JPH0819158B2 - ヒト−プレプロインスリン様成長因子▲ｉ▼ - Google Patents
ヒト−プレプロインスリン様成長因子▲ｉ▼Info
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- JPH0819158B2 JPH0819158B2 JP62000969A JP96987A JPH0819158B2 JP H0819158 B2 JPH0819158 B2 JP H0819158B2 JP 62000969 A JP62000969 A JP 62000969A JP 96987 A JP96987 A JP 96987A JP H0819158 B2 JPH0819158 B2 JP H0819158B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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- C07K14/65—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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- A61P15/14—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for lactation disorders, e.g. galactorrhoea
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Description
【発明の詳細な説明】 〈発明の背景〉 数種のインスリン様成長因子（IGF）が種々の動物か
ら単離されており、そしてそれらは成長ホルモンや胎盤
性ラクトゲンといつた様なホルモンの同化効果を仲介す
る活性成長促進分子であると考えられている。そのよう
なものとして、IGFは種々の成長状態および／または創
傷癒合の治療および／または増進に有用である。
ら単離されており、そしてそれらは成長ホルモンや胎盤
性ラクトゲンといつた様なホルモンの同化効果を仲介す
る活性成長促進分子であると考えられている。そのよう
なものとして、IGFは種々の成長状態および／または創
傷癒合の治療および／または増進に有用である。
“インスリン様成長因子”という命名は、これらのペ
プチドのインスリン様効果及びインスリン様構造を表現
する為に用いたものである。IGFは50％に近いアミノ酸
相同性をインスリンと共有し又三次構造的にはプロイン
スリンと類似する。さらに、三次構造模型を作ると、IG
Fはプロインスリンと、一本鎖である点、３つのジスル
フイド結合で架橋される点、及びＢ鎖様のアミノ末端部
分（Ｂ領域）、結合ペプチド（Ｃ領域）、及びＡ鎖様部
分（Ａ領域）より構成される点で類似している。それに
加えて、プロインスリンにはないカルボキシ末端の延長
部分（Ｄ領域）が存在する。最近の研究によれば、Ｅ領
域と命名された、プロインスリンにない今一つのＣ−末
端延長部分の存在が報告されている。Ｅ領域のペプチド
は現在迄にラツト及びヒトのIGF-IIとの関連で同定され
ている。（Hylka等（1985）及びZumstein等（198
5））。
プチドのインスリン様効果及びインスリン様構造を表現
する為に用いたものである。IGFは50％に近いアミノ酸
相同性をインスリンと共有し又三次構造的にはプロイン
スリンと類似する。さらに、三次構造模型を作ると、IG
Fはプロインスリンと、一本鎖である点、３つのジスル
フイド結合で架橋される点、及びＢ鎖様のアミノ末端部
分（Ｂ領域）、結合ペプチド（Ｃ領域）、及びＡ鎖様部
分（Ａ領域）より構成される点で類似している。それに
加えて、プロインスリンにはないカルボキシ末端の延長
部分（Ｄ領域）が存在する。最近の研究によれば、Ｅ領
域と命名された、プロインスリンにない今一つのＣ−末
端延長部分の存在が報告されている。Ｅ領域のペプチド
は現在迄にラツト及びヒトのIGF-IIとの関連で同定され
ている。（Hylka等（1985）及びZumstein等（198
5））。
今日迄、数種類のIGFが同定されている。それらに含
まれるものとして、IGF-I（ソマトメジンＣ）、IGF-I
I、ソマトメジンＡ、及び増殖刺激活性体（MSA）があ
る。これらの異種ペプチドは試験管内（Daughandy（197
7）;Clemmons及びVan Wyk（1981a））；及び生体内（va
n Buul-Offers及びVan deu Brande（1980）、Schoenle
等（1982））で顕著な成長促進効果を示す。
まれるものとして、IGF-I（ソマトメジンＣ）、IGF-I
I、ソマトメジンＡ、及び増殖刺激活性体（MSA）があ
る。これらの異種ペプチドは試験管内（Daughandy（197
7）;Clemmons及びVan Wyk（1981a））；及び生体内（va
n Buul-Offers及びVan deu Brande（1980）、Schoenle
等（1982））で顕著な成長促進効果を示す。
２種のヒトIGFの特性が明かにされている。これら
は、70個のアミノ酸からなる塩基性蛋白質であるIGF-I
（Rinderkhecht及びHumbel（1978a）、Rubin等（198
2））と67個のアミノ酸からなる中性蛋白質であるIGF-I
I（Rinderknecht及びHumbel（1978b）、Marquardt及びT
odars（1981））である。これらの完全なアミノ酸配列
は、ラツトおよびヒトのIGF-IおよびIGF-IIについての
み決定されている（Humbel）1978b））けれども、異な
つた種の動物から得たIGF-I及びIGF-IIの間には、高度
の相同性および／または交互反応性が存在することが、
ラジオイムノアツセイおよび／またはラジオレセプター
アツセイによつて示されている（Wilson及びHiutz（198
2））。
は、70個のアミノ酸からなる塩基性蛋白質であるIGF-I
（Rinderkhecht及びHumbel（1978a）、Rubin等（198
2））と67個のアミノ酸からなる中性蛋白質であるIGF-I
I（Rinderknecht及びHumbel（1978b）、Marquardt及びT
odars（1981））である。これらの完全なアミノ酸配列
は、ラツトおよびヒトのIGF-IおよびIGF-IIについての
み決定されている（Humbel）1978b））けれども、異な
つた種の動物から得たIGF-I及びIGF-IIの間には、高度
の相同性および／または交互反応性が存在することが、
ラジオイムノアツセイおよび／またはラジオレセプター
アツセイによつて示されている（Wilson及びHiutz（198
2））。
これらのペプチドの血中濃度は、その程度に強弱はあ
るにしろ、成長ホルモンの調節下にあると考えられ、IG
F-IはIGF-IIよりも強く調節されている。例えば、IGF-I
は、産後乳腺の発育に対し、成長ホルモン作用の主要な
メデイエイターとして、基本的な役割を果たす（Copela
nd等（1980）及びSchoenle等（1982）参照）。
るにしろ、成長ホルモンの調節下にあると考えられ、IG
F-IはIGF-IIよりも強く調節されている。例えば、IGF-I
は、産後乳腺の発育に対し、成長ホルモン作用の主要な
メデイエイターとして、基本的な役割を果たす（Copela
nd等（1980）及びSchoenle等（1982）参照）。
Vassilopoulou-Selliu及びPhillips（1982）は、モレ
キユラーシーブクロマトグラフイーを用いて、試験管内
と生体内とどちらで測定しても、ラツトの肝から抽出し
たIGF-I活性物質（凡そ30キロダルトン）は、血漿から
抽出したIGF-I活性物（凡そ８キロダルトン）よりも分
子量が高いと推定した。この著者達は、分子量のより高
い物質は、IGF-I前駆体に相当するのであろうと示唆し
た。また彼等は、高分子量のラツト肝IGF-Iの代謝調節
はラツト血清由来のIGF-Iのそれと似ていることを例証
した。最近Zumsteiu等（1985）は、ヒトの血清から、IG
F-IIの変異プロ型を単離し、それがIGF-II様の活性を試
験管内で有することを例証した。
キユラーシーブクロマトグラフイーを用いて、試験管内
と生体内とどちらで測定しても、ラツトの肝から抽出し
たIGF-I活性物質（凡そ30キロダルトン）は、血漿から
抽出したIGF-I活性物（凡そ８キロダルトン）よりも分
子量が高いと推定した。この著者達は、分子量のより高
い物質は、IGF-I前駆体に相当するのであろうと示唆し
た。また彼等は、高分子量のラツト肝IGF-Iの代謝調節
はラツト血清由来のIGF-Iのそれと似ていることを例証
した。最近Zumsteiu等（1985）は、ヒトの血清から、IG
F-IIの変異プロ型を単離し、それがIGF-II様の活性を試
験管内で有することを例証した。
高分子量の前駆体IGF-I蛋白は、種々な成長状態の治
療および／または増進についての潜在的生物活性及び有
用性を有する為に、これら前駆体蛋白質のアミノ酸配列
並びにDNAのコード配列が長い間探求されて来た。
療および／または増進についての潜在的生物活性及び有
用性を有する為に、これら前駆体蛋白質のアミノ酸配列
並びにDNAのコード配列が長い間探求されて来た。
Jansen等（1983）により、より高分子量のIGF-I前駆
体の存在を支持する、ヒトIGF-IcDNAクローン由来のア
ミノ酸配列が提出された。1985年１月16日に公開された
オランダ国特許出願No.8302324参照。しかしながら、Ja
nsenにより開示されたcDNAによつては、示唆されている
前駆体蛋白質に関しての正確な翻訳開始点を教示するに
十分なDNA配列情報が提供されていなかつた。加えて、J
ansen等およびオランダ国特許出願No.8302324には、こ
のcDNA配列が、発現される又はされ得る（例えば示唆さ
れている前駆体蛋白質が産生される）という何等の記載
又は示唆も提供されていない。
体の存在を支持する、ヒトIGF-IcDNAクローン由来のア
ミノ酸配列が提出された。1985年１月16日に公開された
オランダ国特許出願No.8302324参照。しかしながら、Ja
nsenにより開示されたcDNAによつては、示唆されている
前駆体蛋白質に関しての正確な翻訳開始点を教示するに
十分なDNA配列情報が提供されていなかつた。加えて、J
ansen等およびオランダ国特許出願No.8302324には、こ
のcDNA配列が、発現される又はされ得る（例えば示唆さ
れている前駆体蛋白質が産生される）という何等の記載
又は示唆も提供されていない。
確かにIGF-Iの生合成に関しては、ほとんど全く分つ
ていない。Ullrichらの予備試験の結果によれば、１半
数体ゲノム当り１個のヒトIGF-I遺伝子しか存在しない
ことが示唆されている（Ullrich等（1984）;Brissencie
n等（1984）；及びTricoli等（1984））。IGFの生合成
に関する研究は、IGF-Iの組織内含量（Vasilopoulou-Se
llm及びPhillips（1982））が極めて低いことにより、
又IGF-IIとは対照的に、このペプチドを有為な量生み出
す培養細胞系が同定されていない（Clemmons及びVan Wy
k（1981b）;Clemons及びShaw（1983））為に、困難であ
つた。更に加えて、完全なヒトIGF-I遺伝子も単離され
たおらず、また完全なDNA配列も決定されていない。Bel
l等（1985）の予備試験により、ヒトIGF-I遺伝子は、長
さは少くとも35キロベース（kb）であり、そのうち210
塩基対（bp）のみが成熟ヒトIGF-Iをコードすることが
示唆されている。またBell等（1985）の研究により、ヒ
トIGF-I遺伝子は４個のエキソンのみを含有し、それら
は協同して単一の前駆体IGF-I蛋白質をコードすること
が明らかにされている。この遺伝子は成熟IGF-Iのコー
ド配列と比較すると、大きく（例えば35kb以上）且つ複
雑であるために、完全なゲノムDNA配列の単離と同定が
極端に困難であつた。ゲノムIGF-Iクローンの単離によ
り、IGF-I生合成の研究が容易になり、又前駆体、成熟
および／または中間型のIGF-Iまたはその対立遺伝子変
異体の単離並びに同定が大いに容易になるであろう。ゲ
ノムクローンにより、このように、どの蛋白質が活性成
長促進ペプチドであるかを決定するのが容易になる。
ていない。Ullrichらの予備試験の結果によれば、１半
数体ゲノム当り１個のヒトIGF-I遺伝子しか存在しない
ことが示唆されている（Ullrich等（1984）;Brissencie
n等（1984）；及びTricoli等（1984））。IGFの生合成
に関する研究は、IGF-Iの組織内含量（Vasilopoulou-Se
llm及びPhillips（1982））が極めて低いことにより、
又IGF-IIとは対照的に、このペプチドを有為な量生み出
す培養細胞系が同定されていない（Clemmons及びVan Wy
k（1981b）;Clemons及びShaw（1983））為に、困難であ
つた。更に加えて、完全なヒトIGF-I遺伝子も単離され
たおらず、また完全なDNA配列も決定されていない。Bel
l等（1985）の予備試験により、ヒトIGF-I遺伝子は、長
さは少くとも35キロベース（kb）であり、そのうち210
塩基対（bp）のみが成熟ヒトIGF-Iをコードすることが
示唆されている。またBell等（1985）の研究により、ヒ
トIGF-I遺伝子は４個のエキソンのみを含有し、それら
は協同して単一の前駆体IGF-I蛋白質をコードすること
が明らかにされている。この遺伝子は成熟IGF-Iのコー
ド配列と比較すると、大きく（例えば35kb以上）且つ複
雑であるために、完全なゲノムDNA配列の単離と同定が
極端に困難であつた。ゲノムIGF-Iクローンの単離によ
り、IGF-I生合成の研究が容易になり、又前駆体、成熟
および／または中間型のIGF-Iまたはその対立遺伝子変
異体の単離並びに同定が大いに容易になるであろう。ゲ
ノムクローンにより、このように、どの蛋白質が活性成
長促進ペプチドであるかを決定するのが容易になる。
従つて本発明の目的の一つは、IGF-I前駆体蛋白質
（プレプロインスリン様成長因子−Ｉ）および／または
その部分ペプチドをコードし且つそれら蛋白質および／
またはその部分ペプチドを作成するのに有用な高度に精
製された遺伝子および／または合成DNA配列を提供する
ことにある。
（プレプロインスリン様成長因子−Ｉ）および／または
その部分ペプチドをコードし且つそれら蛋白質および／
またはその部分ペプチドを作成するのに有用な高度に精
製された遺伝子および／または合成DNA配列を提供する
ことにある。
更に他の一つの本発明の目的は、当該DNAを当該蛋白
質および／またはペプチドの生産に利用することにあ
る。
質および／またはペプチドの生産に利用することにあ
る。
本発明の他の目的は、新規プレプロインスリン様蛋白
質のアミノ酸配列並びに動物中で望ましい細胞の成長又
は機能性を促進する為に、当該蛋白質或はその断片を利
用する方法を提供することにある。
質のアミノ酸配列並びに動物中で望ましい細胞の成長又
は機能性を促進する為に、当該蛋白質或はその断片を利
用する方法を提供することにある。
〈本発明の要約〉 本発明は、新規なプレプロインスリン様成長因子‐Ｉ
（ppIGF-I）蛋白質、実質的に純粋なヒトIGF-I遺伝子、
及び新規ppIGF-Iをコードする合成DNAに関する。
（ppIGF-I）蛋白質、実質的に純粋なヒトIGF-I遺伝子、
及び新規ppIGF-Iをコードする合成DNAに関する。
一つの実施態様に於て、本発明は、少くとも２種のpp
IGF-I蛋白質をコードし且つ第４図に示すようなヌクレ
オチド配列（もしくは蛋白質発現に関してそれと等価
物）を含有する実質的に純粋なIGF-I遺伝子を提供す
る。
IGF-I蛋白質をコードし且つ第４図に示すようなヌクレ
オチド配列（もしくは蛋白質発現に関してそれと等価
物）を含有する実質的に純粋なIGF-I遺伝子を提供す
る。
その他の実施態様に於て、本発明は新規ppIGF-I蛋白
質をコードする合成DNA配列を提供する。当該合成DNA配
列の一つは、第２図に示すようなヌクレオチド配列もし
くは蛋白発現に関してはそれと機能的等価物）を含有す
る。
質をコードする合成DNA配列を提供する。当該合成DNA配
列の一つは、第２図に示すようなヌクレオチド配列もし
くは蛋白発現に関してはそれと機能的等価物）を含有す
る。
更に他の実施態様に於て、本発明は新規ppIGF-I蛋白
質のカルボキシル末端延長部をコードする実質的に純粋
なDNA配列（を提供する。そのような実質的に純粋なDNA
配列は、下記のヌクレオチド配列（もしくはペプチド発
現に関してそれと機能的等価物）を含有する。
質のカルボキシル末端延長部をコードする実質的に純粋
なDNA配列（を提供する。そのような実質的に純粋なDNA
配列は、下記のヌクレオチド配列（もしくはペプチド発
現に関してそれと機能的等価物）を含有する。
更に他の一つの実施態様に於て、本発明は、第６図に
示すアミノ酸配列を有する新規ppIGF-I蛋白質を提供す
る。
示すアミノ酸配列を有する新規ppIGF-I蛋白質を提供す
る。
別の実施態様に於て、本発明は下記のアミノ酸配列を
有する新規な延長ペプチドを提供する。
有する新規な延長ペプチドを提供する。
本延長ペプチドは新規ppIGF-I蛋白質のカルボキシ末端
延長部分に相当する。
延長部分に相当する。
他の実施態様に於て、本発明は動物細胞の成長および
／または他の好ましい機能を促進する為に、発明に係る
新規蛋白質および／またはペプチドを動物に当該効果を
惹起するに十分な量投与することからなる、動物細胞の
成長または他の好ましい機能を促進する種々の方法を提
供する。
／または他の好ましい機能を促進する為に、発明に係る
新規蛋白質および／またはペプチドを動物に当該効果を
惹起するに十分な量投与することからなる、動物細胞の
成長または他の好ましい機能を促進する種々の方法を提
供する。
他の実施態様に於て、本発明は、本発明に記載する実
質的に純粋な蛋白質を、本発明で提供された遺伝子およ
び／または合成DNAを発現させることにより生産する為
の方法を提供する。
質的に純粋な蛋白質を、本発明で提供された遺伝子およ
び／または合成DNAを発現させることにより生産する為
の方法を提供する。
〈本発明の詳細な説明〉 ここで使用するに当たり、アミノ酸（例えばアラニン
に対してAla）及びヌクレオチド（Ｇ、Ｃ、Ａ、Ｔ）に
相当する符号は、慣用的に採用されているものである
（Lehuinger（1976）参照）。
に対してAla）及びヌクレオチド（Ｇ、Ｃ、Ａ、Ｔ）に
相当する符号は、慣用的に採用されているものである
（Lehuinger（1976）参照）。
ここで使用するに当り、“遺伝子”とは、ある特定の
蛋白質をコードするDNA配列を含有する染色体DNAの領域
を指す。典型的には、真核生物遺伝子はエキソンとイン
トロンとを含有する。用語“エキソン”はRNAに転写さ
れる遺伝子（例えばDNA）配列を指す。ある特定のエキ
ソンは、それ故に、蛋白質をコードするDNA及び非コー
ドDNAから構成されるが、その際コード及び非コード両D
NAともRNAには転写されるが、コード配列のみが蛋白質
に翻訳される。用語“イントロン”は、特定の遺伝子に
存在するDNA配列を指し、一般的には、エキソンの間に
見出される（それ故に名前が“イントロン”）。
蛋白質をコードするDNA配列を含有する染色体DNAの領域
を指す。典型的には、真核生物遺伝子はエキソンとイン
トロンとを含有する。用語“エキソン”はRNAに転写さ
れる遺伝子（例えばDNA）配列を指す。ある特定のエキ
ソンは、それ故に、蛋白質をコードするDNA及び非コー
ドDNAから構成されるが、その際コード及び非コード両D
NAともRNAには転写されるが、コード配列のみが蛋白質
に翻訳される。用語“イントロン”は、特定の遺伝子に
存在するDNA配列を指し、一般的には、エキソンの間に
見出される（それ故に名前が“イントロン”）。
ここで蛋白質、ペプチド、核酸（DNA又はRNA）配列、
遺伝子および／または分子を記載するのに使用する際、
用語“本質的に純粋”は、天然（例えば生体内）の状態
での蛋白質、ペプチド、核酸配列、遺伝子および／また
は分子と関連の深い他の蛋白質、ペプチド、核酸、遺伝
子および／または分子を本質的に全く含まないことを意
味する。
遺伝子および／または分子を記載するのに使用する際、
用語“本質的に純粋”は、天然（例えば生体内）の状態
での蛋白質、ペプチド、核酸配列、遺伝子および／また
は分子と関連の深い他の蛋白質、ペプチド、核酸、遺伝
子および／または分子を本質的に全く含まないことを意
味する。
ここで蛋白質又はペプチドを記載する場合、用語“合
成（的）”は、動物体内における自然産生以外の技法
（例えば化学的又は酵素的合成或は組換えDNA発現）に
よつて産生された蛋白質又はペプチドを意味する。従つ
て、合成蛋白質又はペプチドは、生産されたままで典型
的に実質的に純粋である（例えば天然由来の蛋白質又は
ペプチドを全く含まない）。同様にDNA配列又は分子に
関して、用語“合成（的）”は当該DNA配列又は分子が
天然の生体内複製以外の技法で作られたことを意味す
る。即ち、ここで記載されるヌクレオチド配列を使用す
るならば、本発明に係るどのDNAも、それに限る訳では
ないけれども、自動DNA合成装置、他の化学合成的工
程、酵素的単離、cDNA合成又はクローン化技法といつた
当業者には既知の種々な“合成”技法で調製出来る。
成（的）”は、動物体内における自然産生以外の技法
（例えば化学的又は酵素的合成或は組換えDNA発現）に
よつて産生された蛋白質又はペプチドを意味する。従つ
て、合成蛋白質又はペプチドは、生産されたままで典型
的に実質的に純粋である（例えば天然由来の蛋白質又は
ペプチドを全く含まない）。同様にDNA配列又は分子に
関して、用語“合成（的）”は当該DNA配列又は分子が
天然の生体内複製以外の技法で作られたことを意味す
る。即ち、ここで記載されるヌクレオチド配列を使用す
るならば、本発明に係るどのDNAも、それに限る訳では
ないけれども、自動DNA合成装置、他の化学合成的工
程、酵素的単離、cDNA合成又はクローン化技法といつた
当業者には既知の種々な“合成”技法で調製出来る。
ここで用いる用語“カルボキシル末端延長ペプチド”
又は、その代りの“延長ペプチド”は成熟IGF-Iをコー
ドするDNA配列の下流３′でコードされるペプチドを意
味する。例えば、本発明に係る一つの延長ペプチドは下
記のアミノ酸配列を有する： 第２の延長ペプチドは上記の配列で下線を施したアミ
ノ酸から構成される。この第２延長ペプチドは本発明に
係る新規のIGF-Iエキソンでコードされる。これらの延
長ペプチドは、増強された生物学的活性を、それ自身で
持つている。更にその上／またはIGF-I遺伝子でコード
される蛋白質にそれら活性を与えるものと考えられてい
る。
又は、その代りの“延長ペプチド”は成熟IGF-Iをコー
ドするDNA配列の下流３′でコードされるペプチドを意
味する。例えば、本発明に係る一つの延長ペプチドは下
記のアミノ酸配列を有する： 第２の延長ペプチドは上記の配列で下線を施したアミ
ノ酸から構成される。この第２延長ペプチドは本発明に
係る新規のIGF-Iエキソンでコードされる。これらの延
長ペプチドは、増強された生物学的活性を、それ自身で
持つている。更にその上／またはIGF-I遺伝子でコード
される蛋白質にそれら活性を与えるものと考えられてい
る。
本発明に係る蛋白質について、それに対応するアミノ
酸配列を用いて言及する場合には、その蛋白質の活性が
本質的に維持される限りにあつては、種々のアミノ酸の
置換、附加および／あるいは欠失を包含することも当業
者には理解されよう。同様に本発明によつて同定された
実質的に純粋なDNA配列及び合成DNA配列には、ヌクレオ
チドの欠失、置換、逆位、附加、対立遺伝子変異等によ
る変化体および／又はコードされる蛋白質の発現に関し
ての機能的な等価物も、それらによつて発現される蛋白
質の活性が本質的に維持される限りは、包含されると理
解すべきである。こういつたアミノ酸及びヌクレオチド
の変動は、当業者には衆知であり、又全化学合成、酵素
的操作及び組換えDNA技法といつた慣用的な技法で創製
することが出来る。例えば、本発明に係る蛋白質を合成
するのに使用される特定の宿主細胞又は生体が有するコ
ドンおよび／または発現の優先性に合致する既知の遺伝
暗号の縮重により、本発明に係る特定のDNA配列および
／または遺伝子の改変を行うことが出来ることが期待さ
れる。
酸配列を用いて言及する場合には、その蛋白質の活性が
本質的に維持される限りにあつては、種々のアミノ酸の
置換、附加および／あるいは欠失を包含することも当業
者には理解されよう。同様に本発明によつて同定された
実質的に純粋なDNA配列及び合成DNA配列には、ヌクレオ
チドの欠失、置換、逆位、附加、対立遺伝子変異等によ
る変化体および／又はコードされる蛋白質の発現に関し
ての機能的な等価物も、それらによつて発現される蛋白
質の活性が本質的に維持される限りは、包含されると理
解すべきである。こういつたアミノ酸及びヌクレオチド
の変動は、当業者には衆知であり、又全化学合成、酵素
的操作及び組換えDNA技法といつた慣用的な技法で創製
することが出来る。例えば、本発明に係る蛋白質を合成
するのに使用される特定の宿主細胞又は生体が有するコ
ドンおよび／または発現の優先性に合致する既知の遺伝
暗号の縮重により、本発明に係る特定のDNA配列および
／または遺伝子の改変を行うことが出来ることが期待さ
れる。
本発明に係るDNA 本発明の一つの実施態様に於て、IGF-1BcDNAと命名す
る新規でIGF-Iに特異的なcDNAが同定単離された。このI
GF-1Bのヌクレオチド配列は、第２図に示す配列を有す
ることが決定された。それに続き、IGF-1BcDNAのDNA配
列分析により、ここでppIGF-1Bと命名される新規な195
個のアミノ酸より成るプレプロインスリン様成長因子−
Ｉ蛋白質をコードする、585個のヌクレオチドよりなる
オープンリーデイングフレーム（ヌクレオチド183から7
67、第２図）が明かにされた。この新規ppIGF-1Bのアミ
ノ酸配列は、第６図に示してある。より詳細に後述し且
つ第５図に示すように、IGF-1B cDNAと、Jansen等（198
3）によつて発表されたpp IGF-I cDNAとの比較によれ
ば、IGF-1B cDNAは、新規で別個のppIGF-1蛋白質（例え
ばppIGF-1B）をコードする、新規で別個の合成DNA配列
であることが明らかにされた。特に、IGF-1B cDNA配列
は、Jansen等（1983）による最初の402個のヌクレオチ
ドの配列と実質的に相同であるが、その後のヌクレオチ
ド配列は際立つて相違する。かくして、Jansen等のcDNA
とIGF-1B cDNAにより、大きさ（IGF-1B195個のアミノ酸
に対して153個のアミノ酸）及びＣ末端延長成分の異な
る、別個のppIGF-I蛋白質が得られることになり、その
意義については更に詳しく後述する。
る新規でIGF-Iに特異的なcDNAが同定単離された。このI
GF-1Bのヌクレオチド配列は、第２図に示す配列を有す
ることが決定された。それに続き、IGF-1BcDNAのDNA配
列分析により、ここでppIGF-1Bと命名される新規な195
個のアミノ酸より成るプレプロインスリン様成長因子−
Ｉ蛋白質をコードする、585個のヌクレオチドよりなる
オープンリーデイングフレーム（ヌクレオチド183から7
67、第２図）が明かにされた。この新規ppIGF-1Bのアミ
ノ酸配列は、第６図に示してある。より詳細に後述し且
つ第５図に示すように、IGF-1B cDNAと、Jansen等（198
3）によつて発表されたpp IGF-I cDNAとの比較によれ
ば、IGF-1B cDNAは、新規で別個のppIGF-1蛋白質（例え
ばppIGF-1B）をコードする、新規で別個の合成DNA配列
であることが明らかにされた。特に、IGF-1B cDNA配列
は、Jansen等（1983）による最初の402個のヌクレオチ
ドの配列と実質的に相同であるが、その後のヌクレオチ
ド配列は際立つて相違する。かくして、Jansen等のcDNA
とIGF-1B cDNAにより、大きさ（IGF-1B195個のアミノ酸
に対して153個のアミノ酸）及びＣ末端延長成分の異な
る、別個のppIGF-I蛋白質が得られることになり、その
意義については更に詳しく後述する。
この新規IGF-1B cDNAは、ppIGF-1Bを試験管内で産生
するのに有用であることが例証され、そしてて適当な宿
主細胞（細菌、酵母、哺乳類又は植物）中で、慣用的な
組み換えDNA技法及び遺伝工学によつて、ppIGF-1B若し
くはその任意の部分を産生するのに有用な合成DNA配列
を提供するものとして期待される。又、特定の哺乳動物
細胞中で、合成IGF-1B DNA配列は細胞内又は産生後に起
るppIGF-1Bの成熟IGFへのプロセシングの結果として、
成熟IGF-1の産生するのに有用であることも期待され
る。
するのに有用であることが例証され、そしてて適当な宿
主細胞（細菌、酵母、哺乳類又は植物）中で、慣用的な
組み換えDNA技法及び遺伝工学によつて、ppIGF-1B若し
くはその任意の部分を産生するのに有用な合成DNA配列
を提供するものとして期待される。又、特定の哺乳動物
細胞中で、合成IGF-1B DNA配列は細胞内又は産生後に起
るppIGF-1Bの成熟IGFへのプロセシングの結果として、
成熟IGF-1の産生するのに有用であることも期待され
る。
IGF-1B cDNAのDNA配列を既に提供したので（第２図参
照）、上記配列を構成する合成DNAは、自動DNA合成のよ
うな慣用的方法によつて出来るようになる。
照）、上記配列を構成する合成DNAは、自動DNA合成のよ
うな慣用的方法によつて出来るようになる。
本発明の一実施態様に於て、IGF-1B cDNAを、ヒト肝
メツセンジヤーRNA（mRNA）から構築したcDNAライブラ
リーから単離した。このc-DNAライブラリーは、構築さ
れ、Kwok等（1985）とGubler及びHoffman（1983）によ
つて記載された方法に従つて、IGF-1を含有するクロー
ンについてスクリーニングされた。肝はIGF産生の主要
部位であるけれども、例えば胎児組織及び繊維芽細胞と
いつた多くの他の組織も同様に種々のIGFを合成する。
かくして、そういつた他の組織も一つの可能性としてヒ
トcDNAライブラリーの構築に使用されよう。
メツセンジヤーRNA（mRNA）から構築したcDNAライブラ
リーから単離した。このc-DNAライブラリーは、構築さ
れ、Kwok等（1985）とGubler及びHoffman（1983）によ
つて記載された方法に従つて、IGF-1を含有するクロー
ンについてスクリーニングされた。肝はIGF産生の主要
部位であるけれども、例えば胎児組織及び繊維芽細胞と
いつた多くの他の組織も同様に種々のIGFを合成する。
かくして、そういつた他の組織も一つの可能性としてヒ
トcDNAライブラリーの構築に使用されよう。
本発明の一つの好ましい実施態様に於て、成熟IGF-I
のコード配列に対応するオリゴヌクレオチド プローブ
が、IGF-Iに特異的なcDNA配列を含有するクローンの存
在分析を行う為に、ヒトcDNAライブラリーをスクリーニ
ングするのに使用される。特に、成熟ヒトIGF-Iのアミ
ノ酸10から23（第６図のアミノ酸58-70参照）をコード
する42ヌクレオチド（42量体）からなるプローブが使用
される。当該プローブは、成熟IGF-Iの全部又は一部を
コードするゲノムcDNAおよび／またはRNAを単離するの
に使われる。成熟IGF-I DNAコード配列の、任意の他の
領域がその代りに使われる。その上、こういつたオリゴ
ヌクレオチドの長さ（例えばヌクレオチドの数）は使用
するハイブリツド形成条件の厳格さに依存して変るであ
ろう。典型的には、当該オリゴヌクレオチドプローブ
は、同定を必要とするDNA又はRNA配列と相同性を共有す
る、少くとも13又は14のヌクレオチドから構成されてい
る必要がある。
のコード配列に対応するオリゴヌクレオチド プローブ
が、IGF-Iに特異的なcDNA配列を含有するクローンの存
在分析を行う為に、ヒトcDNAライブラリーをスクリーニ
ングするのに使用される。特に、成熟ヒトIGF-Iのアミ
ノ酸10から23（第６図のアミノ酸58-70参照）をコード
する42ヌクレオチド（42量体）からなるプローブが使用
される。当該プローブは、成熟IGF-Iの全部又は一部を
コードするゲノムcDNAおよび／またはRNAを単離するの
に使われる。成熟IGF-I DNAコード配列の、任意の他の
領域がその代りに使われる。その上、こういつたオリゴ
ヌクレオチドの長さ（例えばヌクレオチドの数）は使用
するハイブリツド形成条件の厳格さに依存して変るであ
ろう。典型的には、当該オリゴヌクレオチドプローブ
は、同定を必要とするDNA又はRNA配列と相同性を共有す
る、少くとも13又は14のヌクレオチドから構成されてい
る必要がある。
成熟IGF-I用のプローブを用いてのcDNAライブラリー
のスクリーニングにより、そのライブラリーを構築する
際に用いた組織の中で活発に発現されているIGF-Iメツ
センジヤーRNA（mRNA）を、潜在的にはすべて同定する
ことができる。そのようなmRNAが翻訳出来るものの中に
は、それに限る訳ではないけれども、成熟IGF-I、成熟I
GF-Iの一部を少くとも含有するIGF-I前駆体、及びその
他の蛋白質であつて、その蛋白質生合成のm-RNAレベル
に於て、少くとも成熟IGF-I蛋白質の一部分を含有する
ものがある。好ましい実施態様では、IGF-I遺伝子産生
物のcDNA分析を採用したが、当業者には既知である、IG
F-I特異的mRNAを同定する為のノザンブロツテイング分
析により細胞内mRNAをスクリーニングすることも可能で
ある。P.S.Thomas（1980）参照。
のスクリーニングにより、そのライブラリーを構築する
際に用いた組織の中で活発に発現されているIGF-Iメツ
センジヤーRNA（mRNA）を、潜在的にはすべて同定する
ことができる。そのようなmRNAが翻訳出来るものの中に
は、それに限る訳ではないけれども、成熟IGF-I、成熟I
GF-Iの一部を少くとも含有するIGF-I前駆体、及びその
他の蛋白質であつて、その蛋白質生合成のm-RNAレベル
に於て、少くとも成熟IGF-I蛋白質の一部分を含有する
ものがある。好ましい実施態様では、IGF-I遺伝子産生
物のcDNA分析を採用したが、当業者には既知である、IG
F-I特異的mRNAを同定する為のノザンブロツテイング分
析により細胞内mRNAをスクリーニングすることも可能で
ある。P.S.Thomas（1980）参照。
更に詳しく後述するように、IGF-I特異的DNA配列を含
有するクローンを次に単離し、その中に含まれる、IGF-
I特異的なcDNA挿入部分の大きさ及び領域を決定する為
に、種々の制限エンドヌクレアーゼで切断した。どの制
限酵素を使つてもよい。Maniatis等（1982）参照。これ
らの手段によつて、凡そ800から1150ヌクレオチド対の
範囲の大きさをもつIGF-I cDNA挿入部分を同定単離し
た。それに続いてこれらのDNA挿入部分の制限酵素地図
を作ると、予想に反して単離された挿入部分は２つの型
をもつておることが明らかとなり、それぞれIGF-1A cDN
A（IGF-1A）及びIGF-1B（IGF-1B）と命名した。このppI
GF-Iをコードする新規の配列の発見は、新規のIGF-I遺
伝子配列を同定単離し、又合成従つて実質的に純粋な新
規ppIGF-I蛋白質を産生する為の手段及び成熟IGF-I生合
成の研究又、恐らくは望ましい活性そして／または効果
を得る為の操作を出来るようにする手段を提供するとい
う点で有意義である。
有するクローンを次に単離し、その中に含まれる、IGF-
I特異的なcDNA挿入部分の大きさ及び領域を決定する為
に、種々の制限エンドヌクレアーゼで切断した。どの制
限酵素を使つてもよい。Maniatis等（1982）参照。これ
らの手段によつて、凡そ800から1150ヌクレオチド対の
範囲の大きさをもつIGF-I cDNA挿入部分を同定単離し
た。それに続いてこれらのDNA挿入部分の制限酵素地図
を作ると、予想に反して単離された挿入部分は２つの型
をもつておることが明らかとなり、それぞれIGF-1A cDN
A（IGF-1A）及びIGF-1B（IGF-1B）と命名した。このppI
GF-Iをコードする新規の配列の発見は、新規のIGF-I遺
伝子配列を同定単離し、又合成従つて実質的に純粋な新
規ppIGF-I蛋白質を産生する為の手段及び成熟IGF-I生合
成の研究又、恐らくは望ましい活性そして／または効果
を得る為の操作を出来るようにする手段を提供するとい
う点で有意義である。
これら２つのcDNAのDNA配列分析を次に行い、それぞ
れの配列を第５図に示すように比較した。既に考察した
ように、このIGF-1B cDNAはpp-IGF-1Bと呼ぶppIGF-I蛋
白質をコードする新規の別個な合成IGF-I DNAである。
このIGF-1A cDNAはJansen等（1983）によつて単離され
たCDAN配列と同等であることが決定された。注目に値す
ることに、本発明記載の方法で単離したこの両者のIGF-
I cDNA（−1A及び−1B）は、そこでコードする前駆体蛋
白質（ppIGF-I）に関してどこが翻訳開始点になり得る
かをすべて正確に決定出来るようにする附加的な５′末
端配列を含有していた。
れの配列を第５図に示すように比較した。既に考察した
ように、このIGF-1B cDNAはpp-IGF-1Bと呼ぶppIGF-I蛋
白質をコードする新規の別個な合成IGF-I DNAである。
このIGF-1A cDNAはJansen等（1983）によつて単離され
たCDAN配列と同等であることが決定された。注目に値す
ることに、本発明記載の方法で単離したこの両者のIGF-
I cDNA（−1A及び−1B）は、そこでコードする前駆体蛋
白質（ppIGF-I）に関してどこが翻訳開始点になり得る
かをすべて正確に決定出来るようにする附加的な５′末
端配列を含有していた。
特に、第２図に示すように、４つの翻訳開始シグナル
トとなり得るコドン（ATG）が、成熟IGF-Iをコードする
DNA配列に関して枠内に同定された。始めのATGコドンは
ヌクレオチド83に始まり、２番目は183、３番目は252そ
して４番目は261で始まる。第２図に示すように、本発
明に係るこの新規の５′IGF-1B cDNA配列は又ヌクレオ
チド183で始まる２番目のATGコドンより上流に、そのコ
ドンに関して枠内に２つの枠内翻訳終結コドン（＃＃＃
及び＊＊＊の符号を付す）の存在を示し、ヌクレオチド
183から185がppIGF-I蛋白質に対する第１番目の実際に
作動する翻訳開始信号コドン（ATG）に相当することを
示唆する。かくして、後述の実施例で更に詳しく示すよ
うに、ヌクレオチド183から185は、事実、IGF-1A及び−
Ｂの合成DNA配列でコードされるppIGF-I蛋白質の翻訳開
始信号として作動するコドン（ATG）を構成している。
トとなり得るコドン（ATG）が、成熟IGF-Iをコードする
DNA配列に関して枠内に同定された。始めのATGコドンは
ヌクレオチド83に始まり、２番目は183、３番目は252そ
して４番目は261で始まる。第２図に示すように、本発
明に係るこの新規の５′IGF-1B cDNA配列は又ヌクレオ
チド183で始まる２番目のATGコドンより上流に、そのコ
ドンに関して枠内に２つの枠内翻訳終結コドン（＃＃＃
及び＊＊＊の符号を付す）の存在を示し、ヌクレオチド
183から185がppIGF-I蛋白質に対する第１番目の実際に
作動する翻訳開始信号コドン（ATG）に相当することを
示唆する。かくして、後述の実施例で更に詳しく示すよ
うに、ヌクレオチド183から185は、事実、IGF-1A及び−
Ｂの合成DNA配列でコードされるppIGF-I蛋白質の翻訳開
始信号として作動するコドン（ATG）を構成している。
この知見は、翻訳開始信号コドンと翻訳終結コドンが
ある一定の遺伝子或は合成DNA配列の中ではつきりと同
定されるのは、そこでコードされる一つ或は複数の蛋白
質のアミノ酸配列が演繹されそして／またはついで、そ
れから生産される前でなければならないという理由で意
義深い。本発明によつて提供されるIGF-I遺伝子及び合
成DNA配列は、ppIGF-I蛋白質（ppIGF-1B）をコードする
新しく発見されたIGF-1B及びJansen等（1983）により提
案されたIGF-I前駆体蛋白質に対して翻訳開始信号とし
て作動するコドンに関する上述のような始めての叙述の
基礎となつている。更に、このppIGF-I蛋白質に対する
翻訳開始点の同定は、化学的、酵素的および／または組
み換えDNA的方法論といつた慣用的手段による合成ppIGF
-I蛋白質の生産を量的及び質的に可能にしている。実施
例で後述するように、実際、本発明に係るppIGF-I蛋白
質は、ここで同定単離されたppIGF-IcDNAを試験管内細
胞溶解液発現系中で発現させることにより効率的に産生
出来る。その他に、ppIGF-1A及びppIGF-1B蛋白質および
／またはそれからの断片は、組換えDNA（γDNA）技法に
よつて産生することも出来る。組み換えDNAによる産生
方法は、少くとも蛋白質をコードする配列（例えば、IG
F-1Bに対しては第２図のヌクレオチド183から凡そ767ま
で）の当業者に入手可能な細胞（細菌、酵母、哺乳類お
よび／または植物）発現ベクターへの慣用的方法による
クローン化、及びそれに続く選ばれた宿主細胞内でのpp
IGF-I蛋白質の産生（例えばppIGF-IDNAのコード配列の
発現）を組みこむことになろう。これらのそして他の慣
用的手段、それに限ることはないが、例えば化学合成に
よつて、DNA配列に関する情報及びIGF-1A並びにIGF-1B
cDNAの全部又は一部を含有する合成cDNAは、実質的に純
粋な成熟IGF-I、ppIGF-I（例えばppIGF-1B）および／ま
たは延長ペプチドを産生するのに用い得る。
ある一定の遺伝子或は合成DNA配列の中ではつきりと同
定されるのは、そこでコードされる一つ或は複数の蛋白
質のアミノ酸配列が演繹されそして／またはついで、そ
れから生産される前でなければならないという理由で意
義深い。本発明によつて提供されるIGF-I遺伝子及び合
成DNA配列は、ppIGF-I蛋白質（ppIGF-1B）をコードする
新しく発見されたIGF-1B及びJansen等（1983）により提
案されたIGF-I前駆体蛋白質に対して翻訳開始信号とし
て作動するコドンに関する上述のような始めての叙述の
基礎となつている。更に、このppIGF-I蛋白質に対する
翻訳開始点の同定は、化学的、酵素的および／または組
み換えDNA的方法論といつた慣用的手段による合成ppIGF
-I蛋白質の生産を量的及び質的に可能にしている。実施
例で後述するように、実際、本発明に係るppIGF-I蛋白
質は、ここで同定単離されたppIGF-IcDNAを試験管内細
胞溶解液発現系中で発現させることにより効率的に産生
出来る。その他に、ppIGF-1A及びppIGF-1B蛋白質および
／またはそれからの断片は、組換えDNA（γDNA）技法に
よつて産生することも出来る。組み換えDNAによる産生
方法は、少くとも蛋白質をコードする配列（例えば、IG
F-1Bに対しては第２図のヌクレオチド183から凡そ767ま
で）の当業者に入手可能な細胞（細菌、酵母、哺乳類お
よび／または植物）発現ベクターへの慣用的方法による
クローン化、及びそれに続く選ばれた宿主細胞内でのpp
IGF-I蛋白質の産生（例えばppIGF-IDNAのコード配列の
発現）を組みこむことになろう。これらのそして他の慣
用的手段、それに限ることはないが、例えば化学合成に
よつて、DNA配列に関する情報及びIGF-1A並びにIGF-1B
cDNAの全部又は一部を含有する合成cDNAは、実質的に純
粋な成熟IGF-I、ppIGF-I（例えばppIGF-1B）および／ま
たは延長ペプチドを産生するのに用い得る。
それに加えて、本発明に係るDNA配列及び遺伝子は、
当業者が成熟IGF-Iの生合成及び生物学的調節をより効
果的に研究しおよび／または操作することを可能にす
る。更に、本発明に係るIGF-I遺伝子又はDNA配列の全部
若しくは一部を、ヒトや他の動物（例えばウシ、ブタそ
して／または鳥）の中の等価なDNA分子、RNA分子、遺伝
子および／またはそれからの対立遺伝子変異を、当該DN
Aおよび／またはRNAに十分な相同性が存在する場合に、
同定するのに使用出来る。実際に、本発明により包含さ
れるそういつたRNA分子の一例としてIGF-1B cDNAおよび
／または新規の延長ペプチドをコードする合成cDNAとの
ハイブリツド形成によつて同定された1.7、3.7及び6.3k
b（キロ塩基）のポリアデニル化されたIGF-I RNAが含ま
れる。こういつたDNAおよび／またはRNA配列或は分子の
同定に必要な相同の程度は当業者には衆知であり、且つ
用いたハイブリツド形成条件の厳格さおよび／または遺
伝子或は核酸配列および用いたプローブの相対的な大き
さに依存して変動する。
当業者が成熟IGF-Iの生合成及び生物学的調節をより効
果的に研究しおよび／または操作することを可能にす
る。更に、本発明に係るIGF-I遺伝子又はDNA配列の全部
若しくは一部を、ヒトや他の動物（例えばウシ、ブタそ
して／または鳥）の中の等価なDNA分子、RNA分子、遺伝
子および／またはそれからの対立遺伝子変異を、当該DN
Aおよび／またはRNAに十分な相同性が存在する場合に、
同定するのに使用出来る。実際に、本発明により包含さ
れるそういつたRNA分子の一例としてIGF-1B cDNAおよび
／または新規の延長ペプチドをコードする合成cDNAとの
ハイブリツド形成によつて同定された1.7、3.7及び6.3k
b（キロ塩基）のポリアデニル化されたIGF-I RNAが含ま
れる。こういつたDNAおよび／またはRNA配列或は分子の
同定に必要な相同の程度は当業者には衆知であり、且つ
用いたハイブリツド形成条件の厳格さおよび／または遺
伝子或は核酸配列および用いたプローブの相対的な大き
さに依存して変動する。
ここで提供された遺伝子及びDNA配列の対立遺伝子変
異に関しては、Jansen等（1983）の（IGF-1A）cDNAは新
規IGF-1Bと、413のヌクレオチドについて、Jansen等（1
983）のcDNA配列における１ヌクレオチドの相異を除い
ては同一性（例えば正確な相同）が維持されていること
が決つており、その一つの差異はグリシンコドンの保存
的な第３次目の変化（IGF-1B配列のヌクレオチド452）
である。ある特定のコドンに起るこの位置の変化は対立
遺伝子変異の結果および／またはその例示であり得よ
う。本発見に係るIGF-1B DNA配列に発生し得るような対
立遺伝子変異はここに提供されたIGF-I遺伝子及びDNA配
列の等価物に相当すると考えられる。
異に関しては、Jansen等（1983）の（IGF-1A）cDNAは新
規IGF-1Bと、413のヌクレオチドについて、Jansen等（1
983）のcDNA配列における１ヌクレオチドの相異を除い
ては同一性（例えば正確な相同）が維持されていること
が決つており、その一つの差異はグリシンコドンの保存
的な第３次目の変化（IGF-1B配列のヌクレオチド452）
である。ある特定のコドンに起るこの位置の変化は対立
遺伝子変異の結果および／またはその例示であり得よ
う。本発見に係るIGF-1B DNA配列に発生し得るような対
立遺伝子変異はここに提供されたIGF-I遺伝子及びDNA配
列の等価物に相当すると考えられる。
第５図に示すように、459ヌクレオチドの同一性のあ
と、IGF-1AとIGF-1BのDNAはその後は分岐する。特に、
蛋白質によつて分析した場合、第２図に示すように、分
岐点は成熟IGF-1領域から16アミノ酸後にあるリジンに
続く。更に詳細に後述するように、分岐点は第３図に示
したIGF-I遺伝子構造中に存在するエキソン−イントロ
ン接合点に対応する。IGF-1 cDNA配列はIGF-1Aと−1Bと
の分岐点を越えて尚19アミノ酸をコードし、それによつ
て以下ppIGF-1Aと呼ぶ全長195アミノ酸となり得るppIGF
-I蛋白質をコードする。IGF-1B cDNA配列はIGF-Aと−Ｂ
の分岐点を越して更に61アミノ酸を含有し、それによつ
て長さが約195アミノ酸であり、ここでppIGF-1Bと呼ぶp
pIGF-1をコードする。この二つのそれぞれ本質的に19ア
ミノ酸及び61アミノ酸から構成される、IGF-1A及びIGF-
1Bのカルボキシ末端延長部は互にアミノ酸相同性を示さ
ない。それに加えて、どちらのカルボキシ末端延長ペプ
チドもNational Biomedical Research Foundation Prot
ein Sequence Data（1983）に掲載する他のどの蛋白質
とも相同性を示さない。（Dayhoff等（1983）並びにWil
bur及びLipman（1983））。これらの差異を、続いて行
なつた対応するmRNA分子（後述実施例参照）の生体内同
定によつて確認された２つの別個のppIGF-I cDNAの存在
と組合せると、本発明中に提供される合成ppIGF-A DNA
配列が新規で別個のppIGF-I蛋白質（ppIGF-1B）及び延
長蛋白質をコードする新規なppIGF-Iに相当することが
確認される。
と、IGF-1AとIGF-1BのDNAはその後は分岐する。特に、
蛋白質によつて分析した場合、第２図に示すように、分
岐点は成熟IGF-1領域から16アミノ酸後にあるリジンに
続く。更に詳細に後述するように、分岐点は第３図に示
したIGF-I遺伝子構造中に存在するエキソン−イントロ
ン接合点に対応する。IGF-1 cDNA配列はIGF-1Aと−1Bと
の分岐点を越えて尚19アミノ酸をコードし、それによつ
て以下ppIGF-1Aと呼ぶ全長195アミノ酸となり得るppIGF
-I蛋白質をコードする。IGF-1B cDNA配列はIGF-Aと−Ｂ
の分岐点を越して更に61アミノ酸を含有し、それによつ
て長さが約195アミノ酸であり、ここでppIGF-1Bと呼ぶp
pIGF-1をコードする。この二つのそれぞれ本質的に19ア
ミノ酸及び61アミノ酸から構成される、IGF-1A及びIGF-
1Bのカルボキシ末端延長部は互にアミノ酸相同性を示さ
ない。それに加えて、どちらのカルボキシ末端延長ペプ
チドもNational Biomedical Research Foundation Prot
ein Sequence Data（1983）に掲載する他のどの蛋白質
とも相同性を示さない。（Dayhoff等（1983）並びにWil
bur及びLipman（1983））。これらの差異を、続いて行
なつた対応するmRNA分子（後述実施例参照）の生体内同
定によつて確認された２つの別個のppIGF-I cDNAの存在
と組合せると、本発明中に提供される合成ppIGF-A DNA
配列が新規で別個のppIGF-I蛋白質（ppIGF-1B）及び延
長蛋白質をコードする新規なppIGF-Iに相当することが
確認される。
本発明に係る今一つの重要な実施態様に於て、新規の
ヒトIGF-I遺伝子が同定単離された。Bell等（1985）に
よつて同定された遺伝子とは違い、このIGF-I遺伝子は
５つのエキソンを含有し、少くとも２つのppIGF-I蛋白
質をコードする。この新規なIGF-I遺伝子の遺伝子構造
及びDNA配列はそれぞれ第３図及び第４図に示されてい
る。エキソン1,2,3及び５は第３図に示すように、Bell
等（1985）によつて構造的に同定されたのに対して、こ
れらのエキソンの完全なDNA配列は提供されなかつた。
これらの配列はIGF-I遺伝子中でコードされるppIGF-Iで
あるべき蛋白質の数とアミノ酸組成を決定する上で本質
的である。更に、配列に関する情報は、それに引続く遺
伝子又はその一部分（例えば特定のエキソン又はイント
ロン−エキソン組み合せ）の試験管内或は生体内産生系
への使用に際して本質的である。
ヒトIGF-I遺伝子が同定単離された。Bell等（1985）に
よつて同定された遺伝子とは違い、このIGF-I遺伝子は
５つのエキソンを含有し、少くとも２つのppIGF-I蛋白
質をコードする。この新規なIGF-I遺伝子の遺伝子構造
及びDNA配列はそれぞれ第３図及び第４図に示されてい
る。エキソン1,2,3及び５は第３図に示すように、Bell
等（1985）によつて構造的に同定されたのに対して、こ
れらのエキソンの完全なDNA配列は提供されなかつた。
これらの配列はIGF-I遺伝子中でコードされるppIGF-Iで
あるべき蛋白質の数とアミノ酸組成を決定する上で本質
的である。更に、配列に関する情報は、それに引続く遺
伝子又はその一部分（例えば特定のエキソン又はイント
ロン−エキソン組み合せ）の試験管内或は生体内産生系
への使用に際して本質的である。
ppIGF-I蛋白質、IGF-I関連蛋白質及び成熟IGF-I蛋白
質を、例えば、哺乳類の系で合成する目的の為には、実
質的に純粋なIGF-I遺伝子或はその一部分（例えばエキ
ソン）を使用するのが望ましいであろう。特に、イント
ロン及びエキソンを構成するIGF-I特異的DNA配列を使用
することが望ましいであろう。その他に、ここに提供さ
れたIGF-I遺伝子由来の本質的にイントロンを含まないD
NA配列の使用はppIGF-I又は延長蛋白質の産生の際に、
望ましいこととして採用されるであろう。これらの理由
からそして本発明に係る新規DNA配列をIGF-I遺伝子配列
内に位置付けする目的の為に、本発見者等はIGF-I遺伝
子配列を単離しクローン化した。
質を、例えば、哺乳類の系で合成する目的の為には、実
質的に純粋なIGF-I遺伝子或はその一部分（例えばエキ
ソン）を使用するのが望ましいであろう。特に、イント
ロン及びエキソンを構成するIGF-I特異的DNA配列を使用
することが望ましいであろう。その他に、ここに提供さ
れたIGF-I遺伝子由来の本質的にイントロンを含まないD
NA配列の使用はppIGF-I又は延長蛋白質の産生の際に、
望ましいこととして採用されるであろう。これらの理由
からそして本発明に係る新規DNA配列をIGF-I遺伝子配列
内に位置付けする目的の為に、本発見者等はIGF-I遺伝
子配列を単離しクローン化した。
本発明に係る好ましい一つの実施態様に於て、２つの
ゲノムライブラリーについてIGF-1A及び−B cDNA若しく
はその断片を用いてIGF-I遺伝子挿入部に対するスクリ
ーニングを行つた。更に詳しく後述し又第３図及び第４
図に示すように本発明者等は、それまで４個のエキソン
が既に報告されているのに反して、５個のエキソンを同
定した。Bell等（1985）参照。この新しく発見されたエ
キソン４は、エキソン５がppIGF-Aのカルボキシ末端延
長部をコードするのに対して、ppIGF-1Bのカルボキシ末
端延長部をコードすると決められた。
ゲノムライブラリーについてIGF-1A及び−B cDNA若しく
はその断片を用いてIGF-I遺伝子挿入部に対するスクリ
ーニングを行つた。更に詳しく後述し又第３図及び第４
図に示すように本発明者等は、それまで４個のエキソン
が既に報告されているのに反して、５個のエキソンを同
定した。Bell等（1985）参照。この新しく発見されたエ
キソン４は、エキソン５がppIGF-Aのカルボキシ末端延
長部をコードするのに対して、ppIGF-1Bのカルボキシ末
端延長部をコードすると決められた。
エキソン１はIGF-Iの分泌を可能にするリーダーペプ
チドを構成するであろう少くとも21アミノ酸をコードす
る。IGF-Iはそれを産生する細胞によつて分泌されるこ
とが分つて居りそれ故にIGF-I前駆体を表す“プレプロ
インスリン様成長因子−I"という用語がある。エキソン
２は長さが約157ヌクレオチドであり、52アミノ酸をコ
ードし且つUlrich等（1984）によつて報告されたIGF-I
エキソンとDNA配列が同一である。エキソン２にコード
される最初の27アミノ酸は成熟IGF-1B領域の開始点に先
行し、今一つの翻訳開始信号として役立ち得るであろう
２つのメチオニン残基を含有する。エキソン２は又成熟
IGF-IのＢ領域の初めの25アミノ酸をコードする。コド
ン26は少くとも26kbの大きなイントロンで中断されてい
ることが分つている。成熟IGF-Iをコードする残りの遺
伝子情報はエキソン３に存在する。特に、エキソン３は
残りのＢ領域をコードする11ヌクレオチド、Ｃ領域をコ
ードする12コドン、Ａ領域をコードする21コドンそして
Ｄ領域をコードする８コドンを含有する。その上エキソ
ン３はそれに加えて尚16アミノ酸をコードし、これは新
しく記載されたＥ領域そして／またはpIGF-1A及びpIGF-
1Bのカルボシキル末端延長の一部に相当するようであ
る。かように、本発見に係るカルボキシル“末端延長蛋
白質”或は“延長蛋白質”は、エキソン３でコードされ
る最後の16アミノ酸（例えばNH2‐Arg Ser Val Arg Ala
Gln Arg His Thr Asp Met Pro Lys Thr Gln Lys-COO
H）及びエキソン４でコードされるペプチドとの組合
せ、エキソン４でコードされるペプチドおよび／または
エキソン４内にあるDNA配列及びエキソン３の最後の48
ヌクレオチドでコードされる一連のアミノ酸を含むこと
が出来る。
チドを構成するであろう少くとも21アミノ酸をコードす
る。IGF-Iはそれを産生する細胞によつて分泌されるこ
とが分つて居りそれ故にIGF-I前駆体を表す“プレプロ
インスリン様成長因子−I"という用語がある。エキソン
２は長さが約157ヌクレオチドであり、52アミノ酸をコ
ードし且つUlrich等（1984）によつて報告されたIGF-I
エキソンとDNA配列が同一である。エキソン２にコード
される最初の27アミノ酸は成熟IGF-1B領域の開始点に先
行し、今一つの翻訳開始信号として役立ち得るであろう
２つのメチオニン残基を含有する。エキソン２は又成熟
IGF-IのＢ領域の初めの25アミノ酸をコードする。コド
ン26は少くとも26kbの大きなイントロンで中断されてい
ることが分つている。成熟IGF-Iをコードする残りの遺
伝子情報はエキソン３に存在する。特に、エキソン３は
残りのＢ領域をコードする11ヌクレオチド、Ｃ領域をコ
ードする12コドン、Ａ領域をコードする21コドンそして
Ｄ領域をコードする８コドンを含有する。その上エキソ
ン３はそれに加えて尚16アミノ酸をコードし、これは新
しく記載されたＥ領域そして／またはpIGF-1A及びpIGF-
1Bのカルボシキル末端延長の一部に相当するようであ
る。かように、本発見に係るカルボキシル“末端延長蛋
白質”或は“延長蛋白質”は、エキソン３でコードされ
る最後の16アミノ酸（例えばNH2‐Arg Ser Val Arg Ala
Gln Arg His Thr Asp Met Pro Lys Thr Gln Lys-COO
H）及びエキソン４でコードされるペプチドとの組合
せ、エキソン４でコードされるペプチドおよび／または
エキソン４内にあるDNA配列及びエキソン３の最後の48
ヌクレオチドでコードされる一連のアミノ酸を含むこと
が出来る。
エキソン４及び５は、それぞれ別個の延長ペプチドを
コードすることが解つており、翻訳終結コード、３′非
翻訳領域、ポリＡ附加（例えばアデニル化）信号及びポ
リアデニル附加部位をもつ。エキソン４は、エキソン３
に対し３′方向に1.5kb離れて位置しているが、515ヌク
レオチドからなり、IGF-1Bのコード配列を含む。エキソ
ン４でコードされる延長ペプチドは多数の塩基性残基を
有する極めて塩基性の高いペプチドから成る。同じく前
駆体蛋白質中間体を利用する他の生合成経路（例えばプ
ロインスリンのインスリンへの転換）との類推からすれ
ば、これらの塩基性残基は、本発明に係る単一或は複数
の遺伝子でコードされるppIGF-Iを、例えば成熟IGF-I蛋
白質へ酵素的にプロセシングする為の備えとなつている
のであろう。それに加えて、或はそれとは別に、これら
の残基はDNAのような負に荷電した高分子への結合を容
易にするであろう。TGA終結コドンに続いて、エキソン
４中には329塩基からなる３′側非翻訳DNAがある。エキ
ソン３の下流（３′方向）17kbに位置するエキソン５
は、長さ344塩基でありIGF-1Aコード配列の３′末端を
コードし且TAG翻訳終結コドン及び284塩基からなる３′
側非翻訳DNAを含む。その上、すべてのイントロン−エ
キソン境界はコンセンサスなRNAスプライシング配列を
含み、エキソンのどんな組合せも、m-RNA分子の中に存
在し、その故にIGF-I遺伝子関連蛋白質に翻訳され得る
ことを示す。
コードすることが解つており、翻訳終結コード、３′非
翻訳領域、ポリＡ附加（例えばアデニル化）信号及びポ
リアデニル附加部位をもつ。エキソン４は、エキソン３
に対し３′方向に1.5kb離れて位置しているが、515ヌク
レオチドからなり、IGF-1Bのコード配列を含む。エキソ
ン４でコードされる延長ペプチドは多数の塩基性残基を
有する極めて塩基性の高いペプチドから成る。同じく前
駆体蛋白質中間体を利用する他の生合成経路（例えばプ
ロインスリンのインスリンへの転換）との類推からすれ
ば、これらの塩基性残基は、本発明に係る単一或は複数
の遺伝子でコードされるppIGF-Iを、例えば成熟IGF-I蛋
白質へ酵素的にプロセシングする為の備えとなつている
のであろう。それに加えて、或はそれとは別に、これら
の残基はDNAのような負に荷電した高分子への結合を容
易にするであろう。TGA終結コドンに続いて、エキソン
４中には329塩基からなる３′側非翻訳DNAがある。エキ
ソン３の下流（３′方向）17kbに位置するエキソン５
は、長さ344塩基でありIGF-1Aコード配列の３′末端を
コードし且TAG翻訳終結コドン及び284塩基からなる３′
側非翻訳DNAを含む。その上、すべてのイントロン−エ
キソン境界はコンセンサスなRNAスプライシング配列を
含み、エキソンのどんな組合せも、m-RNA分子の中に存
在し、その故にIGF-I遺伝子関連蛋白質に翻訳され得る
ことを示す。
ここで提供する遺伝子及びDNA配列は、次に単一のエ
キソンがコードする蛋白質そして／または種々のエキソ
ン組合せがコードする蛋白質の、組換えDNA及び化学合
成といつた技法による産生並びに生体内検出を可能にす
る。当該蛋白質は生物学的に活性であり、特にIGF一様
活性を持つと信じられる。従つて、この付随した生物学
的活性は、当業者が試験管内そして／または生体内検定
法を用いて確め得よう。Daughaday（1977）;Clemmons及
びVan Wyk（1981a）;van Bunl-Offers及びVan de Brand
e（1980）;Schoenle等（1982）；並びにHylka等（198
5）参照。
キソンがコードする蛋白質そして／または種々のエキソ
ン組合せがコードする蛋白質の、組換えDNA及び化学合
成といつた技法による産生並びに生体内検出を可能にす
る。当該蛋白質は生物学的に活性であり、特にIGF一様
活性を持つと信じられる。従つて、この付随した生物学
的活性は、当業者が試験管内そして／または生体内検定
法を用いて確め得よう。Daughaday（1977）;Clemmons及
びVan Wyk（1981a）;van Bunl-Offers及びVan de Brand
e（1980）;Schoenle等（1982）；並びにHylka等（198
5）参照。
更に、IGF-I遺伝子の構造及び配列の単離、制限地図
並びにその最終的な決定は、例えば染色体制限エンドヌ
クレアーゼ分析によつて検出されるDNA多型現象をつき
とめる可能性を提供するという意味で有意義である。事
実、本発明者等は、お互に関連し又ゲノムIGF-I遺伝子
のエキソン５に対する地図と関連する、Bell等（1985）
によつて報告されている制限エンドヌクレアーゼHindII
I及びPvuIIに関する部位多型現象をつきとめた。こうい
つた多型現象は家族性遺伝連鎖を確立するのに有用であ
り、種々な病気に対し診断用として用いられて来た。そ
の上、当該IGF-I遺伝子多型現象は成長が冒された状態
に対する診断用として用いられよう。更に、当該多型現
象はここに提供された遺伝子配列の等価物を構成するも
のと考えられる。
並びにその最終的な決定は、例えば染色体制限エンドヌ
クレアーゼ分析によつて検出されるDNA多型現象をつき
とめる可能性を提供するという意味で有意義である。事
実、本発明者等は、お互に関連し又ゲノムIGF-I遺伝子
のエキソン５に対する地図と関連する、Bell等（1985）
によつて報告されている制限エンドヌクレアーゼHindII
I及びPvuIIに関する部位多型現象をつきとめた。こうい
つた多型現象は家族性遺伝連鎖を確立するのに有用であ
り、種々な病気に対し診断用として用いられて来た。そ
の上、当該IGF-I遺伝子多型現象は成長が冒された状態
に対する診断用として用いられよう。更に、当該多型現
象はここに提供された遺伝子配列の等価物を構成するも
のと考えられる。
本発明は更に、本発明に係る実質的に純粋なIGF-I遺
伝子又はそれの一部分（例えばエキソン）は、成熟IGF-
I蛋白質、その変異形および／またはその生合成中間体
を含み且これらに限らないIGF-I遺伝子関連蛋白質を新
規に創造しおよび／あるいは生体内で増殖産生するのに
使用され得ることを意図する。
伝子又はそれの一部分（例えばエキソン）は、成熟IGF-
I蛋白質、その変異形および／またはその生合成中間体
を含み且これらに限らないIGF-I遺伝子関連蛋白質を新
規に創造しおよび／あるいは生体内で増殖産生するのに
使用され得ることを意図する。
蛋白質 一つの実施態様に於て、本発明は、第６図に示すよう
なアミノ酸配列を有する新規なppIGF-Iに目標を置い
た。他の重要な実施態様に於て、本発明は第７図に示す
ようなアミノ酸配列を有するペプチドで例証される新規
な延長蛋白質に目標を置いた。ここに提供された配列に
基いて、これらの蛋白質及びそれの等価物は、化学的試
験管内酵素的合成、組換えDNA技法そして／またはヒト
の組織よりの単離といつた慣用法で作製することが既に
可能である。本発明に係る蛋白質又はペプチドのγDNA
または／あるいは化学合成による生産はその結果として
アミノ酸組成に些細な変更が起る可能性が予測される。
例えば、細菌内の生産の結果としてアミノ（NH2）末端
にメチオニンの附加が起り又化学合成の結果カルボキシ
ル（−COOH）末端の変更が起り例えば−COOR、−CRO,−
CONHR1、CONR1R2又は−CH2OR（R1とR2は互に独立の低級
アルカリ又は水素）になる可能性がある。上記のような
実質的に純粋なそして／または合成の蛋白質は本特許の
範囲内にあると考えられる。
なアミノ酸配列を有する新規なppIGF-Iに目標を置い
た。他の重要な実施態様に於て、本発明は第７図に示す
ようなアミノ酸配列を有するペプチドで例証される新規
な延長蛋白質に目標を置いた。ここに提供された配列に
基いて、これらの蛋白質及びそれの等価物は、化学的試
験管内酵素的合成、組換えDNA技法そして／またはヒト
の組織よりの単離といつた慣用法で作製することが既に
可能である。本発明に係る蛋白質又はペプチドのγDNA
または／あるいは化学合成による生産はその結果として
アミノ酸組成に些細な変更が起る可能性が予測される。
例えば、細菌内の生産の結果としてアミノ（NH2）末端
にメチオニンの附加が起り又化学合成の結果カルボキシ
ル（−COOH）末端の変更が起り例えば−COOR、−CRO,−
CONHR1、CONR1R2又は−CH2OR（R1とR2は互に独立の低級
アルカリ又は水素）になる可能性がある。上記のような
実質的に純粋なそして／または合成の蛋白質は本特許の
範囲内にあると考えられる。
更に、本発明に依て提供される新規のDNA配列及び遺
伝子は、成熟IGF-I及び延長蛋白質を包含し且、それに
限らないppIGF-I及び／またはそれからの生物学的に活
性な断片を当業者が同定し、単離しそして／または生産
すること可能にしている。これらの蛋白質の生物学的活
性は、それだけに限らないがIGF-Iの生成促進活性は包
含する可能性があり又、それ故に、当業者に既知の試験
管内及び生体内検定に従い検証することが出来る。
伝子は、成熟IGF-I及び延長蛋白質を包含し且、それに
限らないppIGF-I及び／またはそれからの生物学的に活
性な断片を当業者が同定し、単離しそして／または生産
すること可能にしている。これらの蛋白質の生物学的活
性は、それだけに限らないがIGF-Iの生成促進活性は包
含する可能性があり又、それ故に、当業者に既知の試験
管内及び生体内検定に従い検証することが出来る。
その中でも特に、IGF-Iは細胞の増殖、骨格の成長、
体重増加及び乳腺の成長を誘起することが示されてお
り、上記の最後のものは母乳産生増強の前提条件であ
る。ここに記載する新規ppIGF-1B蛋白質は上記の成長促
進活性の全て或は一部を共有し特定の組織中の活性を増
強し得ることが期待される。
体重増加及び乳腺の成長を誘起することが示されてお
り、上記の最後のものは母乳産生増強の前提条件であ
る。ここに記載する新規ppIGF-1B蛋白質は上記の成長促
進活性の全て或は一部を共有し特定の組織中の活性を増
強し得ることが期待される。
本発明に係るこの蛋白質の生物学的活性断片は慣用的
な手段で作製することが出来ることも期待される。これ
らは以下時に応じて“IGF-I遺伝子関連蛋白質”と呼
び、それを構成する蛋白質の少くとも一部分が本発明に
係る遺伝子そして／または合成DNA配列および／又はそ
の対立遺伝子変異体中でコードされていると理解され
る。
な手段で作製することが出来ることも期待される。これ
らは以下時に応じて“IGF-I遺伝子関連蛋白質”と呼
び、それを構成する蛋白質の少くとも一部分が本発明に
係る遺伝子そして／または合成DNA配列および／又はそ
の対立遺伝子変異体中でコードされていると理解され
る。
研究の一つの進め方として、ppIGF-I（例えばppIGF-1
A及びppIGF-1B）のアミノ酸配列及びその延長ペプチド
はそれぞれのc-DNA配列及び本発明により提供される新
規IGF-1遺伝子から演繹された。例えばこのpp-IGF-1B蛋
白質は第６図に示すようなアミノ酸配列を有すると決定
された。
A及びppIGF-1B）のアミノ酸配列及びその延長ペプチド
はそれぞれのc-DNA配列及び本発明により提供される新
規IGF-1遺伝子から演繹された。例えばこのpp-IGF-1B蛋
白質は第６図に示すようなアミノ酸配列を有すると決定
された。
今一つの進め方として、このppIGF-1蛋白質は、IGF-1
A及び−1B cDNAの発現の為に準備された試験管内の系を
用いて同定された。ここで用いる用語“発現”は、遺伝
子或は合成DNA配列について用いた場合にあつては、任
意の遺伝子或はDNA配列の、次の段階で蛋白質へ翻訳さ
れるべきmRNAへの転写を意味する。こうして生産された
蛋白質は、更にポリアクリルアミドゲル電気泳動、アフ
イニテイークロマトグラフイー、イオン交換、逆相HPL
C、免疫沈降又はその他の慣用的分画技法といつた慣用
的技法で単離し、次にその配列を決定することが出来
る。これらの方法により、195アミノ酸よりなるppIGF-1
B蛋白質及び153アミノ酸よりなるppIGF-1A蛋白質が試験
管内で生産され、これらの蛋白質がここで同定されたそ
れぞれのc-DNAから演繹したそれぞれのアミノ酸配列に
対応し且第１番目の枠内メチオニンコドン（例えばIGF-
1Bに関する塩基対183-185（図２参照））が両ppIGF-1蛋
白質の主要翻訳開始信号コドンであるということが例証
された。
A及び−1B cDNAの発現の為に準備された試験管内の系を
用いて同定された。ここで用いる用語“発現”は、遺伝
子或は合成DNA配列について用いた場合にあつては、任
意の遺伝子或はDNA配列の、次の段階で蛋白質へ翻訳さ
れるべきmRNAへの転写を意味する。こうして生産された
蛋白質は、更にポリアクリルアミドゲル電気泳動、アフ
イニテイークロマトグラフイー、イオン交換、逆相HPL
C、免疫沈降又はその他の慣用的分画技法といつた慣用
的技法で単離し、次にその配列を決定することが出来
る。これらの方法により、195アミノ酸よりなるppIGF-1
B蛋白質及び153アミノ酸よりなるppIGF-1A蛋白質が試験
管内で生産され、これらの蛋白質がここで同定されたそ
れぞれのc-DNAから演繹したそれぞれのアミノ酸配列に
対応し且第１番目の枠内メチオニンコドン（例えばIGF-
1Bに関する塩基対183-185（図２参照））が両ppIGF-1蛋
白質の主要翻訳開始信号コドンであるということが例証
された。
この合成IGF-1A及び−1B DNA配列そして／またはその
カルボキシ末端延長部でコードされる蛋白質（例えばpp
IGF-1A及びppIGF-1B）は、生体内では別個で且分離した
ペプチドとして、および／または分離し且別個の蛋白質
の一部分として産生されることを確認する為に、本発明
者等は次のようにした。放射線同位元素で標識した全IG
F-1A cDNA又は全IGF-1B cDNA及びエキソン４或はエキソ
ン５のいずれかに含有されるコード配列に対応する、放
射性同位元素で標識したDNAはヒト肝で産生されるRNA転
写物（mRNA）に個別にハイブリツドを形成した。
カルボキシ末端延長部でコードされる蛋白質（例えばpp
IGF-1A及びppIGF-1B）は、生体内では別個で且分離した
ペプチドとして、および／または分離し且別個の蛋白質
の一部分として産生されることを確認する為に、本発明
者等は次のようにした。放射線同位元素で標識した全IG
F-1A cDNA又は全IGF-1B cDNA及びエキソン４或はエキソ
ン５のいずれかに含有されるコード配列に対応する、放
射性同位元素で標識したDNAはヒト肝で産生されるRNA転
写物（mRNA）に個別にハイブリツドを形成した。
これらの手段によつて、本発明者等は、上述のプロー
ブ総てとハイブリツドを形成した長さ凡そ900から1350
のヌクレオチド範囲にあるポリアデニル化されたRNAを
同定した。これらの結果は、生体内でIGF-1A及び−1B D
NAの両者をコードする活発なDNAの転写が行われている
ことを確認する。更に、本発明者等は、別の３つのポリ
アデニル化されたRNA（mRNA）、長さそれぞれ1.7、3.7
及び6.3キロベース（kb）を同定した。申請者等は次の
機序理論によつて束縛されたくはないが、本発明者等こ
れらと比較的大きいmRNAが、ppIGF-I前駆体のmRNA又はI
GF-1遺伝子関連の蛋白質（例えば実質的に純粋なppIGF-
Iおよび／または実質的に純粋な延長ペプチドの配列を
実質的に構成する蛋白質）をコードするm-RNAに相当す
ると信ずる。それに加えて、本発明のヒトIGF-I遺伝子
が多様な蛋白質を作り出すという発見は、それによつて
IGF-I生合成そして／またはその成熟が調節される可能
性のある手段そして／またはそれによつてIGF-I遺伝子
関連の蛋白質が調節そして／または合成される可能性の
ある手段をはつきりと説明する。特に、IGF-Iは第一義
的には直線的な成長を維持する為に要求されることか
ら、遺伝子発現の度合は成長及び発生の段階によつて変
動しそして／または異なつた組織では当該組織の成長要
求に依存して変動するであろう。このppIGF-I蛋白質
は、これらの成長各段階を通じてそして／または組織特
異的に、成熟IGF-1産生および／またはIGF-1遺伝子関連
蛋白産生を調節する拠点を与えることになろう。
ブ総てとハイブリツドを形成した長さ凡そ900から1350
のヌクレオチド範囲にあるポリアデニル化されたRNAを
同定した。これらの結果は、生体内でIGF-1A及び−1B D
NAの両者をコードする活発なDNAの転写が行われている
ことを確認する。更に、本発明者等は、別の３つのポリ
アデニル化されたRNA（mRNA）、長さそれぞれ1.7、3.7
及び6.3キロベース（kb）を同定した。申請者等は次の
機序理論によつて束縛されたくはないが、本発明者等こ
れらと比較的大きいmRNAが、ppIGF-I前駆体のmRNA又はI
GF-1遺伝子関連の蛋白質（例えば実質的に純粋なppIGF-
Iおよび／または実質的に純粋な延長ペプチドの配列を
実質的に構成する蛋白質）をコードするm-RNAに相当す
ると信ずる。それに加えて、本発明のヒトIGF-I遺伝子
が多様な蛋白質を作り出すという発見は、それによつて
IGF-I生合成そして／またはその成熟が調節される可能
性のある手段そして／またはそれによつてIGF-I遺伝子
関連の蛋白質が調節そして／または合成される可能性の
ある手段をはつきりと説明する。特に、IGF-Iは第一義
的には直線的な成長を維持する為に要求されることか
ら、遺伝子発現の度合は成長及び発生の段階によつて変
動しそして／または異なつた組織では当該組織の成長要
求に依存して変動するであろう。このppIGF-I蛋白質
は、これらの成長各段階を通じてそして／または組織特
異的に、成熟IGF-1産生および／またはIGF-1遺伝子関連
蛋白産生を調節する拠点を与えることになろう。
ppIGF-1 cDNA及び生体内で合成された対応するmRNAの
同定及び単離は、本発明のppIGF-I蛋白質が生体内で作
成されることを示唆する。収量は営利的に望ましい収量
との関連では低いけれども、ここに提供するDNA及びア
ミノ酸配列に基いて、実質的に純粋なppIGF-I蛋白質
が、組織（即ち繊維芽細胞、血液、肝その他）そして／
またはそれから得た細胞から単離し得る。このような実
質的に純粋な蛋白質は本発明の一部であると考えられ
る。
同定及び単離は、本発明のppIGF-I蛋白質が生体内で作
成されることを示唆する。収量は営利的に望ましい収量
との関連では低いけれども、ここに提供するDNA及びア
ミノ酸配列に基いて、実質的に純粋なppIGF-I蛋白質
が、組織（即ち繊維芽細胞、血液、肝その他）そして／
またはそれから得た細胞から単離し得る。このような実
質的に純粋な蛋白質は本発明の一部であると考えられ
る。
最近のＥ領域を含有するラツトIGF-II蛋白質の同定及
びラツト血清中にあるＥ領域に相当する活性をもつ遊離
のペプチドの単離（Zumstein等（1985）及びHylka等（1
985））はIGF関連の生物学的活性をもつペプチド或は蛋
白質の一族が生体内で作られ得ることを示唆する。当該
蛋白質は、ここに開示する新規のIGF-1Bカルボキシ末端
延長ペプチドを包含はするがそれのみに制限されない。
IGF-I遺伝子エキソンの種々の組み合せからなつている
蛋白質も、そういうIGF遺伝子関連蛋白質の一族に包含
され得よう。例えば、pIGF-1Aおよび／または1Bのカル
ボキシル末端延長ペプチドは、限られた細胞の特異的な
生物学的活性に役立つのであろう。それとは違つて発現
されたカルボキシル末端ペプチドは、当業者によつて例
えば合成ペプチドとそれに対する抗体を使用して試験さ
れ得る。それとは別に、RNAスプライシングは、既に他
の遺伝子について示唆されている（Rosenfeld等（198
3））ように、IGF-I遺伝子に対する調節の拠点を与え、
それによつて異なつたエキソンの組み合せが異なつた組
織で機能する可能性がある。このようなエキソンの可能
な組み合せは本発明によつて包含されると考えられる。
びラツト血清中にあるＥ領域に相当する活性をもつ遊離
のペプチドの単離（Zumstein等（1985）及びHylka等（1
985））はIGF関連の生物学的活性をもつペプチド或は蛋
白質の一族が生体内で作られ得ることを示唆する。当該
蛋白質は、ここに開示する新規のIGF-1Bカルボキシ末端
延長ペプチドを包含はするがそれのみに制限されない。
IGF-I遺伝子エキソンの種々の組み合せからなつている
蛋白質も、そういうIGF遺伝子関連蛋白質の一族に包含
され得よう。例えば、pIGF-1Aおよび／または1Bのカル
ボキシル末端延長ペプチドは、限られた細胞の特異的な
生物学的活性に役立つのであろう。それとは違つて発現
されたカルボキシル末端ペプチドは、当業者によつて例
えば合成ペプチドとそれに対する抗体を使用して試験さ
れ得る。それとは別に、RNAスプライシングは、既に他
の遺伝子について示唆されている（Rosenfeld等（198
3））ように、IGF-I遺伝子に対する調節の拠点を与え、
それによつて異なつたエキソンの組み合せが異なつた組
織で機能する可能性がある。このようなエキソンの可能
な組み合せは本発明によつて包含されると考えられる。
本発明は又ここで提供される遺伝子及びDNA配列が上
記IGF-I遺伝子関連蛋白質を創造しそして／またはそれ
の単離を幇助するのに使用され得ることを意図する。本
発明は当該遺伝子及びDNA配列でコードされる特異的なp
pIGF-1Bアミノ酸配列を記載しているが、それとは別の
オープンリーデイングフレームに従つて、別の蛋白質
（例えばアミノ酸配列）がここで提供された遺伝子及び
DNA配列でコードされ得ることが期待される。当該蛋白
質は、ここで提供された新規の遺伝子及びDNA配列によ
つて用意されたIGF-I遺伝子関連蛋白質の中であると考
えられる。
記IGF-I遺伝子関連蛋白質を創造しそして／またはそれ
の単離を幇助するのに使用され得ることを意図する。本
発明は当該遺伝子及びDNA配列でコードされる特異的なp
pIGF-1Bアミノ酸配列を記載しているが、それとは別の
オープンリーデイングフレームに従つて、別の蛋白質
（例えばアミノ酸配列）がここで提供された遺伝子及び
DNA配列でコードされ得ることが期待される。当該蛋白
質は、ここで提供された新規の遺伝子及びDNA配列によ
つて用意されたIGF-I遺伝子関連蛋白質の中であると考
えられる。
既述したように、本発明に係る新規ppIGF-I及び延長
ペプチドは、動物に投与して成長を促進し、母乳産生お
よび／または動物中の赤身対脂肪比若しくは筋肉含量を
増加する為に有用である。こういつた使用を目的とし
て、本発明に係る１種又はそれ以上の蛋白質又はペプチ
ド（或はそれの無毒塩）を無害で生理学的に受け入れら
れる担体（固体若しくは液体）と配合し、動物へ例えば
静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射、鼻内投与、若しく
はその蛋白質或はペプチドを消化管内に於ける分解から
護るような形での経口投与といつた適当な手段で投与し
得る組成物を作ることが出来る。当該組成物は動物に注
射、輸注又は埋め込みにより、好ましくはペプチドの標
的動物細胞へ望ましい速度で供給出来るようにする媒質
と共に（例えば油又は高分子中への分散）動物へ投与す
ることが出来る。動物（例えば妊娠中の牛及び若い雌
牛）への投与の為のこの種の一つの方法は、乳房組織で
の十分な分散を達成する為に適当な補助剤と共に行う蛋
白質或はペプチドの乳房内輸注であり、より詳細には19
86年３月７日出願の同時係属米国特許出願第837,477に
教示されている。上記出願の開示を引用によつてここに
収載する。当該組成物中の担体と生物学的活性ペプチド
の比は、動物での望ましい効果を促進するものであれば
よい。好ましい組成物は当業者によつて容易に決定し得
る。
ペプチドは、動物に投与して成長を促進し、母乳産生お
よび／または動物中の赤身対脂肪比若しくは筋肉含量を
増加する為に有用である。こういつた使用を目的とし
て、本発明に係る１種又はそれ以上の蛋白質又はペプチ
ド（或はそれの無毒塩）を無害で生理学的に受け入れら
れる担体（固体若しくは液体）と配合し、動物へ例えば
静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射、鼻内投与、若しく
はその蛋白質或はペプチドを消化管内に於ける分解から
護るような形での経口投与といつた適当な手段で投与し
得る組成物を作ることが出来る。当該組成物は動物に注
射、輸注又は埋め込みにより、好ましくはペプチドの標
的動物細胞へ望ましい速度で供給出来るようにする媒質
と共に（例えば油又は高分子中への分散）動物へ投与す
ることが出来る。動物（例えば妊娠中の牛及び若い雌
牛）への投与の為のこの種の一つの方法は、乳房組織で
の十分な分散を達成する為に適当な補助剤と共に行う蛋
白質或はペプチドの乳房内輸注であり、より詳細には19
86年３月７日出願の同時係属米国特許出願第837,477に
教示されている。上記出願の開示を引用によつてここに
収載する。当該組成物中の担体と生物学的活性ペプチド
の比は、動物での望ましい効果を促進するものであれば
よい。好ましい組成物は当業者によつて容易に決定し得
る。
必要とされる投与法はそれぞれの場合に求められる結
果及び治療期間によつて変動しよう。ppIGF-1Bおよび／
または延長ペプチドの有効投与量は治療期間１乃至３週
間、毎日投与される動物体重キログラム（Kg）当り凡そ
60マイクログラム（μｇ）から６ミリグラム（mg）であ
る。より好ましい投与量は１日Kg当り400μｇ乃至800μ
ｇである。ここで使用する限りでは、治療有効濃度はそ
の特殊な蛋白質或はペプチドが望まれる細胞の成長およ
び／または機能性に十分な刺激を与える濃度と定義され
る。最も好ましい量若しくは望ましい結果（例えば母乳
産生）を得るのに最も効果的な投与は日常的な実験法で
決定出来る。好ましい投与は特定の動物の大きさ、一般
健康度及び栄養状態といつた変数に依存しよう。
果及び治療期間によつて変動しよう。ppIGF-1Bおよび／
または延長ペプチドの有効投与量は治療期間１乃至３週
間、毎日投与される動物体重キログラム（Kg）当り凡そ
60マイクログラム（μｇ）から６ミリグラム（mg）であ
る。より好ましい投与量は１日Kg当り400μｇ乃至800μ
ｇである。ここで使用する限りでは、治療有効濃度はそ
の特殊な蛋白質或はペプチドが望まれる細胞の成長およ
び／または機能性に十分な刺激を与える濃度と定義され
る。最も好ましい量若しくは望ましい結果（例えば母乳
産生）を得るのに最も効果的な投与は日常的な実験法で
決定出来る。好ましい投与は特定の動物の大きさ、一般
健康度及び栄養状態といつた変数に依存しよう。
本発明の生物活性ペプチドは実質的に純粋な即ち本発
明に係る蛋白質又はペプチドの生物活性に有意の効果を
有する他の蛋白質又はペプチド（期限の如何を問わず）
を含まない形で使われ得る。しかしながら、このことは
本質的ではなく、事実本発明に係る蛋白質又はペプチド
は、有用性を発揮する多くの場合にそれ以外の蛋白質又
はペプチド、例えば牛（又は他の動物）のIGF-1、EGF又
はTGF-α（アルフア形質転換成長因子）といつた他の動
物成長因子との混合物或はその他の組み合せで満足のゆ
く程度（多くの場合には、却つて有利に）使用し得る。
明に係る蛋白質又はペプチドの生物活性に有意の効果を
有する他の蛋白質又はペプチド（期限の如何を問わず）
を含まない形で使われ得る。しかしながら、このことは
本質的ではなく、事実本発明に係る蛋白質又はペプチド
は、有用性を発揮する多くの場合にそれ以外の蛋白質又
はペプチド、例えば牛（又は他の動物）のIGF-1、EGF又
はTGF-α（アルフア形質転換成長因子）といつた他の動
物成長因子との混合物或はその他の組み合せで満足のゆ
く程度（多くの場合には、却つて有利に）使用し得る。
以下の実施例は本発明の好ましい実施態様を例証する
が発明の範囲を如何なる意味に於ても制限することを意
図するものでない。本発明はその好ましい実施態様によ
つて記述されているけれどもその種々な修飾及び変形は
当業者にとつて本申請の教示より明白な筈である。制限
エンドヌクレアーゼ、T4DNAリガーゼ、リボヌクレアー
ゼＡ、DNA修飾酵素等のすべての酵素標品、小麦胚溶解
液、ウサギ網状赤血球溶解液、標識してないアミノ酸類
及びプロテイナーゼＫは、New England Biolabs（Bever
ly,マサチユーセツツ州、米国）及びBethesda Research
Laboratories（BRL）（Gaithersburg,メリーランド
州、米国）より購入し、製造者の仕様に従つて使用し
た。ニトロセルローズ濾紙はScheicher and Schuell（K
eene,ニユーハンプシア州、米国）及びMillipore（Bedf
ord,マサチユーセツツ州、米国）から入手した。放射性
核種及び放射性同位元素で標識されたアミノ酸はNew En
gland Nuclear（Boston,マサチユーセツツ州、米国）及
びAmersham（Arlington Heights,イリノイ州、米国）よ
り購入した。デオキシリボヌクレオシド三燐酸、リボヌ
クレオシド三燐酸はPharmacia-PL Biochemicals（Pisca
taway,ニユージヤージー州、米国）より購入した。
が発明の範囲を如何なる意味に於ても制限することを意
図するものでない。本発明はその好ましい実施態様によ
つて記述されているけれどもその種々な修飾及び変形は
当業者にとつて本申請の教示より明白な筈である。制限
エンドヌクレアーゼ、T4DNAリガーゼ、リボヌクレアー
ゼＡ、DNA修飾酵素等のすべての酵素標品、小麦胚溶解
液、ウサギ網状赤血球溶解液、標識してないアミノ酸類
及びプロテイナーゼＫは、New England Biolabs（Bever
ly,マサチユーセツツ州、米国）及びBethesda Research
Laboratories（BRL）（Gaithersburg,メリーランド
州、米国）より購入し、製造者の仕様に従つて使用し
た。ニトロセルローズ濾紙はScheicher and Schuell（K
eene,ニユーハンプシア州、米国）及びMillipore（Bedf
ord,マサチユーセツツ州、米国）から入手した。放射性
核種及び放射性同位元素で標識されたアミノ酸はNew En
gland Nuclear（Boston,マサチユーセツツ州、米国）及
びAmersham（Arlington Heights,イリノイ州、米国）よ
り購入した。デオキシリボヌクレオシド三燐酸、リボヌ
クレオシド三燐酸はPharmacia-PL Biochemicals（Pisca
taway,ニユージヤージー州、米国）より購入した。
成熟ヒトIGF-I（Jansen等（1983）及びUllrick等（19
84））のアミノ酸10から23をコードするDNA配列に対応
する42塩基のオリゴヌクレオチドはMonsanto Comany（S
t.Louis,ミズリー州、米国）の生物科学部でApplied Bi
osystems社製DNA合成装置を使用し装置製造者によつて
公表された手順に従つて合成された。（Applied Biosys
tems,Inc.,Foster City,カリフオルニヤ州、米国）、こ
の42量体の配列を次に示す： ５′‐AAAGCCCCTGTCTCCACACACGAACTG− AAGAGCATCCACCAG-3′ この42量体はガンマ32Pアデノシン三燐酸とT4ポリヌ
クレオチドキナーゼを用いManiatis等（1982）が発表し
た手順に従つてピコモル当り約107dpmの比活性が得られ
るように標識した。放射線同位元素で標識した42量体は
ついでS.C.M.Kwok等（1985）並びにGubler及びHoffman
（1983）によつて発表された手順に従つて作成されたヒ
ト肝cDNAライブラリーの中からIGF-1を含有するcDNA配
列のスクリーリングを行うのに用いた。λgt11中のヒト
肝cDNAライブラリーはS.L.C.Woo及びT.Chandra両博士
（Baylor University School of Medicine,Houston,テ
キサス州、米国）から入手した。λgt11はAmerican Typ
e Culture Collection（ATCC）（Rockville,メリーラン
ド州、米国）からATCC取得番号37194として、S.C.M.Kwo
k等（1985）によつて記載された手順に従つてその中に
調製されたヒト肝cDNAライブラリーと共に入手し得る。
大腸菌（E.coli）K12株Y1088はATCCからATCC取得番号37
195として入手可能である。プラスミドpGEM1及びpGEM2
はPromega Biotech（Madison,ウイスコンシン州、米
国）から入手した。
84））のアミノ酸10から23をコードするDNA配列に対応
する42塩基のオリゴヌクレオチドはMonsanto Comany（S
t.Louis,ミズリー州、米国）の生物科学部でApplied Bi
osystems社製DNA合成装置を使用し装置製造者によつて
公表された手順に従つて合成された。（Applied Biosys
tems,Inc.,Foster City,カリフオルニヤ州、米国）、こ
の42量体の配列を次に示す： ５′‐AAAGCCCCTGTCTCCACACACGAACTG− AAGAGCATCCACCAG-3′ この42量体はガンマ32Pアデノシン三燐酸とT4ポリヌ
クレオチドキナーゼを用いManiatis等（1982）が発表し
た手順に従つてピコモル当り約107dpmの比活性が得られ
るように標識した。放射線同位元素で標識した42量体は
ついでS.C.M.Kwok等（1985）並びにGubler及びHoffman
（1983）によつて発表された手順に従つて作成されたヒ
ト肝cDNAライブラリーの中からIGF-1を含有するcDNA配
列のスクリーリングを行うのに用いた。λgt11中のヒト
肝cDNAライブラリーはS.L.C.Woo及びT.Chandra両博士
（Baylor University School of Medicine,Houston,テ
キサス州、米国）から入手した。λgt11はAmerican Typ
e Culture Collection（ATCC）（Rockville,メリーラン
ド州、米国）からATCC取得番号37194として、S.C.M.Kwo
k等（1985）によつて記載された手順に従つてその中に
調製されたヒト肝cDNAライブラリーと共に入手し得る。
大腸菌（E.coli）K12株Y1088はATCCからATCC取得番号37
195として入手可能である。プラスミドpGEM1及びpGEM2
はPromega Biotech（Madison,ウイスコンシン州、米
国）から入手した。
実施例１ 以下の実施例はヒト肝cDNAライブラリーからのIGF-1A
及びIGF-1Bの単位を例証する。
及びIGF-1Bの単位を例証する。
概略、λgt11中のヒト肝cDNAライブラリーを次のよう
にスクリーニングする。λgt11を、Young及びDavisによ
つて記載された方法（1983）に従いE.coli K12株Y1088
の上にプレートした。ニトロセルローゼ濾紙を正副２重
にS.L.C.WOOによつて記載された手順に従つて調製し、
５×SSC（１×SSC＝150mM NaCl、15mMクエン酸ナトリウ
ム、pH7.0）50mM燐酸ナトリウム、pH6.8、40％（v/v）
脱イオンフオルムアミド、50μg/ml変性サケ静止DNA、
５×Denhardt溶液［0.1％（w/v）フイコール、0.1％（w
/v）ウシ アルブミン、0.1％ポリビニルピロリドン（M
aniatas等（1982）］を含んだ緩衝液中で、濾紙一枚当
り２×106dpmのプローブを使い約20時間pH6.8でハイブ
リツド形成を行つた。ハイブリツド形成後、濾紙は、22
℃で15分間0.2×SSC、0.1％（w/v）ドデシル硫酸ナトリ
ウム（SDS）を含んだ溶液中で洗い、ついでKodak×RR5
フイルム（Eastman Kodak CO.,Rochester,ニユーヨーク
州、米国）に増感スクリーニングを用いて露光させた。
陽性プラークは更に低い密度で再スクリーニングした。
実際には第１次スクリーニングは137mmフイルター１枚
当り2.5×104のフラークを使用し、２回目のスクリーニ
ングは87mm濾紙１枚当り１−２×102のプラークを使用
した。ついで陽性プラークからのフアージDNAをHelms等
（1985）による記載に従つて調製し、制限酵素消化及び
ゲル電気泳動によつてマツピングし（Maniatis等（198
2））その後で配列を決定した。
にスクリーニングする。λgt11を、Young及びDavisによ
つて記載された方法（1983）に従いE.coli K12株Y1088
の上にプレートした。ニトロセルローゼ濾紙を正副２重
にS.L.C.WOOによつて記載された手順に従つて調製し、
５×SSC（１×SSC＝150mM NaCl、15mMクエン酸ナトリウ
ム、pH7.0）50mM燐酸ナトリウム、pH6.8、40％（v/v）
脱イオンフオルムアミド、50μg/ml変性サケ静止DNA、
５×Denhardt溶液［0.1％（w/v）フイコール、0.1％（w
/v）ウシ アルブミン、0.1％ポリビニルピロリドン（M
aniatas等（1982）］を含んだ緩衝液中で、濾紙一枚当
り２×106dpmのプローブを使い約20時間pH6.8でハイブ
リツド形成を行つた。ハイブリツド形成後、濾紙は、22
℃で15分間0.2×SSC、0.1％（w/v）ドデシル硫酸ナトリ
ウム（SDS）を含んだ溶液中で洗い、ついでKodak×RR5
フイルム（Eastman Kodak CO.,Rochester,ニユーヨーク
州、米国）に増感スクリーニングを用いて露光させた。
陽性プラークは更に低い密度で再スクリーニングした。
実際には第１次スクリーニングは137mmフイルター１枚
当り2.5×104のフラークを使用し、２回目のスクリーニ
ングは87mm濾紙１枚当り１−２×102のプラークを使用
した。ついで陽性プラークからのフアージDNAをHelms等
（1985）による記載に従つて調製し、制限酵素消化及び
ゲル電気泳動によつてマツピングし（Maniatis等（198
2））その後で配列を決定した。
ヒト肝cDNAライブラリーから概略５×105のプラーク
をIGF-I特異的な42量体プローブを用い上に記載したよ
うにスクリーニングした結果約800から約1150のヌクレ
オチド対範囲のDNA挿入部を持つた７個の陽性プラーク
を得た。EcoRI、BamHI及びPatIを用いて制限地図を作つ
たところ、このcDNAには２つの型があることが見出され
た。７個の中２個の凡そ800から850ヌクレオチド対の挿
入部を含有する陽性プラークは内部BamHI制限エンドヌ
クレアーゼ部位を含有しJansen等（1983）によつて報告
されているIGF-I cDNAに対応することが分つた。これら
の挿入部はIGF-1A cDNAと命名された。残りの５個の陽
性クローンは共通してIGF-1A cDNAの制限エンドヌクレ
アーゼ地図とは異なつた地図を示した。これらの５個の
クローンはIGF-1B cDNAと命名された。その中から第１
図にλIGF-2及びλIGF-5として示した最も大きい２個の
挿入部をDNA配列分析用に選んだ。
をIGF-I特異的な42量体プローブを用い上に記載したよ
うにスクリーニングした結果約800から約1150のヌクレ
オチド対範囲のDNA挿入部を持つた７個の陽性プラーク
を得た。EcoRI、BamHI及びPatIを用いて制限地図を作つ
たところ、このcDNAには２つの型があることが見出され
た。７個の中２個の凡そ800から850ヌクレオチド対の挿
入部を含有する陽性プラークは内部BamHI制限エンドヌ
クレアーゼ部位を含有しJansen等（1983）によつて報告
されているIGF-I cDNAに対応することが分つた。これら
の挿入部はIGF-1A cDNAと命名された。残りの５個の陽
性クローンは共通してIGF-1A cDNAの制限エンドヌクレ
アーゼ地図とは異なつた地図を示した。これらの５個の
クローンはIGF-1B cDNAと命名された。その中から第１
図にλIGF-2及びλIGF-5として示した最も大きい２個の
挿入部をDNA配列分析用に選んだ。
DNA配列決定は、Norrander等（1983）によつて記載さ
れたように制限断片をM13mp18及びM13mp19バクテリオフ
アージにサブクローンした後、Sanger等（1977）及びBi
ggin等（1983）によつて記載されたチエーンターミネー
ター法によつて行つた。配列決定に用いた戦略は図１に
示してある。この２個のIGF-1B cDNA単離体のDNA配列
は、一方向のみ３回配列決定した一つのクローンλIGF-
5（第３図参照）の３′−側最末端を除き両鎖につき、
そして開始点として用いた全ての制限酵素部位を横切つ
て全体に亘つて決定された。
れたように制限断片をM13mp18及びM13mp19バクテリオフ
アージにサブクローンした後、Sanger等（1977）及びBi
ggin等（1983）によつて記載されたチエーンターミネー
ター法によつて行つた。配列決定に用いた戦略は図１に
示してある。この２個のIGF-1B cDNA単離体のDNA配列
は、一方向のみ３回配列決定した一つのクローンλIGF-
5（第３図参照）の３′−側最末端を除き両鎖につき、
そして開始点として用いた全ての制限酵素部位を横切つ
て全体に亘つて決定された。
２つの単離体は共通領域について同じ結果を与えた。
そのDNA配列とアミノ酸への翻訳は第２図にのつてい
る。この寄木細工のようになつているIGF-1B cDNAは、
ポリＡ域にある42デオキシアデノシン残基を含んで1136
のヌクレオチドからなる。IGF-1B cDNAの大きさは、以
下により詳細に記載する濾紙ハイブリツド形成により決
定された主要mRNA（900から1350ヌクレオチド）の大き
さと一致する。この配列は３つの区画からなる：最初の
182ヌクレオチドからなる５′非翻訳領域；開始コドン
と約585ヌクレオチド（195コドン）からなるオープン読
み取り枠とそれに続くオパール（TGA）終結コドン；約3
68ヌクレオチドからなりポリＡ領域で終る非翻訳領域。
そのDNA配列とアミノ酸への翻訳は第２図にのつてい
る。この寄木細工のようになつているIGF-1B cDNAは、
ポリＡ域にある42デオキシアデノシン残基を含んで1136
のヌクレオチドからなる。IGF-1B cDNAの大きさは、以
下により詳細に記載する濾紙ハイブリツド形成により決
定された主要mRNA（900から1350ヌクレオチド）の大き
さと一致する。この配列は３つの区画からなる：最初の
182ヌクレオチドからなる５′非翻訳領域；開始コドン
と約585ヌクレオチド（195コドン）からなるオープン読
み取り枠とそれに続くオパール（TGA）終結コドン；約3
68ヌクレオチドからなりポリＡ領域で終る非翻訳領域。
第２図に示すように、585ヌクレオチドのオープン読
み取り枠は第２番目の相の同調したATGコドンで始ま
る。第１番目ヌクレオチド84から86にあるATGは直後に
同一枠にあるオパール終結コドンが続く。第２図に示し
たオープン読み取り枠は、塩基183から185にあるATGコ
ドンが蛋白合成を開始すると仮定すれば、分子量21,841
で195アミノ酸からなるppIGF-Iをコードする。成熟IGF-
I蛋白配列は第１図で斜線を施した第２図で下線を施し
た部分で表わしたヌクレオチド327から536でコードされ
る。この70の成熟IGF-Iコドンに77のアミノ酸からなる
独特の且新規なカルボキシル末端延長部が続く。このカ
ルボキシル末端延長部の最初の16アミノ酸は、IGF-1Aカ
ルボキシル末端延長部の最初の16アミノ酸と同一である
けれども、残りの61アミノ酸は、IGF-1Aとの或はNation
al Biomedical Research Foundation Sequence Data Ba
nk収載の他の如何なる蛋白質との相同性がないことによ
つて結論づけられるように独特である。（Dayhoff等（1
983）並びにWilbur及びLipman（1983））。
み取り枠は第２番目の相の同調したATGコドンで始ま
る。第１番目ヌクレオチド84から86にあるATGは直後に
同一枠にあるオパール終結コドンが続く。第２図に示し
たオープン読み取り枠は、塩基183から185にあるATGコ
ドンが蛋白合成を開始すると仮定すれば、分子量21,841
で195アミノ酸からなるppIGF-Iをコードする。成熟IGF-
I蛋白配列は第１図で斜線を施した第２図で下線を施し
た部分で表わしたヌクレオチド327から536でコードされ
る。この70の成熟IGF-Iコドンに77のアミノ酸からなる
独特の且新規なカルボキシル末端延長部が続く。このカ
ルボキシル末端延長部の最初の16アミノ酸は、IGF-1Aカ
ルボキシル末端延長部の最初の16アミノ酸と同一である
けれども、残りの61アミノ酸は、IGF-1Aとの或はNation
al Biomedical Research Foundation Sequence Data Ba
nk収載の他の如何なる蛋白質との相同性がないことによ
つて結論づけられるように独特である。（Dayhoff等（1
983）並びにWilbur及びLipman（1983））。
IGF-1A及び−1B cDNAでそれぞれコードされる２つの
別個のppIGF-I蛋白質の生体内発現についての確認は、
これらの蛋白質をコードするメツセンジヤーRNAを同定
することにより達成された。実際には、肝のポリアデニ
ル化されたRNAを、−70℃で急速冷凍した組織からChirg
win等（1979）によつて記載された手順に従つてチオシ
アン酸グアニジニウムを用いる抽出とAviv及びLeder（1
982）によつて記載されたオリゴdTセルローズ上で行う
一回のクロマトグラフイーによつて単離した。ポリアデ
ニル化されたRNAは、McMaster及びCarmichael（1977）
によつて記載されているようにグリオキザールで変性さ
れ、1.25％（w/v）アガロースゲル中を電気泳動されそ
してThomas（1980）によつて記載された手順に従つて、
ブロツテイング法によりニトロセルローズ濾紙に移され
た。完全なIGF-1A及び−1B cDNA又はIGF-1A或は−1Bカ
ルボキシ末端延長部をコードするDNAを、すべて個別にR
igby等（1977）によつて記載されているニツクトランス
レーシヨンにより32Pで8-12×108dpm/μｇにラベルした
後、50％（v/v）フオルムアミド、５×SSC、50mM燐酸ナ
トリウム、pH6.5、100μg/ml変性サケ精子DNA、１×Den
hardt溶液及び0.1％（w/v）デキストラン硫酸を含有す
る溶液中で、42℃で濾紙上でハイブリツド形成させた。
濾紙を0.2×SSC及び0.1％（w/v）SDSを含有する緩衝液
中で15分間22℃で、ついで30分間同じ緩衝液を２回代え
て48℃で洗い、そして次に増感スクリーンを使用、62時
間−70℃でオートラジオグラフした。
別個のppIGF-I蛋白質の生体内発現についての確認は、
これらの蛋白質をコードするメツセンジヤーRNAを同定
することにより達成された。実際には、肝のポリアデニ
ル化されたRNAを、−70℃で急速冷凍した組織からChirg
win等（1979）によつて記載された手順に従つてチオシ
アン酸グアニジニウムを用いる抽出とAviv及びLeder（1
982）によつて記載されたオリゴdTセルローズ上で行う
一回のクロマトグラフイーによつて単離した。ポリアデ
ニル化されたRNAは、McMaster及びCarmichael（1977）
によつて記載されているようにグリオキザールで変性さ
れ、1.25％（w/v）アガロースゲル中を電気泳動されそ
してThomas（1980）によつて記載された手順に従つて、
ブロツテイング法によりニトロセルローズ濾紙に移され
た。完全なIGF-1A及び−1B cDNA又はIGF-1A或は−1Bカ
ルボキシ末端延長部をコードするDNAを、すべて個別にR
igby等（1977）によつて記載されているニツクトランス
レーシヨンにより32Pで8-12×108dpm/μｇにラベルした
後、50％（v/v）フオルムアミド、５×SSC、50mM燐酸ナ
トリウム、pH6.5、100μg/ml変性サケ精子DNA、１×Den
hardt溶液及び0.1％（w/v）デキストラン硫酸を含有す
る溶液中で、42℃で濾紙上でハイブリツド形成させた。
濾紙を0.2×SSC及び0.1％（w/v）SDSを含有する緩衝液
中で15分間22℃で、ついで30分間同じ緩衝液を２回代え
て48℃で洗い、そして次に増感スクリーンを使用、62時
間−70℃でオートラジオグラフした。
IGF-1A及び−1B cDNAは共にヒト肝のRNA転写物にハイ
ブリツドした。独特なIGF-1A又は−1B cDNAの独特なカ
ルボキシ−末端延長部のハイブリツド形成は、凡そ900
から1350ヌクレオチドの大きなバンドを示す。他の比較
的大きいバンドが1.7、3.7及び6.3キロベースに見ら
れ、おそらくは、それぞれプロセスされた前駆体mRNAか
さもなくば他のIGF-I遺伝子mRNAに相当するものであろ
う。全体のIGF-1A及び−1BcDNAを用いた並行実験も類似
の結果を与えた。
ブリツドした。独特なIGF-1A又は−1B cDNAの独特なカ
ルボキシ−末端延長部のハイブリツド形成は、凡そ900
から1350ヌクレオチドの大きなバンドを示す。他の比較
的大きいバンドが1.7、3.7及び6.3キロベースに見ら
れ、おそらくは、それぞれプロセスされた前駆体mRNAか
さもなくば他のIGF-I遺伝子mRNAに相当するものであろ
う。全体のIGF-1A及び−1BcDNAを用いた並行実験も類似
の結果を与えた。
実施例２ この実施例はヒトIGF-Iゲノム遺伝子の単位及びマツ
ピングを例証する。
ピングを例証する。
ヒトのゲノム−ライブラリーはハイブリツドベクタ
ー、λMG14、（Helms等（1985））、及びManiatis等（1
982）によつて記載されているMboIで部分消化されたサ
イズ分画ヒト白血球DNAを用いて調製された。ゲノム−
ライブラリーはManiatis等（1982）によつて記載されて
いるようにして調製することも出来る。このライブラリ
ー及び今一つLawn等（1978）によつて記載されたヒト胎
児肝由来のものから凡そ４×105のプラークを、Rigby等
（1977）が記載したようにニツクトランスレーシヨンを
用いて調製した32P−標識IGF-I cDNAをハイブリツド形
成プローブとして用いて、Maniatis等（1982）によつて
記載された方法に従つてスクリーニングした。プラーク
で純粋にした陽性単離物（Helms等（1985））からのDNA
をBamHI、EcoRI及びHindIIIの単回及び二回消化を用
い、32P IGF-I cDNA及びSchmidとJelinek（1982）によ
つて記載されたように調製したヒトAluプローブへのハ
イブリツド形成によつてマツピングした。IGF-Iエキソ
ンを含有した15のゲノムクローンから８個を制限エンド
ヌクレアーゼ−マツピング及びサザンブロツテイング法
からなる更に進んだ分析を行う為に選択した。選択した
８個のクローン及びその中のゲノムDNA領域を第３図
（ａ）に示し“λIGF−”と次に加えた数字で符号をつ
けた。
ー、λMG14、（Helms等（1985））、及びManiatis等（1
982）によつて記載されているMboIで部分消化されたサ
イズ分画ヒト白血球DNAを用いて調製された。ゲノム−
ライブラリーはManiatis等（1982）によつて記載されて
いるようにして調製することも出来る。このライブラリ
ー及び今一つLawn等（1978）によつて記載されたヒト胎
児肝由来のものから凡そ４×105のプラークを、Rigby等
（1977）が記載したようにニツクトランスレーシヨンを
用いて調製した32P−標識IGF-I cDNAをハイブリツド形
成プローブとして用いて、Maniatis等（1982）によつて
記載された方法に従つてスクリーニングした。プラーク
で純粋にした陽性単離物（Helms等（1985））からのDNA
をBamHI、EcoRI及びHindIIIの単回及び二回消化を用
い、32P IGF-I cDNA及びSchmidとJelinek（1982）によ
つて記載されたように調製したヒトAluプローブへのハ
イブリツド形成によつてマツピングした。IGF-Iエキソ
ンを含有した15のゲノムクローンから８個を制限エンド
ヌクレアーゼ−マツピング及びサザンブロツテイング法
からなる更に進んだ分析を行う為に選択した。選択した
８個のクローン及びその中のゲノムDNA領域を第３図
（ａ）に示し“λIGF−”と次に加えた数字で符号をつ
けた。
これらの分析の結果は、単離されたゲノムIGF-I遺伝
子の制限地図を与えている第３図（ａ）に要約されてい
る。単離されたDNAの５つの領域はcDNAプローブにハイ
ブリツドし、図３（ａ）に番号を付した箱で示してある
エキソン１−５と命名された。エキソン1,2,3及び５はI
GF-1AのmRNA（例えばpIGF-1AをコードするDNA）を含み
又エキソン1,2,3及び４はIGF-1BのmRNA（例えばpIGF-1B
をコードするDNA）を含む。エキソン１のはじめからエ
キソン５の終りまでの間、遺伝子は45キロ塩基（kb）以
上に広がつている。エキソン２と３の間にあるその特徴
が完全には明にされていないDNA領域は、その配列が成
熟IGF-IのＢ領域にあるアスパラギンのコドンを中断し
ており従つて今一つのエキソンではあり得ないという理
由から、イントロンであると決定された。第３図（ａ）
に示すように、このゲノムIGF-I遺伝子の中には、Alu型
の中度反復配列（Schmid及びJelinek（1982））に強く
ハイブリツドする５つの領域がある。これらのAlu型配
列は、地図の上では、中間部及び両端部に位置するDNA
配列に見られる。（Schmid及びJelinek（1982））。
子の制限地図を与えている第３図（ａ）に要約されてい
る。単離されたDNAの５つの領域はcDNAプローブにハイ
ブリツドし、図３（ａ）に番号を付した箱で示してある
エキソン１−５と命名された。エキソン1,2,3及び５はI
GF-1AのmRNA（例えばpIGF-1AをコードするDNA）を含み
又エキソン1,2,3及び４はIGF-1BのmRNA（例えばpIGF-1B
をコードするDNA）を含む。エキソン１のはじめからエ
キソン５の終りまでの間、遺伝子は45キロ塩基（kb）以
上に広がつている。エキソン２と３の間にあるその特徴
が完全には明にされていないDNA領域は、その配列が成
熟IGF-IのＢ領域にあるアスパラギンのコドンを中断し
ており従つて今一つのエキソンではあり得ないという理
由から、イントロンであると決定された。第３図（ａ）
に示すように、このゲノムIGF-I遺伝子の中には、Alu型
の中度反復配列（Schmid及びJelinek（1982））に強く
ハイブリツドする５つの領域がある。これらのAlu型配
列は、地図の上では、中間部及び両端部に位置するDNA
配列に見られる。（Schmid及びJelinek（1982））。
個々のエキソンのサブクローンは、制限地図を更に作
り直す為に、Norrander等（1983）によつて記載された
手順に従つてpUC18及びpUC19プラスミド中に、又DNA配
列を決める為にNorrander等（1983）によつて記載され
た手順に従つて、M13mp18及びM13mp19中に調製された。
M13mp18、M13mp19、pUC18及びpUC19はNew England Biol
abs（Berverly、マサチユーセツツ州、米国）から入手
可能である。DNA配列分析はSanger等（1977）及びBiggi
n等（1983）によつて記載された手順に従いジデオキシ
連鎖終結性阻害剤、35S‐dATP及び標準並びに変性ゲル
電気泳動を用いて行つた。採用したDNA配列決定の戦略
は第３図（ｂ）に図示してある。エキソン３及び４に関
する最初のDNA配列決定は、Poncz等（1982）によつて記
載された一連の重複欠失部を、第３図（ｂ）に示した配
列決定方式中に黒丸で指し示したように、Bal31エンド
ヌクレアーゼを用いて調製した後に行つた。他のすべて
の配列分析は第３図（ｂ）に短い縦線で描いたように特
異的なエンドヌクレアーゼ部位から開始した。エキソン
２に先行するイントロン中の100ヌクレオチド及びエキ
ソン４の一部分を除いて、第４図に提示したすべての配
列は、開始点として用いた制限エンドヌクレアーゼ部位
を含んで、両方のDNA鎖から照合された。総てのエキソ
ン−イントロン間スプライシング接合点及びポリアデニ
ル化部位はIGF-1A及びIGF-1B cDNA配列との比較によつ
て決定した。
り直す為に、Norrander等（1983）によつて記載された
手順に従つてpUC18及びpUC19プラスミド中に、又DNA配
列を決める為にNorrander等（1983）によつて記載され
た手順に従つて、M13mp18及びM13mp19中に調製された。
M13mp18、M13mp19、pUC18及びpUC19はNew England Biol
abs（Berverly、マサチユーセツツ州、米国）から入手
可能である。DNA配列分析はSanger等（1977）及びBiggi
n等（1983）によつて記載された手順に従いジデオキシ
連鎖終結性阻害剤、35S‐dATP及び標準並びに変性ゲル
電気泳動を用いて行つた。採用したDNA配列決定の戦略
は第３図（ｂ）に図示してある。エキソン３及び４に関
する最初のDNA配列決定は、Poncz等（1982）によつて記
載された一連の重複欠失部を、第３図（ｂ）に示した配
列決定方式中に黒丸で指し示したように、Bal31エンド
ヌクレアーゼを用いて調製した後に行つた。他のすべて
の配列分析は第３図（ｂ）に短い縦線で描いたように特
異的なエンドヌクレアーゼ部位から開始した。エキソン
２に先行するイントロン中の100ヌクレオチド及びエキ
ソン４の一部分を除いて、第４図に提示したすべての配
列は、開始点として用いた制限エンドヌクレアーゼ部位
を含んで、両方のDNA鎖から照合された。総てのエキソ
ン−イントロン間スプライシング接合点及びポリアデニ
ル化部位はIGF-1A及びIGF-1B cDNA配列との比較によつ
て決定した。
サザンブロツテイング分析は、簡潔にすれば、次のよ
うに行つた。ヒトの白血球より得たDNA（Maniatis（198
2））10μｇを種々の制限酵素HindIII、PvuII、EcoRI、
BamHI及びBglIIで消化し、ついで0.8％（w/v）アガロー
ズゲル中、20-25ボルト、0.089Mトリス‐硼酸、0.089M
硼酸及び0.001M Na2EDTAを含有する緩衝液を用いて電気
泳動した。DNA断片は、Southan（1975）によつて記載さ
れた手順に従つてブロツテイングによりニトロセルロー
ズ濾紙へ移した。使用する濾紙のハイブリド形成前処
理、既述のように調製した放射性同位元素で標識したIG
F-Iプローブへのハイブリツド形成及びWahl等（1978）
の手順に従つたハイブリツド形成後の洗滌。形成したハ
イブリツドのハンドはオートラジオグラフイーで検出し
た。
うに行つた。ヒトの白血球より得たDNA（Maniatis（198
2））10μｇを種々の制限酵素HindIII、PvuII、EcoRI、
BamHI及びBglIIで消化し、ついで0.8％（w/v）アガロー
ズゲル中、20-25ボルト、0.089Mトリス‐硼酸、0.089M
硼酸及び0.001M Na2EDTAを含有する緩衝液を用いて電気
泳動した。DNA断片は、Southan（1975）によつて記載さ
れた手順に従つてブロツテイングによりニトロセルロー
ズ濾紙へ移した。使用する濾紙のハイブリド形成前処
理、既述のように調製した放射性同位元素で標識したIG
F-Iプローブへのハイブリツド形成及びWahl等（1978）
の手順に従つたハイブリツド形成後の洗滌。形成したハ
イブリツドのハンドはオートラジオグラフイーで検出し
た。
サザンブロツテイング分析を正常状態にあり互に類縁
関係のない18人の成人について、IGF-1B cDNA及び上記
に掲げた制限酵素を使つて実施した。本発明者等はBell
等（1985）によつて報告されたHindIII及びPvuIIに対す
る部位多型現象が互に連鎖し且地図の上ではゲノムIGF-
I遺伝子のエキソン５の近くにすべて位置することを見
出した。
関係のない18人の成人について、IGF-1B cDNA及び上記
に掲げた制限酵素を使つて実施した。本発明者等はBell
等（1985）によつて報告されたHindIII及びPvuIIに対す
る部位多型現象が互に連鎖し且地図の上ではゲノムIGF-
I遺伝子のエキソン５の近くにすべて位置することを見
出した。
ゲノムIGF-I遺伝子全体の配列を第４図に提示した。
エキソン４の一方向に配列推定した領域は、それと対応
するpIGF-1Bのカルボキシル末端延長ペプチドをコード
するcDNAの配列と完全に一致する。エキソン５のDNA配
列は、それと対応するpIGF-1AのＣ−末端延長ペプチド
をコードするcDNAと完全に一致する。
エキソン４の一方向に配列推定した領域は、それと対応
するpIGF-1Bのカルボキシル末端延長ペプチドをコード
するcDNAの配列と完全に一致する。エキソン５のDNA配
列は、それと対応するpIGF-1AのＣ−末端延長ペプチド
をコードするcDNAと完全に一致する。
ヒト肝RNA及び32Pで標記した、５′TG-AGAGCAATGTCAC
ATTTC3′を使用するプライマーエクステンシヨン分析に
よると、ppIGF-ImRNAの５′末端は第４図の1108にある
開始部位の上流へ583ヌクレオチド延びていることが解
つた。若しこの遺伝子の５′非翻訳領域がイントロンを
含んでいないものとすれば、転写第４図525又は526の位
置で始まらなければならない。若しイントロンが５′非
翻訳領域に含まれているならば、転写は525又は526の位
置よりも更に上流（５′）で始まるのが最も本当らし
い。第２図に示したIGF-1BcDNAは、翻訳開始コドンから
５′方向に182ヌクレオチド延びて居り、且第４図に表
わしたように相の同調したいくつもの翻訳終結コドンを
含有している。更に５′方向199から241の位置にある42
ヌクレオチドよりなる領域は潜在的にＺ型DNAを形成し
得る交互に現われるプリンとピリミジン残基を含み、活
発に転写されるDNAであることを暗示する。（Nordheim
及びRich（1983））。
ATTTC3′を使用するプライマーエクステンシヨン分析に
よると、ppIGF-ImRNAの５′末端は第４図の1108にある
開始部位の上流へ583ヌクレオチド延びていることが解
つた。若しこの遺伝子の５′非翻訳領域がイントロンを
含んでいないものとすれば、転写第４図525又は526の位
置で始まらなければならない。若しイントロンが５′非
翻訳領域に含まれているならば、転写は525又は526の位
置よりも更に上流（５′）で始まるのが最も本当らし
い。第２図に示したIGF-1BcDNAは、翻訳開始コドンから
５′方向に182ヌクレオチド延びて居り、且第４図に表
わしたように相の同調したいくつもの翻訳終結コドンを
含有している。更に５′方向199から241の位置にある42
ヌクレオチドよりなる領域は潜在的にＺ型DNAを形成し
得る交互に現われるプリンとピリミジン残基を含み、活
発に転写されるDNAであることを暗示する。（Nordheim
及びRich（1983））。
実施例３ 本実施例は、IGF-1A及びIGF-1B前駆体ペプチドの試験
内発現を例証し、又第１番目の枠内メチオニン（ATG）
コドンがppIGF-Iの翻訳開始のシグナルとなり得ること
を例証する。
内発現を例証し、又第１番目の枠内メチオニン（ATG）
コドンがppIGF-Iの翻訳開始のシグナルとなり得ること
を例証する。
本実施例に於ては、ヒトのIGF-1A及びIGF-1B cDNAを
別々にプラスミドpGEM1及びpGEM2に連結してpGEMプラス
ミド中に含有されるバクテリオフアージT4のプロモータ
ーに隣接して５′−末端をもつたIGF-1 cDNAを含有する
組換えプラスミドを創造した。実際には、IGF-1A cDNA
を予めEcoRIで消化したpGEM1プラスミドに連結した。こ
のIGF-1A cDNAが組換えプラスミドの中で正しく方向付
けられていることはBamHIを使用した制限エンドヌクレ
アーゼ分析で確認した。IGF-1BcDNAを含有する組換えpG
EM2プラスミドは、EcoRIリンカーを３′末端に含有し且
RsaIにより消化されたIGF-1B cDNAを、予めEcoRI及びHi
ndIIが二重に消化されたpGEM2プラスミドに連結して構
築した。この組み換えプラスミド中に於てIGF-1B cDNA
がT7プロモーターに対して正しく方向付けられているこ
とは、PstIを用いる消化で確認された。それぞれpGEM1/
IGF-1A及びpGEM2/IGF-1Bと命令されたプラスミドを単離
した後、各々のプラスミドはそれぞれ酵素HindIII及びE
coRIを用いて、対応するIGF-1 DNA配列の３′末端で直
線化した。IGF-1A cRNA及びIGF-1B cRNAと命名された相
補的RNAをT7RNAポリメラーゼ（Davanloo等（1984））を
用い、Melton等（1984）の方法に従つて試験管内転写で
調製した。それに続く翻訳の効率を上げる為に、各々の
mRNAは、Melton等（1984）の方法に従つて、転写時にキ
ヤツプ構造を与えられた。キヤツプされた全領域に亘る
IGF-1A及びIGF-1BのcRNAは、小麦胚とウサギ網状赤血球
溶解液と（Pelham及びJackson（1976））を用いて、35S
‐メチオニン若しくは3H−ロイシンと残り19すべての標
識されていないアミノ酸の存在下で翻訳させた。その際
いずれの標識を用いても結果は同等であつた。主要な翻
訳産生物を、12％（w/v）又は15％（w/v）のアクリルア
ミドでポリアクリルアミド−ゲル電気泳動とそれに続く
オートラジオグラフイーによつて評価した。実験的に決
められた主要IGF-1A翻訳産生物は概略17,000ダルトンの
移動度を示し、152アミノ酸からなる前駆体の予測分子
量、17,026ダルトンと非常によく一致した。その上、こ
の試験管内で合成されたIGF-1Aのアミノ−末端アミノ酸
配列が決められ、それはIGF-1A cDNAから予測された主
要翻訳産生物の配列と完全に一致した。従つて翻訳は１
番目の枠内メチオニンコドン（例えば第５図、IGF-1Aに
対する塩基対59-61）で始まり残基24或は27（例えば第
５図、IGF-1Aに対する塩基対128-130又は137-139）から
ではない。IGF-1Aは従つて153アミノ酸からなる前駆体
として合成された。同様に、実験的に決められた主要IG
F-1B翻訳産生物はポリアクリルアマイドゲル上を概略2
2,000ダルトンの移動度で移行し、IGF-1BのcDNA配列か
ら定義付けた195アミノ酸からなるIGF-1Bの予測分子
量、21,841ダルトンと非常によく一致した。従つて、IG
F-1Bは、本発明に係る合成DNA及び実質的に純粋なIGF-
遺伝子でコードされる蛋白質に対応する195アミノ酸分
子として産生された。
別々にプラスミドpGEM1及びpGEM2に連結してpGEMプラス
ミド中に含有されるバクテリオフアージT4のプロモータ
ーに隣接して５′−末端をもつたIGF-1 cDNAを含有する
組換えプラスミドを創造した。実際には、IGF-1A cDNA
を予めEcoRIで消化したpGEM1プラスミドに連結した。こ
のIGF-1A cDNAが組換えプラスミドの中で正しく方向付
けられていることはBamHIを使用した制限エンドヌクレ
アーゼ分析で確認した。IGF-1BcDNAを含有する組換えpG
EM2プラスミドは、EcoRIリンカーを３′末端に含有し且
RsaIにより消化されたIGF-1B cDNAを、予めEcoRI及びHi
ndIIが二重に消化されたpGEM2プラスミドに連結して構
築した。この組み換えプラスミド中に於てIGF-1B cDNA
がT7プロモーターに対して正しく方向付けられているこ
とは、PstIを用いる消化で確認された。それぞれpGEM1/
IGF-1A及びpGEM2/IGF-1Bと命令されたプラスミドを単離
した後、各々のプラスミドはそれぞれ酵素HindIII及びE
coRIを用いて、対応するIGF-1 DNA配列の３′末端で直
線化した。IGF-1A cRNA及びIGF-1B cRNAと命名された相
補的RNAをT7RNAポリメラーゼ（Davanloo等（1984））を
用い、Melton等（1984）の方法に従つて試験管内転写で
調製した。それに続く翻訳の効率を上げる為に、各々の
mRNAは、Melton等（1984）の方法に従つて、転写時にキ
ヤツプ構造を与えられた。キヤツプされた全領域に亘る
IGF-1A及びIGF-1BのcRNAは、小麦胚とウサギ網状赤血球
溶解液と（Pelham及びJackson（1976））を用いて、35S
‐メチオニン若しくは3H−ロイシンと残り19すべての標
識されていないアミノ酸の存在下で翻訳させた。その際
いずれの標識を用いても結果は同等であつた。主要な翻
訳産生物を、12％（w/v）又は15％（w/v）のアクリルア
ミドでポリアクリルアミド−ゲル電気泳動とそれに続く
オートラジオグラフイーによつて評価した。実験的に決
められた主要IGF-1A翻訳産生物は概略17,000ダルトンの
移動度を示し、152アミノ酸からなる前駆体の予測分子
量、17,026ダルトンと非常によく一致した。その上、こ
の試験管内で合成されたIGF-1Aのアミノ−末端アミノ酸
配列が決められ、それはIGF-1A cDNAから予測された主
要翻訳産生物の配列と完全に一致した。従つて翻訳は１
番目の枠内メチオニンコドン（例えば第５図、IGF-1Aに
対する塩基対59-61）で始まり残基24或は27（例えば第
５図、IGF-1Aに対する塩基対128-130又は137-139）から
ではない。IGF-1Aは従つて153アミノ酸からなる前駆体
として合成された。同様に、実験的に決められた主要IG
F-1B翻訳産生物はポリアクリルアマイドゲル上を概略2
2,000ダルトンの移動度で移行し、IGF-1BのcDNA配列か
ら定義付けた195アミノ酸からなるIGF-1Bの予測分子
量、21,841ダルトンと非常によく一致した。従つて、IG
F-1Bは、本発明に係る合成DNA及び実質的に純粋なIGF-
遺伝子でコードされる蛋白質に対応する195アミノ酸分
子として産生された。
種々の他の例は本開示を本発明の精神と範囲から逸脱
することなく通読した後には当業者にとつて明白であ
り、又そのような他の例はすべて本申請に添付する特許
申請の範囲に包含されるべきことを意図する。引用文献 Aviv,H.and Leder,P.（1972）Proc.Nat′l. Aca.Sci.,U.S.A.69:1408-1412. Bell,G.I.,Gergard,D.S.,Fong,N.M., Sanchez-Pescador,R.and Rall,L.B. （1985）Proc.Nat′l.Acad.Sci.U.S.A. 82:6450-6454. Biggin,M.D.,Gibson,T.J.and Hong,G.F. （1983）Proc.Nat′l.Acad.Sci., U.S.A.80:3963-3965. Brissenden,J.E.,Ullrich,A.and Francke, U.（1984）Nature(London)310:781-784. Chirgwin,J.M.,Przybyla,A.E.,Macdonald, R.J.and Rutter,W.J.（1979） Biochemistry 24:5294-5299. Clemmons,D.R.,and Shaw,D.S.（1983） J.Cellular Physiol.115:137-142. Clemmons,D.R.,and Van Wyk,J.J.（1981a） J.Cell Physiol.106:361-367. Clemmons,D.R.,and Van Wyk,J.J.（1981b） J.Clin.Invest.67:10-19. Copeland,K.C.,Underwood,L.E.and Van Wyk, J.J.（1980）J.Clin.Endocrinol. Metab.50:690-697. Davanloo,P.et al.（1984）Proc.Nat′l Acad. Sci.,U.S.A.81:2035-2039. Daughaday,W.H.（1977），Clin.Endocrin. Metal 6:117-135. Dayhoff,M.O.,Barker,W.C.and Hunt,C.T. （1983）Methods in Enzymol.91:524-545. Gubler,V.and Hoffman,B.J.（1983）Gene 25:263-269. Hart,R.P.,McDevitt,M.A.,and Nevins,J.R. （1985）Cell43:677-683. Helms,C.,Graham,M.Y.,Dutchik,J.E.and Olson,M.V.（1985）DNA 4:39-49. Humbel,R.E.（1984）in Hormonal Proteins and Peptides ed.Choh Hao Li,Academic Press,Inc.,vol.XII p.66-68. Hylka,V.W.,Teplow,D.B.,Kent,S.B.H.,and Strauss,D.S.（1985）J.Biol.Chem. 260:14417-14420. Jansen,M.,van Schaik,F.M.A.,Ricker, A.T.,Bullock,B.,Woods,D.E., Gabbay,K.H.,Nussbaum,A.L., Sussenbach,J.S.and Van den Brande, J.L.（1983）Nature(London) 306:609-611. Kwok,S.C.M.,Ledley,F.D.,Di Lella,A.G., Robson,K.J.H.,and woo,S.L.C.（1985） Biochemistry 24:556-561. Laemmli,U.K.（1970）Nature 277:680-685. Lawn,R.M.et al.（1978）Cell 15:1157-1174. Lehninger,A.L.（1976）Biochemistry,2nd Ed., Worth Publishers,Inc.,New York, N.Y.pp72-73,315-322. Maniatis,T.,Fritsch,E.F.,Sambrook, J.（1982）in Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,pp.104-107,374-382. Marquardt,H.,and Todaro,G.J.（1981） J.Biol.Chem.256:6859-6863. McMaster and Carmichael （1977）Proc. Nat′l.Acad.Sci.U.S.A.74:4835-4838. Melton,D.A.et al.（1984）Nuc.Acid Res. 12:7035-7055. Nordheim,A.and Rich,A.（1983）Proc. Nat′l.Acad.Sci.,U.S.A.74:560-564. Norrander,J.,Kempe,T.and Messing J. （1983） Gene26:101-106. Pelham,H.R.B.and Jackson,R.J.（1976）Eur. J.Biochem.67:247;256. Poncz,M.et al.（1982）Proc.Nat′l.Acad. Sci.,U.S.A.79:4298-4302. Rigby et al.（1977）J.Mol.Biol. 113:237-251. Rinderknecht,E.and Humbel,R.E.（1978a） J.Biol.Chem.253:2769-2776. Rinderknecht,E.and Humbel,R.E.（1978b） FEBS Lett 89:283-286. Rosenfeld,M.G.et al.（1983） Nature 304:129-135. Rubin,J.S.,Muriz,I.,Jacobs,J.W., Daughaday,W.H.and Bradshaw,R.A. （1982） Endocrinology 110:734-740. Sanger,F.,Nicklen,S.,and Coulsen,A.R. （1977）Proc.Nat′l.Acad.Sci.,U.S.A. 74:5463-5467. Schmid,C.W.and Jelinek,W.R.（1982） Science 216:1065-1070. Schoenle,E.,Zapf,J.,Humbel,R.E.and Foresch,E.R.（1982）Nature(London) 296:252-253. Southern,E.M.（1975）J.Mol.Biol. 98:503-517. Thomas,P.S.（1980）Proc.Nat′l.Acad.Sci. U.S.A.77:5201-5205. Tricoli,J.V.,Rall,L.B.,Scott,J.,Bell, G.I.,and Shows,J.B.（1984）Nature (London)310:784-786. Ullrich,A.,Berman,C.H.,Dull,T.J.,Gray, A.and Lee,J.M.（1984）EMBO J. 3:361-364. van Buul-Offers,S.and Van den Brande,J.L. （1980）in Growth Hormone and Other Biologically Active Peptides eds. Pecile,A.＆ Miller,E.E.;p.103-122; Excerpta Medica,Amsterdam. Vassilopoulou-Sellin,R.and Phillips,L.S. （1982） Endocrinology 110:582-589. Wahl,G.M.,Stein,M.and Stark,G.R.（1979） Proc.Nat′l.Acad.Sci.,U.S.A.76: 3683-3687. Wilbur,W.J.and Lipman,O.J.（1983）Proc. Nat′l.Sci.,U.S.A.80:726-730. Wilson,D.M.and Hintz,R.L.（1982）J. Endocrinol.95:59. Woo,S.L.C.（1979）Methods in Enz. 68:389-395. Young and Davis（1983）Proc.Nat′l.Acad. Sci.,U.S.A.80:1194-1198. Zapf,J.,Schmid,C.H.,and Froesch,E.R. （1984）J.Clin.Endocrinol.Metal 13:3-10. Zumstein,P.P.,Luthi,C.and Humbel,R.E. （1985）Proc.Nat′l.Acad.Sci.,U.S.A. 82:3169-3172.
することなく通読した後には当業者にとつて明白であ
り、又そのような他の例はすべて本申請に添付する特許
申請の範囲に包含されるべきことを意図する。引用文献 Aviv,H.and Leder,P.（1972）Proc.Nat′l. Aca.Sci.,U.S.A.69:1408-1412. Bell,G.I.,Gergard,D.S.,Fong,N.M., Sanchez-Pescador,R.and Rall,L.B. （1985）Proc.Nat′l.Acad.Sci.U.S.A. 82:6450-6454. Biggin,M.D.,Gibson,T.J.and Hong,G.F. （1983）Proc.Nat′l.Acad.Sci., U.S.A.80:3963-3965. Brissenden,J.E.,Ullrich,A.and Francke, U.（1984）Nature(London)310:781-784. Chirgwin,J.M.,Przybyla,A.E.,Macdonald, R.J.and Rutter,W.J.（1979） Biochemistry 24:5294-5299. Clemmons,D.R.,and Shaw,D.S.（1983） J.Cellular Physiol.115:137-142. Clemmons,D.R.,and Van Wyk,J.J.（1981a） J.Cell Physiol.106:361-367. Clemmons,D.R.,and Van Wyk,J.J.（1981b） J.Clin.Invest.67:10-19. Copeland,K.C.,Underwood,L.E.and Van Wyk, J.J.（1980）J.Clin.Endocrinol. Metab.50:690-697. Davanloo,P.et al.（1984）Proc.Nat′l Acad. Sci.,U.S.A.81:2035-2039. Daughaday,W.H.（1977），Clin.Endocrin. Metal 6:117-135. Dayhoff,M.O.,Barker,W.C.and Hunt,C.T. （1983）Methods in Enzymol.91:524-545. Gubler,V.and Hoffman,B.J.（1983）Gene 25:263-269. Hart,R.P.,McDevitt,M.A.,and Nevins,J.R. （1985）Cell43:677-683. Helms,C.,Graham,M.Y.,Dutchik,J.E.and Olson,M.V.（1985）DNA 4:39-49. Humbel,R.E.（1984）in Hormonal Proteins and Peptides ed.Choh Hao Li,Academic Press,Inc.,vol.XII p.66-68. Hylka,V.W.,Teplow,D.B.,Kent,S.B.H.,and Strauss,D.S.（1985）J.Biol.Chem. 260:14417-14420. Jansen,M.,van Schaik,F.M.A.,Ricker, A.T.,Bullock,B.,Woods,D.E., Gabbay,K.H.,Nussbaum,A.L., Sussenbach,J.S.and Van den Brande, J.L.（1983）Nature(London) 306:609-611. Kwok,S.C.M.,Ledley,F.D.,Di Lella,A.G., Robson,K.J.H.,and woo,S.L.C.（1985） Biochemistry 24:556-561. Laemmli,U.K.（1970）Nature 277:680-685. Lawn,R.M.et al.（1978）Cell 15:1157-1174. Lehninger,A.L.（1976）Biochemistry,2nd Ed., Worth Publishers,Inc.,New York, N.Y.pp72-73,315-322. Maniatis,T.,Fritsch,E.F.,Sambrook, J.（1982）in Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,pp.104-107,374-382. Marquardt,H.,and Todaro,G.J.（1981） J.Biol.Chem.256:6859-6863. McMaster and Carmichael （1977）Proc. Nat′l.Acad.Sci.U.S.A.74:4835-4838. Melton,D.A.et al.（1984）Nuc.Acid Res. 12:7035-7055. Nordheim,A.and Rich,A.（1983）Proc. Nat′l.Acad.Sci.,U.S.A.74:560-564. Norrander,J.,Kempe,T.and Messing J. （1983） Gene26:101-106. Pelham,H.R.B.and Jackson,R.J.（1976）Eur. J.Biochem.67:247;256. Poncz,M.et al.（1982）Proc.Nat′l.Acad. Sci.,U.S.A.79:4298-4302. Rigby et al.（1977）J.Mol.Biol. 113:237-251. Rinderknecht,E.and Humbel,R.E.（1978a） J.Biol.Chem.253:2769-2776. Rinderknecht,E.and Humbel,R.E.（1978b） FEBS Lett 89:283-286. Rosenfeld,M.G.et al.（1983） Nature 304:129-135. Rubin,J.S.,Muriz,I.,Jacobs,J.W., Daughaday,W.H.and Bradshaw,R.A. （1982） Endocrinology 110:734-740. Sanger,F.,Nicklen,S.,and Coulsen,A.R. （1977）Proc.Nat′l.Acad.Sci.,U.S.A. 74:5463-5467. Schmid,C.W.and Jelinek,W.R.（1982） Science 216:1065-1070. Schoenle,E.,Zapf,J.,Humbel,R.E.and Foresch,E.R.（1982）Nature(London) 296:252-253. Southern,E.M.（1975）J.Mol.Biol. 98:503-517. Thomas,P.S.（1980）Proc.Nat′l.Acad.Sci. U.S.A.77:5201-5205. Tricoli,J.V.,Rall,L.B.,Scott,J.,Bell, G.I.,and Shows,J.B.（1984）Nature (London)310:784-786. Ullrich,A.,Berman,C.H.,Dull,T.J.,Gray, A.and Lee,J.M.（1984）EMBO J. 3:361-364. van Buul-Offers,S.and Van den Brande,J.L. （1980）in Growth Hormone and Other Biologically Active Peptides eds. Pecile,A.＆ Miller,E.E.;p.103-122; Excerpta Medica,Amsterdam. Vassilopoulou-Sellin,R.and Phillips,L.S. （1982） Endocrinology 110:582-589. Wahl,G.M.,Stein,M.and Stark,G.R.（1979） Proc.Nat′l.Acad.Sci.,U.S.A.76: 3683-3687. Wilbur,W.J.and Lipman,O.J.（1983）Proc. Nat′l.Sci.,U.S.A.80:726-730. Wilson,D.M.and Hintz,R.L.（1982）J. Endocrinol.95:59. Woo,S.L.C.（1979）Methods in Enz. 68:389-395. Young and Davis（1983）Proc.Nat′l.Acad. Sci.,U.S.A.80:1194-1198. Zapf,J.,Schmid,C.H.,and Froesch,E.R. （1984）J.Clin.Endocrinol.Metal 13:3-10. Zumstein,P.P.,Luthi,C.and Humbel,R.E. （1985）Proc.Nat′l.Acad.Sci.,U.S.A. 82:3169-3172.
下記の図表に於て、アミノ酸配列はそのアミノ末端（NH
2）からカルボキシ末端（COOH）へ向つて読むようにし
て与えられている。DNA配列は５′から３′の方向に与
えられている。問題となる制限エンドヌクレアーゼ部位
も示されている。下記に記載するように記号が付してあ
るDNA領域は図示の目的の為のみであつて、特に断らな
い限り一定の尺度で描かれてはいない。５′から３′に
向けてのDNA配列又はアミノ末端からカルボキシ末端へ
のアミノ酸配列に関する番号付けは図示の目的の為のみ
である。 第１図はヒトIGF-1BのcDNAクローンに関する地図を描写
する。水平の矢印はcDNA配列決定の為の攻め方を表わ
す：白抜きの箱全体は585塩基からなるオープン読み取
り枠を表わし；その中の斜線を施した箱は成熟ヒトIGF-
1ペプチドをコードするDNA配列を表わし；細線は、1136
ヌクレオチドcDNAの５′側及び３′側にある非翻訳領域
を表わす。ヒトIGF-1B cDNAの地図の下に、λIGF-2及び
λIGF-5として表わした代表的なcDNAクローンがある。
λIGF-5に付した“A42”は42個のアデノシン（Ａ）から
なるポリＡコード配列を表わす。 第２図はIGF-1B cDNA（1136ヌクレオチド）及びヌクレ
オチド183からはじまり、585塩基からなるオープン読み
取り枠（例えばppIGF-1Bアミノ酸配列）の翻訳を描写す
る。終結コドンは＃＃＃及び＊＊＊で表わす。破線で下
線した領域は、成熟ヒトIGF-Iペプチドをコードするヌ
クレオチド（ヌクレオチド327からヌクレオチド536）及
びそれに付属した成熟ヒトIGF-Iを表わす。実線で下線
した領域はカルボキシル−末端延長ペプチドをコードす
るヌクレオチド及び上記延長ペプチドに付属するアミノ
酸配列を表わす。 第３図（ａ）はヒトIGF-I遺伝子の構造及び制限地図を
描写する。５′から３′に向いた矢印はこのIGF-I遺伝
子の５′から３′への方向を示す。細線はイントロン及
びフランキング領域を表わし；∬は分子クローニングに
よつて単離されなかつた領域を表わし；黒塗りの箱（1,
2,3,4,5）はコーデイング領域を表し又斜線を施した箱
は非コーデイング領域を表わし；エキソン４及び５の下
にある垂直の矢印はポリアデニル化部位を表わす。“Al
u"と記した領域はAlu型中度反復DNAへのハイブリツド形
成を表わす。制限部位は、“B"＝BamHI、“E"＝EcoRI、
“H"＝HindIIIによつて表わされている。制限地図の下
に示したのは代表的なゲノム−クローンである。 同（ｂ）はIGF-Iエキソン１から５に関する詳細な制限
地図を描写する。水平の矢印はDNA配列決定の戦略を表
わし；箱はエキソンを表わすが、その際黒塗りの領域は
コード領域を表わし、斜線を施した領域は非コード領域
を表わす。エキソン４及び５の下にある垂直の矢印はポ
リアデニル化部位を表わす。 第４図はヒトIGF-I遺伝子のDNA配列を描写する。エキソ
ンは大文字にしてあり、イントロン及びフランキングDN
Aは小文字にしてある。ppIGF-I蛋白質の翻訳（例えば、
ppIGF-1A及びppIGF-1Bのアミノ酸配列）も示されてお
り、pIGF-1A及びpIGF-1Bのカルボキシル−末端延長部は
それぞれ1A及び1Bと標識した実線の上線で表わされてい
る。成熟IGF-Iの70アミノ酸は破線の下線で表わされて
いる。枠内翻訳終結コドン、TGA及びTAAは、翻訳開始信
号コドンATGに先行するものも含めて＊＊＊で表わされ
ている。推定上の転写開始部位は∧∧によつて表わされ
ている。エキソン４及び５に於てポリアデニル化信号AA
TATTは実線の上線で表わされており、それに続くポリＡ
付加部位は“poly A∧”でそれぞれ表わしてある。点線
は配列が決つていない領域を表わし、その長さはその中
にkb（キロ塩基）で記されている。 第５図はIGF-1A及びIGF-1BのcDNA配列を描写する。上段
はIGF-1Bに相当する。下段はIGF-1Aに相当する。末端
（５′及び３′）ヌクレオチドは“X"で表わしてある。 第６図はppIGF-1B蛋白質のアミノ酸配列を描写する。
2）からカルボキシ末端（COOH）へ向つて読むようにし
て与えられている。DNA配列は５′から３′の方向に与
えられている。問題となる制限エンドヌクレアーゼ部位
も示されている。下記に記載するように記号が付してあ
るDNA領域は図示の目的の為のみであつて、特に断らな
い限り一定の尺度で描かれてはいない。５′から３′に
向けてのDNA配列又はアミノ末端からカルボキシ末端へ
のアミノ酸配列に関する番号付けは図示の目的の為のみ
である。 第１図はヒトIGF-1BのcDNAクローンに関する地図を描写
する。水平の矢印はcDNA配列決定の為の攻め方を表わ
す：白抜きの箱全体は585塩基からなるオープン読み取
り枠を表わし；その中の斜線を施した箱は成熟ヒトIGF-
1ペプチドをコードするDNA配列を表わし；細線は、1136
ヌクレオチドcDNAの５′側及び３′側にある非翻訳領域
を表わす。ヒトIGF-1B cDNAの地図の下に、λIGF-2及び
λIGF-5として表わした代表的なcDNAクローンがある。
λIGF-5に付した“A42”は42個のアデノシン（Ａ）から
なるポリＡコード配列を表わす。 第２図はIGF-1B cDNA（1136ヌクレオチド）及びヌクレ
オチド183からはじまり、585塩基からなるオープン読み
取り枠（例えばppIGF-1Bアミノ酸配列）の翻訳を描写す
る。終結コドンは＃＃＃及び＊＊＊で表わす。破線で下
線した領域は、成熟ヒトIGF-Iペプチドをコードするヌ
クレオチド（ヌクレオチド327からヌクレオチド536）及
びそれに付属した成熟ヒトIGF-Iを表わす。実線で下線
した領域はカルボキシル−末端延長ペプチドをコードす
るヌクレオチド及び上記延長ペプチドに付属するアミノ
酸配列を表わす。 第３図（ａ）はヒトIGF-I遺伝子の構造及び制限地図を
描写する。５′から３′に向いた矢印はこのIGF-I遺伝
子の５′から３′への方向を示す。細線はイントロン及
びフランキング領域を表わし；∬は分子クローニングに
よつて単離されなかつた領域を表わし；黒塗りの箱（1,
2,3,4,5）はコーデイング領域を表し又斜線を施した箱
は非コーデイング領域を表わし；エキソン４及び５の下
にある垂直の矢印はポリアデニル化部位を表わす。“Al
u"と記した領域はAlu型中度反復DNAへのハイブリツド形
成を表わす。制限部位は、“B"＝BamHI、“E"＝EcoRI、
“H"＝HindIIIによつて表わされている。制限地図の下
に示したのは代表的なゲノム−クローンである。 同（ｂ）はIGF-Iエキソン１から５に関する詳細な制限
地図を描写する。水平の矢印はDNA配列決定の戦略を表
わし；箱はエキソンを表わすが、その際黒塗りの領域は
コード領域を表わし、斜線を施した領域は非コード領域
を表わす。エキソン４及び５の下にある垂直の矢印はポ
リアデニル化部位を表わす。 第４図はヒトIGF-I遺伝子のDNA配列を描写する。エキソ
ンは大文字にしてあり、イントロン及びフランキングDN
Aは小文字にしてある。ppIGF-I蛋白質の翻訳（例えば、
ppIGF-1A及びppIGF-1Bのアミノ酸配列）も示されてお
り、pIGF-1A及びpIGF-1Bのカルボキシル−末端延長部は
それぞれ1A及び1Bと標識した実線の上線で表わされてい
る。成熟IGF-Iの70アミノ酸は破線の下線で表わされて
いる。枠内翻訳終結コドン、TGA及びTAAは、翻訳開始信
号コドンATGに先行するものも含めて＊＊＊で表わされ
ている。推定上の転写開始部位は∧∧によつて表わされ
ている。エキソン４及び５に於てポリアデニル化信号AA
TATTは実線の上線で表わされており、それに続くポリＡ
付加部位は“poly A∧”でそれぞれ表わしてある。点線
は配列が決つていない領域を表わし、その長さはその中
にkb（キロ塩基）で記されている。 第５図はIGF-1A及びIGF-1BのcDNA配列を描写する。上段
はIGF-1Bに相当する。下段はIGF-1Aに相当する。末端
（５′及び３′）ヌクレオチドは“X"で表わしてある。 第６図はppIGF-1B蛋白質のアミノ酸配列を描写する。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ
Claims (6)
- 【請求項１】下記のアミノ酸配列より成る実質的に純粋
なプレプロインスリン様成長因子−Ｉ蛋白質。 - 【請求項２】下記のアミノ酸配列より成るペプチドのア
ミノ末端に、そのカルボキシ末端に於て直接に連結した
実質的に純粋な成熟ヒトインスリン様成長因子−Ｉペプ
チド。 - 【請求項３】下記のアミノ酸配列より成る実質的に純粋
なプレプロインスリン様成長因子−Ｉ蛋白質の治療上有
効な用量をヒトを除く動物に投与することから成る、動
物に於ける成長を促進することを目的とする方法。 - 【請求項４】下記のアミノ酸配列より成る実質的に純粋
なプレプロインスリン様成長因子−Ｉ蛋白質の治療上有
効な用量をウシに投与することよりなる、ウシに於ける
乳汁分泌を増強することを目的とする方法。 - 【請求項５】下記のアミノ酸配列より成る実質的に純粋
なプレプロインスリン様成長因子−Ｉ蛋白質の治療上有
効な用量及び医薬的に容認可能な担体乃至は希釈剤より
成る成長の促進を目的とする治療用組成物。 - 【請求項６】下記のアミノ酸配列より成る実質的に純粋
なプレプロインスリン様成長因子−Ｉ蛋白質の治療的有
効な用量及び医薬的に容認可能な担体乃至は希釈剤より
成るウシに於ける乳汁分泌の増強を目的とする治療用組
成物。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US81666286A | 1986-01-07 | 1986-01-07 | |
| US06/929,671 US4963665A (en) | 1986-01-07 | 1986-11-20 | Human preproinsulin-like growth factor I |
| US929671 | 1986-11-20 | ||
| US816662 | 1992-01-03 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62228285A JPS62228285A (ja) | 1987-10-07 |
| JPH0819158B2 true JPH0819158B2 (ja) | 1996-02-28 |
Family
ID=27124101
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62000969A Expired - Lifetime JPH0819158B2 (ja) | 1986-01-07 | 1987-01-06 | ヒト−プレプロインスリン様成長因子▲ｉ▼ |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0229750B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0819158B2 (ja) |
| KR (1) | KR920005918B1 (ja) |
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