JPH0820400B2

JPH0820400B2 - バイオセンサ

Info

Publication number: JPH0820400B2
Application number: JP1067064A
Authority: JP
Inventors: 真理子河栗; 真由美藤田; 史朗南海; 孝志飯島
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Holdings Corp
Priority date: 1989-03-17
Filing date: 1989-03-17
Publication date: 1996-03-04
Anticipated expiration: 2011-03-04
Also published as: JPH02245650A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、種々の微量の生体試料中の特定成分につい
て、試料液を希釈することなく迅速かつ簡便に定量する
ことのできるバイオセンサに関する。

従来の技術従来、血液などの生体試料中の特定成分について、試
料液の希釈や攪拌などを行なう事なく簡易に定量しうる
方式として、第５図に示すようなバイオセンサを提案し
た。このバイオセンサは、絶縁性の基板１上にスクリー
ン印刷等の方法でカーボンなどからなる電極2,3を形成
し、前記電極２、３上に親水性高分子と酸化還元酵素と
電子受容体とからなる酵素反応層５を形成したものであ
る。試料液を酵素反応層５へ滴下すると、酸化還元酵素
と電子受容体とが試料液に溶解し、試料液中の基質との
間で酵素反応が進行し電子受容体が還元される。反応終
了後、このとき得られる酸化電流値から試料液中の基質
濃度を求める。

発明が解決しようとする課題この様な従来の構成では、試料液中に還元性の物質が
含有されている場合、反応時に電子受容体と反応したり
電極反応が影響されて応答がばらついた。

課題を解決するための手段本発明は上記課題を解決するために、絶縁性の基板上
に少なくとも測定極と対極とからなる電極系を設け、酵
素及び電子受容体の試料液との反応に際しての物質濃度
変化を電気化学的に前記電極系で検知し、試料液中の基
質濃度を測定するバイオセンサにおいて、前記電極系の
表面に酸化還元酵素と親水性高分子と電子受容体とから
主になる酵素反応層を形成し、さらに妨害物質除去部を
付加するものである。

作用本発明によれば、電極系をも含めたディスポーザブル
タイプのバイオセンサを構成することができ、試料液を
センサに添加することにより、極めて容易に基質濃度を
測定することができる。しかも、試料の添加時に妨害物
質除去部で試料液中の還元性の物質を酸化するため応答
への影響がなくなり、安定した応答が得られる。

実施例以下、本発明の一実施例について説明する。

実施例１バイオセンサの一例として、グルコースセンサについて
説明する。第１図及び第２図は、グルコースセンサの一
例について示したもので、バイオセンサの斜視図と縦断
面図である。ポリエチレンテレフタレートからなる絶縁
性の基板１に、スクリーン印刷により導電性カーボンペ
ーストを印刷し、加熱乾燥することにより、対極２、測
定極３からなる電極系を形成する。次に、電極系を部分
的に覆い、各々の電極２、３の電気化学的に作用する部
分２′、３′を残すように、絶縁性ペーストを前記と同
様に印刷し、加熱処理をして絶縁層４を形成する。前記
部分２′、３′の表面を覆うようにセルロース系の親水
性高分子の一種であるCMC（カルボキシメチルセルロー
ス）の水溶液を塗布し、45℃で30分乾燥した。得られた
CMC層の上に酸化還元酵素としてグルコースオキシダー
ゼ（GOD）をpH5.6のリン酸緩衝液に溶解したものを塗布
した後、室温で乾燥した。その上に有機溶媒としてトル
エンに電子受容体であるフェリシアン化カリウムの微結
晶を混ぜたものを滴下し、室温で放置してトルエンを気
化させることによりフェリシアン化カリウム層を形成し
た。このようにして、酵素反応層５を形成した。さら
に、電極２の近くに妨害物質除去部６として過ヨウ素酸
カリウムを担持し、試料の供給部とした。

上記のように構成したグルコースセンサに試料液とし
て血清を供給部に10μｌ滴下し、２分後に対極２を基準
にして測定極３にアノード方向へ＋0.6Vのパルス電圧を
印加し５秒後の電流を測定する。血清を添加すると、妨
害物質除去部６として担持されていた過ヨウ素酸カリウ
ムにより血清中の還元物質であるアスコルビン酸などが
酸化されて酵素反応層５のフェリシアン化カリウムと反
応するのを妨害する。さらに、妨害物質が除去された血
清によりフェリシアン化カリウムが溶解し、血清中のグ
ルコースが酵素反応層５において酸化される際、フェロ
シアン化カリウムに還元される。そこで、上記のパルス
電圧の印加により、生成したフェロシアン化カリウムの
濃度に基づく酸化電流が得られる。この電流値は基質で
あるグルコースの濃度に対応する。グルコースの標準液
を滴下し応答電流を測定したところ500mg/dlという高濃
度まで良好な直線性が得られた。

つぎに、グルコース標準液に還元性物質の代表として
アスコルビン酸を10mg/dl加え、測定したところ本実施
例のように過ヨウ素酸カリウムのある場合はほとんどア
スコルビン酸の影響がみられなかったが、過ヨウ素酸カ
リウムが無い場合は、グルコース濃度100mg/dlにおいて
約10％も高い応答が得られた。これは、アスコルビン酸
がフェリシアン化カリウムと反応してフェロシアン化カ
リウムが生成し、見かけ上、正の誤差が生じたものと考
えられる。

本実施例によれば、過ヨウ素酸カリウムを妨害物質除
去部６として担持することにより、アスコルビン酸を前
もって酸化して影響を除去することが出来た。

実施例２実施例１に示したようにしてCMC-GOD層を形成した
後、フェリシアン化カリウム層を形成する際トルエンに
界面活性剤としてレシチン（ホスファチジルコリン）を
溶解して1wt％溶液を調製し、これにフェリシアン化カ
リウムの微結晶を混ぜたものを用いてフェリシアン化カ
リウムとレシチンの層を形成した。こうして、本実施例
の酵素反応層を設けた。

レシチンの濃度が0.01wt％以上になるとフェリシアン
化カリウムがうまくトルエン中で分散したため滴下が容
易となり、３μｌの微量な液でも薄膜状のフェリシアン
化カリウム−レシチン層が形成できた。レシチンがない
場合は、フェリシアン化カリウム層が不均一に形成され
たり基板をまげるとはがれるという欠点が見られたが、
レシチンを添加することにより均一ではがれにくいフェ
リシアン化カリウム層が容易に形成できた。レシチンの
濃度が高くなるとともに、フェリシアン化カリウム層が
はがれにくくなるが、フェリシアン化カリウムの溶解速
度も落ちるため、0.01−3wt％が適当と考えられる。

上記センサにグルコース標準液を滴下して実施例１と
同様にして応答を測定したところ、グルコース濃度500m
g/dlまで直線性が得られた。さらに、血液を滴下したと
ころ、レシチン層によりすみやかにひろがり反応が始ま
ったため、６μｌという微量のサンプルでも再現性のよ
い応答が得られた。サンプルが少量になると、妨害物質
除去部としての過ヨウ素酸カリウムの担持量も少なくて
効果がみられた。

レシチンのかわりにポリエチレングルコースアルキル
フェニルエーテル（商品名：トルエンＸ）を用いたとこ
ろ、フェリシアン化カリウムの微粒子をトルエン中に分
散させるためには0.1％以上必要であったが、レシチン
と同様に良好なフェリシアン化カリウム層が形成でき
た。界面活性剤としては、前記の例の他に、オレイン酸
やポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステルやシク
ロデキストリンなど、電子受容体を有機溶媒に分散さ
せ、かつ酵素活性に影響をおよぼさないものであれば、
特に制限されることはない。

親水性高分子としてCMCの他にもゼラチンやメチルセ
ルロースなども使用でき、でんぷん系、カルボキシメチ
ルセルロース系、ゼラチン系、アクリル酸塩系、ビニル
アルコール系、ビニルプロリドン系、無水マレイン酸系
のものが好ましい。これらの高分子は容易に水溶液とす
ることができるので、適当な濃度の水溶液を塗布、乾燥
することにより、必要な厚さの薄膜を電極上に形成する
ことができる。

電子受容体を混合する有機溶媒としては、トルエンや
石油エーテルなど、GOD活性および印刷電極への影響の
少ないものであればよい。

電極系を形成する方法としてのスクリーン印刷は、均
一な特性を有するディスポーザブルタイプのバイオセン
サを安価に製造することができ、特に、価格が安く、し
かも安定した電極材料であるカーボンを用いて電極を形
成するのに好都合な方法である。

試料中の還元性物質を酸化する物質としては、過ヨウ
素酸カリウムの他に、活性酸化マンガン、塩化鉄、Ｐ−
ベンゾキノン等が効果があった。上記の物質は、酸化力
はあるが、反応が穏やかで、酵素反応層への影響が少な
かった。

実施例３試料液として、血液や血清を用いる場合、還元性の物
質の主なものは、アスコルビン酸であることが知られて
いる。そこで、血糖を測定するセンサの試料供給部にア
スコルビン酸オキシダーゼおよびカタラーゼを担持し
た。

血清を滴下すると、試料中のアスコルビン酸がアスコ
ルビン酸オキシダーゼにより酸化され、過酸化水素が生
成し、カタラーゼにより分解される。そのため、アスコ
ルビン酸の影響なしに血糖の測定が可能となった。酵素
を用いているために、温和な状態で、速やかにアスコル
ビン酸の選択的な除去ができ、酵素反応層へ与える影響
も少なかった。アスコルビン酸オキシダーゼおよびカタ
ラーゼは同時に架橋して固定化して担持することができ
るため、血清や血液が滴下されたとき溶け出さないで反
応し、グルコースセンサの酵素反応層や電極部に妨害を
与えることがなかった。尿酸に対してはアスコルビン酸
オキシダーゼの代わりにウリカーゼを用いることでその
影響を除去することができた。

実施例４実施例２に示した構成のセンサに第３図に示すように
カバー７をつけた。このカバーの試料供給部にアスコル
ビン酸オキシダーゼ及びカタラーゼを固定化して担持し
界面活性剤を付加した。血液をカバー７の試料供給部に
供給すると、界面活性剤によりすみやかに妨害物質除去
部６に導入され固定化された上記酵素と反応後、電極部
２、３に広がり、酵素反応層５で反応が進み再現の良い
応答が得られた。カバー７内の容積を小さくすること
で、サンプル量およびアスコルビン酸オキシダーゼとカ
タラーゼの担持量を微量にすることができた。さらに、
カバー７で囲むことにより、外気と遮断できるため、カ
バー７内の試料の蒸発を防ぐことが出来た。

実施例５実施例４に示したカバー付のバイオセンサにおいて、
その試料供給口をアスコルビン酸オキシダーゼ及びカタ
ラーゼを固定化したナイロン不織布で第４図のようにふ
さいだ。血液を試料供給口へ付着させるとナイロン不織
布を通過して酵素反応層５へ流れた。そのあいだに、試
料中のアスコルビン酸が反応して除去されるとともに血
球などの大きな分子がナイロン不織布に吸着して除去さ
れ試料の粘度が下がるため、反応速度が増した。妨害物
質の担体としては、ナイロン不織布の他にパルプ、ガラ
ス繊維、ポリカーボネート多孔体膜などが使用できた。

なお、本発明のバイオセンサは上記実施例に示したグ
ルコースセンサに限らず、アルコールセンサやコレステ
ロールセンサなど、酸化還元酵素の関与する系に用いる
ことができる。酸化還元酵素として上記実施例ではグル
コースオキシダーゼを用いたが、他の酵素、たとえばア
ルコールオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、
キサンチンオキシダーゼ、等を用いることができる。ま
た、電子受容体として、上記実施例に用いたフェリシア
ン化カリウムが安定に反応するので適しているがＰ−ベ
ンゾキノンを使えば、反応速度が大きいので高速化に適
している。また、2,6−ジクロロフェノールインドフェ
ノール、メチレンブルー、フェナジンメトサンフェー
ト、β−ナフトキノン４−スルホン酸カリウム、フェロ
セン等が使用できる発明の効果このように本発明のバイオセンサは、絶縁性の基板上
に電極系を印刷し、酸化還元酵素と親水性高分子及び電
子受容体からなる酵素反応層を形成し、さらに、妨害物
質除去部として溶解して酸化反応をする物質を付加した
り、酵素を担持することにより、あらかじめ生体試料中
に存在する還元性の物質は除去して極めて容易に生体試
料中の基質濃度を測定することができ、測定精度を向上
させたものである。

また、電子受容体層を形成するとき界面活性剤を添加
することにより、微量の電子受容体と均一にかつはがれ
にくい薄膜層に担持でき、保存性や大量生産に大きな効
果がある。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例におけるバイオセンサの斜視
図、第２図、第３図、第４図は同バイオセンサの縦断面
図、第５図は従来例のバイオセンサの縦断面図である。１……基板、２……対極、３……測定極、４……絶縁
層、５……酵素反応層、６……妨害物質除去部、７……
カバー。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者飯島孝志大阪府門真市大字門真1006番地松下電器産業株式会社内 (56)参考文献特開昭63−58149（ＪＰ，Ａ) 特開昭64−66559（ＪＰ，Ａ) 特開昭61−210939（ＪＰ，Ａ) 特開昭62−64940（ＪＰ，Ａ) 特開昭60−173457（ＪＰ，Ａ) 特開昭60−24444（ＪＰ，Ａ) 特開昭61−294351（ＪＰ，Ａ) 特開昭60−173458（ＪＰ，Ａ) 特開昭64−54345（ＪＰ，Ａ) 特開昭62−232554（ＪＰ，Ａ)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】少なくとも測定極と対極とからなる電極系
を設けた絶縁性の基板を備え、前記電極系の表面に酸化
還元酵素と親水性高分子と電子受容体とから主になる酵
素反応層を設け、さらに、妨害物質除去部を付加し、前
記酵素と電子受容体と試料液の反応に際しての物質濃度
変化を電気化学的に前記電極系で検知し前記基質濃度を
測定するように構成したことを特徴とするバイオセン
サ。
【請求項２】少なくとも測定極と対極とからなる電極系
を設けた絶縁性の基板を備え、前記電極系の表面に酸化
還元酵素と親水性高分子と界面活性剤を含有した電子受
容体とから主になる酵素反応層を設け、さらに、妨害物
質除去部を付加し、前記酵素と電子受容体と試料液の反
応に際しての物質濃度変化を電気化学的に前記電極系で
検知し前記基質濃度を測定するように構成したことを特
徴とするバイオセンサ。
【請求項３】妨害物質除去部が酸化力を有する物質から
なる請求項１または２記載のバイオセンサ。
【請求項４】妨害物質除去部に酵素を担持した請求項１
または２記載のバイオセンサ。
【請求項５】妨害物質除去部の酵素が固定化されている
請求項４記載のバイオセンサ。
【請求項６】電極系が、絶縁性の基板上にスクリーン印
刷で形成されたカーボンを主体とする材料からなる請求
項１または２記載のバイオセンサ。
【請求項７】電極系の上に、酵素反応層及び妨害物質除
去部を内側に含むようにカバーを設置した請求項１また
は２記載のバイオセンサ。