JPH0880199A

JPH0880199A - 酸化性物質測定方法、ペルオキシダーゼ様物質測定方法、酵素免疫測定方法または酵素免疫染色方法及びこれらの測定方法に用いられる凍結乾燥組成物

Info

Publication number: JPH0880199A
Application number: JP21743394A
Authority: JP
Inventors: 稔 ▲高▼田; Minoru Takada; Shinya Yoshida; 伸也吉田
Original assignee: Konica Minolta Inc
Current assignee: Konica Minolta Inc
Priority date: 1994-09-12
Filing date: 1994-09-12
Publication date: 1996-03-26

Abstract

(57)【要約】【目的】比較的容易に調製する事が可能で発色感度、
検量線の直線性に優れ、しかも長期保存性にも優れたペ
ルオキシダーゼ様物質の検出および定量、酸化性物質の
検出及び定量、酵素免疫測定方法および酵素免疫染色方
法のための組成物を提供すること、そして、この組成物
を用いることによる再現性の高い測定系を提供する。【構成】アルキル部分が1〜3個の炭素原子よりなるテ
トラアルキルベンジジンを、有機酸を含有する水溶液に
溶解した後、この溶液を凍結乾燥することにより得られ
ることを特徴とする凍結乾燥組成物及び該組成物を用い
たペルオキシダーゼ様物質の検出および定量、酸化性物
質の検出及び定量方法又は、テトラアルキルベンジジ
ン、N-メチル-2-ピロリドンおよびpＨを一定の値に調節
することの出来る緩衝物質を含有する発色液を用いたペ
ルオキシダーゼ様物質の検出および定量、酸化性物質の
検出及び定量。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、テトラアルキルベンジ
ジンを含有する、ペルオキシダーゼ様物質及び酸化性物
質の検出及び測定のための組成物に関する。さらに詳し
くは、この組成物を利用した医学的診断もしくは生物学
的評価への利用に関する。

【０００２】

【従来の技術】現在、ペルオキシダーゼ様物質または酸
化性物質を測定するために最も一般的に行われているの
は、過酸化物の存在下で被酸化性発色物質である色原体
を酸化させ、形成された色素の量を比色定量する方法で
ある。色原体としては例えば、o-フェニレンジアミン(O
PD)、2,2′-アジノジ(3-エチルベンゾチアゾリン-6-ス
ルフォン酸)(ABTS)、5-アミノサリチル酸(5-ASA)などが
用いられている。しかしながら、これらの物質は例え
ば、OPDのように不安定で非酵素的な発色が起こりやす
いもの、5-ASAの様に感度の低いものなど、現在広く用
いられている色原体は、必ずしも使い勝手の良い色原体
とはいえない。また、これらの化合物は、それらのうち
のかなりの物が発癌性もしくは変異原性を持つといわれ
ており、最近広がりつつある環境問題やPL法の観点から
考えてもこれらの化合物を使用するということは好まし
いとはいえない。

【０００３】このような観点から変異原性を持たず、し
かも感度の良い色原体として3,3′,5,5′-テトラメチル
ベンジジン(以下TMB)が開発された。TMBは当初、血液中
のヘモグロビンを検出するために使用されていたが(Tet
rahedron, 30 ,(1974) , p3299-3302)、現在では、ペル
オキシダーゼ活性の検出、免疫組織染色(Anal. Bio-che
m., 98 ,(1979) , p388-393)、酵素免疫測定法(J. Immu
noassay, 2 ,(1981), P187-204)など多岐にわたる分野
で用いられている。

【０００４】しかしながら、これらの文献でも指摘され
ているように、TMBを含め、テトラアルキルベンジジン
は水に対する溶解度が極めて低く、多くの研究者たち
は、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ジメチルホルムアミ
ド(DMF)、メタノール、1,4-ジオキサンなどの有機溶媒
の助けを借りることによって溶解度を上昇させていた。
ところが、ここに示した有機溶媒は全てが有害もしくは
有毒物質であることから、人体への影響や安全性、環境
への影響等を考えると、ここに示したものを使用するこ
とは望ましいものとは言えず、加えて、幾つかのものは
蛋白質を変性させる働きを持つことから、酵素反応に影
響を与えることも考えられる。つまり、安全性を重視す
る目的で開発された色原体を使用するために安全性に問
題のある有機溶媒を用いることになり、結果的に本末転
倒となっている。ここにテトラアルキルベンジジンを用
いる上での第一の問題がある。

【０００５】第一の問題を解決するために、有機溶媒を
用いずにテトラアルキルベンジジンを水性媒体に溶解さ
せることが考えられた。すなわち、テトラアルキルベン
ジジンの塩酸塩、硫酸塩等の無機酸塩を用いる方法であ
る。しかしながら、これらの塩をpＨ3〜6程度の弱酸性
緩衝液に対し直接溶解させようとすると、一旦は溶解す
るものの、数分後には沈殿を生じるなどの問題点があ
る。そのため緩衝液に溶解する場合には、一旦、水に溶
解したものを緩衝液に加えるという方法を用いる必要が
あり、作業が煩雑になる上に精度も落ちるという欠点を
もっている。

【０００６】特開昭62-134100号および特開平1-104196
号に示されているように、酸性度の高い溶液に溶解する
方法もテトラアルキルベンジジンの溶液を調製するには
大変有効な手段である。この方法は、テトラアルキルベ
ンジジンが芳香族アミン化合物であり、強酸性溶液に対
しては比較的容易に溶解することを利用するもので、以
前より知られている(Tetrahedron, 30 ,(1974) , p3299
-3302)が、この方法によるとかなり高濃度のテトラアル
キルベンジジンの溶液を作ることが出来る。しかし、調
製の際に、強酸（塩酸、硫酸など）を用いるため安全上
好ましくなかった。

【０００７】つまり、これまでに発表されたいずれの方
法も、色原体としてテトラアルキルベンジジンを用いる
ということにおいて、安全性、操作の簡便さおよび長期
の保存性のすべてを満足するものではない。

【０００８】また、テトラアルキルベンジジンを用いる
上での第二の問題として、発明者らが本発明のテトラア
ルキルベンジジンを用いた発色液を開発するに当たり、
従来の方法を検討した結果、従来のテトラアルキルベン
ジジンを用いた方法では、特にEIA、ELISAなどの固定化
抗体に対するサンドイッチアッセイを用いる測定系にお
いて検量線の直線性が悪いという問題があることが明ら
かになった。この現象は、遊離のペルオキシダーゼを用
いた系では観察されず、固相に結合した標識化ペルオキ
シダーゼを用いた反応のみで観察されている。この現象
により結果の再現性及び精度が低下することは明らかで
あり、得られたデータの信頼性にもかかわる。にもかか
わらず、これまで、この現象は報告例さえなく、問題提
起されていなかったのが現状である。当然のことなが
ら、これまでに報告されたいずれの方法においてもこの
問題を解決するには至っていない。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、比較
的容易に調製する事が可能で発色感度、検量線の直線性
に優れ、しかも長期保存性にも優れたペルオキシダーゼ
様物質の検出および定量、酸化性物質の検出及び定量、
酵素免疫測定方法および酵素免疫染色方法のための組成
物を提供すること、そして、この組成物を用いることに
よる再現性の高い測定系を提供することにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明の上記目的は下記
の構成により達成される。

【００１１】１）アルキル部分が１〜３個の炭素原子
よりなるテトラアルキルベンジジンと有機酸を含有する
水溶液を凍結乾燥することにより得られる凍結乾燥組成
物。

【００１２】２）アルキル部分が１〜３個の炭素原子
からなるテトラアルキルベンジジンと有機酸を含有する
水溶液がpＨ3.5以下の水溶液であることを特徴とする前
記１記載の組成物。

【００１３】３）アルキル部分が１〜３個の炭素原子
からなるテトラアルキルベンジジンと有機酸を含有する
水溶液がpＨ2.5〜3.5の水溶液であることを特徴とする
前記１記載の組成物。

【００１４】４）前記２記載の水溶液が、アルキル部
分が１〜３個の炭素原子よりなるテトラアルキルベンジ
ジンを有機酸を含有する水溶液に溶解した後にpＨ3.5以
下に調製した水溶液であることを特徴とする前記２記載
の組成物。

【００１５】５）前記３記載の水溶液が、アルキル部
分が１〜３個の炭素原子よりなるテトラアルキルベンジ
ジンを有機酸を含有する水溶液に溶解した後にpＨ2.5〜
3.5に調製した水溶液であることを特徴とする前記３記
載の組成物。

【００１６】６）有機酸がクエン酸であることを特徴
とする前記１〜５のいずれかに記載の組成物。

【００１７】７）酸化性物質の測定方法において、上
記１〜６のいずれかに記載の組成物と水性媒体を混合
し、テトラアルキルベンジジンおよび緩衝物質を含有す
る発色液を作製し、該発色液と酸化性物質により生成し
た色素の呈色を測定することを特徴とする酸化性物質の
測定方法。

【００１８】８）ペルオキシダーゼ様物質の測定方法
において、上記１〜６のいずれかに記載の組成物と水性
媒体を混合し、テトラアルキルベンジジン、酸化性物質
および緩衝物質を含有する発色液を作製し、該発色液と
ペルオキシダーゼ様物質により生成した色素の呈色を測
定することを特徴とするペルオキシダーゼ様物質の測定
方法。

【００１９】９）ペルオキシダーゼにより標識された
抗体または抗原を用いる酵素免疫測定方法において、上
記１〜６のいずれかに記載の組成物と水性媒体を混合
し、テトラアルキルベンジジン、酸化性物質および緩衝
物質を含有する発色液を作製し、該発色液と標識化抗体
または抗原に結合したペルオキシダーゼ様物質により生
成した色素の呈色を比色定量することを特徴とする酵素
免疫測定方法。

【００２０】10）ペルオキシダーゼにより標識された
抗体または抗原を用いる酵素免疫染色方法において、上
記１〜６のいずれかに記載の組成物と水性媒体を混合
し、テトラアルキルベンジジン、酸化性物質および緩衝
物質を含有する発色液を作製し、該発色液と標識化抗体
または抗原に結合したペルオキシダーゼ様物質により生
成した色素の呈色を観察し、目的とする物質の存在の確
認もしくは測定を行うことを特徴とする酵素免疫染色方
法。

【００２１】11）酸化性物質の測定方法において、テ
トラアルキルベンジジン、pＨを一定の値に調節するこ
との出来る緩衝物質及び下記一般式１で表される化合物
を含有する発色液を用いることにより、生成した色素を
定量することを特徴とする酸化性物質の測定方法。

【００２２】

【化２】

【００２３】式中Ｒは、アルキル基、ヒドロキシアルキ
ル基、カルボキシアルキル基を表す。

【００２４】12）ペルオキシダーゼ様物質の測定方法
において、テトラアルキルベンジジン、酸化性物質、p
Ｈを一定の値に調節することの出来る緩衝物質及び上記
一般式１で表される化合物を含有する発色液を用いるこ
とにより、生成した色素を定量することを特徴とするペ
ルオキシダーゼ様物質の測定方法。

【００２５】13）ペルオキシダーゼにより標識された
抗体または抗原を用いる酵素免疫測定方法において、テ
トラアルキルベンジジン、酸化性物質、pＨを一定の値
に調節することの出来る緩衝物質及び上記一般式１で表
される化合物を含有する発色液を用いることにより、生
成した色素を定量することを特徴とする酵素免疫測定方
法。

【００２６】14）ペルオキシダーゼにより標識された
抗体または抗原を用いる酵素免疫染色方法において、テ
トラアルキルベンジジン、酸化性物質、pＨを一定の値
に調節することの出来る緩衝物質及び上記一般式１で表
される化合物を含有する発色液を用いることにより、生
成した色素を観察し、目的とする物質の存在の確認もし
くは測定を行うことを特徴とする酵素免疫染色方法。

【００２７】15）テトラアルキルベンジジンが3,3′,
5,5′-テトラメチルベンジジンであることを特徴とする
前記１〜14のいずれかに記載の方法。

【００２８】16）酸化性物質が過酸化水素であること
を特徴とする前記７または11記載の測定方法。

【００２９】17）ペルオキシダーゼ様物質がペルオキ
シダーゼであることを特徴とする前記８または12記載の
測定方法。

【００３０】18）ペルオキシダーゼが西洋ワサビペル
オキシダーゼであることを特徴とする前記17記載の測定
方法。

【００３１】本発明でいうペルオキシダーゼを結合した
抗体もしくは抗原分子を用いた酵素免疫測定方法とは、
医学書院より1982年に初版が発行された「酵素免疫測定
法」(石川榮治らの編集)の30〜49ページ及び、東京化学
同人より1989年に初版が発行された「エンザイムイムノ
アッセイ」(P.TIJSSEN著、監訳石川榮治)の8〜19ページ
に記載されているような酵素免疫測定方法であって、ペ
ルオキシダーゼ標識抗体または抗原を用い、ペルオキシ
ダーゼ活性量を酸化性物質及び発色剤で構成される発色
液を用いて測定する方法なら、どの様なものでも適合で
きる。

【００３２】本発明でいうペルオキシダーゼを結合した
抗体もしくは抗原分子を用いた酵素免疫染色方法とは、
ソフトサイエンス社より1987年に初版が発行された「実
験操作ブロッティング法」(口野らの編集)の211〜241ペ
ージに記載されているようなWesternブロッティング法
における免疫学的検出方法であって、ペルオキシダーゼ
標識された抗体または抗原を抗原抗体反応により目的と
する物質に反応させた後、酸化性物質及び発色剤の添加
によって色素を生成させ、呈色した色素を観察すること
により、目的とする物質の存在の確認もしくは測定を行
うことを特徴とする方法であればどの様なものでも適合
できる。

【００３３】本発明に用いられるテトラアルキルベンジ
ジンは、置換アルキル基としては、メチル基、エチル
基、プロピル基が挙げられるが、メチル基が好ましい。
特に好ましいテトラアルキルベンジジンは、3,3′,5,
5′-テトラメチルベンジジンである。

【００３４】本発明において、上述したテトラアルキル
ベンジジンの溶解性という第一の問題を解決するため
に、鋭意検討を重ねた。その結果、TMBなどのテトラア
ルキルベンジジンをクエン酸などの有機酸の水溶液に溶
解した後、凍結乾燥し、使用時に水性溶媒を加えること
により、テトラアルキルベンジジンを高濃度で容易に溶
解することが出来、しかも長期の保存性能に優れる組成
物を発明するに至った。有機酸の種類としては、蟻酸、
酢酸、プロピオン酸などの飽和脂肪族モノカルボン酸、
シュウ酸、マロン酸、琥珀酸などのジカルボン酸、クエ
ン酸、イソクエン酸、リンゴ酸、フマル酸、酒石酸等が
挙げられる。なかでもクエン酸が好ましい。また、凍結
乾燥に供する有機酸の溶液は、テトラアルキルベンジジ
ンを溶解したそのままの溶液でもよいが、より好ましく
は前述の有機酸溶液にテトラアルキルベンジジンを溶解
した後、pＨを2.5〜3.5の範囲に調節することが好まし
い。これは、pＨ2.5以上においては、保存性においてよ
り優れた効果が得られ、一方、pＨが3.5より大きくなる
とテトラアルキルベンジジンが析出し易くなってしまう
ためである。

【００３５】本発明に用いられる凍結乾燥組成物の作成
方法は、公知の凍結乾燥法により作製される。測定に際
しては、水性媒体と混合して、発色液とするが、発色液
において、テトラアルキルベンジジンまたはその塩の濃
度は0.01ないし1.0mg／mlが好ましく、より好ましくは
0.05ないし0.2mg／mlである。

【００３６】また、固相に結合したペルオキシダーゼを
用いたテトラアルキルベンジジンによる反応において検
量線の直線性が悪いという第二の問題については、鋭意
検討の結果、発色液中に一般式１で表される化合物を高
濃度に含有させることによって解決できることを見いだ
した。

【００３７】酵素免疫測定法において５〜20％(v/v)のN
-メチル-2-ピロリジノンを含有する発色液を使用する方
法は既に開示されており(特表昭62-500882)、N-メチル-
2-ピロリジノンが毒性や有害性を持たない物質であるこ
とも既に確認されている。しかしながら、ここに記載さ
れている濃度域での添加は、あくまでテトラアルキルベ
ンジジンの溶解性を向上することを目的とするためのも
のであった。発明者は、一般式1で表される化合物を反
応液中に高濃度に含有させることによって、驚くべきこ
とに検量線の直線性が大幅に改善されることを見いだし
た。一般式１の化合物を30％以上含有させることで検量
線の直線性が改善される傾向が得られ、特に、35％以上
の高濃度で含有させた場合、極めて良好な直線性が得ら
れたのである。また、60％よりも混合率を上げると、感
度の低下が観察されることから、好ましくは35〜60％の
範囲で用いるのが効果的である。そして、この発色液を
用いることにより、ペルオキシダーゼにより標識化され
た抗体または抗原を用いた酵素免疫測定法の系における
検量線の直線性が大幅に改善され、第二の問題を解決す
るに至った。加えて、危険または有害な方法を用いずに
テトラアルキルベンジジンの溶解性を向上させることに
も成功した。

【００３８】発色液において、テトラアルキルベンジジ
ンまたはその塩の濃度は、一般式１に示した化合物を使
用する方法においては0.01ないし5.0mg／mlであり、好
ましくは0.05ないし2.0mg／mlである。

【００３９】緩衝液を構成する成分としては、クエン
酸、酢酸、シュウ酸など前述の有機酸とクエン酸ナトリ
ウム、リン酸ナトリウムなどのナトリウム塩やカリウム
塩など有機酸塩または無機酸塩を選択することが出来
る。クエン酸を含有している溶液であればより好まし
い。

【００４０】また、発色を補助する成分として、キレー
ト剤（特開昭63-199270）、非イオン性界面活性剤（特
開昭62-294099）、トリポリりん酸（特開平1-243998）
などを色原体を安定化させるために反応系に添加するこ
とも出来る。

【００４１】一般式１で示される化合物の具体例として
はN-メチル-2-ピロリジノン、N-エチル-2-ピロリジノ
ン、N-プロピル-2-ピロリジノン、N-ブチル-2-ピロリジ
ノン、N-オクチル-2-ピロリジノン、N-ドデシル-2-ピロ
リジノン等のN-アルキル-2-ピロリジノン。また、N-ヒ
ドロキシメチル-2-ピロリジノン、N-(2-ヒドロキシエチ
ル)-2-ピロリジノン、N-(2-ヒドロキシプロピル)-2-ピ
ロリジノン、N-(2-ヒドロキシペンチル)-2-ピロリジノ
ン、N-(2-ヒドロキシオクチル)-2-ピロリジノン、N-(2-
ヒドロキシドデシルプロピル)-2-ピロリジノン等のN-ヒ
ドロキシアルキル-2-ピロリジノン及びN-(カルボキシメ
チル)-2-ピロリジノン、N-(2-カルボキシエチル)-2-ピ
ロリジノン、N-(3-カルボキシプロピル)-2-ピロリジノ
ン等のN-(ω-カルボキシアルキル)-2-ピロリジノン等が
挙げられる。

【００４２】本発明に係るペルオキシダーゼ様物質とし
ては、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、サイトク
ロムcペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ミ
エロペルオキシダーゼ、グルタチオンペルオキシダー
ゼ、また、鉄、金、銀などの金属及び金属化合物、ヘモ
グロビン等が挙げられるが、好ましくは西洋ワサビペル
オキシダーゼである。

【００４３】さらに、本発明で述べている酸化性物質と
は、ペルオキシダーゼの共存下で、テトラアルキルベン
ジジンを酸化することが可能なものであれば、どのよう
なものでも良い。具体的には、過酸化水素、アルキルヒ
ドロキシペルオキシド、p-ニトロペルオキシ安息香酸、
クメンヒドロキシペルオキシド、過酸化尿素等が挙げら
れるが、特に過酸化水素が好ましい。また、酸化性物質
の濃度は0.001ないし0.1％が好ましい。0.001％以下で
は感度が悪化し、0.1％以上では酵素活性が阻害され良
好な判定を行うことが不可能となるため再現性の点で好
ましくない。より好ましくは、0.005ないし0.02％であ
る。以上の条件を満たすものであれば、従来、同様の用
途に用いられてきた試薬と比較して、感度の面で優れた
結果が得られる。

【００４４】本発明を酸化性物質の検出、もしくは測定
に適用する場合、その方法は従来の方法と同様に行うこ
とが出来る。すなわち、本発明で述べられている組成物
及び西洋ワサビペルオキシダーゼ及び緩衝剤（さらに必
要ならば添加剤を加えても良い）により構成された発色
液と酸化性物質を含む試料を混合する。所定の温度(通
常室温付近)で所定の時間(通常５〜60分)反応させた
後、硫酸等の反応停止剤を加え、反応を停止する。その
後、吸光度を測定することにより、酸化性物質を測定す
ることが出来る。さらに、一般式１で示した化合物を用
いる場合、その濃度は35%以上が望ましく、より好まし
くは35〜60％(v/v)である。

【００４５】また、本発明をペルオキシダーゼ様物質の
検出、もしくは活性測定に適用する場合も従来行われて
きた方法と同様に行うことが出来る。例えば、本発明で
述べられている組成物及び過酸化水素及び緩衝液（さら
に必要ならば添加剤を加えても良い）により構成された
発色液とペルオキシダーゼ様物質を含む試料を混合し、
所定の温度(通常室温付近)で所定の時間(通常５〜60分)
反応させた後、硫酸等の反応停止剤を加え、反応を停止
する。その後、吸光度を測定することにより、ペルオキ
シダーゼ様物質のペルオキシダーゼ活性を求めることが
出来る。さらに、一般式１で示した化合物を用いる場
合、その濃度は35％以上が望ましく、より好ましくは35
〜60％(v/v)である。この範囲であれば、他の溶媒を用
いた場合と比べ、感度、直線性ともに優れた結果を得る
ことが可能になる。

【００４６】また、本発明をペルオキシダーゼを結合し
た抗体もしくは抗原分子を用いた酵素免疫測定法に適合
する場合、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡなどにおいて通常行われ
ている方法に準じ、得られたペルオキシダーゼ活性を標
準物質を用いることにより得られたペルオキシダーゼ活
性の検量線との対比によって、検体中の測定対象物質の
濃度(または量、単位)を求めることが出来る。

【００４７】加えて、本発明をペルオキシダーゼを結合
した抗体もしくは抗原分子を用いた酵素免疫染色法に適
合する場合、通常行われているのと同様に、Westernブ
ロッティング等のブロッティング操作の後、一次抗体を
反応させ、ペルオキシダーゼを結合した抗体もしくは抗
原分子を用いて二次反応を行った後、本発明の発色液を
作用させることによって目的物質の存在の確認もしくは
測定を行うことが出来る。

【００４８】

【実施例】以下に実施例を示し本発明の詳細な説明を行
うが、これにより限定される物ではない。

【００４９】実施例１＜発色液キットの製造＞（1）発色剤の調製クエン酸一水和物を3.95ｇ秤量し、20ml程度の蒸留水を
加え溶解した。このクエン酸溶液に3,3′,5,5′-テトラ
メチルベンジジン50mgを加え撹拌して溶解させた。溶解
後蒸留水を加え全量を25mlに調整した。ここで得られた
3,3′,5,5′-テトラメチルベンジジン溶液を褐色のバイ
アル瓶に１mlずつ分注し、凍結乾燥を行った。これを発
色剤とした。

【００５０】（2）基質溶液の調製クエン酸三ナトリウム（二水和物）を9.18ｇ秤量し、蒸
留水を450ml程度加え溶解した。さらに最終的に0.02重
量％濃度になるように過酸化水素水を加え良く撹拌した
後、蒸留水を加え、全量を500mlとした。この溶液を褐
色のバイアル瓶に20mlずつ分注し、保存した。これを基
質液とした。

【００５１】（3）発色液の調製（1）で製造した発色剤と（2）で調製した基質液を混合
し、発色液を調製した。この時、テトラメチルベンジジ
ンは完全に溶解し析出は認められなかった。比較として
テトラメチルベンジジンの二塩酸塩とクエン酸−クエン
酸ナトリウム緩衝液（pＨ4.8）を混合したところ、溶解
はするものの、すぐに析出が観察された。

【００５２】実施例２＜発色液キットの強制劣化試験＞発色液キット(発色剤
と基質液)をそれぞれ42℃の恒温槽中に静置し、経時的
に取り出し、混合して発色液を調製した後、発色性能、
バックグランドについて調べた。発色性能は、保存後の
発色剤と基質液を混合し、１mU／mlの西洋ワサビペルオ
キシダーゼを80μl加えて30分間反応させることにより
得られた吸光度を、保存開始時を100％として換算した
値を示した。また、バックグランドは各発色液調製後、
室温で３時間放置した後の吸光度の変化を調べた。結果
を表１および２に示した。表中のTMB-１は実施例１の
(1)と同様に調製した発色剤を、TMB-２は3,3′,5,5′-
テトラメチルベンジジンを、クエン酸を含有する水溶液
に溶解した後、pＨを2.5に調節したほかは、実施例１の
(1)と同様に調製した発色剤を用いた。また、TMB-３は
3,3′,5,5′-テトラメチルベンジジンを、クエン酸を含
有する水溶液に溶解した後、pＨを3.5に調節し、この溶
液を凍結乾燥したほかは、実施例１の(1)と同様に調製
した発色剤を用いた。また、基質液は実施例１の(2)と
同様に調製した。

【００５３】

【表１】

【００５４】

【表２】

【００５５】これらの結果から、本発明の発色液は強制
劣化後も性能的には問題なく使用可能であることが解
る。特にpＨを2.5〜3.5の範囲に調製したものでより良
好な結果が得られていることが解る。

【００５６】実施例３過酸化水素の定量実施例１に記載した方法により3,3′,5,5′-テトラメチ
ルベンジジンを含む発色液を調製した。ただし、このと
きの基質液には過酸化水素は加えなかった。この発色液
に、過酸化水素濃度が0〜0.02％になるように過酸化水
素水を加えた。調製した発色液300μlに１mU／mlの西洋
ワサビペルオキシダーゼ溶液80μlを加え、よく撹拌し
た後、室温で 30分間放置。その後1N H₂SO₄を加え反応
を停止し、450nmでの吸光度を測定した。その結果、図
１に示した結果が得られた。

【００５７】この結果から、過酸化水素濃度で0.02％濃
度までは、過酸化水素量と得られた吸光度がほぼ直線を
示しており、この範囲で酸化性物質の定量が可能である
ことがわかる。

【００５８】実施例４ペルオキシダーゼ活性の測定実施例１に記載した方法により3,3′,5,5′-テトラメチ
ルベンジジンを含む発色液を調製した。調製した発色液
300μlに０〜30mU／mlの濃度の西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ溶液80μlを加え、よく撹拌した後、室温で30分間
放置。その後、１mlの1N H₂SO₄を加え、反応を停止し
た。さらに、450nmでの吸光度を測定した。その結果を
図２に示した。

【００５９】その結果、本発明の系である3,3′,5,5′-
テトラメチルベンジジンを用いた発色液は、西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ濃度と吸光度の関係もほぼ直線にな
り、ペルオキシダーゼ様物質の定量が可能であることが
わかる。

【００６０】実施例５ガラクトシルトランスフェラーゼ量の測定 3,3′,5,5′-テトラメチルベンジジンの発色液につい
て、酵素免疫測定方法の系により検討を行った。

【００６１】特開平3-259093号に記載されている抗癌関
連ガラクトシルトランスフェラーゼ(以下GATと略記)モ
ノクローナル抗体MAb8513を、1M塩化ナトリウム含有0.1
M炭酸緩衝液(pＨ9.15)中に10μg／mlに希釈し、この溶
液中にポリスチレン製ビーズ(積水化学製)を4℃・24時間
浸漬し抗体の固定化を行うことにより、抗体固定化ビー
ズを得た。

【００６２】次に、ブロッキング溶液として牛血清アル
ブミン(以下BSAと略記)を１％含有する0.02Mリン酸緩衝
液(150mM NaCl含有pＨ7.3、以降PBSと称す)を調製す
る。この溶液中に抗体固定化後のビーズを移し、37℃、
10時間浸漬・放置し、ビーズ表面の抗体非結合部位の被
覆(ブロッキング)を行った。これら一連の作業により以
下に用いる抗体固定化ビーズを得た。

【００６３】検体としてGATを含有する癌患者プール血
清を用いた。この検体50μlに0.02Mリン酸緩衝液(pＨ6.
5、150mM NaCl及び0.01％ Tween20含有)200μlを添加
し、ここに上記に記載の方法により調製した抗体固定化
ビーズを浸漬し、一次反応（４５℃、２時間）を行っ
た。反応後PBSにて洗浄操作を行った。西洋ワサビペル
オキシダーゼ(以下 HRPと称す)にて標識したHRP標識抗G
AT抗体MAb8628(特開平3-259093号)を1％BSA含有PBS溶液
に適宜希釈し、これをビーズに固定化した抗体に対応す
るように250μl添加し、二次反応を行った。この後、同
様にPBSによる洗浄操作を行った。さらに、実施例１に
示された方法により調製した3,3′,5,5′-テトラメチル
ベンジジンの発色液を300μl加え、室温にて30分発色反
応を行った。反応後、1N H₂SO₄を1ml添加し反応を停止
させ、450nmでの吸光度を測定した。結果を図３に示
す。

【００６４】その結果、本発明の系である3,3′,5,5′-
テトラメチルベンジジンを用いた発色液は、GAT標準物
質を用いた検量線において濃度と吸光度の関係は、ほぼ
直線になり、酵素免疫測定方法における使用が可能であ
ることが示された。

【００６５】実施例６酵素免疫染色方法実施例１に記載した方法により調製した3,3′,5,5′-テ
トラメチルベンジジンを含む発色液を用いてWesternブ
ロッティング後の免疫染色を行った。

【００６６】メタノールによりウエッティング操作を行
ったPVDF膜(ミリポア社製)にブロッティング装置を用
い、量変化させたヒトIgGをドットブロットした。これ
を１％BSA-PBSにて37℃で一時間ブロッキングした後、
ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIgG抗体と4℃にて一時
間反応させ、その後PBSで充分洗浄した。上記の免疫反
応後の膜を実施例1に従い調製した3,3′,5,5′-テトラ
メチルベンジジンを含む発色液に浸漬し、室温にて発色
反応を行った。

【００６７】発色反応を開始してから10分後に膜を発色
液から取り出し、純水にて洗浄した後に風乾し目視にて
確認を行ったところ、膜上に極微量のIgGによる色素の
形成を確認することが出来た。このことから、本発明の
発色液を用いることにより、酵素免疫染色が可能である
ことが示された。

【００６８】実施例７ (a)有機溶媒の比較有機溶媒の種類による3,3′,5,5′-テトラメチルベンジ
ジンの溶解性を調べた。有機溶媒としては、メタノール
(MeOH)、エタノール(EtOH)、ジメチルホルムアミド(DM
F)、N-メチル-2-ピロリジノン(NMP)、N-ブチル-2-ピロ
リジノン(NBP)、N-ヒドロキシメチル-2-ピロリジノン(N
HMP)を用いた。結果を表３に示した。MeOH、EtOHを用い
た場合は緩衝液混合以前に、溶媒にも完全に溶解しなか
った。DMFを用いたものは溶媒には溶解するものの、溶
媒の混合比が低いものは、緩衝液混合後に3,3′,5,5′-
テトラメチルベンジジンの析出が観察された。本発明の
一般式１で表されるNMP、NBP、NHMPは、混合比10％でも
析出は観察されなかった。

【００６９】

【表３】

【００７０】（b）発色液の調製 3,3′,5,5′-テトラメチルベンジジンを5mg／ml濃度で
含有するN-メチル-2-ピロリジノン溶液を4mlと0.02％の
過酸化水素を含む0.1Mクエン酸−クエン酸ナトリウム緩
衝液(pＨ3.5)を６ml加え、発色液を調製した。以下の実
施例ではことわりのない限りこの溶液を発色液として用
いた。

【００７１】実施例８過酸化水素の定量 3,3′,5,5′-テトラメチルベンジジン５mgを４mlのNMP
に溶解し、クエン酸及びクエン酸ナトリウムからなる0.
1Mクエン酸緩衝液(pＨ3.5) ６mlと混合した。この溶液
に、過酸化水素濃度が0〜0.025％になるように過酸化水
素水を加えた。比較例として、NMPの代わりにEtOHまた
はDMSOを40％含有する系についても同様に測定を行っ
た。調製した発色液を各々300mlずつ分取し、１mU／ml
の西洋ワサビペルオキシダーゼ溶液80mlを加え、良く撹
拌した後、室温で30分間放置。その後1N H₂SO₄を１ml加
え反応を停止し、450nmでの吸光度を測定した。

【００７２】その結果、図４に示した結果が得られた。
この結果から、過酸化水素濃度で0.020％濃度までは、
過酸化水素量と得られた吸光度がほぼ直線を示してお
り、この範囲で酸化性物質の定量が可能であることが示
された。また、本発明の系を用いることにより、比較例
に示したような、従来用いられてきた物質を使用した系
と比べて、より高い感度が得られることがわかる。

【００７３】実施例９ペルオキシダーゼ活性の測定実施例７に記載した方法により3,3′,5,5′-テトラメチ
ルベンジジンを含む発色液を調製した。調製した発色液
300μlに0〜30mU／mlの濃度の西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ溶液80μlを加え、よく撹拌した後、室温で30分間
放置。その後、１mlの1N H₂SO₄を加え、反応を停止し
た。さらに、450nmでの吸光度を測定した。また、比較
例として、NMPの代わりにEtOHまたはDMFを40％含有する
発色液を調製し、この発色液についても同様に測定を行
った。その結果を図５に示した。

【００７４】その結果、本発明の系である3,3′,5,5′-
テトラメチルベンジジンを用いた発色液は、西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ濃度と吸光度の関係もほぼ直線にな
り、ペルオキシダーゼ様物質の定量が可能であることが
示された。加えて、本発明の系を用いることにより、比
較例に示したような、EtOHおよびDMFなど、従来用いら
れてきた物質を使用した系と比べて、より高い感度が得
られることがわかる。

【００７５】実施例10 ガラクトシルトランスフェラーゼ量の測定一般式１で表される化合物を含有する3,3′,5,5′-テト
ラメチルベンジジンの発色液と従来の方法で調製された
3,3′,5,5′-テトラメチルベンジジンを含有する発色液
を用いて、酵素免疫測定法の系により検討を行った。

【００７６】特開平3-259093号に記載されている抗癌関
連ガラクトシルトランスフェラーゼ（以下GATと略記）
モノクローナル抗体MAb8513を、1M塩化ナトリウム含有
0.1M炭酸緩衝液（pＨ9.15）中に10μg／mlに希釈し、こ
の溶液中にポリスチレン製ビーズ（積水化学製）を４℃
・24時間浸漬し抗体の固定化を行った。

【００７７】次に、ブロッキング溶液として牛血清アル
ブミン（以下BSAと略記）を１％含有する0.02Mリン酸緩
衝液（150mM NaCl含有pＨ7.3、以降PBSと称す）を調製
し、この溶液中に抗体固定化後のビーズを移し、37℃、
10時間浸漬・放置し、ビーズ表面の抗体非結合部位の被
覆（ブロッキング）を行った。これら一連の作業により
以下に用いる抗体固定化ビーズを得た。

【００７８】検体としてGATを含有する癌患者プール血
清を用いた。この検体50μlに0.02Mリン酸緩衝液（pＨ
6.5、150mM NaCl及び0.01％ Tween20含有）200μlを添
加し、ここに上記に記載の方法により調製した抗体固定
化ビーズを浸漬し、一次反応（45℃、２時間）を行っ
た。反応後PBSにて洗浄操作を行った。西洋ワサビペル
オキシダーゼ(以下 HRPと称す)にて標識したHRP標識抗G
AT抗体MAb8628（特開平3-259093号）を１％BSA含有PBS
溶液に適宜希釈し、これを250μl添加し、二次反応を行
った。この後、同様にPBSによる洗浄操作を行った。

【００７９】さらに、NMP、NBP、NHMPを各々10、20、3
0、35、40、60、65％(v/v)の割合で含有する発色液をそ
れぞれ300μl加え、室温にて30分発色反応を行った。ま
た、比較例として、MeOH、EtOH、DMFを10、20、30、3
5、40、60、65％(v/v)含有する発色液及び有機溶媒を含
有しない発色液についても同様に反応を行った。反応
後、それぞれに1N H₂SO₄を1mlずつ添加し反応を停止さ
せ、450nmでの吸光度を測定した。結果は、検量線の相
関係数によって比較した。これらの結果を図６及び表４
に示す。

【００８０】

【表４】

【００８１】その結果、本発明の一般式１で表される化
合物を含有する3,3′,5,5′-テトラメチルベンジジンの
発色液は、従来の3,3′,5,5′-テトラメチルベンジジン
を用いた発色液と比較して、直線性に優れるという結果
がえられた。特に、一般式１で表される化合物の混合比
は35〜60％の範囲において良好であるという結果が得ら
れた。

【００８２】実施例11 酵素免疫染色方法実施例７に記載した方法により3,3′,5,5′-テトラメチ
ルベンジジンを含む発色液を調製し、この発色液を用い
てWesternブロッティング後の免疫染色を行った。

【００８３】メタノールによりウエッティング操作を行
ったPVDF膜(ミリポア社製)にブロッティング装置を用
い、量変化させたヒトIgGをドットブロットした。これ
を１％BSA-PBSにて37℃で一時間ブロッキングした後、
ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIgG抗体と４℃にて一
時間反応させ、その後PBSで充分洗浄した。上記の免疫
反応後の膜を実施例7に従い調製した3,3′,5,5′-テト
ラメチルベンジジンを含む発色液に浸漬し、室温にて発
色反応を行った。

【００８４】発色反応を開始してから10分後に膜を発色
液から取り出し、純水にて洗浄した後に風乾し目視にて
確認を行ったところ、膜上に極微量のIgGによる色素の
形成を確認することが出来た。このことから、本発明の
発色液を用いることにより、酵素免疫染色が可能である
ことが示された。

【００８５】実施例12 ＜発色液キットの製造＞（1）発色剤の調製クエン酸一水和物を3.95ｇ秤量し、20ml程度の蒸留水を
加え溶解する。このクエン酸一水和物の溶液に3,3′,5,
5′-テトラメチルベンジジン50mgを加え撹拌して溶解さ
せる。溶解後蒸留水を加え全量を25mlに調整する。ここ
で得られた3,3′,5,5′-テトラメチルベンジジン溶液を
褐色のバイアル瓶に１mlずつ分注し、凍結乾燥を行う。
これを発色剤とした。

【００８６】（2）基質溶液の調製クエン酸三ナトリウム（二水和物）を9.18ｇ秤量し、蒸
留水を250ml程度加え溶解する。この溶液にN-メチル-2-
ピロリジノンを200ml加え、さらに最終的に0.02重量％
濃度になるように過酸化水素水を加え良く撹拌した後、
蒸留水を加え、全量を500mlとする。この溶液を褐色の
バイアル瓶に20mlずつ分注し、保存する。これを基質液
とする。

【００８７】（3）発色液の調製（1）で製造した発色剤と（2）で調製した基質液を混合
し、発色液を調製した。この時、テトラメチルベンジジ
ンは完全に溶解し析出は認められなかった。

【００８８】

【発明の効果】本発明により、従来のテトラアルキルベ
ンジジンを用いた方法に比べ、溶解性を向上出来るこ
と、発色液調製の操作が簡便であること、保存性に優れ
ることが解る。また本発明では、特に酵素免疫測定方法
の系において検量線の直線性を飛躍的に向上させると共
に、テトラアルキルベンジジンの溶解性を向上すること
が可能になった。

【図面の簡単な説明】

【図１】請求項２の方法により、3,3′,5,5′-テトラメ
チルベンジジンを含む溶液を凍結乾燥した組成物より作
成した発色液を使用した時の過酸化水素濃度と発色の関
係を示す図である。

【図２】請求項２の方法により、3,3′,5,5′-テトラメ
チルベンジジンを含む溶液を凍結乾燥した組成物より作
成した発色液を西洋ワサビペルオキシダーゼにより発色
させ、検量線を引いた図である。

【図３】請求項２の方法により、3,3′,5,5′-テトラメ
チルベンジジンを含む溶液を凍結乾燥した組成物より作
成した発色液を用いて、ＥＩＡ法により、血清中のガラ
クトシルトランスフェラーゼ濃度の検量線を求めた図で
ある。

【図４】請求項８の方法により作成した、3,3′,5,5′-
テトラメチルベンジジンを含む発色液及び従来の方法に
より調製した3,3′,5,5′-テトラメチルベンジジンを含
む発色液を用いた時の過酸化水素濃度と発色の関係を示
す図である。

【図５】請求項９の方法により作成した、3,3′,5,5′-
テトラメチルベンジジンを含む発色液を用い西洋ワサビ
ペルオキシダーゼにより発色させ、検量線を引いた図で
ある。

【図６】3,3′,5,5′-テトラメチルベンジジン、N-メチ
ル-2-ピロリドン、過酸化水素およびpＨを一定の値に調
節することの出来る緩衝物質を含有する発色液、及び従
来の方法により作成した3,3′,5,5′-テトラメチルベン
ジジンを含む発色液を用い、ＥＩＡ法により、血清中の
ガラクトシルトランスフェラーゼ濃度の検量線を求めた
図である。

【符号の説明】

１本発明の発色液を用いた検量線２ NMPの代わりにDMFを用いた検量線３ NMPの代わりにEtOHを用いた検量線

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アルキル部分が１〜３個の炭素原子より
なるテトラアルキルベンジジンと有機酸を含有する水溶
液を凍結乾燥することにより得られる凍結乾燥組成物。
【請求項２】アルキル部分が１〜３個の炭素原子から
なるテトラアルキルベンジジンと有機酸を含有する水溶
液がpＨ3.5以下の水溶液であることを特徴とする請求項
１記載の組成物。
【請求項３】アルキル部分が１〜３個の炭素原子から
なるテトラアルキルベンジジンと有機酸を含有する水溶
液がpＨ2.5〜3.5の水溶液であることを特徴とする請求
項１記載の組成物。
【請求項４】請求項２記載の水溶液が、アルキル部分
が１〜３個の炭素原子よりなるテトラアルキルベンジジ
ンを有機酸を含有する水溶液に溶解した後にpＨ3.5以下
に調製した水溶液であることを特徴とする請求項２記載
の組成物。
【請求項５】請求項３記載の水溶液が、アルキル部分
が１〜３個の炭素原子よりなるテトラアルキルベンジジ
ンを有機酸を含有する水溶液に溶解した後にpＨ2.5〜3.
5に調製した水溶液であることを特徴とする請求項３記
載の組成物。
【請求項６】有機酸がクエン酸であることを特徴とす
る請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】酸化性物質の測定方法において、上記請
求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物と水性媒体を
混合し、テトラアルキルベンジジンおよび緩衝物質を含
有する発色液を作製し、該発色液と酸化性物質により生
成した色素の呈色を測定することを特徴とする酸化性物
質の測定方法。
【請求項８】ペルオキシダーゼ様物質の測定方法にお
いて、上記請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物
と水性媒体を混合し、テトラアルキルベンジジン、酸化
性物質および緩衝物質を含有する発色液を作製し、該発
色液とペルオキシダーゼ様物質により生成した色素の呈
色を測定することを特徴とするペルオキシダーゼ様物質
の測定方法。
【請求項９】ペルオキシダーゼにより標識された抗体
または抗原を用いる酵素免疫測定方法において、上記請
求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物と水性媒体を
混合し、テトラアルキルベンジジン、酸化性物質および
緩衝物質を含有する発色液を作製し、該発色液と標識化
抗体または抗原に結合したペルオキシダーゼ様物質によ
り生成した色素の呈色を比色定量することを特徴とする
酵素免疫測定方法。
【請求項１０】ペルオキシダーゼにより標識された抗
体または抗原を用いる酵素免疫染色方法において、上記
請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物と水性媒体
を混合し、テトラアルキルベンジジン、酸化性物質およ
び緩衝物質を含有する発色液を作製し、該発色液と標識
化抗体または抗原に結合したペルオキシダーゼ様物質に
より生成した色素の呈色を観察し、目的とする物質の存
在の確認もしくは測定を行うことを特徴とする酵素免疫
染色方法。
【請求項１１】酸化性物質の測定方法において、テト
ラアルキルベンジジン、pＨを一定の値に調節すること
の出来る緩衝物質及び下記一般式１で表される化合物を
含有する発色液を用いることにより、生成した色素を定
量することを特徴とする酸化性物質の測定方法。【化１】式中Ｒは、アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボ
キシアルキル基を表す。
【請求項１２】ペルオキシダーゼ様物質の測定方法に
おいて、テトラアルキルベンジジン、酸化性物質、pＨ
を一定の値に調節することの出来る緩衝物質及び上記一
般式１で表される化合物を含有する発色液を用いること
により、生成した色素を定量することを特徴とするペル
オキシダーゼ様物質の測定方法。
【請求項１３】ペルオキシダーゼにより標識された抗
体または抗原を用いる酵素免疫測定方法において、テト
ラアルキルベンジジン、酸化性物質、pＨを一定の値に
調節することの出来る緩衝物質及び上記一般式１で表さ
れる化合物を含有する発色液を用いることにより、生成
した色素を定量することを特徴とする酵素免疫測定方
法。
【請求項１４】ペルオキシダーゼにより標識された抗
体または抗原を用いる酵素免疫染色方法において、テト
ラアルキルベンジジン、酸化性物質、pＨを一定の値に
調節することの出来る緩衝物質及び上記一般式１で表さ
れる化合物を含有する発色液を用いることにより、生成
した色素を観察し、目的とする物質の存在の確認もしく
は測定を行うことを特徴とする酵素免疫染色方法。
【請求項１５】テトラアルキルベンジジンが3,3′,5,
5′-テトラメチルベンジジンであることを特徴とする請
求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】酸化性物質が過酸化水素であることを
特徴とする請求項７または１１記載の測定方法。
【請求項１７】ペルオキシダーゼ様物質がペルオキシ
ダーゼであることを特徴とする請求項８または１２記載
の測定方法。
【請求項１８】ペルオキシダーゼが西洋ワサビペルオ
キシダーゼであることを特徴とする請求項１７記載の測
定方法。