JPH08196294A - 抗体作製方法及び免疫学的測定方法 - Google Patents

抗体作製方法及び免疫学的測定方法

Info

Publication number
JPH08196294A
JPH08196294A JP995595A JP995595A JPH08196294A JP H08196294 A JPH08196294 A JP H08196294A JP 995595 A JP995595 A JP 995595A JP 995595 A JP995595 A JP 995595A JP H08196294 A JPH08196294 A JP H08196294A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
antibody
hapten
pbs
avidin
producing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP995595A
Other languages
English (en)
Inventor
Noriyasu Kuzuhara
憲康 葛原
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Konica Minolta Inc
Original Assignee
Konica Minolta Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Konica Minolta Inc filed Critical Konica Minolta Inc
Priority to JP995595A priority Critical patent/JPH08196294A/ja
Publication of JPH08196294A publication Critical patent/JPH08196294A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【目的】 高感度にハプテンの量を測定できる抗体の提
供と該抗体を用いた免疫学的測定方法の提供。 【構成】 ビオチンを結合したハプテン及びアビジンま
たはストレプトアビジンからなる免疫原を用いて免疫す
ることを特徴とする抗体作製方法。ビオチンを結合した
ハプテン及びアビジンまたはストレプトアビジンの結合
体を固定化した抗原と被検液中のハプテンを上記抗体と
競合反応させることにより被検液中のハプテンを定量す
ることを特徴とする免疫学的測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、それ自身では免疫原性
がない低分子化合物（ハプテン）を担体（通常蛋白質の
ような高分子化合物）と結合させた形で動物に対して免
疫感作をおこなうことにより当該ハプテン部分に対する
抗体作製方法及び該抗体を用いた免疫学的測定方法に関
する。さらに詳しくは、ビオチン化抗原を用いた抗体作
製方法及び該抗体を用いた免疫学的測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】低分子化合物（ハプテン）はそれ自身で
は免疫原性がないため担体（通常蛋白質のような高分子
化合物）と結合させた形で動物に対して免疫感作をおこ
なうことにより当該ハプテン部分に対する抗体を産生さ
せることが出来る。そのための方法としては、「エンザ
イムイムノアッセイ：生化学実験法11／P.TIJSSEN著、
石川栄治 監訳」に詳しい。
【０００３】これらの代表的方法を下記に示す。
【０００４】免疫原としては担体１分子あたり一定数、
例えばBSA（ウシ血清アルブミン）１分子につき８〜25
のハプテン分子が結合しているのが最適と云われてい
る。一般に担体としては、動物（特にウシ）血清アルブ
ミン、スカシガイヘモシアニン（KLH）、オボアルブミ
ン（OVA）、チログロブリン、フィブリノーゲンなどの
蛋白質が挙げられる。ハプテンと蛋白質は、それぞれの
官能基により結合される。そして、ハプテンとの結合に
用いる蛋白質の官能基は、ε-およびα-アミノ基（pKa1
0.8）、フェノール基、スルフヒドリル基、イミダゾー
ル基、カルボキシル基などが挙げられる。ハプテンと蛋
白質分子を架橋するために用いる架橋試薬（または方
法）としては、カルボキシル基活性化方法として、混合
酸無水物法、カルボジイミド法、NHS（N-ヒドロキシス
クシンイミド）エステル法などがあり、アミノ基活性化
方法として、グルタルアルデヒド法（１段階または２段
階）、NHS法（マレイミド：スクシンイミド、スクシン
イミド：スクシンイミド、スクシンイミド：2-ピリジル
チオプロピオネート等）などがあり、チオール基活性化
方法としてマレイミド法などがある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】ハプテンの測定（定
量）を行うために競合法によるEIA（酵素免疫測定法）
を行う際に固相化抗原を用いる場合、測定の感度は固相
化抗原の濃度、抗体の濃度によって敏感に影響を受けて
しまう。とりわけ固相化抗原の濃度は相関が強く、シグ
ナルが得られる範囲で可能な限り薄い方がハプテンの検
出感度は向上する。逆に言えば固相化抗原の濃度により
測定系は感度変化が生ずるため固相化抗原量の管理は当
該測定系においてはその安定性・信頼性のためには非常
に重要な問題である。固相化抗原量の制御は通常蛋白量
により管理することが可能である。しかしながら、ハプ
テン結合したキャリアータンパクはタンパク量の管理と
は別にハプテン結合量を制御しなくてはならない。しか
も、通常ハプテン分子の結合量は完全に制御することは
出来ず、通常表される結合量比は平均値にすぎない。更
に悪いことには、通常ハプテン結合したキャリアータン
パクは１分子あたり数分子以上のハプテンを結合してい
るため、タンパク濃度を低くして固定化しない限り感度
低下を招くこととなる。タンパク濃度を低くすると今度
はその結合量制御の精度が低下してしまう。
【０００６】本発明の目的は、高感度に低濃度のハプテ
ンの量を測定できる抗体の提供と該抗体を用いた免疫学
的測定方法の提供にある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明の上記目的は下記
の構成により達成される。
【０００８】１）ビオチンを結合したハプテン及びアビ
ジンまたはストレプトアビジンからなる免疫原を用いて
免疫することを特徴とする抗体作製方法。
【０００９】２）抗体がモノクローナル抗体であること
を特徴とする前記１記載の抗体作製方法。
【００１０】３）アビジンまたはストレプトアビジンに
対する抗体を含む画分の存在下前記１記載の抗体作製方
法により免疫感作することを特徴とする抗体作製方法。
【００１１】４）アビジンまたはストレプトアビジンに
対する抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とす
る前記３記載の抗体作製方法。
【００１２】５）ビオチンを結合したハプテン及びアビ
ジンまたはストレプトアビジンの結合体を固定化した抗
原と被検液中のハプテンを前記１乃至４のいずれかに記
載された抗体と競合反応させることにより被検液中のハ
プテンを定量することを特徴とする免疫学的測定方法。
【００１３】本発明において、固相化するハプテンは、
ハプテンをビオチン化したものとアビジンの結合体とし
てアビジン１分子あたり２分子相当のハプテンを安定的
に結合させたものを用いる。その際、用いる抗体はハプ
テンをBSAなどのキャリアータンパクにより免疫して得
られたものは特異性、アフィニティの点でビオチン化ハ
プテンとの反応において問題があることがしばしばあ
る。そのため、免疫原としてビオチン化抗原を用いるこ
とによりハプテンに対して反応する抗体を作製する。ま
た、アビジンを担体として用いる際にアビジンに対する
抗体の産生を抑制すべくアビジンにより予め免疫感作し
た同一動物種の抗体を含む分画（例えば抗血清）による
免疫感作する行程を含めると、なお良い。
【００１４】免疫原として目的のハプテンの官能基をも
ちいてビオチンの反応性基と反応を行い、ハプテン-ビ
オチン標識体を得る。その後、当該ハプテン-ビオチン
標識体とアビジンとを（好ましくは予め混合してビオチ
ン-アビジン結合体を調整した後）動物（例えばマウ
ス）に免疫感作する。その場合、好ましくは予め同一動
物種にアビジンにより免疫感作した後採血した抗アビジ
ン抗体を含む分画（例えば抗血清）も免疫感作させると
良い。
【００１５】免疫後、当該動物より抗血清を分離するか
脾臓細胞を分離してミエローマ細胞との融合株を樹立す
るかによりポリクローナル抗体、またはモノクローナル
抗体を得ることが出来る。ポリクローナル抗体の場合に
は同時に生成しているアビジンに対する抗体をアビジン
を固定化したアフィニティクロマトグラフィにより除去
することによりビオチン化ハプテンに対する特異的な抗
体を得ることが可能となる。これを用いて競合法により
ハプテンを免疫測定することにより高感度で正確な測定
が可能となった。
【００１６】本発明において、ハプテンとしては、生理
機能を有すると考えられているビオプテリン誘導体、ネ
オビオプテリン誘導体、例えばビオプテリン又はネオビ
オプテリンの夫々のブテリン環の２位のアミノ基をプロ
ピルアミノに置換したものなどが挙げられる。
【００１７】
【実施例】以下に実施例を示し本発明の詳細な説明を行
うが、これにより限定されるものではない。
【００１８】実施例１ ビオチン化BP誘導体の調製 特開平3-90081号記載の方法により、2-(3-アミノプロピ
ルアミノ)-4-ヒドロキシ-6-(1,2-ジヒドロキシプロピ
ル)プテリジン（以後ＢＰ誘導体と省略する）を合成し
て、ビオチン-スクシンイミドエステル（ビオチン-NH
S）との反応に用いた。該BP誘導体を0.1Ｍ炭酸緩衝液
（pＨ8.3）に溶解して１mg／mlとして、一方ビオチン-N
HSをジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解して３mg／30
0μlとして両者を混合して室温で３時間放置した。これ
をHPLCにより分離した。溶離条件／カラム：ODS−80TS
（6.5×250mm）（東ソー株式会社製）、流速：1.0ml／m
in、グラジエント：水100％→メタノール100％（リニ
ア）、検出：UV280nm，FS.EX350nm・EM455nm。BP誘導体
は34分時点、BP−ビオチン（BP−BT）は36分時点に得ら
れた。ただし、反応後未反応BP誘導体は存在しなかっ
た。BP−BTはODS−80TS（21.5×30mm）（東ソー株式会
社製）により分取した。
【００１９】実施例２ モノクローナル抗体の作製 ストレプトアビジン（ザイメット社製）を200μg／mlの
濃度のPBS溶液として完全フロインドアジュバントと等
量混合して乳化させた。これをBALB／ｃマウス（雌、８
週齢）に免疫（腹腔投与）した。該マウスから抗血清約
500μlを得た。
【００２０】１mgのストレプトアビジンと100μgのBP−
BTを２mlPBSに溶解して室温で１時間反応させてBP−BT
・AVを得た。
【００２１】該BP−BT・AV20μgのPBS溶液を完全フロイ
ンド・アジュバントと混合しエマルジョンにしてBALB／
ｃマウス（雌、８週齢）に免疫（腹腔投与）した。３週
間後に不完全フロインド・アジュバントを用いて同様に
追加免疫を行った。この２週間後に採血して、酵素免疫
測定法（ELISA）により抗体価を測定して陽性であるこ
とを確認した後、該マウスから抗血清約500μlを得た。
【００２２】該抗血清をPBSで10倍に希釈して、新たにB
ALB／ｃマウス（雌、８週齢）に300μl／匹を静脈注射
した。次いで30分経過後にBP−BT・AV20μg（PBS溶液）
を完全フロインド・アジュバントと混合しエマルジョン
にして該マウスに免疫（腹腔投与）した。さらに２週間
後に同様にして該抗血清を静脈注射した後、不完全フロ
インド・アジュバント）を用いてm−ATを同量投与し
た。この投与の２週間後に採血して、酵素免疫測定法
（ELISA）により抗体価を測定して陽性であることを確
認した後、PBSに溶解したm−AT試料300μgを静脈注射し
た。３日後、該マウスより脾臓を摘出し以下のように細
胞融合を行った。
【００２３】免疫されたマウスから脾臓を無菌的に摘出
し、ステンレスメッシュにより単細胞にほぐし、脾細胞
の1/5量のマウスミエローマ細胞株Ｐ３×63−Ag８−653
細胞とRPMI1640培地（日水製薬製）を混合し遠心分離
後、細胞のペレットに50％ポリエチレングリコール1500
（べーリンガー社製）を加え、融合操作を行った。その
後徐々にRPMI1640液で希釈し遠心分離により上清を除去
した融合細胞を、20％牛胎児血清（FCS）を加えたHAT培
地（0.01mMヒポキサンチン、1.6μMチミジン、0.04μM
アミノプテリンを含むRPMI1640培地）に懸濁し、96穴マ
イクロプレートに１ウェルあたり１×105個の細胞をま
き込み５％CO2下37℃で培養した。
【００２４】スクリーニングは、96穴マイクロタイター
プレートに５μg／mlのPBS溶液として各ウェルに50μl
づつ巻き込み固定化（37℃、１時間）したBP−BT・AV，
AVのみのものをPBSで洗浄後、１％BSA／PBSを100μlづ
つ各ウェルに巻き込み37℃１時間で固定化した。該液を
除去後、細胞培養液を50μlづつ添加した。このとき、
固相がBP−BT・AVのものについてはBP（アルドリッチ社
製）を含む（20μg／ml相当）ものと含まないものを比
較した。37℃で１時間反応後PBSにより洗浄し、１％BSA
・PBSに希釈したHRP標識化抗マウスＩｇ（ザイメット社
製）を添加して室温で１時間反応させた。PBSで洗浄後
溶液を除去し、PBSで充分に洗浄した後、基質として濃
度1.5mg／mlのo-フェニレンジアミンを溶解したクエン
酸・リン酸緩衝液（pＨ5.0）（0.02％H2O2を含む）を各
ウェルに100μlづつ添加し発色させた。９Ｎ硫酸50μl
を各ウェルに加えて発色反応を停止し、波長492nmの吸
光度をマイクロプレトリーダーMPRA４（東ソー社製）を
用いて測定した。ここで、固相BP−BT・AVのみに反応
し、BP添加時に反応が阻害されるクローンが目的のクロ
ーンである。
【００２５】こうして得られた、AVには反応せずBP、BP
−BTに反応する抗体を産生するハイブリドーマを限界希
釈法により２回クローニングを行い目的のクローンMJ05
5を得た。
【００２６】（モノクローナル抗体の特徴づけ）モノク
ローナル抗体の抗体クラスとサブクラスは、マウスモノ
クローナル・サブ-アイソタイピングキット（AMERICAN
QUALEX 社製）を使用して決定した。その結果、得られ
たモノクローナル抗体MJ055はIgG１と決定された。
【００２７】（モノクローナル抗体の精製）クローンMJ
055について10％FCSを加えたRPMI1640培地で培養し、遠
心分離（200ｇ，５分間）してRPMI1640培地で洗浄して
再度遠心分離した後RPMI1640で１×107個／mlの濃度に
懸濁した。これを７日前にあらかじめプリスタン（２、
６、10、14-テトラメチルペンタデカン）を注射してお
いたBALB／ｃ系マウスの腹腔に0.5mlづつ接種した。約
２週間後、腹部の膨張したマウスから腹水を採取し、遠
心分離（200ｇ，５分間）により細胞を除去した後、こ
れを硫酸アンモニアムを加えて50％飽和溶液とし、沈澱
を分離してPBSに溶解した。
【００２８】これを３Ｍ塩化カリウムを含む1.5Ｍグリ
シン緩衝液（pＨ8.0）で十分に透析し、プロテインＡカ
ラム（20mm×５mm）（ファルマシア社製）にアプライし
て十分に吸着させた後３Ｍチオシアン酸カリウム・グリ
シン緩衝液で溶出した。
【００２９】実施例３ 抗原の定量（固相抗原競合EIA） 実施例１で得たBP−BTのPBS溶液10μg／mlとAVのPBS溶
液20μg／mlを等量混合して室温で２時間放置した後96
穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）に50μlづ
つ添加して４℃で一晩固定化した。次いでPBS洗浄後、
１％BSA・PBSを150μlづつ添加して37℃で１時間ブロッ
キングを行った。PBS洗浄後１％BSA・PBSにBPを０，0.
1，0.3，0.9，2.7，8.1μg／ml添加したものをそれぞれ
50μlとMJ055を含む１％BSA・PBS溶液50μlを混合して
各ウェルに添加して37℃で１時間反応した。さらにPBS
で洗浄した後、１％BSA・PBSに希釈したHRP標識化抗マ
ウスIg抗体（ザイメット社製）を50μlづつ添加して室
温で１時間反応した。反応終了後、基質として濃度1.5m
g／mlのo-フェニレンジアミンを溶解したクエン酸・リ
ン酸緩衝液（pＨ5.0）（0.02％H2O2を含む）を各ウェル
に100μlづつ添加し発色させた。９Ｎ硫酸50μlを各ウ
ェルに加えて発色反応を停止し、波長492nmの吸光度を
マイクロプレトリーダーMPRA４（東ソー社製）を用いて
測定した。その結果を図１に示す。
【００３０】比較例１ 抗体作製 BSA（シグマ社製）50mgを6.25mlのリン酸緩衝生理食塩
水（PBS）に溶解し、50％グルタルアルデヒド（GA）溶
液25μlを加えて４℃で４時間撹拌して反応させた。こ
れをセファデックスＧ−25（ファルマシア社製）カラム
（10×100mm）にかけてグルタルアルデヒド結合BSA10mg
を得た。これをビオプテリン（BP）（アルドリッチ社
製）2.0mgと混合して４℃で一晩反応させた。反応終了
後、１Ｍグリシン，0.1Ｍトリスを含む水溶液を150μl
添加して更に一晩放置後、PBSで十分に透析してBSA−GA
−BPを得た。得られたBSA−GA−BPを用いて実施例２と
同様に免疫、細胞融合、スクリーニングを行い、得られ
たハイブリドーマをクローニングして安定した抗体産生
クローンMB198を得た。
【００３１】比較例２ 抗原の定量（固相抗原競合EIA） BSA−GA−BPを濃度10μg／mlのPBS溶液として96穴マイ
クロタイタープレート（ヌンク社製）に50μlづつ添加
して４℃で一晩固定化した。次いでPBS洗浄後、１％BSA
・PBSを150μlづつ添加して37℃で１時間ブロッキング
を行った。PBS洗浄後１％BSA・PBSにBPを０，0.1，0.
3，0.9，2.7，8.1μg／ml添加したものをそれぞれ50μl
とMB198を含む１％BSA・PBS溶液50μlを混合して各ウェ
ルに添加して37℃で１時間反応した。さらにPBSで洗浄
した後、１％BSA・PBSに希釈したHRP標識化抗マウスIg
抗体（ザイメット社製）を50μlづつ添加して室温で１
時間反応した。反応終了後、基質として濃度1.5mg／ml
のo-フェニレンジアミンを溶解したクエン酸・リン酸緩
衝液（pＨ5.0）（0.02％H2O2を含む）を各ウェルに100
μlづつ添加し発色させた。９Ｎ硫酸50μlを各ウェルに
加えて発色反応を停止し、波長492nmの吸光度をマイク
ロプレトリーダーMPRA４（東ソー社製）を用いて測定し
た。その結果を図２に示す。
【００３２】図１と図２から、本発明の抗体を用いた図
１はビオプテリンが１ml当たり0.1〜2.7μgの範囲で吸
光度とビオプテリン濃度の間に相関がある。しかし、本
発明外の抗体を用いた図２では感度が低く定量性が十分
ではない。
【００３３】
【発明の効果】本発明により、低濃度のハプテンを効率
よく定量的に測定できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の抗体を用いた場合の抗原濃度と吸光度
の関係を示す図である。
【図２】本発明外の抗体を用いた場合の抗原濃度と吸光
度の関係を示す図である。

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ビオチンを結合したハプテン及びアビジ
    ンまたはストレプトアビジンからなる免疫原を用いて免
    疫することを特徴とする抗体作製方法。
  2. 【請求項２】 抗体がモノクローナル抗体であることを
    特徴とする請求項１記載の抗体作製方法。
  3. 【請求項３】 アビジンまたはストレプトアビジンに対
    する抗体を含む画分の存在下、請求項１記載の抗体作製
    方法により免疫感作することを特徴とする抗体作製方
    法。
  4. 【請求項４】 アビジンまたはストレプトアビジンに対
    する抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする
    請求項３記載の抗体作製方法。
  5. 【請求項５】 ビオチンを結合したハプテン及びアビジ
    ンまたはストレプトアビジンの結合体を固定化した抗原
    と被検液中のハプテンを請求項１乃至４のいずれかに記
    載された抗体と競合反応させることにより被検液中のハ
    プテンを定量することを特徴とする免疫学的測定方法。
JP995595A 1995-01-25 1995-01-25 抗体作製方法及び免疫学的測定方法 Pending JPH08196294A (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP995595A JPH08196294A (ja) 1995-01-25 1995-01-25 抗体作製方法及び免疫学的測定方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP995595A JPH08196294A (ja) 1995-01-25 1995-01-25 抗体作製方法及び免疫学的測定方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH08196294A true JPH08196294A (ja) 1996-08-06

Family

ID=11734384

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP995595A Pending JPH08196294A (ja) 1995-01-25 1995-01-25 抗体作製方法及び免疫学的測定方法

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JPH08196294A (ja)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9970929B2 (en) Voriconazole immunoassays
US20180299436A1 (en) A method, kit and system for preparing an antibody pair and the use of the kit
US11136412B2 (en) Antibodies to symmetrically dimethylated arginine analytes and use thereof
CA2028849A1 (en) Monoclonal antibodies, assay method, reagent kit, sarching method and drug missiles using them
JP2867325B2 (ja) 抗ｐｉｖｋａ−ｉｉ抗体産生ハイブリドーマ及び免疫学的測定方法
JP4183777B2 (ja) インドキシル硫酸誘導体、抗原、抗体及びそれを用いるインドキシル硫酸の検出方法
JPH08196294A (ja) 抗体作製方法及び免疫学的測定方法
WO2001079266A1 (fr) Anticorps anti-recepteur du facteur de croissance du keratinocyte humain
JP4663831B2 (ja) モノクローナル抗体、細胞株及びｎ１，ｎ１２−ジアセチルスペルミンの測定法
EP0404783A1 (en) Immunoassays using monoclonal antibodies directed against natural binding proteins
JPH08211054A (ja) 抗体、抗体作製方法及び免疫学的測定方法
JPH0534353A (ja) ヒト９２ｋＤａゼラチナーゼの免疫学的定量法
JP3149960B2 (ja) ヒト組織因子を定量する方法
JPWO1991006005A1 (ja) Ｄ型バニリルマンデル酸の測定法およびそれに使用する試薬およびキット
JP2712018B2 (ja) モノクローナル抗体
JP2603822B2 (ja) ヒトｉ型プロコラーゲンｃ末端ペプチドの定量用キツト
JP3849001B2 (ja) 抗−２′−デオキシシチジン抗体並びにその製造及び使用
Cernoch et al. Production and analytical characterization of neopterin immunoreagents for biosensor developments
JP4221119B2 (ja) ドウモイ酸に対する特異的抗体及びドウモイ酸の免疫学的分析方法
US6291198B1 (en) Antibody that recognizes pyrazine derivative and method for measuring 1,2-dicarbonyl derivative using said antibody
US20070178544A1 (en) Anti fk778antibodies and high sensitive immunoassay methods
JPH09278800A (ja) メトプレンに特異的なモノクローナル抗体、それを産生するハイブリドーマ、及びメトプレンの測定方法
JPH0192659A (ja) 抗ｆｒ−９００５０６物質抗体、および高感度酵素免疫測定法
JPH09154596A (ja) パラニトロフェノキシ系有機リン化合物に特異的な抗体、その製造方法、及びパラニトロフェノキシ系有機リン化合物の測定方法
Boye et al. Solid-phase iodothyronine-5′-deiodinase (5′-D) assays applied in production of monoclonal antibodies against 5′-D