JPH08217793A - ペプチドの製造法及びそれに用いる中間体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 式：Pro-Ser-X-Gly-Asp-Trp-OHで表されるペ
プチドを製造する方法において、Boc-Trp(Z)-OBzl のBo
c基を除去し、Boc-Asp(OBzl)-OHとカップリングさせ、
得られたBoc-Asp(OBzl)-Trp(Z)-OBzl のBoc基を除去
し、Boc-Gly-OHとカップリングさせ、得られたBoc-Gly-
Asp(OBzl)-Trp(Z)-OBzl のBoc基を除去し、Boc-X-OHと
カップリングさせ、得られたBoc-X-Gly-Asp(OBzl)-Trp
(Z)-OBzl のBoc基を除去し、Boc-Ser(Bzl)-OHとカップ
リングさせ、得られたBoc-Ser(Bzl)-X-Gly-Asp(OBzl)-T
rp(Z)-OBzlのBoc基を除去し、Z-Pro-OHとカップリング
させ、得られたZ-Pro-Ser(Bzl)-X-Gly-Asp(OBzl)-Trp
(Z)-OBzlからBzl基及びZ基を除去することを特徴とする
ペプチドの製造法。 【効果】 血小板凝集抑制能力及び安全性に優れたペプ
チドを、液相合成によって多量に製造することができ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、生物活性を有するペプ
チドの製造法及びその製造法において使用される中間体
に関し、特に式：Pro-Ser-X-Gly-Asp-Trp-OHで表される
生物活性ペプチド（特に血小板凝集抑制作用を有するペ
プチド）の製造法及びその製造法において使用される中
間体に関する。

【０００２】

【従来の技術】血液中において、血小板は、損傷した血
管の表面に相互に吸着して、出血を防止するという大き
な役割を演じている。しかしながら、病的な環境下にお
いては、血小板の凝集は血栓が形成される主要な原因と
なり、この血栓が原因で血管が閉塞することが知られて
いる。そしてこの閉塞は、組織や臓器への酸素や栄養分
の十分な供給を妨げ、これが心筋梗塞や脳卒中に代表さ
れる循環器の虚血性疾患の重大な原因となる。そして、
今日においてかかる虚血性疾患は癌に次ぐ死亡率を示
し、大きな社会問題になっている。

【０００３】外科手術時における人工心肺の使用や腎不
全患者の腎透析のように、体外への血液の循環を伴う医
学的処置を行う場合、血液が体外に循環する際にも血小
板活性化と血小板凝集に起因する血液凝固が起こること
があり、これらの処置を実施する上で大きな障害となっ
ている。よって、これらの血栓あるいは血液凝固を防止
することは、上記虚血性疾患の発生、あるいは安全な体
外循環の実施のためには非常に重要な事項である。

【０００４】そこで、従来より血小板凝集抑制剤が用い
られているが、特に体外循環や外科手術時等において、
血小板の凝集能力を一時的にのみ抑える目的で血小板凝
集抑制剤を使用する場合、当該薬剤は血小板凝集抑制能
力に優れていることが望ましいことは言うまでもない
が、それと同時に使用目的に応じた適度な薬効時間を有
し、なおかつ当該薬剤の失活後は副作用のない化合物に
速やかに代謝される安全性に優れた特性を有することが
必要である。

【０００５】我々は、このように血小板凝集抑制能力に
優れ、かつ天然のペプチドに可能な限り近い構造を有
し、生体内に投与した場合、適度な薬効時間の後、速や
かに副作用の無い化合物に代謝されて活性を消失すると
いう安全性に優れた特性を持つペプチドを用いた血小板
凝集抑制剤を、特願平6-235745号に提案している。その
中でも、特に式：Pro-Ser-X-Gly-Asp-Trp-OHで表される
ペプチドは高活性である。しかしながら、上記ペプチド
の製造法として特願平6-235745号に具体的に記載した方
法は固相合成法であり、多量スケールでの合成には適し
ていない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、血小
板凝集抑制能力及び安全性に優れた式：Pro-Ser-X-Gly-
Asp-Trp-OHで表されるペプチドを、液相合成法によって
多量に製造し得る方法を提供することである。また、本
発明の別の課題は、上記ペプチドを製造するのに有用な
中間体を提供することである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上記課題に鑑み鋭意研究
の結果、本発明者らは、Boc-Trp(Z)-OBzl を出発物質と
して、所定のペプチドを用いて液相法により順次カップ
リングさせることによって、血小板凝集抑制能力及び安
全性に優れた式：Pro-Ser-X-Gly-Asp-Trp-OHで表される
ペプチドを多量に製造することができることを見出し、
本発明を完成した。

【０００８】すなわち、本発明は、次式(I) ： Pro-Ser-X-Gly-Asp-Trp-OH (I) （式中、Xはプロリン、ヒドロキシプロリン、シクロヘ
キシルグリシン又はターシャルロイシンを表す。）で表
されるペプチドを製造する方法であって、 ａ）Boc-Trp(Z)-OBzl（式中、Boc はｔ−ブトキシカル
ボニルを表し、Z はベンジルオキシカルボニルを表し、
OBzlはベンジルエステルを表す。）のBoc基を除去し、B
oc-Asp(OBzl)-OHとカップリングさせ、 ｂ）得られたBoc-Asp(OBzl)-Trp(Z)-OBzl のBoc基を除
去し、Boc-Gly-OHとカップリングさせ、

【０００９】ｃ）得られたBoc-Gly-Asp(OBzl)-Trp(Z)-O
Bzl のBoc基を除去し、Boc-X-OHとカップリングさせ、 ｄ）得られたBoc-X-Gly-Asp(OBzl)-Trp(Z)-OBzl のBoc
基を除去し、Boc-Ser(Bzl)-OH（式中、Bzl はベンジル
を表す。）とカップリングさせ、 ｅ）得られたBoc-Ser(Bzl)-X-Gly-Asp(OBzl)-Trp(Z)-OB
zlのBoc基を除去し、Z-Pro-OHとカップリングさせ、 ｆ）得られたZ-Pro-Ser(Bzl)-X-Gly-Asp(OBzl)-Trp(Z)-
OBzlからBzl基及びZ基を除去することを特徴とするペプ
チドの製造法である。

【００１０】また、本発明は、式：Boc-Asp(OBzl)-Trp
(Z)-OBzl で表されるペプチド、式：Boc-Gly-Asp(OBzl)
-Trp(Z)-OBzlで表されるペプチド、式：Boc-X-Gly-Asp
(OBzl)-Trp(Z)-OBzlで表されるペプチド、式：Boc-Ser
(Bzl)-X-Gly-Asp(OBzl)-Trp(Z)-OBzlで表されるペプチ
ド及び式：Z-Pro-Ser(Bzl)-X-Gly-Asp(OBzl)-Trp(Z)-OB
zlで表されるペプチドである。

【００１１】以下、本発明を詳細に説明する。本明細書
において、アミノ酸、ペプチド、保護基、活性基、その
他に関して略号で表示する場合、国際純正及び応用化学
連合（ＩＵＰＡＣ）、国際生化学連合（ＩＢＵ）の規定
又は該当分野における慣用記号に従うものとする。以下
にその例を示す。

【００１２】 Asp ：アスパラギン酸 Gly ：グリシン Pro ：プロリン Hyp ：ヒドロキシプロリン Chg ：シクロヘキシルグリシン Tle ：ターシャルロイシン Ser ：セリン Trp ：トリプトファン Z ：ベンジルオキシカルボニル Boc ：ｔ−ブトキシカルボニル Bzl ：ベンジル OBzl ：ベンジルエステル

【００１３】本発明は、次式(I) ： Pro-Ser-X-Gly-Asp-Trp-OH (I) で表されるペプチドを液相合成によって製造する方法で
ある。本発明では、以下ａ）〜ｆ）の工程を経て該ペプ
チド(I) を合成する。 ａ）Boc-Trp(Z)-OBzl のBoc基を除去し、Boc-Asp(OBzl)
-OHとカップリングさせ、 ｂ）得られたBoc-Asp(OBzl)-Trp(Z)-OBzl のBoc基を除
去し、Boc-Gly-OHとカップリングさせ、

【００１４】ｃ）得られたBoc-Gly-Asp(OBzl)-Trp(Z)-O
Bzl のBoc基を除去し、Boc-X-OHとカップリングさせ、 ｄ）得られたBoc-X-Gly-Asp(OBzl)-Trp(Z)-OBzl のBoc
基を除去し、Boc-Ser(Bzl)-OHとカップリングさせ、 ｅ）得られたBoc-Ser(Bzl)-X-Gly-Asp(OBzl)-Trp(Z)-OB
zlのBoc基を除去し、Z-Pro-OHとカップリングさせ、 ｆ）得られたZ-Pro-Ser(Bzl)-X-Gly-Asp(OBzl)-Trp(Z)-
OBzlからBzl基及びZ基を除去する。

【００１５】XがHyp（ヒドロキシプロリン）であるペプ
チドを合成する場合、工程ｃ）で使用するBoc-X-OHの水
酸基を、保護基によって保護するのが好ましい。そのよ
うな保護基としては、Bzl（ベンジル）、Bzl(NO₂)（2-
ニトロベンジル）、Bzl(Cl)（クロロベンジル）、Ztf
（1-ベンジルオキシカルボニルアミノ-2,2,2-トリフル
オロエチル）などを用いることができ、中でもBzl（ベ
ンジル）を用いるのが好ましい。

【００１６】各工程において、Boc（ｔ−ブトキシカル
ボニル）基の除去は、塩酸／ジオキサン、塩酸／酢酸エ
チル、トリフルオロ酢酸等を用いればよく、好ましくは
4N塩酸／ジオキサン溶液を用いて行うことができる。反
応は、氷冷から室温の範囲内の温度下で行うのが好まし
く、具体的には０〜25℃で行うのが好ましい。例えば、
4N塩酸／ジオキサン溶液をペプチドの濃度が５〜10重量
％になるように加え、氷冷下で１〜３時間攪拌する。さ
らに必要に応じて、室温で１〜３時間攪拌する。その
後、塩酸／ジオキサンを減圧留去する。

【００１７】各工程におけるカップリングは、塩化メチ
レン、クロロホルム、酢酸エチル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホ
ルムアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン、ジオキ
サン、テトラヒドロフラン、Ｎ−メチルピロリドン、
水、メタノール等を溶媒として用いることができるが、
塩化メチレン等の比較的低極性な溶媒中で行うのが好ま
しい。そのような溶媒を用いることにより、溶媒留去等
のカップリング反応の後処理における操作性が良好とな
る。

【００１８】各工程で用いるカップリング試薬として
は、当該分野において公知のジシクロヘキシルカルボジ
イミド、水溶性カルボジイミド、1-プロパンスルフォン
酸環状無水物、ジフェニルホスホリルアジド等を用いれ
ばよく、中でも水溶性カルボジイミドを用いるのが好ま
しい。カップリング試薬は、用いるペプチドに対して１
〜５当量加えるのが好ましく、特に１〜３当量加えるの
が好ましい。

【００１９】カップリング試薬としてカルボジイミドを
用いる場合、1-ヒドロキシベンゾトリアゾールのような
試薬を加えれば、そのカップリング反応を促進すること
ができる。1-ヒドロキシベンゾトリアゾールは、用いる
ペプチドに対して１〜５当量加えるのが好ましく、特に
１〜３当量加えるのが好ましい。カップリング反応は、
氷冷から室温の範囲内の温度下で行うのが好ましく、具
体的には０〜25℃で行うのが好ましい。カップリングを
行うには、例えば、ペプチドを塩化メチレンに溶解し、
氷浴で冷却しながらトリエチルアミン等を用いてpHを６
〜７とし、これに、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール、
カップリングの相手となるペプチド及び水溶性カルボジ
イミドを順次加え、氷冷下で１〜５時間攪拌する。さら
に必要に応じて、室温で１〜15時間攪拌する。

【００２０】各工程では、不純物の成長を防ぐため、得
られる中間体を再結晶又はカラムクロマトグラフィーに
よって精製するのが好ましい。いずれの方法によって精
製する場合であっても、常法によって行えばよい。再結
晶を行う場合は、例えば、反応後の反応液を５％クエン
酸で２回、飽和食塩水で１回、５％炭酸水素ナトリウム
で２回及び飽和食塩水で１回洗浄し、得られた有機層を
無水硫酸ナトリウム等で乾燥させ、次いで減圧留去し、
固化した粗生成物をメタノール等により再結晶すればよ
い。

【００２１】カラムクロマトグラフィーを行う場合は、
例えば、メルク社製 Kieselgel60を用い、溶出溶媒とし
て１〜５％メタノールを含むクロロホルムで溶出すれば
よい。このように各工程で得られる中間体を精製するこ
とにより、最終生成物の精製が容易になる。

【００２２】工程ｆ）においてBzl基及びZ基を除去する
には、接触水素化分解を行うのが好ましい。このとき、
触媒として５〜10％パラジウム炭素を用いるのが好まし
い。触媒は、ペプチドに対して５〜50重量％加えるのが
好ましく、特に20〜40重量％加えるのが好ましい。接触
水素化分解は常法によって行えばよく、ペプチドを例え
ば酢酸／メタノール／水の混合溶液に溶解させ、これに
５〜10％パラジウム炭素を添加し、水素気流下、10〜40
℃で２〜48時間攪拌する。この反応は、大気圧下で行っ
てもよいし、オートクレーブを用いて水素圧を上げて行
ってもよい。

【００２３】接触水素化分解で得られたペプチドは、例
えば、逆相液体クロマトグラフィーにより精製し、目的
とするペプチド：Pro-Ser-X-Gly-Asp-Trp-OHを得る。逆
相液体クロマトグラフィーを行うには、例えば、カラム
としてWaters社製Bondapak C ₁₈を用い、流速10〜20ml／
min において、0.1 ％ＴＦＡ中アセトニトリル10〜25％
のgradientで溶出すればよい。

【００２４】ここで、本発明において用いる出発物質
(1) 及び本発明において得られる中間体化合物(2) 〜
(6) を以下に示す。 (1) Boc-Trp(Z)-OBzl (2) Boc-Asp(OBzl)-Trp(Z)-OBzl (3) Boc-Gly-Asp(OBzl)-Trp(Z)-OBzl (4) Boc-X-Gly-Asp(OBzl)-Trp(Z)-OBzl (5) Boc-Ser(Bzl)-X-Gly-Asp(OBzl)-Trp(Z)-OBzl (6) Z-Pro-Ser(Bzl)-X-Gly-Asp(OBzl)-Trp(Z)-OBzl

【００２５】(1) 〜(6) の化合物は、トリプトファンの
インドール核上の窒素プロトンが保護されているため、
保護基Bocを除去する際にエタンジチオール等のカルボ
ニウムイオン補足剤を用いる必要がなく、各工程におけ
る中間体精製を簡単に行うことができる。また、この保
護により塩化メチレン等の比較的低極性な溶媒に対する
溶解度が向上し、アミド結合生成反応において塩化メチ
レンの使用が可能であり、当該分野において一般的に用
いられる高沸点、高極性であるジメチルホルムアミドを
用いた場合と比べて溶媒留去等の反応後の後処理の操作
性が良好である。さらに、(1) 〜(6) の化合物の保護基
をすべてベンジル（Bzl）及びベンジルオキシカルボニ
ル（Z）に統一したことにより、保護されたペプチドか
ら最終生成物であるペプチドに変換する最終脱保護反応
において、比較的穏和な条件で接触水素化分解反応を行
うことができる。

【００２６】本発明では、出発原料としてBoc-Trp(Z)-O
Bzlを用いるが、このBoc-Trp(Z)-OBzl は、木曽らの論
文（Kiso et al.,Chemistry letters, 1983 年, p739）
及びティラクらの論文（Tilak, Tetrahedron letters,
1968年, p6323）に記載されている方法で合成して得ら
れる。また、カップリングの相手として工程ａ）ではBo
c-Asp(OBzl)-OHを用い、工程ｂ）ではBoc-Gly-OHを用
い、工程ｃ）ではBoc-X-OHを用い、工程ｄ）ではBoc-Se
r(Bzl)-OHを用い、工程ｅ）ではZ-Pro-OHを用いるが、
これらのペプチドは渡辺化学工業(株)などの試薬メーカ
ーから購入して得られる。

【００２７】本発明で得られた血小板凝集抑制ペプチ
ド：Pro-Ser-X-Gly-Asp-Trp-OHは、血小板凝集抑制能力
に優れ、また天然のペプチドに可能な限り近い構造を有
するため、生体内に投与した場合、適度な薬効時間の
後、速やかに副作用の無い化合物に代謝されて活性を消
失するという安全性に優れた特性を有する。

【００２８】

【実施例】以下、製造例及び実施例により本発明を更に
具体的に説明するが、本発明はこれらの製造法及び実施
例に限定されるものではない。 （製造例１）(1) Boc-Trp-OBzlの製造 Boc-Trp-OH 25.00g (0.0821mol) をDMF（ジメチルホル
ムアミド）180ml に溶解し、これにジシクロヘキシルア
ミン14.89g (0.0821mol)及びベンジルブロマイド14.05g
(0.0821mol)を加え、室温にて40時間攪拌した。反応
後、生じた沈殿物を濾別し、濾液を減圧留去した。残渣
を酢酸エチル300ml に溶かし、その際の不溶物を濾過に
よって除いた後、５％クエン酸、水、５％炭酸水素ナト
リウム及び飽和食塩水の順で洗浄した。有機層を無水硫
酸ナトリウムで乾燥させ、減圧留去し、Boc-Trp-OBzlを
得た。収量は30.07gであり、収率は92.85％であった。
なお、質量分析及びＮＭＲの結果は以下の通りである。

【００２９】質量分析（C₂₃H₂₆N₂O₄：394.9）FAB-MS：4
17(M＋Na) ＮＭＲ（CDCl₃，δ ppm）：1.43 (s,9H)、3.28 (d,J=5.
2,2H)、4.64 (dd,J=5.2,7.8,1H)、5.05 (s,2H)、6.94
(s,1H)、7.08-7.24 (m,2H)、7.31 (d,J=7.8,1H)、7.54
(d,J=7.6,1H)、8,45 (s,1H)

【００３０】(2) Boc-Trp(Z)-OBzlの製造 (1) で得られたBoc-Trp-OBzl 25.00ｇ(0.0630mol) を塩
化メチレン140mlに溶解し、微細化した水酸化ナトリウ
ム6.30g (0.1575mol)、亜硫酸水素テトラブチルアンモ
ニウム120mg(0.63mmol)及びベンジルクロロフォルメー
ト16.20g(0.0945mol)を順次加え、アルゴン気流下、室
温で１時間攪拌した。反応後、不溶物をセライト濾過
し、氷冷6N塩酸及び飽和食塩水の順で各々２回づつ洗浄
した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧留
去し、固化した粗生成物をメタノールより再結晶し、Bo
c-Trp(Z)-OBzlを得た。収量は27.75gであり、収率は 7
5.00％であった。なお、質量分析及びＮＭＲの結果は以
下の通りである。

【００３１】質量分析（C₃₁H₃₂N₂O₆：528.2）FAB-MS：5
51(M＋Na) ＮＭＲ（CDCl₃，δ ppm）：1.40 (s,9H)、3.20 (m,2
H)、4.69 (dd,J=5.2,7.3, 1H) 、5.05 (s,2H) 、5.41
(s,2H)、7.17-7.50(m,14H)、8.14 (br-s,1H)

【００３２】（実施例１） Pro-Ser-Pro-Gly-Asp-Trp-O
Hの合成 ａ）Boc-Asp(OBzl)-Trp(Z)-OBzlの製造 製造例１を繰り返して得られたBoc-Trp(Z)-OBzl 70.00g
(0.1352mol)に4N塩酸／ジオキサン溶液1000mlを加え、
氷浴中で１時間10分攪拌し、さらに室温で３時間30分攪
拌した後、塩酸／ジオキサンを減圧留去した。残渣を塩
化メチレンに溶解し、氷浴にて冷却しながらトリエチル
アミンを加え、pHを約７とした。これに1-ヒドロキシベ
ンゾトリアゾール 20.29g (0.1352mol)、Boc-Asp(OBzl)
-OH 47.10g (0.1458mol)及び水溶性カルボジイミド30.4
8g(0.1590mol)を順次加え、氷浴中で１時間30分攪拌
し、さらに室温で15時間攪拌した。

【００３３】反応後、反応液を５％クエン酸（２回）、
飽和食塩水、５％炭酸水素ナトリウム（２回）及び飽和
食塩水の順で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで
乾燥させ、減圧留去し、固化した粗生成物をメタノール
より再結晶し、Boc-Asp(OBzl)-Trp(Z)-OBzlを得た。収
量は71.85gであり、収率は 72.46％であった。なお、質
量分析及びＮＭＲの結果は以下の通りである。

【００３４】質量分析（C₄₂H₄₃N₃O₉：733.3）FAB-MS：7
56(M＋Na) ＮＭＲ（CDCl₃，δ ppm）：1.35 (s,9H)、2.65 (dd,J=
5.6,11.6,2H) 、2.96-3.08 (m,1H)、3.16-3.22 (m,2
H)、4.95 (dd,J=4.0,9.2,1H) 、5.01 (s,2H)、5.02 (s,
2H)、5.41(s,2H)、7.11-7.52 (m,19H)、8.15 (br-s,1H)

【００３５】ｂ）Boc-Gly-Asp(OBzl)-Trp(Z)-OBzlの製
造 ａ）で得られたBoc-Asp(OBzl)-Trp(Z)-OBzl 15.00g (0.
0204mol)に4N塩酸／ジオキサン溶液200mlを加え、氷浴
中で40分攪拌し、さらに室温で２時間攪拌した後、塩酸
／ジオキサンを減圧留去した。残渣を塩化メチレンに溶
解し、氷浴にて冷却しながらトリエチルアミンを加え、
pHを約７とした。これに1-ヒドロキシベンゾトリアゾー
ル 3.13g(0.0204mol)、Boc-Gly-OH 3.93g (0.0224mol)
及び水溶性カルボジイミド 4.70g(0.0244mol)を順次加
え、氷浴中で45分攪拌し、さらに室温で15時間攪拌し
た。

【００３６】反応後、反応液を５％クエン酸（２回）、
飽和食塩水、５％炭酸水素ナトリウム（２回）及び飽和
食塩水の順で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで
乾燥させ、減圧留去し、固化した粗生成物をメタノール
より再結晶し、Boc-Gly-Asp(OBzl)-Trp(Z)-OBzlを得
た。収量は13.15gであり、収率は 79.94％であった。な
お、質量分析及びＮＭＲの結果は以下の通りである。

【００３７】質量分析（C₄₄H₄₆N₄O₁₀：790.3）FAB-MS：
813(M＋Na) ＮＭＲ（CDCl₃，δ ppm）：1.42 (s,9H)、2.57 (dd,J=
2.4,4.4,1H)、2.65 (dd,J=2.4,6.3,1H)、2.94-3.00 (m,
1H)、3.13-3.25(m,2H)、3.46-3.65 (m,2H)、4.78-4.89
(m,2H)、5.02 (s,2H)、5.06 (s,2H)、5.41 (s,2H)、7.1
5-7.51 (m,19H)、8.13 (br-s,1H)

【００３８】ｃ）Boc-Pro-Gly-Asp(OBzl)-Trp(Z)-OBzl
の製造 ｂ）で得られたBoc-Gly-Asp(OBzl)-Trp(Z)-OBzl 4.95g
(6.27mmol)に4N塩酸／ジオキサン溶液150mlを加え、氷
浴中で３時間攪拌した後、塩酸／ジオキサンを減圧留去
した。残渣を塩化メチレンに溶解し、氷浴にて冷却しな
がらトリエチルアミンを加え、pHを約７とした。これに
1-ヒドロキシベンゾトリアゾール 0.96g(6.27mmol)、Bo
c-Pro-OH 1.49g (6.90mmol)及び水溶性カルボジイミド
1.44g(7.53mmol)を順次加え、氷浴中で２時間攪拌し、
さらに室温で５時間30分撹拌した。

【００３９】反応後、反応液を５％クエン酸（２回）、
飽和食塩水、５％炭酸水素ナトリウム（２回）及び飽和
食塩水の順で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで
乾燥させ、減圧留去し、固化した粗生成物をカラムクロ
マトグラフィー（メルク社製Kieselgel60、溶出：クロ
ロホルム、メタノール）により精製し、Boc-Pro-Gly-As
p(OBzl)-Trp(Z)-OBzlを得た。収量は 4.35gであり、収
率は78.27％であった。なお、質量分析及びＮＭＲの結
果は以下の通りである。

【００４０】質量分析（C₄₉H₅₃N₅O₁₁：887.9）MS：910
(M＋Na) ＮＭＲ（CDCl₃，δ ppm）：1.43 (s,9H)、1.71-1.96
(m,2H)、2.03-2.13 (m,2H)、2.82-2.98 (br,2H)、3.20
(m,2H)、3.32-3.52 (m,2H)、4.17 (t,J=6.1Hz,1H)、4.7
6-4.91(m,2H)、5.02 (s,2H)、5.06 (s,2H)、5.43 (s,2
H)、7.17-7.51 (m,19H)、8.08 (br-s,1H)

【００４１】ｄ）Boc-Ser(Bzl)-Pro-Gly-Asp(OBzl)-Trp
(Z)-OBzlの製造 ｃ）で得られたBoc-Pro-Gly-Asp(OBzl)-Trp(Z)-OBzl 1.
00g (1.13mmol)に4N塩酸／ジオキサン溶液50mlを加え、
氷浴中で３時間攪拌した後、塩酸／ジオキサンを減圧留
去した。残渣を塩化メチレンに溶解し、氷浴にて冷却し
ながらトリエチルアミンを加え、pHを約７とした。これ
に1-ヒドロキシベンゾトリアゾール 0.17g(1.13mmol)、
Boc-Ser(Bzl)-OH 0.83g (1.24mmol)及び水溶性カルボジ
イミド 0.26g(1.35mmol)を順次加え、氷浴中２時間攪拌
し、さらに室温で４時間攪拌した。

【００４２】反応後、反応液を５％クエン酸（２回）、
飽和食塩水、５％炭酸水素ナトリウム（２回）及び飽和
食塩水の順で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで
乾燥させ、減圧留去し、Boc-Ser(Bzl)-Pro-Gly-Asp(OBz
l)-Trp(Z)-OBzlの粗生成物を得た。収量は1.51gであっ
た。なお、質量分析及びＮＭＲの結果は以下の通りであ
る。

【００４３】質量分析（C₅₉H₆₄N₆O₁₃：1065.1）MS：108
7(M＋Na) ＮＭＲ（CDCl₃，δ ppm）：1.33 (s,9H)、1.78-2.16
(m,4H)、2.96 (m,2H)、3.20 (d,J=6.4,2H)、3.58-3.92
(m,6H)、4.16(m,1H)、4.47 (s,2H)、4.76-4.92 (m,2
H)、4.99 (s,2H)、5.05 (s,2H)、5.41 (s,2H)、7.11-7.
62 (m,24H)

【００４４】ｅ）Z-Pro-Ser(Bzl)-Pro-Gly-Asp(OBzl)-T
rp(Z)-OBzlの製造 ｄ）で得られたBoc-Ser(Bzl)-Pro-Gly-Asp(OBzl)-Trp
(Z)-OBzl 1.34g(1.26mmol)に4N塩酸／ジオキサン溶液50
mlを加え、氷浴中で３時間攪拌した後、塩酸／ジオキサ
ンを減圧留去した。残渣を塩化メチレンに溶解し、氷浴
にて冷却しながらトリエチルアミンを加え、pHを約７と
した。これに1-ヒドロキシベンゾトリアゾール 0.19g
(1.26mmol)、Z-Pro-OH 0.36g (1.38mmol)及び水溶性カ
ルボジイミド0.29g (1.51mmol)を順次加え、氷浴中で２
時間攪拌し、さらに室温で３時間30分攪拌した。

【００４５】反応後、反応液を５％クエン酸（２回）、
飽和食塩水、５％炭酸水素ナトリウム（２回）及び飽和
食塩水の順で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで
乾燥させ、減圧留去し、固化した粗生成物をカラムクロ
マトグラフィー（メルク社製Kieselgel60、溶出：クロ
ロホルム、メタノール）により精製し、Z-Pro-Ser(Bzl)
-Pro-Gly-Asp(OBzl)-Trp(Z)-OBzlを得た。収量は 1.16g
であり、収率は 77.02％であった。なお、質量分析及び
ＮＭＲの結果は以下の通りである。

【００４６】質量分析（C₆₇H₆₉N₇O₁₄：1196.3）MS：121
8(M＋Na) ＮＭＲ（CDCl₃，δ ppm）：1.70-2.19 (m,8H)、2.94
(m,2H)、3.08-3.22 (m,2H)、3.30-3.90 (m,6H)、4.04
(m,1H)、4.42 (s,2H)、4.75-4.89 (m,2H)、5.01 (s,2H
X2)、5.40(s,2H x2)、7.03-7.52 (m,29H)

【００４７】ｆ）Pro-Ser-Pro-Gly-Asp-Trp-OHの製造 ｅ）までの工程を繰り返して得られたZ-Pro-Ser(Bzl)-P
ro-Gly-Asp(OBzl)-Trp(Z)-OBzl 73.0mg (0.061mmol) を
酢酸／メタノール／水（４：２：１）の混合溶液７mlに
溶かし、これに10％パラジウム炭素16.5mgを加え、水素
気流下、室温で19時間攪拌した。反応後、遠心濾過フィ
ルター（ミリポア製）にて10％パラジウム炭素を除去
し、溶媒を減圧留去した。残渣を1M酢酸溶液に溶かした
後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて精製
した。ＨＰＬＣでは、Bondapak C18（φ19×150 mm）カ
ラム（Waters社製）を用い、流速17ml／min において、
0.1％ＴＦＡ中アセトニトリル10〜25％（20分）のgradi
ent溶出で、保持時間11.5分のピークを分取した。ＨＰ
ＬＣによる精製の結果、Pro-Ser-Pro-Gly-Asp-Trp-OHを
トリフルオロ酢酸塩として得た。収量は29.5mgであり、
収率は 73.52％であった。また、a)〜f)までのトータル
収率は25.67％であった。なお、質量分析、ＮＭＲ、ア
ミノ酸分析及びＨＰＬＣ分析の結果は以下の通りであ
る。

【００４８】質量分析（C₃₀H₃₉N₇O₁₀：658.3）FAB-MS：
658(M＋H) ＮＭＲ（DMSO-d₆，δ ppm）：1.78-1.94 (m,8H)、1.94-
2.23 (m,2H)、2.25(dd,J=8.9,18.0,1H)、2.72 (dd,J=4.
3,18.0,1H)、3.07-3.30 (m,4H)、4.22 (m,4H)、4.34-4.
48(m,2H)、4.65-4.85 (m,2H)、7.01 (t,J=7.6,1H)、7.1
0 (t,J=7.3,1H) 、7.19 (s,1H)、7.37 (d,J=7.8,1H)、
7.55 (d,J=7.8,1H)、8.09 (d,J=8.4,1H)、8.18 (m,2
H)、8.52 (br-s,0.5H)、8.66 (d,J=7.8,1H)、9.27 (br-
s,0.5H)、10.87(s,1H) アミノ酸分析（6N HCl＋phenol，24hr，110℃）：

【００４９】本検出法では、トリプトファンは酸加水分
解中に分解されるために検出できなかった。 Trp − (1) Asp 0.99 (1) Gly 1.13 (1) Pro 2.05 (2) Ser 1.00 (1) ＨＰＬＣ分析：Cosmosil 5C18-AR（φ4.6×200mm）カラ
ム（ナカライテスク社製）を用い、流速1.0 ml／min に
おいて、0.1 ％ＴＦＡ中アセトニトリル10〜40％（60
分）のgradient溶出で、保持時間21.0分の単一ピークを
示した。

【００５０】（実施例２） Pro-Ser-Hyp-Gly-Asp-Trp-O
Hの合成 工程ｃ）においてBoc-Hyp(Bzl)-OHを用いる以外、実施
例１と同様にして式：Pro-Ser-Hyp-Gly-Asp-Trp-OHで表
されるペプチドを合成した。トータル収率は21.11％で
あった。アミノ酸分析及びＨＰＬＣ分析の結果を以下に
示す。 アミノ酸分析（6N HCl＋phenol，24hr，110℃）： Trp − (1) Asp 0.96 (1) Gly 1.10 (1) Hyp 1.04 (1) Ser 1.00 (1) Pro 1.11 (1) ＨＰＬＣ分析：Cosmosil 5C18-AR（φ4.6×200mm）カラ
ム（ナカライテスク社製）を用い、流速1.0 ml／min に
おいて、0.1 ％ＴＦＡ中アセトニトリル10〜40％（60
分）のgradient溶出で、保持時間19.7分の単一ピークを
示した。

【００５１】（実施例３） Pro-Ser-Chg-Gly-Asp-Trp-O
Hの合成 工程ｃ）においてBoc-Chg-OHを用いる以外、実施例１と
同様にして式： Pro-Ser-Chg-Gly-Asp-Trp-OHで表され
るペプチドを合成した。トータル収率は29.39％であっ
た。アミノ酸分析及びＨＰＬＣ分析の結果を以下に示
す。 アミノ酸分析（6N HCl＋phenol，24hr，110℃）： Trp − (1) Asp 1.01 (1) Gly 0.99 (1) Chg 1.08 (1) Ser 1.00 (1) Pro 1.05 (1) ＨＰＬＣ分析：Cosmosil 5C18-AR（φ4.6×200mm）カラ
ム（ナカライテスク社製）を用い、流速1.0 ml／min に
おいて、0.1 ％ＴＦＡ中アセトニトリル10〜40％（60
分）のgradient溶出で、保持時間39.5分の単一ピークを
示した。

【００５２】（実施例４） Pro-Ser-Tle-Gly-Asp-Trp-O
Hの合成 工程ｃ）においてBoc-Tle-OHを用いる以外、実施例１と
同様にして式： Pro-Ser-Tle-Gly-Asp-Trp-OHで表され
るペプチドを合成した。トータル収率は22.43％であっ
た。アミノ酸分析及びＨＰＬＣ分析の結果を以下に示
す。 アミノ酸分析（6N HCl＋phenol，24hr，110℃）： Trp − (1) Asp 0.99 (1) Gly 1.05 (1) Tle 1.02 (1) Ser 1.00 (1) Pro 1.10 (1) ＨＰＬＣ分析：Cosmosil 5C18-AR（φ4.6×200mm）カラ
ム（ナカライテスク社製）を用い、流速1.0 ml／min に
おいて、0.1 ％ＴＦＡ中アセトニトリル10〜40％（60
分）のgradient溶出で、保持時間34.0分の単一ピークを
示した。

【００５３】（試験例１）合成ペプチドの活性測定 実施例１〜４で得られたペプチドについて、PRP を用い
たin vitroヒト血小板凝集の活性を測定した。被験者と
しては、少なくとも２週間以上いかなる薬も服用してい
ない健康な男性を選んだ。採血は、19号の注射針と1/10
容量の3.8 ％クエン酸ナトリウム溶液を予め入れておい
たプラスチックシリンジを用い、空腹時に下はく部の静
脈から採血を行った。採血後速やかに、シリンジを軽く
攪拌して両液を混合した。この血液を室温で15分間遠心
分離し (1100rpm, 250g)、ブレーキをかけずに回転を止
めた後、上清を駒込ピペットで取り、多血小板血漿 (Ｐ
ＲＰ) とし室温で保存した。遠心後の残りの血液を更に
室温で15分間遠心分離し (3500rpm, 1500g) 、ブレーキ
をかけずに停止させた後の上清を取り、寡血小板血漿
(ＰＰＰ) とした。ＰＲＰ調製後血小板数を計測し、血
小板数が２×10⁸/ml以上のものについてのみ以下に述べ
る実験を行った。

【００５４】血小板の凝集は、８チャンネルの血小板凝
集測定機 (Hematracer, Nikoh Bioscience, Tokyo, Jap
an) を用いてＰＲＰの光の透過度の変化から測定した。
まず、200 μl のＰＰＰ, ＰＲＰをガラスキュベットに
入れ、37℃でインキュベート後、透過度を測定しＰＰＰ
の透過度を100 ％、ＰＲＰの透過度を０％とした。次
に、生理食塩水又はサンプルを含む生理食塩水をＰＲＰ
に10μl 加え37℃で１分間インキュベートした後、更に
100 μg/mlのコラーゲン溶液を10μl 加え (終濃度５μ
g/ml) 凝集を誘発し、以後７分間透過度を測定した。実
験は、最初にコラーゲンとＡＤＰを用いて凝集が起こる
ことを確認し、コラーゲンの最大凝集率が70％以上のも
のについてのみ、実験に用いた。

【００５５】サンプルは 2.2×10^-2M になるように生理
食塩水に溶解し、これを基に２倍の希釈系列を調製し実
験に用いた。生理食塩水に不溶のサンプルについては10
％のジメチルスルホキシドを含む生理食塩水に溶解し
た。結果は次のように計算する。

【００５６】

【数１】

【００５７】サンプルの濃度に対し凝集抑制率をプロッ
トした図を作図し、この図から凝集を50％抑制する濃度
(IC₅₀) を計算した。表１に各ペプチドのIC₅₀を示す。
フィブリノーゲン分子中に存在するアミノ酸配列である
ＲＧＤＳ（表１、比較例１）に比べ、Ｎ端にPro-Ser 構
造を持ち、かつグアニジノ基を有しないアミノ酸を導入
した基本骨格を有する各ペプチドは、血小板凝集阻害活
性を大きく上昇させた。

【００５８】

【表１】

【００５９】

【発明の効果】本発明によれば、式：Pro-Ser-X-Gly-As
p-Trp-OHで表されるペプチドを、液相合成によって多量
に製造することができる。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次式(I) ： Pro-Ser-X-Gly-Asp-Trp-OH (I) （式中、Xはプロリン、ヒドロキシプロリン、シクロヘ
   キシルグリシン又はターシャルロイシンを表す。）で表
   されるペプチドを製造する方法において、 ａ）Boc-Trp(Z)-OBzl（式中、Boc はｔ−ブトキシカル
   ボニルを表し、Z はベンジルオキシカルボニルを表し、
   OBzlはベンジルエステルを表す。）のBoc基を除去し、B
   oc-Asp(OBzl)-OHとカップリングさせ、 ｂ）得られたBoc-Asp(OBzl)-Trp(Z)-OBzl のBoc基を除
   去し、Boc-Gly-OHとカップリングさせ、 ｃ）得られたBoc-Gly-Asp(OBzl)-Trp(Z)-OBzl のBoc基
   を除去し、Boc-X-OHとカップリングさせ、 ｄ）得られたBoc-X-Gly-Asp(OBzl)-Trp(Z)-OBzl のBoc
   基を除去し、Boc-Ser(Bzl)-OH（式中、Bzl はベンジル
   を表す。）とカップリングさせ、 ｅ）得られたBoc-Ser(Bzl)-X-Gly-Asp(OBzl)-Trp(Z)-OB
   zlのBoc基を除去し、Z-Pro-OHとカップリングさせ、 ｆ）得られたZ-Pro-Ser(Bzl)-X-Gly-Asp(OBzl)-Trp(Z)-
   OBzlからBzl基及びZ基を除去することを特徴とするペプ
   チドの製造法。
2. 【請求項２】 式：Boc-Asp(OBzl)-Trp(Z)-OBzl（式
   中、Boc はｔ−ブトキシカルボニルを表し、Z はベンジ
   ルオキシカルボニルを表し、OBzlはベンジルエステルを
   表す。）で表されるペプチド。
3. 【請求項３】 式：Boc-Gly-Asp(OBzl)-Trp(Z)-OBzl
   （式中、Boc はｔ−ブトキシカルボニルを表し、Z はベ
   ンジルオキシカルボニルを表し、OBzlはベンジルエステ
   ルを表す。）で表されるペプチド。
4. 【請求項４】 式：Boc-X-Gly-Asp(OBzl)-Trp(Z)-OBzl
   （式中、Xはプロリン、ヒドロキシプロリン、シクロヘ
   キシルグリシン又はターシャルロイシンを表し、Boc は
   ｔ−ブトキシカルボニルを表し、Z はベンジルオキシカ
   ルボニルを表し、OBzlはベンジルエステルを表す。）で
   表されるペプチド。
5. 【請求項５】 式：Boc-Ser(Bzl)-X-Gly-Asp(OBzl)-Trp
   (Z)-OBzl（式中、Xはプロリン、ヒドロキシプロリン、
   シクロヘキシルグリシン又はターシャルロイシンを表
   し、Boc はｔ−ブトキシカルボニルを表し、Z はベンジ
   ルオキシカルボニルを表し、OBzlはベンジルエステルを
   表す。）で表されるペプチド。
6. 【請求項６】 式：Z-Pro-Ser(Bzl)-X-Gly-Asp(OBzl)-T
   rp(Z)-OBzl（式中、Xはプロリン、ヒドロキシプロリ
   ン、シクロヘキシルグリシン又はターシャルロイシンを
   表し、Boc はｔ−ブトキシカルボニルを表し、Z はベン
   ジルオキシカルボニルを表し、OBzlはベンジルエステル
   を表す。）で表されるペプチド。