JPH08183768A - Ｌ−プロリンの単離法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 不純物アミノ酸を含むＬ−プロリン水溶液か
ら高純度のＬ−プロリンを高収率で単離する。 【構成】 不純物アミノ酸を含むＬ−プロリン水溶液を
Ｈ⁺型強酸性カチオン交換樹脂に操作温度４０〜８０℃
の範囲で付し、Ｌ−プロリンを吸着させた後、アンモニ
ア水を通液することにより、吸着したＬ−プロリンを溶
離する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、Ｌ−プロリンの単離法
に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】食品用、飼料用、医薬用、化粧品用、工
業用などの広い分野で用いられているＬ−プロリンは、
通常、グルコース等の糖分を炭素源とする発酵法により
製造される。この方法で得られるＬ−プロリンを含む発
酵液は、Ｌ−プロリンだけでなく数種の副生アミノ酸を
含んでいる。また、その他にも有機酸や無機のカチオ
ン、アニオン、色素等の不純物を含んでいる。したがっ
て、醗酵法で製造されるＬ−プロリンを醗酵液から純粋
な形で得る為には、これらの多くの不純物や副生アミノ
酸を効率良く除去することが大きな課題となる。このよ
うな発酵液は、後述のように、本発明で処理されるべき
Ｌ−プロリン水溶液の典型的な一例である。

【０００３】Ｌ−プロリン発酵液からＬ−プロリンを単
離する方法として、室温あるいはそれより低い温度で強
酸性陽イオン交換樹脂に吸着させ夾雑物を貫流した後、
アンモニア水でＬ−プロリンを溶出させ、その後晶析に
より分離するという、ごく一般的な方法が知られている
（例えば、特開昭５８−６０９９５号、特開昭６０−１
４１２８４号、特開平３−１９５４９３号）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、実際に
はＬ−プロリンに近い等電点を持つ副生アミノ酸をＬ−
プロリンからイオン交換樹脂により分離するのは難し
く、どうしても、夾雑した状態のものが得られるに過ぎ
ず、そのため、より純度の高いＬ−プロリンを製造する
には、再晶析を繰り返えさざるを得ず、収率の低下をき
たすという問題がある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、高純度の
Ｌ−プロリンを高収率で単離する方法を見いだすべく鋭
意研究した結果、本発明を完成するに至った。

【０００６】すなわち、本発明は、Ｌ−プロリンが主成
分であるアミノ酸混合液からＨ⁺型強酸性カチオン交換
樹脂を用い、イオン交換クロマトグラフィーの操作温度
を４０〜８０℃の範囲で吸着、溶離を行うことを特徴と
するＬ−プロリンの単離法である。

【０００７】さらに、Ｈ⁺型強酸性カチオン交換樹脂に
Ｌ−プロリンを主成分とする混合液（副生アミノ酸を含
有するＬ−プロリン発酵液を含む）を吸着させ、Ｈ⁺型
強酸性カチオン交換樹脂からＬ−プロリンが濃縮された
形で得られた溶離液をＯＨ^-型強塩基性アニオン交換樹
脂に接触させてＯＨ^-型強塩基性アニオン交換樹脂吸着
成分を除去する、高純度のＬ−プロリンを効率良く単離
する方法である。

【０００８】一般に、高速液体クロマトグラフィーにお
けるイオン交換クロマトグラフィーでは、カラムの温度
を上げることにより、固定相中の試料成分の拡散速度が
速くなり、イオン交換反応を促進するため理論段数が上
がる。そのため、高温での操作により分離効率を上げる
ことができ、常温においては重なり合うピークでも分離
することが可能になる。しかし、高速液体クロマトグラ
フィーでは、イオン交換樹脂の交換容量からみると、分
離用に供することができる試料の量は極微量であり、使
用する樹脂当たりの処理効率は低く、多量の試料を処理
することはできない。

【０００９】また、イオン交換樹脂により、同じ電荷を
帯びた不純物を樹脂に吸着させ除去しようとする場合、
目的物の一部も樹脂に吸着され、収率が低下するという
問題がある。

【００１０】本発明は、イオン交換樹脂の交換容量ぎり
ぎりまで試料を注入し、大量かつ効果的に高純度のアミ
ノ酸を製造しようとする工業的規模への応用の道を新た
に開いたものである。

【００１１】以下、本発明を更に詳しく説明する。Ｌ−
プロリンと他の中性アミノ酸、例えばＬ−アラニン、Ｌ
−バリン等はＨ⁺型強酸性カチオン交換樹脂に対する吸
着力には大きな差は見られない。操作温度が常温では、
アンモニア水による溶離の際、それら副生アミノ酸はＬ
−プロリンとほぼ同時に溶出してくる。このためＬ−プ
ロリンの収率は低かった。また、酸性アミノ酸であるＬ
−グルタミン酸等も、このような分離操作によりＬ−プ
ロリンよりは早く溶出する傾向はあるものの、大部分は
Ｌ−プロリンと同時に溶出してしまう。

【００１２】一方、操作温度を４０〜８０℃に上げるこ
とにより、樹脂のイオン交換反応が促進され、吸着時に
Ｌ−プロリンと副生アミノ酸の樹脂に対する吸着力に差
が生じる。また、アンモニア水による溶離時において
は、樹脂が加温されることによる分離効率の向上によ
り、Ｌ−プロリンと副生アミノ酸が効率よく分離されＬ
−プロリンの収率が著しく向上すると考えられる。

【００１３】吸着・溶離のいずれの操作においても、操
作温度が８０℃を越える場合では、カラム内に気泡が発
生し、また、樹脂の劣化が早まるため、実用的ではな
く、一方、４０℃未満では不純物アミノ酸とＬ−プロリ
ンとの分離が充分でなく、収率よく高純度のＬ−プロリ
ンを得るためにはさらなる精製が必要となる。

【００１４】不純物を含有するＬ−プロリン水溶液を型
強酸性カチオン交換樹脂に付するに際しては、先ずＬ−
プロリン水溶液を酸性に調整し、Ｌ−プロリンを荷電状
態とする。Ｌ−プロリンの等電点付近では、樹脂に対す
る吸着能は低下する。

【００１５】一方、強酸性カチオン交換樹脂はＨ⁺型に
して使用する。他のカチオンの型、例えばアンモニウム
塩型では、樹脂に対するＬ−プロリンの吸着能が低下す
るため実用的ではない。

【００１６】溶離に用いるアンモニア水の濃度は、０．
２５〜１％程度が適当である。アンモニア水の濃度が高
まれば、Ｌ−プロリンの溶出速度は増す。

【００１７】本発明に用いる強酸性カチオン交換樹脂と
しては、公知のものがいずれでも使用できる。市販のも
のとして、例えば、ダイヤイオンＵＢＫ−５３０Ｋ、Ｓ
Ｋ−１０２、ＳＫ−１０４、ＳＫ−１０６、ＳＫ−１Ｂ
およびＳＫ−１０４Ｓ（以上、三菱化成社製）、レバチ
ットＳ−１００、Ｓ−１０９、ＳＰ−１１２、ＳＰ−１
２０およびＭＤＳ−１３６８（以上、バイエル社製）、
ＩＲ−１１６、ＩＲ−１１８、ＩＲ−１２０Ｂ、ＩＲ−
１２２およびＩＲ−１２４（以上、アンバーライト社
製）等をあげることができる。これらの中ではマクロポ
ーラス型のものよりゲル型のものの方が分離能が良い。
架橋度は４〜８％が一般的である。

【００１８】使用する強酸性カチオン交換樹脂量は、水
溶液のＬ−プロリンおよび不純物全体の濃度の多少によ
り適宜決定されるが、樹脂にＬ−プロリンを吸着させた
時、Ｌ−プロリンが洩れない程度であれば良く、例え
ば、Ｌ−プロリン濃度が５％程度で無機塩の濃度が５％
程度の水溶液の場合、その水溶液量の１〜２倍程度で充
分である。

【００１９】本発明の方法では、まず、Ｈ⁺型強酸性カ
チオン交換樹脂をカラムに充填し、カラム温度を４０〜
８０℃の範囲で恒温化させた後、カラム上部に上記の目
安の量のＬ−プロリン水溶液を注入する。

【００２０】例えば、不純物を含むＬ−プロリン水溶液
の場合、Ｈ⁺型強酸性カチオン交換樹脂をカラムに充填
し、カラム温度を４０〜８０℃に恒温化し、その上部に
ｐＨを１〜５好ましくは２〜４に調節したＬ−プロリン
水溶液を適量注入する。次いで、水を通液することによ
り、アニオン、非荷電性物質、発酵液においてはさらに
種々の色素等の夾雑物を溶出させる。その後に０．２５
〜１％アンモニア溶液を通液することにより、まず、酸
性アミノ酸、続いてＬ−プロリン、そして中性、塩基性
アミノ酸の順に溶離させ、Ｌ−プロリンが主成分である
画分を集める。

【００２１】通液速度（ＳＶ）については、通常０．５
〜１０程度であれば良い。目的分画位置は溶離液のｐ
Ｈ、着色度、電気伝導度などの時間的変化を追跡して決
定することができる。

【００２２】本発明において、Ｌ−プロリンが主成分で
あれば上記によりＬ−プロリンが効率よく単離できるの
であるが、特にたとえばＬ−グルタミン酸のような酸性
アミノ酸が含まれている場合、上記により単離できるが
Ｌ−プロリンとの分離が充分でないことが多い。

【００２３】好ましくは、Ｈ⁺型強酸性カチオン交換樹
脂から溶離されたＬ−プロリン画分をＯＨ^-型強塩基性
アニオン交換樹脂に通液し、酸性アミノ酸であるＬ−グ
ルタミン酸等を吸着除去する。なお、ＯＨ^-型強塩基性
アニオン交換樹脂にＬ−プロリンも同時に吸着される
が、通液が進むにつれ、一端吸着したＬ−プロリンは、
より樹脂に対する吸着力が強いＬ−グルタミン酸等と置
換され、順次溶出してくる。よって、樹脂量を適切に設
定することにより、Ｌ−プロリンを９５％以上回収で
き、Ｌ−グルタミン酸等の酸性アミノ酸も除去すること
が可能となる。

【００２４】Ｈ⁺型強酸性カチオン交換樹脂カラムの溶
出液のＬ−プロリン画分を強塩基性アニオン交換樹脂に
付するに際し、特に溶出液のｐＨを調節する必要はない
が通常は３〜７の範囲であることが多い。

【００２５】強塩基性アニオン交換樹脂はＯＨ^-型にし
て使用する。他のアニオンの型、例えば、Ｃｌ^-型では
溶出液中にＣｌ^-が混入し、また樹脂に対するＬ−グル
タミン酸等の吸着能が低下するため実用的ではない。

【００２６】ここで用いうる強塩基性アニオン交換樹脂
としては、公知の強塩基性アニオン交換樹脂がいずれで
も使用でき、市販品として、例えば、ダイヤイオンＰＡ
３０６、ＰＡ３１２およびＰＡ３１８（以上、三菱化成
社製）、レバチットＭ５００、ＭＰ５００およびＭＰ５
００Ａ（以上、バイエル社製）、アンバーライトＩＲＡ
−４３０、ＩＲＡ−９００およびＩＲＡ−９０４（以
上、アンバーライト社製）が販売されている。これらの
中ではマクロポーラス型のものがゲル型のものより吸着
能が良く、好適に使用できる。

【００２７】使用する強塩基性アニオン交換樹脂量は、
Ｌ−プロリン含有液に含まれるＬ−グルタミン酸等の酸
性成分を完全に補足できる量で充分であり、例えば、酸
性アミノ酸成分がＬ−グルタミン酸のみである場合、そ
の濃度が０．３％程度のときは、その水溶液量の１／３
０程度で充分である。水溶液のＬ−グルタミン酸濃度の
多少により、樹脂量は適宜設定する。

【００２８】本発明では、ＯＨ^-型強塩基性アニオン交
換樹脂をカラムに充填し、カラムの上部に上記の目安の
量のＬ−プロリン水溶液を注入する。

【００２９】例えば、Ｌ−グルタミン酸を含むＬ−プロ
リン水溶液の場合、ＯＨ^-型強塩基性アニオン交換樹脂
をカラムに充填し、その上部にＬ−プロリン水溶液を適
量注入する。通液につれて、Ｌ−グルタミン酸が優先的
に樹脂に吸着し、Ｌ−プロリンは殆ど未吸着のまま溶出
し、素通しの流出液として回収される。次いで適量の水
で水洗することにより、カラム内に残存するＬ−プロリ
ンを回収する。

【００３０】通液速度（ＳＶ）については、通常０．５
〜２０程度であれば良い。カラムの操作温度については
常温で良い。温度を上げればＬ−グルタミン酸の吸着能
が増すが、５０℃以上では、樹脂の性能が著しく劣化す
るため実用的ではない。

【００３１】得られたＬ−プロリン溶離液からＬ−プロ
リンの単離は、従来公知の方法ででき、例えば、活性炭
により残存する色素を除去した後、スプレードライによ
る乾燥でＬ−プロリンを得ることができる。

【００３２】

【実施例】以下、本発明を実施例によってさらに詳細に
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。

【００３３】実施例１ Ｌ−プロリン５０ｇ／ｌおよびＬ−アラニン０．５ｇ／
ｌ、Ｌ−バリン３．０ｇ／ｌ、NaCl１０ｇ／ｌ、 MgSO₄
・7H₂O ０．５ｇ／ｌ、 (NH₄)₂SO₄ ２０ｇ／ｌを含む
Ｌ−プロリン水溶液のｐＨを塩酸で３．０に調節したの
ち７０℃にし、その１１０mlを強酸性イオン交換樹脂ダ
イヤイオンＵＢＫ−５３０Ｋ（架橋度６％、ゲル型、三
菱化成社製）のＨ⁺型を１１０ml充填した、７０℃に保
温したカラム（φ１．６×５５cm）の上部に注入した。
次に、７０℃の水４４０mlで水洗した後、７０℃の０．
５％アンモニア水１ｌで溶離した。吸着、水洗、溶離の
操作はＳＶ＝２．０の条件下であった。アンモニア水溶
離液をフラクションコレクターで１２ml毎に分取し、ア
ミノ酸をアミノ酸ＨＰＬＣにて測定した。また、ｐＨも
測定した。結果を図１に示す。Ｌ−プロリンが溶出し始
めてからＬ−アラニン、Ｌ−バリンが溶出してくるまで
のフラクションをＬ−プロリン画分として集め、アミノ
酸ＨＰＬＣにて分析して、Ｌ−アラニンおよびＬ−バリ
ンの除去率、Ｌ−プロリンの回収率を以下の式によって
求めた。結果を表１に示す。 Ｌ−アラニン（Ｌ−バリン）の除去率（％）＝１００−
（Ａ／Ｂ）×１００ Ａ：Ｌ−プロリン画分液中のＬ−アラニン（Ｌ−バリ
ン）絶対量（ｇ） Ｂ：カラムに注入したＬ−プロリン水溶液中のＬ−アラ
ニン（Ｌ−バリン）絶対量（ｇ） Ｌ−プロリンの回収率（％）＝（ａ／ｂ）×１００ ａ：Ｌ−プロリン画分液中のＬ−プロリン絶対量（ｇ） ｂ：カラムに注入したＬ−プロリン水溶液中のＬ−プロ
リン絶対量（ｇ）

【００３４】実施例２〜５ 吸着、水洗、溶離の操作温度を４０、５０、６０または
８０℃にする他は実施例１を繰り返した。結果を図２〜
５および表１に示す。

【００３５】比較例１ 吸着、水洗、溶離の操作温度を３０℃にする他は実施例
１を繰り返した。結果を図６および表１に示す。

【００３６】比較例２ 吸着、水洗、溶離の操作温度を９０℃にする他は実施例
１を繰り返そうとしたが、カラム内が発泡して吸着させ
ることができず、実験を中止した。

【００３７】

【表１】

【００３８】実施例６、比較例３ 強酸性イオン交換樹脂としてレバチットＭＤＳ１３６８
（架橋度６％、ゲル型、バイエル社製）のＨ⁺型を用い
る他は実施例１または比較例１を繰り返した。溶出曲線
はそれぞれ図７、図８に示す通りであった。また、Ｌ−
アラニン、Ｌ−バリン除去率およびＬ−プロリン回収率
は表２に示す通りであった。

【００３９】

【表２】

【００４０】実施例７ Ｌ−プロリン発酵液を除菌して得た、Ｌ−プロリン５５
ｇ／ｌおよびＬ−グルタミン酸６．２ｇ／ｌ、Ｌ−アラ
ニン０．３ｇ／ｌ、Ｌ−バリン３．５ｇ／ｌ、Ｎａ⁺５
ｇ／ｌ、Ｍｇ²⁺０．０５ｇ／ｌ、ＮＨ₄ ⁺３ｇ／ｌを含む
Ｌ−プロリン水溶液のｐＨを塩酸で３．０に調節し、そ
の１１０mlを強酸性イオン交換樹脂ダイヤイオンＵＢＫ
−５３０Ｋ（架橋度６％、三菱化成社製）のＨ⁺型を１
１０ml充填したカラム（φ１.６×５５cm）の上部に注
入した。含まれるカチオンの量は、イオンクロマトグラ
フィーにより定量して求めた。次に、４４０mlの水で水
洗した後、０．５％のアンモニア水１．０ｌで溶離し
た。吸着、水洗、溶離の操作をＳＶ＝２．０の条件下
で、温度を７０℃で行った。上記実施例の溶出曲線は図
９に示す通りであった。また、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリ
ン除去率はともに９９．３％であり、Ｌ−プロリン回収
率は８７％であった。得られたＬ−プロリン画分の液２
６４mlには、Ｌ−グルタミン酸が２．５ｇ／ｌ含まれて
おり、ｐＨは４．２であった。次に強塩基性アニオン交
換樹脂ダイヤイオンＰＡ３０６（三菱化成社製）のＯＨ
^-型を９ml充填したカラム（φ１．６×４．５cm）の上
部に流速がＳＶ＝２．０、操作温度２５℃の条件下で注
入し、３６mlの水で水洗を行い、Ｌ−グルタミン酸を除
去して、Ｌ−プロリン水溶液３００mlを得た。この水溶
液を凍結乾燥し、Ｌ−プロリンの結晶５．０ｇを得た。
Ｌ−プロリンの最終純度は９９．９％、回収率はＬ−プ
ロリン発酵液に対して８３％であった。

【００４１】

【発明の効果】このように、本発明の方法は、Ｈ⁺型強
酸性カチオン交換樹脂の操作温度を常温で分離する従来
の方法に比べ、Ｌ−プロリンの分離性が良好であること
は明らかであり、なおかつ、Ｈ⁺型強酸性カチオン交換
樹脂で完全に除去できない酸性アミノ酸についても、Ｏ
Ｈ^-型強塩基性アニオン交換樹脂を適切に用いることに
より除去され、Ｌ−プロリンを高純度、高収率にかつ容
易に得ることができるので、その工業的価値は極めて高
い。

【図面の簡単な説明】

【図１】 実施例１の溶離曲線（操作温度 ７０⁰C）。

【図２】 実施例２の溶離曲線（操作温度 ４０⁰C）。

【図３】 実施例３の溶離曲線（操作温度 ５０⁰C）。

【図４】 実施例４の溶離曲線（操作温度 ６０⁰C）。

【図５】 実施例５の溶離曲線（操作温度 ８０⁰C）。

【図６】 比較例１の溶離曲線（操作温度 ３０⁰C）。

【図７】 実施例６の溶離曲線（操作温度 ７０⁰C）。

【図８】 比較例３の溶離曲線（操作温度 ３０⁰C）。

【図９】 実施例７の溶離曲線（操作温度 ７０⁰C）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 中村 武史 北海道砂川市豊沼町１番地 三井東圧化学 株式会社内

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】Ｌ−プロリンが主成分であるアミノ酸混合
   液からＨ⁺型強酸性カチオン交換樹脂を用い、イオン交
   換クロマトグラフィーの操作温度を４０〜８０℃の範囲
   で吸着、溶離を行うことを特徴とするＬ−プロリンの単
   離法。
2. 【請求項２】Ｈ⁺型強酸性カチオン交換樹脂を用いてＬ
   −プロリンを単離した後、Ｌ−プロリンを主として含む
   溶離液をさらにＯＨ^-型強塩基性アニオン交換樹脂によ
   り酸性アミノ酸を除去する請求項１記載のＬ−プロリン
   の単離法。