JPH09297121A

JPH09297121A - コレステロールセンサ

Info

Publication number: JPH09297121A
Application number: JP8341001A
Authority: JP
Inventors: Tomohiro Yamamoto; 智浩山本; Makoto Ikeda; 信池田; Toshihiko Yoshioka; 俊彦吉岡; Shiro Nankai; 史朗南海; Jiyunko Iwata; 潤子岩田
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Holdings Corp
Priority date: 1996-03-07
Filing date: 1996-12-20
Publication date: 1997-11-18

Abstract

(57)【要約】【課題】血清中のコレステロール濃度を短時間で、高
精度な測定ができるセンサを提供することを目的とす
る。【解決手段】絶縁性の基板、基板上に設けられた測定
極および対極を含む電極系、基板上に配されて基板との
間に基板端部から前記電極系への試料液供給路を形成す
る溝を有するカバー部材、および前記試料液供給路に露
出する部分に設けられた反応試薬系を含む反応層を具備
し、前記反応試薬系中に少なくともコレステロールデヒ
ドロゲナーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド、および電子メディエーターを含むコレステロールセ
ンサ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、試料中のコレステ
ロールについて、迅速かつ高精度な定量を簡便に実施す
ることができるコレステロールセンサに関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、試料中の特定成分について、試料
液の希釈や攪拌などを行うことなく簡易に定量する方式
として、様々なバイオセンサが提案されている。バイオ
センサの一例として、まずグルコースセンサを説明す
る。酵素電極を用いたグルコースの定量方法としては、
グルコースオキシダーゼと酸素電極あるいは過酸化水素
電極とを組み合わせた方式が一般に知られている。グル
コースオキシダーゼは、酸素を電子メディエーターとし
て基質であるβーＤ−グルコースをＤ−グルコノーδー
ラクトンに選択的に酸化する。この反応にともない、酸
素は過酸化水素に還元される。このときの酸素消費量を
酸素電極によって測定するか、もしくは過酸化水素の生
成量を白金電極等を用いた過酸化水素電極によって測定
することによりグルコースの定量が行われる。

【０００３】しかし、上記の方法では、酸素のない条件
下では測定が不可能である。そこで、酸素を電子メディ
エーターとして用いず、フェリシアン化カリウム、フェ
ロセン誘導体、キノン誘導体等の金属錯体や有機化合物
を電子メディエーターとして用いるタイプのグルコース
センサが開発されている。このタイプのセンサでは、酵
素反応の結果生じた電子メディエーターの還元体を電極
で酸化することにより、その酸化電流からグルコース濃
度が求められる。この手法は、グルコースに限らず他の
基質の定量にも広く応用されている。

【０００４】この種のバイオセンサの一例として、次の
ようなグルコースセンサが知られている（特開平２−０
６２９５２号公報）。すなわち、絶縁性の基板上にスク
リーン印刷等の方法で測定極、対極および参照極からな
る電極系を形成し、この電極系上に、電極系に接して反
応試薬系として、親水性高分子と酸化還元酵素と電子メ
ディエーター、必要に応じて加えた緩衝剤を含む反応層
を形成したものである。基質を含む試料液を反応層上へ
滴下すると、反応層が溶解し、緩衝剤の緩衝作用により
最も高い酵素活性の得られるｐＨに調整され、酵素と基
質が反応し、さらに電子メディエーターが還元される。
酵素反応終了後、この還元された電子メディエーターを
電気化学的に酸化し、このとき得られる酸化電流値から
試料液中の基質濃度を求めるものである。

【０００５】このようなバイオセンサは、測定対象物質
を基質とする酵素を用いることで、様々な物質に対する
測定が原理的には可能である。酸化還元酵素にコレステ
ロールオキシダーゼを用いれば、血清中のコレステロー
ルを測定するバイオセンサを構成することができる。し
かし、診断指針として用いられる血清コレステロール値
は、コレステロールと、コレステロールエステルの濃度
を合計したものである。コレステロールエステルはコレ
ステロールオキシダーゼによる酸化反応の基質になるこ
とができないので、診断指針としての血清コレステロー
ル値を測定するためには、コレステロールエステルをコ
レステロールに変化させる過程が必要である。この過程
を触媒する酵素として、コレステロールエステラーゼが
知られている。そこで、現在使用されている方法は、次
の一般反応式に基づいて行われる。

【０００６】

【化１】

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】ところが上に示したよ
うな、コレステロールオキシダーゼによってコレステロ
ールを酸化させる反応において、酸素以外の化合物を電
子メディエーターとして用いた場合、酸素と酵素間の二
次反応速度が電子メディエーターと酵素間の二次反応速
度に比べて大きいために、試料液中に酸素が溶存した場
合、電極から得られる電子メディエーターの酸化電流値
は、試料液中の基質の酸化反応がすべて電子メディエー
ターの還元反応と共役した場合に得られると予想される
数値より低くなる傾向にあった。このため、特に試料液
中の基質濃度が低いときの応答が正確ではない場合があ
るという問題を有していた。また、反応に要する時間が
長くなるという問題もあり、これを避けるためにコレス
テロールオキシダーゼの担持量を増加させると、製造コ
ストの増加を招き、また、センサに担持される試薬量の
増加は、センサの構成を物理的に困難にするという問題
があった。

【０００８】本発明は、このような問題点を解決するも
ので、高速かつ高精度な定量が可能なコレステロールセ
ンサを提供することを目的とするものである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】この目的を達成するため
に本発明のコレステロールセンサは、測定極と対極を有
する電極系、および反応試薬系を具備し、反応試薬系に
少なくともコレステロールデヒドロゲナーゼ、ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド、および電子メディエー
ターを含む構成を有する。この構成により、酸素の影響
を受けることなく、迅速にコレステロール濃度を測定で
きるバイオセンサを得ることができる。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明のコレステロールセンサ
は、上記の反応試薬を溶液とし、この溶液中に電極系を
浸漬する構成とすることができるが、反応試薬を乾燥状
態で電極系上またはその近傍に配置した構成とすること
により、安価に作製することができ、かつ使用が簡便な
コレステロールセンサを得ることができる。すなわち、
絶縁性の基板、前記基板上に設けられた測定極および対
極を含む電極系、並びに前記基板上に配されて基板との
間に基板端部から前記電極系への試料液供給路を形成す
る溝を有するカバー部材によりセンサ本体を構成し、前
記試料液供給路に露出する部分に反応試薬系を含む反応
層を形成するのである。

【００１１】このような構成のコレステロールセンサに
ついて、反応層の配置に関しいくつかの好ましい形態を
以下に説明する。第１の構成例は、基板の電極系上に反
応層を有する。この反応層を形成するに際しては、電極
系上にＣＭＣのような親水性高分子の層を形成し、反応
層の構成成分である酵素や電子メディエーターが電極系
表面に直接接触するのを阻止するのが好ましい。これに
よって、電極系表面へのタンパク質の吸着や、フェリシ
アン化カリウムのような酸化能を有する物質の化学的作
用による電極系の特性変化が起こり難くなる。

【００１２】第２の構成例は、反応層が電極系上および
カバー部材側に分割して形成されている。特に、反応試
薬として、高いｐＨ下で比較的不安定な１，２−ナフト
キノン−４−スルホン酸カリウムのような電子メディエ
ーターとトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンー塩
酸（以下、Ｔｒｉｓ塩酸塩と略す）緩衝剤のような緩衝
剤を含む場合は、両者を分離して配置するのが好まし
い。例えば、カバー部材の試料液供給路に露出する部分
に１，２−ナフトキノン−４−スルホン酸カリウムのよ
うな電子メディエーターの層を形成し、基板の電極系上
にはＴｒｉｓ塩酸塩のような緩衝剤を含む反応層を形成
する。

【００１３】第３の構成例は、１，２−ナフトキノン−
４−スルホン酸カリウムのような電子メディエーターと
Ｔｒｉｓ塩酸塩のような緩衝剤が同じ基板上に分割して
形成されている。例えば、電極系上に前記緩衝剤を含む
反応層が形成され、この反応層よりも試料液供給路の開
口部側に１，２−ナフトキノン−４−スルホン酸カリウ
ムのような電子メディエーターを含む層を設ける。後者
の層の下地に親水性高分子の層を形成するか、またはそ
れらの層に親水性高分子を混合するのが好ましい。

【００１４】第４の構成例は、基板上の電極系上には親
水性高分子の層を有し、カバー部材の試料液供給路に露
出する部分に反応層が形成されている。なお、第２およ
び第３の構成例においても、電極系上は親水性高分子の
層で被覆されているのが好ましい。また、第２および第
３の構成例において、カバー部材側に電子メディエータ
ーなどを含む層を形成する際は、その下地に親水性高分
子の層を形成するか、またはそれらの層に親水性高分子
を混合するのが好ましい。また、上記の反応層上または
その近傍にレシチンの層を設けて、電極系への試料液の
導入を円滑にすることが好ましい。

【００１５】本発明において、好ましい電子メディエー
ターとしては、フェリシアン化物、１，２−ナフトキノ
ン−４−スルホン酸、２，６−ジクロロフェノールイン
ドフェノール、ジメチルベンゾキノン、１−メトキシ−
５−メチルフェナジニウムサルフェート、メチレンブル
ー、ガロシアニン、チオニン、フェナジンメトサルフェ
ート、およびメルドラブルーからなる群より選択される
少なくとも一種である。また、反応試薬系中にジアホラ
ーゼを含むことが好ましい。ジアホラーゼは、電子メデ
ィエーターとニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの
還元体との反応を触媒し、測定時間の短縮に役立つ。
１，２−ナフトキノン−４−スルホン酸カリウムのよう
に、ジアホラーゼの触媒作用なしでも、ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチドの還元体と非常に速い酸化還元
反応を行う電子メディエーターを用いる場合は、ジアホ
ラーゼは特に必要としない。反応試薬系中にコレステロ
ールエステラーゼおよび界面活性剤を含むことが好まし
い。

【００１６】

【実施例】以下、本発明の実施例を説明する。《実施例１》図１は本実施例のコレステロールセンサを
示している。１はガラスセルであり、内に攪拌子２を入
れ、スタラーマシン８上に固定されている。ガラスセル
１には、電極固定器具３により、測定極４、対極５、お
よび参照極６がセットされている。測定極４はグラッシ
ーカーボン電極で、また対極５は白金線でそれぞれ構成
されている。参照極６は、銀／塩化銀電極で構成され、
アガロースゲルにＫＣｌ溶液を浸潤させた塩橋を介して
ガラスセルに接続されている。これらの電極は、それぞ
れ定電位設定装置９を介して、記録装置１０に接続され
ている。以上の各要素から測定装置系が構成されてい
る。

【００１７】前記ガラスセル１中には、反応溶液７が満
たされており、反応溶液７は攪拌子２によって攪拌され
る。反応溶液７は、コレステロールデヒドロゲナーゼ
（以下、ＣｈＤＨと略す）、ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド（以下ＮＡＤと略す）、電子メディエータ
ーとしてのフェリシアン化カリウム、およびジアホラー
ゼを含むＴｒｉｓ塩酸塩の緩衝水溶液である。各反応試
薬の望ましい濃度は以下のとおりである。ＣｈＤＨ＝１０ユニット／ｍｌ、ＮＡＤ＝２５ｍＭ／
ｌ、ジアホラーゼ＝２０ユニット／ｍｌ、フェリシアン
化カリウム＝１００ｍＭ／ｌ、Ｔｒｉｓ塩酸塩＝０．３
Ｍ／ｌ。ここにあげた濃度であることが望ましいが、必要に応
じ、使用条件により、一部異なる濃度を用いても、適切
な応答を得ることができる。ｐＨは８．０から９．０の
範囲内であることが望ましい。ｐＨが８．０より低いと
反応所用時間が著しく増加し、またｐＨ９．０以上で
は、コレステロールの単位濃度あたりに対する電流値が
小さくなり、逆に非酵素的な化学反応によると考えられ
る残余電流値が増大する。

【００１８】上記の測定極４には、参照極６に対して５
００ｍＶの電位が印加されている。コレステロールを含
む試料液を電極固定器具３の貫通孔１１より反応溶液７
中に滴下すると、ＣｈＤＨによりコレステロールが酸化
されてコレステノンになり、この反応と共役して、ＮＡ
Ｄが還元され、その還元体であるＮＡＤＨが生成され
る。生成したＮＡＤＨは、フェリシアン化物イオンとの
間に電子の授受を行い、酸化体であるＮＡＤに戻る。フ
ェリシアン化物イオンは、ＮＡＤＨから電子を受け取
り、フェロシアン化物イオンに還元される。このように
して生成されるフェロシアン化物イオンの濃度は、試料
液中のコレステロール濃度に比例する。この酸化還元反
応はジアホラーゼにより触媒される。ジアホラーゼなし
で自発的に反応は進行するが、ジアホラーゼの存在によ
り非常に速く反応を進行させることができる。

【００１９】前述したように、測定極４には参照極６に
対して５００ｍＶの電位が印加されているため、フェロ
シアン化物イオンは測定極４に電子を渡し、フェリシア
ン化物イオンに戻る。なお、測定極４がグラッシーカー
ボン電極で、測定極４近傍の電位が、銀／塩化銀電極に
対して５００ｍＶなので、ＮＡＤＨが測定極４において
電気化学的に酸化される量はきわめて少ないと考えられ
る。測定極４で受け取った電子の移動を電流として観測
することにより、試料液中のコレステロール濃度を定量
することができる。試料液が血清のようにコレステロー
ルエステルを含む場合には、反応溶液７中に前記成分の
他に、さらにコレステロールエステラーゼ、およびコレ
ステロールエステラーゼの触媒性を促進させるための界
面活性剤を添加することにより、コレステロールエステ
ルとコレステロールの濃度の総和を測定することができ
る。

【００２０】本実施例の測定例を図２、および図３に示
す。図２は、電流値の経時変化を記録装置１０により記
録したものであり、図３は、図２の電流値とコレステロ
ール濃度の関係を示したグラフである。これらに示すよ
うに、コレステロールの滴下に伴い電流値が増加し、１
分以内に定常値に達し、電流値とコレステロール濃度は
非常に良好な直線関係を示した。

【００２１】《実施例２》図４は本実施例のコレステロ
ールセンサのうちカバーおよびスペーサを除いた縦断面
図であり、図５は反応層を除いたコレステロールセンサ
の分解斜視図である。１２はポリエチレンテレフタレー
トからなる絶縁性の基板を示す。この基板１２上には、
スクリーン印刷により銀ペーストを印刷してリード１
３、１４を形成してある。基板１２上には、さらに樹脂
バインダーを含む導電性カーボンペーストを印刷するこ
とにより、測定極１５と対極１６を含む電極系、および
絶縁性ペーストを印刷することにより絶縁層１７をそれ
ぞれ形成してある。絶縁層１７は、測定極１５よび対極
１６の露出部分の面積を一定とし、かつリードを部分的
に覆っている。

【００２２】このようにして電極部分を作製した後、電
極系上に、親水性高分子カルボキシメチルセルロースの
ナトリウム塩（以下ＣＭＣと略す）の０．５ｗｔ％水溶
液を滴下し、５０℃の温風乾燥器中で１０分間乾燥さ
せ、ＣＭＣ層１８を形成した。つづいて、ノカルジア由
来のＣｈＤＨを１０ユニット／ｍｌ、補酵素であるＮＡ
Ｄを５０ｍＭ／ｌ、シュ−ドモナス由来の酵素ジアホラ
ーゼを１０ユニット／ｍｌ、電子メディエーターである
フェリシアン化カリウムを５０ｍＭ／ｌ、シュードモナ
ス由来のコレステロールエステラーゼ（以下ＣｈＥと略
す）を１ｋユニット／ｍｌ、界面活性剤であるｎ−オク
チル−β−Ｄ−チオグルコシドを０．５ｗｔ％、および
緩衝剤であるＴｒｉｓ塩酸塩０．３Ｍ／ｌを含む混合水
溶液を、ｐＨ８．５に調整した。この水溶液をＣＭＣ層
１８上に５μｌずつ滴下し、常温乾燥空気器中で３０分
間乾燥させることにより、ＣｈＤＨ−ＣｈＥ−フェリシ
アン化カリウム−界面活性剤−ＮＡＤ−ジアホラーゼ−
緩衝剤層１９を形成した。

【００２３】この場合、ＣＭＣとＣｈＤＨ、ＣｈＥ、フ
ェリシアン化カリウム、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグ
ルコシド、ＮＡＤ、および緩衝剤は、部分的に混合され
た状態で厚さ数ミクロンの薄膜状となっている。すなわ
ち、ＣＭＣ層上に前記水溶液を滴下すると、最初に形成
したＣＭＣ層は一度溶解し、その後の乾燥過程で酵素な
どと混合された形で層を形成する。しかし、攪拌等をと
もなわないため完全な混合状態とはならず、電極系表面
はＣＭＣのみによって被覆された状態となる。このた
め、酵素および電子メディエーターなどが電極系表面に
接触しないから、電極系表面へのタンパク質の吸着や、
フェリシアン化カリウムのような酸化能を有する物質の
化学的作用による電極系の特性変化が起こり難くなる。
その結果、高精度なセンサ応答を有するセンサ得ること
ができる。このＣｈＤＨ−ＣｈＥ−フェリシアン化カリ
ウム−界面活性剤−ＮＡＤ−ジアホラーゼ−緩衝剤層１
９の上に、ホスファチジルコリンの０．５ｗｔ％トルエ
ン溶液を５μｌ滴下して乾燥させ、レシチン層２０を形
成した。このレシチン層を設けることにより、試料溶液
の導入が円滑に行われる。このレシチン層は、酵素反応
には必須ではない。

【００２４】上記のようにしてＣＭＣ層１８、ＣｈＤＨ
−ＣｈＥ−フェリシアン化カリウム−界面活性剤−ＮＡ
Ｄ−ジアホラーゼ−緩衝剤層１９、およびレシチン層２
０からなる反応層を形成した後、カバー２５およびスペ
ーサー２４を図４中、一点鎖線で示すような位置関係を
もって接着することにより、コレステロールセンサが完
成する。こうして組み立てられたセンサは、スペーサー
２４のスリット２６の部分に試料液供給路２８が形成さ
れる。このコレステロールセンサは、試料液をセンサ先
端の試料液供給路２８の開口部に接触させるだけの簡易
操作で、試料液は容易に反応層部分へ導入される。試料
液の供給量は、試料液供給路２８の容積に依存するた
め、あらかじめ定量する必要はない。さらに、測定中の
試料液の蒸発を最小限に抑えることができ、精度の高い
測定が可能となる。なお、図４中、２７はカバー２５に
設けた空気孔である。ここで、カバー２５およびスペー
サー２４に透明な高分子材料を用いると、反応層の状態
や試料液の導入状況を外部から容易に観察することがで
きる。

【００２５】こうして作製したコレステロールセンサ
に、試料液としてコレステロール標準液３μｌを試料液
供給路の開口部より供給し、３分後に対極を基準にして
測定極にアノード方向へ＋０．５Ｖのパルス電圧を印加
し、５秒後の電流値を測定した。試料液が反応層へ到達
すると、レシチン層２０を溶解し、引続きＣｈＤＨ−Ｃ
ｈＥ−フェリシアン化カリウム−界面活性剤−ＮＡＤ−
ジアホラーゼ−緩衝剤層１９を溶解した。試料液中のコ
レステロ−ルエステルは、ＣｈＤＨ−ＣｈＥ−フェリシ
アン化カリウム−界面活性剤−ＮＡＤ−ジアホラーゼ−
緩衝剤層１９中のｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシ
ドにより再分散され、ＣｈＥの触媒作用によりコレステ
ロールになり、コレステロールはＣｈＤＨによって酸化
され、この酸化反応に共役してＮＡＤが還元され、ＮＡ
ＤＨが生じ、ＮＡＤＨはジアホラーゼの触媒作用によ
り、再び酸化されてＮＡＤに戻る。このＮＡＤＨの酸化
反応に共役してフェリシアン化物イオンがフェロシアン
化物イオンに還元される。次に、上記のパルス電圧の印
加により、生成したフェロシアン化物イオンおよび一部
ＮＡＤＨの酸化電流が得られ、この電流値は基質である
コレステロールの濃度に対応する。なお、観測される電
流値には、一部ＮＡＤＨの酸化電流が含まれている可能
性があるが、反応試薬系へのジアホラーゼの添加によ
り、測定所用時間が短縮されることから、ＮＡＤＨの測
定極上での電気化学的な酸化が測定値に占める割合は、
きわめて低いと思われる。

【００２６】《実施例３》実施例２と同様に、基板上の
電極系上にＣＭＣ層１８を形成した。次に、スペーサー
２４とカバー２５を組み合わせることにより、スリット
２６の部分に形成される凹部にもＣＭＣの０．５ｗｔ％
水溶液を滴下し、乾燥させてＣＭＣ層２３を形成した。
このＣＭＣ層２３を覆うようにして、電子メディエータ
ーである１，２−ナフトキノン−４−スルホン酸カリウ
ム（以下ＮＱＳと略す）の５０ｍＭ溶液を５μｌ滴下
し、常温空気中で乾燥させ、ＮＱＳ層２１を形成した。
スペーサー２４とカバー２５を組合せたカバー部材側に
上部反応層を形成する場合、このＣＭＣ層２３がない
と、反応層が剥離し易くなるので、ＣＭＣ層２３を設け
るのが好ましい。ＣＭＣ層２３とＮＱＳ層２１を設ける
かわりに、ＣＭＣ水溶液にＮＱＳを溶解した溶液を滴下
して、ＣＭＣとＮＱＳの両者を含む層を設けることもで
きる。ＮＱＳは、高いｐＨ下で比較的不安定なので、Ｔ
ｒｉｓ塩酸塩のような緩衝剤を含む溶液に溶解して、長
時間放置することができないが、このように緩衝剤と分
離することにより、センサ中に電子メディエーターとし
て組み入れることができる。

【００２７】次に、ノカルジア由来のＣｈＤＨを１０ユ
ニット／ｍｌ、補酵素であるＮＡＤを５０ｍＭ、シュー
ドモナス由来のＣｈＥを１ｋユニット／ｍｌ、界面活性
剤であるｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシドを０．
５ｗｔ％、および緩衝剤であるＴｒｉｓ塩酸塩０．３Ｍ
を含む混合水溶液を、ｐＨ８．５に調整した。この水溶
液を電極系上のＣＭＣ層１８上に５μｌずつ滴下し、常
温乾燥空気中で３０分間乾燥させることにより、ＣｈＤ
Ｈ−ＣｈＥ−界面活性剤−ＮＡＤ−緩衝剤層２２を形成
した。ＮＱＳのように、ジアホラーゼの触媒作用なしで
も、ＮＡＤＨと非常に速い酸化還元反応を行う電子メデ
ィエーターを用いる場合は、本実施例のように、ジアホ
ラーゼを省略できる。測定時間を更に短縮する必要があ
る場合は、本実施例の構成に、ジアホラーゼを加えるこ
ともできる。このＣｈＤＨ−ＣｈＥ−界面活性剤−ＮＡ
Ｄ−緩衝剤層２２の上層に実施例２と同様にホスファチ
ジルコリンの０．５ｗｔ％トルエン溶液を５μｌ滴下
し、乾燥させてレシチン層２０を形成した。以上によう
にしてコレステロールセンサの下部反応層が形成され
る。

【００２８】上記の上部反応層を形成したスペーサーと
カバーの組合せと、下部反応層を形成した絶縁性基板を
組み合わせることによりコレステロールセンサが完成す
る。このようにして得られたコレステロールセンサの構
造を図６に示す。このようにして作製したコレステロー
ルセンサによって得られたコレステロール標準溶液に対
する応答は、コレステロール濃度に対して直線性を示し
た。

【００２９】《実施例４》図７は本実施例のコレステロ
ールセンサの縦断面図である。まず、実施例２と同様に
して基板上の電極系上にＣＭＣ層１８を形成した。さら
に、このＣＭＣ層１８と試料液供給路２８の開口部に相
当する基板先端部との間の、電極部分を被覆しない位置
に、前記ＣＭＣ層１８に接触しないように、ＣＭＣ層１
８と同様にしてＣＭＣ層２９を形成した。このＣＭＣ層
２９とＣＭＣ層１８は、同じものである必要はない。つ
づいて、ノカルジア由来のＣｈＤＨを１０ユニット／ｍ
ｌ、補酵素であるＮＡＤを５０ｍＭ、シュ−ドモナス由
来の酵素ジアホラーゼを１０ユニット／ｍｌ、電子メデ
ィエーターであるフェリシアン化カリウムを５０ｍＭ、
シュードモナス由来のＣｈＥを１ｋユニット／ｍｌ、界
面活性剤であるｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド
を０．５ｗｔ％、および緩衝剤であるＴｒｉｓ塩酸塩
０．３Ｍを含む混合水溶液をｐＨ８．５に調整した。こ
の混合水溶液を５μｌずつ、ＣＭＣ層２９に接触しない
ように、ＣＭＣ層１８上に滴下し、常温乾燥空気器中で
３０分間乾燥させることにより、ＣｈＤＨ−ＣｈＥ−フ
ェリシアン化カリウム−界面活性剤−ＮＡＤ−ジアホラ
ーゼ−緩衝剤層１９を形成した。

【００３０】さらに、ＣＭＣ層２９を覆うようにして、
電子メディエーターであるＮＱＳの５０ｍＭ溶液を５μ
ｌ滴下し、常温空気中で乾燥させ、ＮＱＳ層２１を形成
した。ＣＭＣ層２９とＮＱＳ層２１を設けるかわりに、
ＣＭＣ水溶液にＮＱＳを溶解した溶液を滴下して、ＣＭ
ＣとＮＱＳを含む層を設ることもできる。ＮＱＳは、高
いｐＨ下で比較的不安定なので、Ｔｒｉｓ塩酸塩のよう
な緩衝剤を含む溶液に溶解して、長時間放置することが
できないが、このように緩衝剤と分離することにより、
センサ中に電子メディエーターとして組み入れることが
できる。ＮＱＳ層２１を形成するために前記ＮＱＳ溶液
をＣＭＣ層２９上に滴下する際、ＮＱＳ溶液をＣｈＤＨ
−ＣｈＥ−フェリシアン化カリウム−界面活性剤−ＮＡ
Ｄ−ジアホラーゼ−緩衝剤層１９に接触しないようにす
る必要があるこのＣｈＤＨ−ＣｈＥ−フェリシアン化カリウム−界面
活性剤−ＮＡＤ−ジアホラーゼ−緩衝剤層１９およびＮ
ＱＳ層２１の上に、ホスファチジルコリンの０．５ｗｔ
％トルエン溶液を５μｌ滴下し乾燥させてレシチン層２
０を形成した。このレシチン層を設けることで、試料溶
液の導入が円滑に行われるが、レシチン層は酵素反応に
は必須ではない。また、レシチン層２０は、スペーサー
２４とカバー２５を組み合わせたカバー部材側の凹部、
すなわち試料液供給路に露出する面に形成してもよい。

【００３１】上記のようにしてＣＭＣ層１８、ＣＭＣ層
２９、ＣｈＤＨ−ＣｈＥ−フェリシアン化カリウム−界
面活性剤−ＮＡＤ−ジアホラーゼ−緩衝剤層１９、ＮＱ
Ｓ層２１、レシチン層２０からなる反応層を形成した
後、カバー２５およびスペーサー２４を図４中、一点鎖
線で示すような位置関係をもって接着することにより、
コレステロールセンサが完成する。

【００３２】《実施例５》実施例２と同様にして基板上
の電極系上にＣＭＣの０．５ｗｔ％水溶液を滴下し、乾
燥させてＣＭＣ層１８を形成した。次に、実施例３と同
様にして、スペーサー２４とカバー２５を組み合わせた
カバー部材側の凹部にＣＭＣの０．５ｗｔ％水溶液を滴
下し、乾燥させてＣＭＣ層２３を形成した。つづいて、
ＣｈＤＨを１０ユニット／ｍｌ、ＮＡＤを５０ｍＭ、ジ
アホラーゼを１０ユニット／ｍｌ、電子メディエーター
であるフェリシアン化カリウムを５０ｍＭ、シュードモ
ナス由来のＣｈＥを１ｋユニット／ｍｌ、界面活性剤で
あるｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシドを０．５ｗ
ｔ％、および緩衝剤であるＴｒｉｓ塩酸塩０．３Ｍを含
む混合水溶液をｐＨを８．５に調整した。この混合水溶
液５μｌをＣＭＣ層２３を覆うように滴下し、常温乾燥
空気器中で３０分間乾燥させることにより、ＣｈＤＨ−
ＣｈＥ−フェリシアン化カリウム−界面活性剤−ＮＡＤ
−ジアホラーゼ−緩衝剤層１９を形成した。

【００３３】このようにして反応層を形成したスペーサ
ー２４とカバー２５からなるカバー部材を前記の基板に
接着することによりコレステロールセンサが完成する。
このように、電極部と隔てて反応層を設け、電極表面に
はＣＭＣ層のみを形成する方が、電極表面に反応層を設
けるよりも、単位基質濃度あたりの電流値が高くなる。

【００３４】なお、上記実施例に示した各試薬の担持量
は、実施の一例であり、本発明はこれらによって限定さ
れるものではない。また、実施例２に示したレシチン層
２０のように、本発明のコレステロールセンサには、反
応層の表面に、試料溶液の反応試薬系への導入を容易に
するために脂質を含む層を設けることができる。この用
途に用いる脂質として、上記の実施例に用いたホスファ
チジルコリンの他、ホスファチジルセリン、ホスファチ
ジルエタノールアミン等のリン脂質などの両親媒性脂質
を用いることができる。さらに、反応層を形成するため
の親水性高分子としては、上記の実施例に用いたカルボ
キシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンの他、ポ
リビニルアルコール、水溶性セルロース誘導体、特にエ
チルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース；ゼラ
チン、ポリアクリル酸およびその塩、デンプンおよびそ
の誘導体、無水マレイン酸およびその塩、ポリアクリル
アミド、メタクリレート樹脂、ポリ２ーヒドロキシエチ
ルメタクリレートなどを用いることができる。

【００３５】また、上記実施例中ではＣｈＥとしてシュ
ードモナス類由来のものを用い、界面活性剤として、ｎ
−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシドを用いているが、
シュードモナス類由来のＣｈＥを用いる場合、Ｌｕｂｒ
ｏｌＰＸ、コール酸ナトリウム、ドデシル−β−マル
トシド、ＤＫ−エステルを用いても良好な応答を示す。
また、ＣｈＥとしては、ほ乳類膵臓由来のものを用いる
ことも可能で、この場合、コール酸ナトリウムなどの、
胆汁酸骨格を持つ界面活性剤を用いることで、非常に良
好な応答性を示す。また、上記の実施例２〜５では、測
定極と対極のみの二極電極系について述べたが、参照極
を加えた三電極方式にすれば、より正確な測定が可能で
ある。

【００３６】

【発明の効果】以上のように本発明によれば、酸素の影
響を受けることなく、より短い時間で試料液中のコレス
テロール濃度を測定できるコレステロールセンサが得ら
れる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施例におけるコレステロールセン
サの構成を示す図である。

【図２】同コレステロールセンサによる測定結果の例を
示す図である。

【図３】同コレステロールセンサの測定例におけるコレ
ステロール濃度と電流値の関係を示す図である。

【図４】本発明の他の実施例におけるコレステロールセ
ンサの要部の構成を示す断面図である。

【図５】同コレステロールセンサの反応層を除いた分解
斜視図である。

【図６】本発明のさらに他の実施例におけるコレステロ
ールセンサの要部の構成を示す断面図である。

【図７】本発明のさらに他の実施例におけるコレステロ
ールセンサの要部の構成を示す断面図である。

【図８】本発明のさらに他の実施例におけるコレステロ
ールセンサの要部の構成を示す断面図である。

【符号の説明】

１ガラスセル２攪拌子３電極固定器具４測定極５対極６参照極７反応溶液８スタラーマシン９定電位設定装置１０記録装置１１貫通孔１２絶縁性の基板１３、１４リード１５測定極１６対極１７絶縁層１８ＣＭＣ層１９ＣｈＤＨ−ＣｈＥ−フェリシアン化カリウム−界
面活性剤−ＮＡＤ−ジアホラーゼ−緩衝剤層２０レシチン層２１ＮＱＳ層２２ＣｈＤＨ−ＣｈＥ−界面活性剤−ＮＡＤ−緩衝剤
層２３ＣＭＣ層２４スペーサー２５カバー２６スリット２７空気孔２８試料液供給路

フロントページの続き (72)発明者南海史朗大阪府門真市大字門真1006番地松下電器産業株式会社内 (72)発明者岩田潤子大阪府門真市大字門真1006番地松下電器産業株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】測定極と対極を有する電極系、および反
応試薬系を具備し、前記反応試薬系中に少なくともコレ
ステロールデヒドロゲナーゼ、ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド、および電子メディエーターを含むこと
を特徴とするコレステロールセンサ。
【請求項２】絶縁性の基板、前記基板上に設けられた
測定極および対極を含む電極系、前記基板上に配されて
基板との間に基板端部から前記電極系への試料液供給路
を形成する溝を有するカバー部材、および前記試料液供
給路に露出する部分に設けられた反応試薬系を含む反応
層を具備し、前記反応試薬系中に少なくともコレステロ
ールデヒドロゲナーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド、および電子メディエーターを含むことを特徴
とするコレステロールセンサ。
【請求項３】電子メディエーターが、フェリシアン化
物、１，２−ナフトキノン−４−スルホン酸、２，６−
ジクロロフェノールインドフェノール、ジメチルベンゾ
キノン、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムサル
フェート、メチレンブルー、ガロシアニン、チオニン、
フェナジンメトサルフェート、およびメルドラブルーか
らなる群より選択される少なくとも一種である請求項１
または２に記載のコレステロールセンサ。
【請求項４】前記反応試薬系中にジアホラーゼを含む
請求項１または２に記載のコレステロールセンサ。
【請求項５】前記反応試薬系中にコレステロールエス
テラーゼおよび界面活性剤を含む請求項１または２に記
載のコレステロールセンサ。
【請求項６】前記反応層が、前記電極系上およびカバ
ー部材側に分割して設けられている請求項２に記載のコ
レステロールセンサ。
【請求項７】前記反応層中の少なくとも一部に親水性
高分子を含む層を有する請求項２または６に記載のコレ
ステロールセンサ。
【請求項８】前記反応層中の少なくとも一部に親水性
高分子と電子メディエーターが混合された層を有する請
求項２または６に記載のコレステロールセンサ。