℃）、および図７（３
７℃）に示すとおりである。本発明に用いるＣ３は、い
ずれの温度条件においても１６時間後まで測定可能な発
色を起こさず、３０時間後でも０．００８〜０．００５
とわずかな発色を示すのみである。一方従来のＰＯＤ活
性測定法に利用されていたＡＢＴＳやＯＰＤでは、数時
間の放置で発色が始まり、３７℃では１２時間で無視で
きないほどの呈色を起こし、１６時間ではその吸光度が
０．１以上に達することがわかった。以上の結果から本
発明に用いるジアミノジフェニルメチレン誘導体の優れ
た安定性が確認された。

【００５１】４．本発明のＰＯＤ測定法における基質類
の過酸化水素共存下での安定性本発明のＰＯＤ活性測定法に用いるジアミノジフェニル
メチレン誘導体の過酸化水素共存下での安定性について
調査した。本発明のＣ２、Ｃ３、およびＣ４をＭＥＳ緩
衝液（１００mM、ｐＨ５．５）に２mMとなるように溶解
し、過酸化水素１mMと共存下に３７℃で放置して発色の
ようすを観察した。結果を図８に示した。Ｃ２、Ｃ３、
およびＣ４は過酸化水素共存下でもきわめて安定で、３
７℃で１５０分間程度の放置には十分に耐えることを確
認した。最も発色の著しかったＣ３でも、３で得たＡＢ
ＴＳが単独で３時間後に示した吸光度よりも低く、いか
に本発明に用いる基質類が安定であるかがわかる。

【００５２】５．反応停止剤の影響本発明によるＰＯＤ活性の測定法では、どのような反応
停止剤が有効であるかを調査した。１で最も高い感度を
示したＣ３を２mM、ＰＯＤを０．００１２５U、過酸化
水素１mMにより発色反応を開始し、反応開始後１０分が
経過したところでアジ化ナトリウム（ＮａＮ₃）水溶液
（０−１%、最終濃度で０−０．５%）となるように添加
して、吸光度の変化を追跡した。緩衝液にはＭＥＳ緩衝
液（１００mM、ｐＨ５．５）を用いた。結果は図９に示
した。０．００１%ではわずかに吸光度の上昇が見られ
るが、０．００５%以上では完全に反応の進行を停止で
きることが確認できた。

【００５３】６．免疫学的測定法への応用１本発明をＰＯＤを標識酵素とするＥＬＩＳＡ法に応用し
た。ＥＬＩＳＡの測定対象はαフェトプロテイン（以下
ＡＦＰと省略する）とし、市販の抗ＡＦＰポリクローナ
ル抗体と抗ＡＦＰモノクローナル抗体を組合せたサンド
イッチ法とした。６−ａ：試薬の調製市販の抗ＡＦＰウサギポリクローナル抗体（日本抗体研
究所製）を５０mMの炭酸緩衝液（ｐＨ１０．０）で５０
μg/mlに希釈し、２００μlをマイクロプレートのウエ
ルに分注した。４℃で一晩インキュベート後抗体溶液を
除き、ウエルを０．０５%のＴｗｅｅｎ２０を含む５０m
Mリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、以下Ｔ−ＰＢＳと省略す
る）で３回洗浄した。洗浄後のウエルに２%ＢＳＡを含
むＰＢＳを３００μl分注し、３７℃で６０分間インキ
ュベートしてブロックした。この操作により固相化ポリ
クローナル抗体を得た。一方ＰＯＤ標識抗体としては、
市販のＰＯＤ標識した抗ＡＦＰマウスモノクローナル抗
体（生化学工業製）を同じＰＢＳで１０μg/mlに希釈し
て用いた。６−ｂ：測定操作ａで得たポリクローナル抗体を固相化したウエルにＡＦ
Ｐ濃度６．２５−５０ng/mlのヒト血清希釈系列（０．
５%ＢＳＡ含有ＰＢＳ、ｐＨ５．５）を１００μl分注し
た。３７℃で９０分間インキュベート後、Ｔ−ＰＢＳで
５回洗浄し、ＰＯＤ標識マウスモノクローナル抗体１０
０μlを分注して３７℃、６０分間インキュベートし
た。インキュベート後Ｔ−ＰＢＳで７回洗浄し、Ｃ３、
またはＣ４（２mM）を１００μl、過酸化水素（１mM）
を１００μlを分注して３７℃、３０分間反応させ、イ
ムノリーダーにより６６０nmの吸光度を測定した。Ｃ３
による測定結果を図１０に示した。本発明によりバック
グランドの低い高感度な測定が可能であることを確認し
た。

【００５４】７．免疫学的測定法への応用２本発明をＰＯＤを標識酵素とするＥＬＩＳＡ法に応用し
た。ＥＬＩＳＡの測定対象は血清コレステリルエステル
転送蛋白質（以下ＣＥＴＰと省略する）とし、ＣＥＴＰ
のドメインペプチドを免疫原として得た抗ＣＥＴＰモノ
クローナル抗体（特開平６−１６９７９３に開示）を組
合せたサンドイッチ法とした。７−ａ：試薬の調製抗ＣＥＴＰモノクローナル抗体を５０mMの炭酸緩衝液
（ｐＨ１０．０）で約５０μg/mlに希釈し、５０μlを
平底マイクロプレートのウエルに分注した。４℃で１２
時間インキュベート後抗体溶液を除き、ウエルをＴ−Ｐ
ＢＳで３回洗浄した。洗浄後のウエルに２%ＢＳＡを含
むＰＢＳを２００μl分注し、３７℃で６０分間インキ
ュベートしてブロック後、３００μlのＴ−ＰＢＳで１
回洗浄した。この操作により固相化モノクローナル抗体
とした。一方ＰＯＤ標識抗体としては、やはり特開平６
−１６９７９３で開示された別のモノクローナル抗体
（２種を混合）をＰＯＤ標識し同じＰＢＳで１０μg/ml
に希釈して用いた。また標準としては、固相化したもの
と同じモノクローナル抗体を使ったイムノアフィニティ
クロマトグラフィーでヒトプール血清から精製したＣＥ
ＴＰを用いた。７−ｂ：測定操作ａで得たモノクローナル抗体を固相化したウエルに精製
ＣＥＴＰのＰＢＳ溶液（濃度６．３×１０^-3−０．２５
μg/ml）を５０μl分注した。３７℃で６０分間インキ
ュベート後、３００μlのＴ−ＰＢＳで５回洗浄し、Ｐ
ＯＤ標識マウスモノクローナル抗体５０μlを分注して
３７℃、４５分間インキュベートした。インキュベート
後３００μlのＴ−ＰＢＳで７回洗浄し、Ｃ３、または
Ｃ４（終濃度２mM）またはＡＢＴＳ（終濃度２mM）を２
５μl、過酸化水素（終濃度０．８mM）を２５μlを分注
して３７℃、１−６０分間反応させ、イムノリーダーに
より６６０nm（Ｃ３、Ｃ４）、または４１５nm（ＡＢＴ
Ｓ）の吸光度を測定した。Ｃ３による測定結果を図１１
に示した。本発明によりバックグランドの低い高感度な
測定が可能であることを確認した。

【００５５】

【発明の効果】本発明によれば、ＰＯＤ様活性の比色測
定におけるバックグランド値の低減、そして呈色安定性
の改善という効果を得ることができる。本発明によって
提供される発色系はきわめて安定性に優れ、ＰＯＤ様活
性の測定の感度、あるいは精度の向上に貢献する。本発
明が提供するＰＯＤ様活性測定のための発色系は、それ
自身の安定性にも優れるため、保存中の非特異的な発色
が抑制されやはり結果としてバックグランドの低下を期
待できる。本発明では、発色系が安定であるため操作上
の利点も生まれる。すなわち水素受容体である過酸化水
素と、発色成分である前記一般式で示される化合物を同
一の溶液中に共存させた状態で供給できる可能性があ
る。

【００５６】本発明のＰＯＤ様活性測定法、あるいは測
定用組成物は、免疫学的測定法におるＰＯＤ標識の測定
に応用することができる。従来のＰＯＤ様活性測定技術
では、発色系自身の問題により免疫学的測定法の本来の
特異性や感度を損なっていた面が有った。しかし本発明
を応用した場合には、その優れた呈色安定性により免疫
学的測定法本来の高い特異性と感度を十分に生かすこと
ができる。

【００５７】加えて本発明のＰＯＤ様活性測定法におい
ては、発色反応をアジ化物で停止することが可能であ
る。分析機器を腐蝕する恐れの無いアジ化物によって反
応停止できる点は、本発明の大きなメリットである。ア
ジ化物を反応停止剤とすれば、キット化にあたっても酸
のように流通上の問題も生じにくい。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明によるＰＯＤ活性測定法の結果
を示すグラフである。縦軸は波長６６０nm（または４１
５nm）における吸光度を、横軸はＰＯＤ活性（×１０^-4
IU/ml)を示す。

【図２】図２は、本発明によるＰＯＤ活性測定法に及ぼ
す緩衝剤の影響を調査した結果を示すグラフである。縦
軸は波長６６０nmにおける吸光度を、横軸はｐＨを示
す。

【図３】図３は、本発明によるＰＯＤ活性測定法の反応
タイムコースを示すグラフである。縦軸は波長６６０nm
における吸光度を、横軸は時間（分）を示す。

【図４】図４は、本発明によるＰＯＤ活性測定法に及ぼ
す基質濃度（Ｃ２、Ｃ３、およびＣ４）の影響を調査し
た結果を示すグラフである。縦軸は波長６６０nmにおけ
る吸光度を、横軸は基質濃度(mM)を示す。

【図５】図５は、本発明によるＰＯＤ活性測定法に及ぼ
す基質濃度（過酸化水素）の影響を調査した結果を示す
グラフである。縦軸は波長６６０nmにおける吸光度を、
横軸は基質濃度(mM)を示す。

【図６】図６は、２０℃における本発明によるＰＯＤ活
性測定法用基質Ｃ３の保存安定性を調査した結果を示す
グラフである。縦軸は吸光度を、横軸は時間（時間）を
示す。

【図７】図７は、３７℃における本発明によるＰＯＤ活
性測定法用基質Ｃ３の保存安定性を調査した結果を示す
グラフである。縦軸は吸光度を、横軸は時間（時間）を
示す。

【図８】図８は、３７℃における過酸化水素共存下での
本発明によるＰＯＤ活性測定法用基質化合物類の保存安
定性を調査した結果を示すグラフである。縦軸は波長６
６０nmにおける吸光度を、横軸は時間（分）を示す。

【図９】図９は、本発明によるＰＯＤ活性測定法に及ぼ
すアジ化ナトリウムの影響を調査した結果を示すグラフ
である。縦軸は波長６６０nmにおける吸光度を、横軸は
時間（分）を示す。

【図１０】図１０は、本発明によるＰＯＤ活性測定法を
応用したＥＬＡＩＳＡの測定結果を示すグラフである。
縦軸は波長６６０nmにおける吸光度を、横軸はＡＦＰ濃
度(ng/ml)を示す。

【図１１】図１１は、本発明によるＰＯＤ活性測定法を
応用したＥＬＡＩＳＡの測定結果を示すグラフである。
縦軸は波長６６０nm（または４１５nm）における吸光度
を、横軸はＣＥＴＰ濃度(μg/ml)を示す。

Claims

【整理番号】Ｐ−０００３１５【特許請求の範囲】

【請求項１】下記一般式を持つジアミノジフェニルメチ
レン誘導体またはその塩を発色剤として用いるペルオキ
シダーゼ様活性測定法【化１】［式中、Ｒは低級アルキル基を示す。］
【請求項２】Ｒが、メチル基、エチル基、プロピル基、
およびブチル基からなる群から選択される請求項１のペ
ルオキシダーゼ様活性測定法
【請求項３】Ｒが、プロピル基である請求項２のペルオ
キシダーゼ様活性測定法
【請求項４】ペルオキシダーゼ様活性が、ペルオキシダ
ーゼに由来するものである請求項１のペルオキシダーゼ
様活性測定法
【請求項５】ペルオキシダーゼが、標識物質である請求
項４のペルオキシダーゼ様活性測定法
【請求項６】ペルオキシダーゼが、免疫学的活性物質の
ための標識物質である請求項５のペルオキシダーゼ様活
性測定法
【請求項７】免疫学的活性物質が、抗原、ハプテン、抗
体、および抗体断片からなる群から選択される請求項６
のペルオキシダーゼ様活性測定法
【請求項８】一般式で示した化合物をペルオキシダーゼ
１mUあたり０．５〜５mMで用いる請求項４のペルオキシ
ダーゼ様活性測定法
【請求項９】水素受容体が、過酸化水素である請求項１
のペルオキシダーゼ様活性測定法
【請求項１０】過酸化水素をペルオキシダーゼ１mUあた
り０．１〜１０mMで用いる請求項９のペルオキシダーゼ
様活性測定法
【請求項１１】次の工程1)〜2)で構成される請求項１の
ペルオキシダーゼ様活性測定法 1)ペルオキシダーゼ様活性を持つ物質に水素受容体と一
般式で示されるジアミノジフェニルメチレン誘導体また
はその塩を加える工程 2)ペルオキシダーゼの触媒作用によって生成する色素を
光学測定する工程
【請求項１２】反応停止剤によって色素の生成反応を停
止後に光学測定する請求項１１のペルオキシダーゼ様活
性測定法
【請求項１３】反応停止剤が、アジ化物である請求項１
２のペルオキシダーゼ様活性測定法
【請求項１４】ペルオキシダーゼ様活性の測定にあた
り、発色剤として下記一般式を持つジアミノジフェニル
メチレン誘導体またはその塩を発色剤として用いること
を特徴とするバックグランド抑制方法【化２】［式中、Ｒは低級アルキル基を示す］
【請求項１５】ペルオキシダーゼ様活性の測定にあた
り、発色剤として下記一般式を持つジアミノジフェニル
メチレン誘導体またはその塩を発色剤として用いること
を特徴とする呈色安定化方法【化３】［式中、Ｒは低級アルキル基を示す］
【請求項１６】水素受容体、および下記一般式を持つジ
アミノジフェニルメチレン誘導体またはその塩を含むペ
ルオキシダーゼ様活性測定用組成物【化４】［式中、Ｒは低級アルキル基を示す］
【請求項１７】水素受容体が、過酸化水素である請求項
１６のペルオキシダーゼ様活性測定用組成物
【請求項１８】ペルオキシダーゼ様活性が、ペルオキシ
ダーゼに由来するものである請求項１６のペルオキシダ
ーゼ様活性測用組成物
【請求項１９】ペルオキシダーゼが、標識物質である請
求項１８のペルオキシダーゼ様活性測定用組成物
【請求項２０】ペルオキシダーゼが、免疫学的活性物質
のための標識物質である請求項１９のペルオキシダーゼ
様活性測定用組成物
【請求項２１】免疫学的活性物質が、抗原、ハプテン、
抗体、および抗体断片からなる群から選択される請求項
２０のペルオキシダーゼ様活性測定用組成物
【請求項２２】下記一般式を持つジアミノジフェニルメ
チレン誘導体またはその塩、水素受容体、および反応停
止剤を含むペルオキシダーゼ様活性測定用キット【化５】［式中、Ｒは低級アルキル基を示す］
【請求項２３】ペルオキシダーゼで標識した免疫学的活
性物質、下記一般式を持つジアミノジフェニルメチレン
誘導体またはその塩、水素受容体、および反応停止剤を
含むペルオキシダーゼ標識による免疫学的測定用キット【化６】［式中、Ｒは低級アルキル基を示す］