JPH08187095A - コレステロールオキシダーゼの安定化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 長期保存によってもコレステロールオキシダ
ーゼ活性が低下せず、かつ、濁りが生じない安定なコレ
ステロールオキシダーゼ製剤を提供する。 【構成】 コレステロールオキシダーゼを含む溶液に、
(1) 牛血清アルブミンと(2) 糖類およびアミノ酸からな
る群から選択された少なくとも１種の化合物、またはリ
ジンを添加し、凍結乾燥することを特徴とするコレステ
ロールオキシダーゼの安定化法および得られた固形製剤
ならびに該製剤を使用するコレステロール測定用試薬キ
ット。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、コレステロールオキシ
ダーゼの安定化法に関し、特に臨床的に、内分泌疾患や
代謝異常の診断の指標となっている体液中のコレステロ
ールの測定等に用いられるコレステロールオキシダーゼ
の安定化法に関する。

【０００２】

【従来の技術】コレステロールオキシダーゼは、臨床的
に、内分泌疾患や代謝異常の診断の指標となっている体
液中のコレステロールの測定等に用いられる酵素であ
る。従来からコレステロールオキシダーゼの安定化法と
しては、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩の添加
（特公昭57-13272号公報）、牛血清アルブミン、デキス
トラン、ポリエチレングリコールの添加（特開平6-6284
6 号公報）が知られている。しかし、これらの物質の添
加では、安定化が充分ではなく、保存期間中に酵素剤の
活性の低下ならびに濁りの生成などの問題点があった。
特に濁りにおいては記載がなく根本的な解決がなされて
いなかった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明はコレステロー
ルオキシダーゼの安定化法に関し、その目的とするとこ
ろは長期間の保存によっても酵素活性が低下しない、か
つ、濁りが生じない安定な酵素剤を提供することにあ
る。ここで言う安定化とは酵素活性の保持と変性などに
よる酵素剤からの濁り生成の抑制の２点を指す。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明はコレステロール
オキシダーゼを含む溶液に、(1) 牛血清アルブミンおよ
び(2) 糖類およびアミノ酸からなる群から選択された少
なくとも１種の化合物を添加することを特徴とするコレ
ステロールオキシダーゼの安定化法である。

【０００５】また本発明はコレステロールオキシダー
ゼ、(1) 牛血清アルブミンおよび(2)糖類およびアミノ
酸からなる群から選択された少なくとも１種の化合物を
含有することを特徴とするコレステロールオキシダーゼ
製剤である。

【０００６】さらに本発明はコレステロールエステラー
ゼ製剤、(1) 牛血清アルブミンおよび(2) 糖類およびア
ミノ酸からなる群から選択された少なくとも１種の化合
物を含有するコレステロールオキシダーゼ製剤、ペルオ
キシダーゼ、４−アミノアンチピリンおよびアニリン誘
導体またはフェノール誘導体および緩衝液からなるコレ
ステロール測定用試薬キットである。

【０００７】また本発明はコレステロールオキシダーゼ
を含む溶液に、リジンを添加することを特徴とするコレ
ステロールオキシダーゼの安定化法である。

【０００８】また本発明は、コレステロールオキシダー
ゼおよびリジンを含有することを特徴とするコレステロ
ールオキシダーゼ製剤である。

【０００９】さらに本発明はコレステロールエステラー
ゼ製剤、コレステロールオキシダーゼおよびリジンを含
有するコレステロールオキシダーゼ製剤、ペルオキシダ
ーゼ、４−アミノアンチピリンおよびアニリン誘導体ま
たはフェノール誘導体および緩衝液からなるコレステロ
ール測定用試薬キットである。

【００１０】本発明に使用するコレステロールオキシダ
ーゼとしては、如何なる起源のものでもよいが、例えば
ストレプトマイセス属、コリネバクテリウム属、ブレビ
バクテリウム属、ノカルディア属等の微生物により生産
されるコレステロールオキシダーゼがある。これらの微
生物を培養して得られるコレステロールオキシダーゼ含
有培養物、該培養物を常法により抽出して得た粗酵素、
あるいは該粗酵素を常法により精製して得られる精製酵
素等が好適に用いられる。さらにこれらの酵素を遺伝子
工学的あるいは化学的、物理的に修飾して得られる酵素
も含まれる。

【００１１】本発明の安定化剤の配合法は、特に制限は
ない。例えばコレステロールオキシダーゼを含む緩衝液
に安定化剤を配合する方法、安定化剤を含む緩衝液にコ
レステロールオキシダーゼを配合する方法、あるいはコ
レステロールオキシダーゼと安定化剤を緩衝液に同時に
添加する方法等がある。本発明では安定化剤を配合した
酵素溶液を凍結乾燥することが好ましい。凍結乾燥の条
件は特に制限はない。

【００１２】本発明に用いる緩衝液としては、リン酸緩
衝液、グッドバッファー、その他生化学で用いられる緩
衝液なら何れでもよいが、ｐＨは４〜１０、望ましくは
ｐＨ６．０〜８．０である。

【００１３】本発明に使用する牛血清アルブミン濃度
は、コレステロールオキシダーゼ溶液に対して０．１％
〜２０％である。しかし、牛血清アルブミン単独では、
下記表１に示すように３７℃一週間保存で８８％の残存
活性しかなく、十分な安定化効果が得られなかった。ま
た、濁りの形成においても著しいものであった。

【００１４】本発明に使用する糖類としては、グルコー
ス、ガラクトース、キシロース、フラクトース等の単糖
類、ラクトース、マルトース等の二糖類、トレハロー
ス、シュークロース、グルコン酸等の多糖類があるが、
特にシュークロース、グルコース、トレハロース、ラク
トース、グルコン酸ナトリウム、マンニトールが好まし
い。また、その濃度としては、コレステロールオキシダ
ーゼ溶液に対して０．１〜２０％である。糖類単独で
は、下記表１に示すように３７℃一週間保存で、十分な
安定化効果が得られず、また濁りの形成においても著し
いものであった。糖類は１種または２種以上を組み合わ
せて使用してもよい。

【００１５】本発明に使用するアミノ酸もしくはその塩
としてはグリシン、グルタミン酸、リジン等の親水性の
アミノ酸もしくはそのナトリウム、カリウム、アンモニ
ウム等の塩、酢酸塩または塩酸塩等があるが、特にグリ
シンアミノ酢酸塩、リジン塩酸塩が好ましい。その濃度
としては、コレステロールオキシダーゼ溶液に対して
０．１〜２０％である。リジン以外のアミノ酸単独で
は、下記表１に示すように３７℃一週間保存で、十分な
安定化効果が得られず、また濁りの形成においても著し
いものであった。リジンは単独にても安定化効果および
濁り形成において優れている。アミノ酸は１種または２
種以上を組み合わせて使用してもよい。

【００１６】本発明の好ましい実施態様は、コレステロ
ールオキシダーゼを含む溶液に、(1) 牛血清アルブミン
および(2) 糖類およびアミノ酸からなる群から選択され
た少なくとも１種の化合物を添加し、さらに凍結乾燥す
るコレステロールオキシダーゼの安定化法である。

【００１７】本発明の別な好ましい実施態様は、コレス
テロールオキシダーゼを含む溶液に、リジンを添加し、
さらに凍結乾燥するコレステロールオキシダーゼの安定
化法である。

【００１８】また、本発明の別な好ましい実施態様は、
コレステロールオキシダーゼ、(1)牛血清アルブミンお
よび(2) 糖類およびアミノ酸からなる群から選択された
少なくとも１種の化合物を含有するコレステロールオキ
シダーゼ固形製剤である。

【００１９】さらに本発明の別な好ましい実施態様は、
コレステロールオキシダーゼ、リジンを含有するコレス
テロールオキシダーゼ固形製剤である。

【００２０】本発明のコレステロール測定用試薬キット
は、コレステロールオキシダーゼの作用により生成した
過酸化水素を公知の種々の方法で測定するものである
が、最も一般的に利用されている方法は、ペルオキシダ
ーゼの存在下、色原体を酸化し、４−アミノアンチピリ
ンなどのカップラーと縮合させて色素を形成させ、比色
定量する方法が挙げられる。この方法に用いられる色原
体としては、フェノール、２−クロロフェノール、４−
クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノールなどの
フェノール誘導体、もしくはアニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエ
チル−ｍ−トルイジン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−アニシ
ジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’
−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−
ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン、
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピ
ル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル
−ｍ−アニシジンなどのアニリン誘導体が挙げられる。
過酸化水素の測定試薬は上記試薬に限られない。

【００２１】

【実施例】以下、本発明を実施例により詳細に説明す
る。実施例１ コレステロールオキシダーゼ溶液(2,000U/ml) 1ml に、
牛血清アルブミン（以下BSA と略す。オルガノテクニカ
製）を17.2mgとシュークロース、グルコース、トレハロ
ース、ラクトース、グルコン酸Na、マンニトール、グル
タミン酸Na、グリシンからなる群から選ばれた一種を、
それぞれ14.7mg添加混合し、凍結乾燥を行い、凍結乾燥
粉末を50mg得た。また同様にして、それぞれの添加剤の
み単独を添加し、または添加せずに、凍結乾燥粉末を得
た。

【００２２】上記製法で得た牛血清アルブミンと糖類ま
たはアミノ酸を添加したコレステロールオキシダーゼ凍
結乾燥粉末、コレステロールオキシダーゼ溶液にBSA 1
7.2mgのみを添加し凍結乾燥した粉末、糖類またはアミ
ノ酸のみを14.7mg添加し、凍結乾燥した粉末ならびに添
加剤なしのコレステロールオキシダーゼ凍結乾燥粉末を
以下のように比較した。凍結乾燥粉末を37℃にて一週間
保存し、その後の残存活性を測定した。また、該粉末を
保存後、過剰テストとして、該粉末を100U/ml になるよ
うに、50mM PIPESバッファー(pH7.0) に溶解し、その溶
液を37℃に保持し、濁りの生成をOD₆₆₀で測定し、かつ
目視により濁りを確認した。その結果を表１および表２
に示す。

【００２３】

【表１】

【００２４】

【表２】

【００２５】本発明の安定化されたコレステロールオキ
シダーゼ凍結乾燥粉末は、37℃で保存した場合、一週間
にわたって充分な活性を維持すること、濁りの生成も実
用レベルでほとんど問題に成らないレベルまで改善され
たことを確認した。一方、無添加のコレステロールオキ
シダーゼ凍結乾燥粉末は、37℃、一週間保存で、活性が
60%しか残存しておらず、著しい濁りの生成がみられ
た。また、BSA のみ添加した凍結乾燥粉末は、残存活性
が 88%であったが、著しい濁りの生成がみられた。

【００２６】実施例２ コレステロールオキシダーゼ溶液(2,000U/ml) 1ml に、
リジンを14.7mg添加混合し、凍結乾燥を行い、凍結乾燥
粉末を50mg得た。また、同様にしてコレステロールオキ
シダーゼ溶液(2,000U/ml) 1ml に、BSAを17.2mgとリジ
ンを14.7mg添加混合し、凍結乾燥を行い、凍結乾燥粉末
を50mg得た。これらの凍結乾燥粉末を37℃にて一週間保
存し、その後の残存活性を測定した。また、該粉末を保
存後、過剰テストとして、該粉末を100U/ml になるよう
に、50mM PIPESバッファー(pH7.0) に溶解し、その溶液
を37℃に保持し、濁りの生成をOD₆₆₀ で測定し、かつ目
視により濁りを確認した。その結果を表３に示す。

【００２７】

【表３】

【００２８】実施例３ コレステロールオキシダーゼ溶液(2,000U/ml) 1ml に、
BSA （オルガノテクニカ製）21.2mgと、リジン16.8mg
（リジン１）または33.6mg（リジン２）を添加混合し、
凍結乾燥を行い、凍結乾燥粉末を得た。得られたコレス
テロールオキシダーゼ凍結乾燥粉末を37℃にて二週間保
存し、その後の残存活性を測定した。また、粉末を保存
後、100U/ml になるように50mMPIPESバッファー(pH7.0)
に溶解し、その溶液を37℃に保持し、濁りの生成をOD
₆₆₀ で測定した。その結果を表４に示す。

【００２９】

【表４】

【００３０】本発明により安定化されたコレステロール
オキシダーゼは、37℃で保存した場合、二週間にわたっ
て充分な活性を維持すること、濁りの生成も実用レベル
でほとんど問題に成らないレベルまで改善されたことを
確認した。

【００３１】実施例４ コレステロールオキシダーゼ溶液(2,000U/ml) 1ml に、
BSA18.6mgおよびリジン14.8mgまたはシュークロース14.
8mgを添加混合し、さらに BSA 18.6mg およびリジンお
よびシュークロースをそれぞれ14.8mg添加混合し、凍結
乾燥を行い、凍結乾燥粉末を得た。

【００３２】得られたコレステロールオキシダーゼ凍結
乾燥粉末を37℃にて一週間保存し、その後の残存活性を
測定した。また、該粉末を保存後、100U/ml になるよう
に50mM PIPESバッファー(pH7.0) に溶解し、その溶液を
37℃に保持し、濁りの生成をOD₆₆₀ で測定した。その結
果を表５に示す。

【００３３】

【表５】

【００３４】本発明により安定化されたコレステロール
オキシダーゼは、37℃で保存した場合、一週間にわたっ
て充分な活性を維持すること、濁りの生成も実用レベル
でほとんど問題に成らないレベルまで改善されたことを
確認した。

【００３５】比較例１ コレステロールオキシダーゼ溶液(2,000U/ml) 1ml に、
塩化ナトリウムをそれぞれ29mg(0.5M)、17.5mg(0.3M)、
8.8mg(0.15M)添加混合し、凍結乾燥を行い、凍結乾燥粉
末を得た。得られた凍結乾燥粉末を37℃にて二週間保存
し、その後の残存活性を測定した。また、粉末を保存
後、100U/ml になるように50mM PIPESバッファー(pH7.
0) に溶解し、その溶液を37℃に保持し、濁りの生成を
目視判定した。その結果を表６に示す。

【００３６】

【表６】 このように、アルカリ金属では濁りの生成が著しい。

【００３７】

【発明の効果】本発明ではリジンを添加することによ
り、安定化効果とともに濁りにおいて優れたコレステロ
ールオキシダーゼ製剤を得ることができる。また、従来
から、牛血清アルブミン、糖類、アミノ酸は各種酵素の
安定化剤として知られているが、本発明ではそれらを組
み合わせることにより、単独で用いる場合よりも熱に対
して、一段と優れた安定化効果が見られる。さらに本発
明では、その組み合わせにより、濁りの生成を抑える効
果が非常に高く、安定な酵素製剤を得ることが出来る。
したがって、生化学試薬等として、前処理なしに使用で
きる利点を有する。

フロントページの続き (72)発明者 手嶋 真一 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績株 式会社敦賀バイオ研究所内 (72)発明者 愛水 重典 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績株 式会社敦賀バイオ研究所内

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 コレステロールオキシダーゼを含む溶液
   に、(1) 牛血清アルブミンおよび(2) 糖類およびアミノ
   酸からなる群から選択された少なくとも１種の化合物を
   添加することを特徴とするコレステロールオキシダーゼ
   の安定化法。
2. 【請求項２】 コレステロールオキシダーゼを含む溶液
   に、(1) 牛血清アルブミンおよび(2) 糖類およびアミノ
   酸からなる群から選択された少なくとも１種の化合物を
   添加し、さらに凍結乾燥する請求項１記載のコレステロ
   ールオキシダーゼの安定化法。
3. 【請求項３】 糖類がシュークロース、グルコース、ト
   レハロース、ラクトース、グルコン酸ナトリウムおよび
   マンニトールからなる群から選ばれた少なくとも１種の
   化合物である請求項１記載のコレステロールオキシダー
   ゼの安定化法。
4. 【請求項４】 アミノ酸がグルタミン酸ナトリウム、リ
   ジンおよびグリシンからなる群から選ばれた少なくとも
   １種のアミノ酸である請求項１記載のコレステロールオ
   キシダーゼの安定化法。
5. 【請求項５】 糖類がシュークロース、グルコース、ト
   レハロース、ラクトース、グルコン酸ナトリウムおよび
   マンニトールからなる群から選ばれた少なくとも１種の
   化合物であり、アミノ酸がグルタミン酸ナトリウム、リ
   ジンおよびグリシンからなる群から選ばれた少なくとも
   １種のアミノ酸である請求項１記載のコレステロールオ
   キシダーゼの安定化法。
6. 【請求項６】 コレステロールオキシダーゼ溶液に対し
   て、牛血清アルブミンを０．１〜２０％および糖類を
   ０．１〜２０％および／またはアミノ酸を０．１〜２０
   ％添加する請求項１記載のコレステロールオキシダーゼ
   の安定化法。
7. 【請求項７】 コレステロールオキシダーゼ、(1) 牛血
   清アルブミンおよび(2) 糖類およびアミノ酸からなる群
   から選択された少なくとも１種の化合物を含有すること
   を特徴とするコレステロールオキシダーゼ製剤。
8. 【請求項８】 固形製剤である請求項７記載のコレステ
   ロールオキシダーゼ製剤。
9. 【請求項９】 糖類がシュークロース、グルコース、ト
   レハロース、ラクトース、グルコン酸ナトリウムおよび
   マンニトールからなる群から選ばれた少なくとも１種の
   化合物である請求項７記載のコレステロールオキシダー
   ゼ製剤。
10. 【請求項１０】 アミノ酸がグルタミン酸ナトリウム、
    リジンおよびグリシンからなる群から選ばれた少なくと
    も１種のアミノ酸である請求項７記載のコレステロール
    オキシダーゼ製剤。
11. 【請求項１１】 糖類がシュークロース、グルコース、
    トレハロース、ラクトース、グルコン酸ナトリウムおよ
    びマンニトールからなる群から選ばれた少なくとも１種
    の化合物であり、アミノ酸がグルタミン酸ナトリウム、
    リジンおよびグリシンからなる群から選ばれた少なくと
    も１種のアミノ酸である請求項７記載のコレステロール
    オキシダーゼ製剤。
12. 【請求項１２】 コレステロールエステラーゼ製剤、
    (1) 牛血清アルブミンおよび(2) 糖類およびアミノ酸か
    らなる群から選択された少なくとも１種の化合物を含有
    するコレステロールオキシダーゼ製剤、ペルオキシダー
    ゼ、４−アミノアンチピリンおよびアニリン誘導体また
    はフェノール誘導体および緩衝液からなるコレステロー
    ル測定用試薬キット。
13. 【請求項１３】 コレステロールオキシダーゼを含む溶
    液に、リジンを添加することを特徴とするコレステロー
    ルオキシダーゼの安定化法。
14. 【請求項１４】 コレステロールオキシダーゼを含む溶
    液に、リジンを添加し、さらに凍結乾燥する請求項１３
    記載のコレステロールオキシダーゼの安定化法。
15. 【請求項１５】 コレステロールオキシダーゼを含む溶
    液に、リジンおよび牛血清アルブミンを添加し、さらに
    凍結乾燥する請求項１３記載のコレステロールオキシダ
    ーゼの安定化法。
16. 【請求項１６】 コレステロールオキシダーゼ溶液に対
    して、リジンを０．１〜２０％添加する請求項１３記載
    のコレステロールオキシダーゼの安定化法。
17. 【請求項１７】 コレステロールオキシダーゼおよびリ
    ジンを含有することを特徴とするコレステロールオキシ
    ダーゼ製剤。
18. 【請求項１８】 コレステロールオキシダーゼ、リジン
    および牛血清アルブミンを含有する請求項１７記載のコ
    レステロールオキシダーゼ製剤。
19. 【請求項１９】 固形製剤である請求項１７記載のコレ
    ステロールオキシダーゼ製剤。
20. 【請求項２０】コレステロールエステラーゼ製剤、コレ
    ステロールオキシダーゼおよびリジンを含有するコレス
    テロールオキシダーゼ製剤、ペルオキシダーゼ、４−ア
    ミノアンチピリンおよびアニリン誘導体またはフェノー
    ル誘導体および緩衝液からなるコレステロール測定用試
    薬キット。