JPH08220095A - 沈殿可能な固相を用いる不均一系イムノアッセイ - Google Patents
沈殿可能な固相を用いる不均一系イムノアッセイInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 現在臨床検査室で用いられている遠心分離分
析装置を利用可能で、操作が簡単で感度および精度の高
い不均一系イムノアッセイの提供。 【解決手段】 生物学的液体サンプル中の被検物質の免
疫化学的検出方法において、コーティングされたピペッ
トで吸引可能な粒状固相を液相から沈殿ついで遠心分離
によって分離し、液相中に検出可能な活性を残存させる
不均一系イムノアッセイ。 【効果】 現在臨床検査室で用いられている遠心分離分
析装置を使用して、ピペットによる吸引工程数および必
要な成分数が少なく、施行時間が著しく短縮された不均
一系免疫化学的検出方法を可能にした。
析装置を利用可能で、操作が簡単で感度および精度の高
い不均一系イムノアッセイの提供。 【解決手段】 生物学的液体サンプル中の被検物質の免
疫化学的検出方法において、コーティングされたピペッ
トで吸引可能な粒状固相を液相から沈殿ついで遠心分離
によって分離し、液相中に検出可能な活性を残存させる
不均一系イムノアッセイ。 【効果】 現在臨床検査室で用いられている遠心分離分
析装置を使用して、ピペットによる吸引工程数および必
要な成分数が少なく、施行時間が著しく短縮された不均
一系免疫化学的検出方法を可能にした。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は不均一系イムノアッ
セイを実施する方法に関し、さらに詳しくはコーティン
グされた固相を液相から沈殿ついで遠心分離によって分
離し、検出可能な活性を液相に残留させる方法に関す
る。
セイを実施する方法に関し、さらに詳しくはコーティン
グされた固相を液相から沈殿ついで遠心分離によって分
離し、検出可能な活性を液相に残留させる方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】被検物質、たとえば、生物学的液体中に
は低濃度でしか存在しないがその検出は疾患の診断およ
び治療に重要な抗体の検出には、免疫化学的方法が頻繁
に用いられる。
は低濃度でしか存在しないがその検出は疾患の診断およ
び治療に重要な抗体の検出には、免疫化学的方法が頻繁
に用いられる。
【０００３】免疫化学定量法は均一法と不均一法に区別
される。均一法においては結合パートナーが検出反応に
先立って分離されることはないが、不均一法では、結合
反応および検出反応は、結合および検出パートナーの物
理的分離後に順次行われる。均一系検出法たとえば粒子
−増幅凝集法における濁度の測定は、不均一法に比べ
て、速やかに行われることが多い反面、分離工程がない
ことにより干渉を受けやすくそして感度は低いことが多
い。
される。均一法においては結合パートナーが検出反応に
先立って分離されることはないが、不均一法では、結合
反応および検出反応は、結合および検出パートナーの物
理的分離後に順次行われる。均一系検出法たとえば粒子
−増幅凝集法における濁度の測定は、不均一法に比べ
て、速やかに行われることが多い反面、分離工程がない
ことにより干渉を受けやすくそして感度は低いことが多
い。
【０００４】さらに、直接検出法と競合検出法によって
も区別される。直接検出法では、結合反応および検出反
応は被検物質上で、たとえば被検物質を固相上の第一の
抗体に結合させ、この複合体に、検出可能な構成成分を
もつ第二の抗体の結合体を結合させることにより、たと
えばサンドイッチアッセイ法で行われる。これとは対照
的に、競合検出法では、サンプルの被検物質は、たとえ
ば被検物質−特異的抗体でコーティングされていてもよ
い固相への結合に際して、標識された被検物質または被
検物質様化合物と競合する。競合は、均一系においても
たとえば凝集反応の阻害により、また不均一系において
もたとえば固相に結合した標識被検物質の量の定量によ
り、いずれの系でも検出できる。このような競合法は、
ただ１個の特異的結合部位をもつ被検物質の検出、また
は１回の結合反応のみが可能で直接検出法の場合に要求
されるような２回の結合反応（固相および結合体）は不
可能な極めて小さい分子（ハプテン）の場合の検出に有
利に用いられる。
も区別される。直接検出法では、結合反応および検出反
応は被検物質上で、たとえば被検物質を固相上の第一の
抗体に結合させ、この複合体に、検出可能な構成成分を
もつ第二の抗体の結合体を結合させることにより、たと
えばサンドイッチアッセイ法で行われる。これとは対照
的に、競合検出法では、サンプルの被検物質は、たとえ
ば被検物質−特異的抗体でコーティングされていてもよ
い固相への結合に際して、標識された被検物質または被
検物質様化合物と競合する。競合は、均一系においても
たとえば凝集反応の阻害により、また不均一系において
もたとえば固相に結合した標識被検物質の量の定量によ
り、いずれの系でも検出できる。このような競合法は、
ただ１個の特異的結合部位をもつ被検物質の検出、また
は１回の結合反応のみが可能で直接検出法の場合に要求
されるような２回の結合反応（固相および結合体）は不
可能な極めて小さい分子（ハプテン）の場合の検出に有
利に用いられる。
【０００５】ただ１個の特徴的エピトープを有するタン
パク質の検出ならびにハプテンの検出には、試験のデザ
インに特別な要求が提起される。すなわち、凝集原理に
よる均一系イムノアッセイはたとえば、せいぜい競合的
デザインでのみ可能である。これらのアッセイの感度
は、最初に述べたように通常低いことから、不均一法が
要求される。被検物質または結合してまだ溶液中にある
被検物質結合体の分離には、慣用の不均一系免疫学的方
法では、被検物質に相補性で、支持体たとえば小チュー
ブまたはマイクロタイトレーションプレート上に固定さ
れ、したがって洗浄可能な結合パートナーが利用され
る。さらに発展した不均一法では、ピペットで吸引可能
な固相は様々な量の様々な被検物質の測定を可能にする
ので（「ランダムアクセス」）その使用が有利である。
たとえば、コーティングされた粒子がピペットで吸引可
能な固相として用いられる。
パク質の検出ならびにハプテンの検出には、試験のデザ
インに特別な要求が提起される。すなわち、凝集原理に
よる均一系イムノアッセイはたとえば、せいぜい競合的
デザインでのみ可能である。これらのアッセイの感度
は、最初に述べたように通常低いことから、不均一法が
要求される。被検物質または結合してまだ溶液中にある
被検物質結合体の分離には、慣用の不均一系免疫学的方
法では、被検物質に相補性で、支持体たとえば小チュー
ブまたはマイクロタイトレーションプレート上に固定さ
れ、したがって洗浄可能な結合パートナーが利用され
る。さらに発展した不均一法では、ピペットで吸引可能
な固相は様々な量の様々な被検物質の測定を可能にする
ので（「ランダムアクセス」）その使用が有利である。
たとえば、コーティングされた粒子がピペットで吸引可
能な固相として用いられる。
【０００６】すなわち、たとえばＤＥ４１ ２６ ４３６
号には、被検物質の免疫化学的単離を行うためにアガロ
ース粒子にカップリングさせた抗体のイムノクロマトグ
ラフィーにおける使用が記載されている。そのほか、コ
ーティングされた微粒子を被検物質の分離に使用する他
の方法も記載されている。これらの方法は互いにコーテ
ィングされた粒子の分離を行う方法が相違する。
号には、被検物質の免疫化学的単離を行うためにアガロ
ース粒子にカップリングさせた抗体のイムノクロマトグ
ラフィーにおける使用が記載されている。そのほか、コ
ーティングされた微粒子を被検物質の分離に使用する他
の方法も記載されている。これらの方法は互いにコーテ
ィングされた粒子の分離を行う方法が相違する。
【０００７】検討する溶液中の微粒子懸濁液をろ過する
ことによる分離も、以前にたとえばＤＥ４１ ２４ ７７
８号に記載されている。また類似の方法を競合イムノア
ッセイの場合に採用することもできる。測定されるもの
は固相上に残存する被検物質の量、または競合法におい
ては、ろ液中に残存する遊離被検物質／酵素結合体の量
である。さらに他の変法では、免疫複合体中に残存する
被検物質／酵素結合体を再び遊離させて酵素の活性が測
定される。
ことによる分離も、以前にたとえばＤＥ４１ ２４ ７７
８号に記載されている。また類似の方法を競合イムノア
ッセイの場合に採用することもできる。測定されるもの
は固相上に残存する被検物質の量、または競合法におい
ては、ろ液中に残存する遊離被検物質／酵素結合体の量
である。さらに他の変法では、免疫複合体中に残存する
被検物質／酵素結合体を再び遊離させて酵素の活性が測
定される。
【０００８】コーティングした粒子を被検物質含有溶液
と接触させたのち手操作で分離し、結合した被検物質を
洗浄したのちさらに分析に付す方法も記載されている。
と接触させたのち手操作で分離し、結合した被検物質を
洗浄したのちさらに分析に付す方法も記載されている。
【０００９】たとえば、ＵＳ（９１／７１６,１４４）
にはコーティングされた磁性粒子を磁石の近接によって
固定化する方法、およびこうして洗浄したのちに結合し
た被検物質をさらに分析に付す方法が記載されている。
にはコーティングされた磁性粒子を磁石の近接によって
固定化する方法、およびこうして洗浄したのちに結合し
た被検物質をさらに分析に付す方法が記載されている。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】これまでに記載されて
いるこれらのすべての方法は分離系に特異的に連動した
装置を必要とする。したがって、特別の洗浄および／ま
たは分離装置を必要としないで現在行われている臨床化
学的分析装置にも適用可能な固相の分離方法が求められ
ている。
いるこれらのすべての方法は分離系に特異的に連動した
装置を必要とする。したがって、特別の洗浄および／ま
たは分離装置を必要としないで現在行われている臨床化
学的分析装置にも適用可能な固相の分離方法が求められ
ている。
【００１１】ＪＰ ８６−２３０９２５では、被検物質
／酵素結合体の存在下に被検物質を抗体でコーティング
されたポリスチレン粒子に結合させ、遠心分離によって
反応溶液から分離し洗浄する。沈澱の酵素活性が測定さ
れる。しかしながら、この方法は極めて強い遠心力を必
要とし、したがって現在用いられている遠心分離分析装
置では使用できない。その上、記載された方法では別個
の洗浄工程が必要になる。現在用いられている遠心分離
分析装置の作動加速度は最高約１５００×ｇまでであ
る。
／酵素結合体の存在下に被検物質を抗体でコーティング
されたポリスチレン粒子に結合させ、遠心分離によって
反応溶液から分離し洗浄する。沈澱の酵素活性が測定さ
れる。しかしながら、この方法は極めて強い遠心力を必
要とし、したがって現在用いられている遠心分離分析装
置では使用できない。その上、記載された方法では別個
の洗浄工程が必要になる。現在用いられている遠心分離
分析装置の作動加速度は最高約１５００×ｇまでであ
る。
【００１２】ＪＰ ８８−１４３２５７では、被検物質
に向けられたコーティング粒子および抗体結合体で構成
される混合物を直接法で形成させ、この混合液を被検物
質含有溶液とともに室温で数時間放置する。ついで上清
中に残存する抗体結合体の可溶性活性を別個に測定す
る。この方法の説明はこの点には触れていないが、生成
した粒子−被検物質−抗被検物質／結合体から構成され
る複合体が長時間のインキュベーションの間に沈降し
て、上清中の抗−被検物質／結合体は遊離被検物質の量
に相当する程度まで除去されることが明白である。この
方法は、沈降に必要な時間として極めて長いためインキ
ュベーション時間が要求され、またこれらの結合体含有
複合体も機械的振動またはピペットアームの浸漬の深さ
の変動により結合体の定量に関与するようになる可能性
があることから、極めて不満足なものである。
に向けられたコーティング粒子および抗体結合体で構成
される混合物を直接法で形成させ、この混合液を被検物
質含有溶液とともに室温で数時間放置する。ついで上清
中に残存する抗体結合体の可溶性活性を別個に測定す
る。この方法の説明はこの点には触れていないが、生成
した粒子−被検物質−抗被検物質／結合体から構成され
る複合体が長時間のインキュベーションの間に沈降し
て、上清中の抗−被検物質／結合体は遊離被検物質の量
に相当する程度まで除去されることが明白である。この
方法は、沈降に必要な時間として極めて長いためインキ
ュベーション時間が要求され、またこれらの結合体含有
複合体も機械的振動またはピペットアームの浸漬の深さ
の変動により結合体の定量に関与するようになる可能性
があることから、極めて不満足なものである。
【００１３】ＧＢ ８４−１１７０６では、被検物質
（ハプテン）、抗−被検物質抗体／標識１結合体および
被検物質／標識２結合体から構成される混合物が、第一
のインキュベーションにおいて、抗被検物質抗体標識１
結合体と遊離被検物質とから、または競合的に被検物質
／標識２結合体とから複合体が形成されて分離される。
結合した被検物質／標識２結合体は、その後の工程で、
標識１を結合することによりそれを固相上に固定化して
分離される。この目的では、標識１に向けられた抗体で
コーティングされた小チューブがとくに使用される。他
の変法では、標識１に対する抗体を最初に添加し、つい
でこれらの抗−標識１抗体に対する抗体でコーティング
されたカオリンを添加する。この第二の変法において
は、分離は遠心分離により達成される。次いで、沈殿中
の標識２の活性が検出されるが、沈殿は溶液中からの相
当する持ち込みを除去するためにさらに洗浄しなければ
ならない。この方法は極めて複雑である．すなわち、第
二の変法では３種の異なる抗体が用いられる。これによ
り、必要なインキュベーション時間は数時間にも及ぶこ
とになる。さらに、この方法はハプテンの検出に限定さ
れる。
（ハプテン）、抗−被検物質抗体／標識１結合体および
被検物質／標識２結合体から構成される混合物が、第一
のインキュベーションにおいて、抗被検物質抗体標識１
結合体と遊離被検物質とから、または競合的に被検物質
／標識２結合体とから複合体が形成されて分離される。
結合した被検物質／標識２結合体は、その後の工程で、
標識１を結合することによりそれを固相上に固定化して
分離される。この目的では、標識１に向けられた抗体で
コーティングされた小チューブがとくに使用される。他
の変法では、標識１に対する抗体を最初に添加し、つい
でこれらの抗−標識１抗体に対する抗体でコーティング
されたカオリンを添加する。この第二の変法において
は、分離は遠心分離により達成される。次いで、沈殿中
の標識２の活性が検出されるが、沈殿は溶液中からの相
当する持ち込みを除去するためにさらに洗浄しなければ
ならない。この方法は極めて複雑である．すなわち、第
二の変法では３種の異なる抗体が用いられる。これによ
り、必要なインキュベーション時間は数時間にも及ぶこ
とになる。さらに、この方法はハプテンの検出に限定さ
れる。
【００１４】以前に記載された方法の一部は既に実用化
されているが、現在用いられている遠心分離分析装置で
の使用に最適な慣用方法は見出されていない。
されているが、現在用いられている遠心分離分析装置で
の使用に最適な慣用方法は見出されていない。
【００１５】本発明の基盤にある技術的問題は、したが
って、現在用いられている遠心分離分析装置の一つでの
使用に適当な不均一系免疫化学的検出方法を見出すこと
であった。
って、現在用いられている遠心分離分析装置の一つでの
使用に適当な不均一系免疫化学的検出方法を見出すこと
であった。
【００１６】
【発明を解決するための手段】この技術的問題は請求範
囲に記載の実施態様の条項により解決される。
囲に記載の実施態様の条項により解決される。
【００１７】驚くべきことに、このような方法は、サン
プルを固定化された特異的結合パートナーおよび標識さ
れた特異的検出物質とインキュベートしたのち以下の物
質、すなわち、 ｉ） 固相に向けられた特異的結合パートナー ii） 検出すべき物質に向けられた結合パートナー iii） 固相上に固定化された繋留物質に向けられた結合
パートナー （これらの抗体は非標識特異的結合パートナーの抗体と
は異なる種からのものであることが好ましい）よりなる
群からの物質少なくとも１種を添加して固相を沈殿さ
せ、現在用いられている遠心分離分析装置により約２０
０〜８００×ｇの加速度で遠心分離し、次いで検出のた
めに、使用されなかった標識特異的検出物質の濃度を上
清中で定量することによって実行可能であることが観察
された。
プルを固定化された特異的結合パートナーおよび標識さ
れた特異的検出物質とインキュベートしたのち以下の物
質、すなわち、 ｉ） 固相に向けられた特異的結合パートナー ii） 検出すべき物質に向けられた結合パートナー iii） 固相上に固定化された繋留物質に向けられた結合
パートナー （これらの抗体は非標識特異的結合パートナーの抗体と
は異なる種からのものであることが好ましい）よりなる
群からの物質少なくとも１種を添加して固相を沈殿さ
せ、現在用いられている遠心分離分析装置により約２０
０〜８００×ｇの加速度で遠心分離し、次いで検出のた
めに、使用されなかった標識特異的検出物質の濃度を上
清中で定量することによって実行可能であることが観察
された。
【００１８】この新規な効果はおそらく、粒子の沈殿
が、これらの粒子に対して高い親和性を有する「結合パ
ートナー」（実施例４参照）の添加により、粒子の沈殿
速度が、現在用いられている遠心分離分析装置でも分離
は約０.１〜１０分好ましくは１〜３分という短時間で
起こる程度にまで上昇することによるものと考えられ
る。本技術分野の熟練者は適当な実験により、結合パー
トナーの濃度を、たとえば高用量−フック効果の回避を
期待して、適当な様式で容易に調整することができる。
が、これらの粒子に対して高い親和性を有する「結合パ
ートナー」（実施例４参照）の添加により、粒子の沈殿
速度が、現在用いられている遠心分離分析装置でも分離
は約０.１〜１０分好ましくは１〜３分という短時間で
起こる程度にまで上昇することによるものと考えられ
る。本技術分野の熟練者は適当な実験により、結合パー
トナーの濃度を、たとえば高用量−フック効果の回避を
期待して、適当な様式で容易に調整することができる。
【００１９】検出感度はラテックス懸濁液を希釈するこ
とにより改良することができる（実施例５）。しかしな
がら、被検物質／酵素結合体の濃度はそれに応じて低下
することから、上清中に存在する酵素活性を間接的に、
すなわち付加的な下流反応を用いて測定することが必要
になる場合も考えられる（実施例６）。
とにより改良することができる（実施例５）。しかしな
がら、被検物質／酵素結合体の濃度はそれに応じて低下
することから、上清中に存在する酵素活性を間接的に、
すなわち付加的な下流反応を用いて測定することが必要
になる場合も考えられる（実施例６）。
【００２０】この新規な方法の顕著な特徴は、ピペット
による吸引工程数が少ないこと、必要な成分数が少ない
こと、およびとくに実行時間が著しく短く、通常１〜６
０分の範囲好ましくは１０〜３０分の範囲で行われるこ
とである。すなわち、この新規方法では２種からの抗体
を必要とするのみである。さらに、この新規方法では、
測定は上清に対して直接行われる。しかも、この方法は
特別の洗浄または分離装置を必要とせず、したがって現
在用いられている臨床化学的分析装置に適用可能であ
る。その上、この方法論的アプローチは競合および直接
検出法の両者に用いることができる。最後に、この方法
はハプテンおよび１個のみの特異的エピトープを有する
物質の検出、ならびに複数個の特異的エピトープを有す
る物質の検出いずれにも使用可能であり、したがって以
前に報告されている方法に比べてその適用可能範囲はか
なり広い。
による吸引工程数が少ないこと、必要な成分数が少ない
こと、およびとくに実行時間が著しく短く、通常１〜６
０分の範囲好ましくは１０〜３０分の範囲で行われるこ
とである。すなわち、この新規方法では２種からの抗体
を必要とするのみである。さらに、この新規方法では、
測定は上清に対して直接行われる。しかも、この方法は
特別の洗浄または分離装置を必要とせず、したがって現
在用いられている臨床化学的分析装置に適用可能であ
る。その上、この方法論的アプローチは競合および直接
検出法の両者に用いることができる。最後に、この方法
はハプテンおよび１個のみの特異的エピトープを有する
物質の検出、ならびに複数個の特異的エピトープを有す
る物質の検出いずれにも使用可能であり、したがって以
前に報告されている方法に比べてその適用可能範囲はか
なり広い。
【００２１】
【発明の実施の形態】測定方法に応じて、標識特異的検
出物質は、競合アッセイの場合には標識被検物質であ
り、またサンドイッチアッセイの場合には標識特異的結
合パートナーである。
出物質は、競合アッセイの場合には標識被検物質であ
り、またサンドイッチアッセイの場合には標識特異的結
合パートナーである。
【００２２】標識特異的結合パートナーは、検出可能な
標識を直接もっているか、さもなくばそれを介して標識
または検出反応に連結できる基をもっている特異的結合
パートナーである。
標識を直接もっているか、さもなくばそれを介して標識
または検出反応に連結できる基をもっている特異的結合
パートナーである。
【００２３】本発明の意味の範囲内では、標識被検物質
は、たとえば、被検物質、被検物質誘導体および検出可
能な標識を直接もっているかさもなくばそれを介して標
識に連結できる基をもっている被検物質類縁体である。
は、たとえば、被検物質、被検物質誘導体および検出可
能な標識を直接もっているかさもなくばそれを介して標
識に連結できる基をもっている被検物質類縁体である。
【００２４】本発明の意味の範囲内では、標識は、たと
えば酵素、同位元素、蛍光もしくは化学発光基、または
他の染色もしくは着色粒子とすることができる。
えば酵素、同位元素、蛍光もしくは化学発光基、または
他の染色もしくは着色粒子とすることができる。
【００２５】本発明の意味の範囲内では、特異的結合パ
ートナーは、たとえば、抗−被検物質抗体、特異的レク
チン、受容体または類似の分子である。
ートナーは、たとえば、抗−被検物質抗体、特異的レク
チン、受容体または類似の分子である。
【００２６】
【実施例】以下の実施例は本発明を例示するものであ
る。
る。
【００２７】実施例１ａ） 抗−Ｆ１＋２ラテックス試薬の調製 ラテックス試薬は、Kapmeyer W．H．ら、J．Clin．La
b．Anal. 2：76〜83(1988)に従って調製された。１mlの
グラフトポリマーを０.１mlの抗体溶液〔Ｆ１＋２プロ
トロンビンフラグメントのＣ末端に対する特異的ウサギ
抗体（その調製についてはＥＰ ０ ３０３ ９８３参
照；濃度：０.５ mg／ml）〕および０.０５mlの２０％T
ween（登録商標）２０水溶液と混合した。シェルポリマ
ー上の保護アルデヒド基を活性化するため、約０.０１m
lの１Ｎ ＨＣｌ溶液を用いて懸濁液をpH２.５に調整し
た。室温で３０分間インキュベートしたのち、２５mgの
水素化ホウ素ナトリウムを１mlの１Ｍリン酸水素ナトリ
ウムの溶液（pH６.５）に溶解し、この溶液０.２５mlを
コーティング溶液に添加した．抗体を室温で１時間、活
性化したアルデヒド基にカップリングさせた。次いで、
ラテックス／抗体結合体を遠心分離して（Beckman 遠心
分離装置、４０,０００×ｇ、３０分）、ペレットを０.
１モルのグリシン緩衝液〔pH８.２；０.１７Ｍ ＮａＣ
ｌおよび０.５％Tween（登録商標）２０含有〕１.５ml
に再懸濁した。溶液を約５秒間超音波処理した（Bronso
n B 15 Sonifier）。この保存溶液は＋４℃で貯蔵し
た。
b．Anal. 2：76〜83(1988)に従って調製された。１mlの
グラフトポリマーを０.１mlの抗体溶液〔Ｆ１＋２プロ
トロンビンフラグメントのＣ末端に対する特異的ウサギ
抗体（その調製についてはＥＰ ０ ３０３ ９８３参
照；濃度：０.５ mg／ml）〕および０.０５mlの２０％T
ween（登録商標）２０水溶液と混合した。シェルポリマ
ー上の保護アルデヒド基を活性化するため、約０.０１m
lの１Ｎ ＨＣｌ溶液を用いて懸濁液をpH２.５に調整し
た。室温で３０分間インキュベートしたのち、２５mgの
水素化ホウ素ナトリウムを１mlの１Ｍリン酸水素ナトリ
ウムの溶液（pH６.５）に溶解し、この溶液０.２５mlを
コーティング溶液に添加した．抗体を室温で１時間、活
性化したアルデヒド基にカップリングさせた。次いで、
ラテックス／抗体結合体を遠心分離して（Beckman 遠心
分離装置、４０,０００×ｇ、３０分）、ペレットを０.
１モルのグリシン緩衝液〔pH８.２；０.１７Ｍ ＮａＣ
ｌおよび０.５％Tween（登録商標）２０含有〕１.５ml
に再懸濁した。溶液を約５秒間超音波処理した（Bronso
n B 15 Sonifier）。この保存溶液は＋４℃で貯蔵し
た。
【００２８】実施例１ｂ） アルカリホスファターゼ(ＡＰ)または西洋ワサビペルオ
キシダーゼ(ＰＯＤ)とのＦ１＋２ペプチド結合体の調製 ａ） 方法の原理 酵素／ペプチド結合体は、最近の原理に従い、たとえば
P．Tijssen（Laboratory techniques in biochemistry
and molecular biology；Vol 15，Elsevier Sciences P
ublishers B．V.，Amsterdam-New York-Oxford，1988）
に記載のような異種二官能性リンカーを用いて調製され
る。合成的に調製した抗原（Ｆ１＋２ペプチド；Behrin
gwerke AG より入手）のアミノ末端にシステインを付加
した（ＥＰ ０ ３０３ ９８３参照）。ペプチドのＮ−
末端システインのＳＨ基と、結合する酵素のＮ−末端の
アミノ官能基の間の結合はｍ−マレイミドブチリル−Ｎ
−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（ＭＢＳ；Serva
より）を用いて行う。酵素／酵素結合体の形成を回避す
るために、実際のカップリングの前にＮ-エチルマレイ
ミド（ＮＥＭ；Servaより）を用いて酵素上の遊離ＳＨ
基はすべて保護される。
キシダーゼ(ＰＯＤ)とのＦ１＋２ペプチド結合体の調製 ａ） 方法の原理 酵素／ペプチド結合体は、最近の原理に従い、たとえば
P．Tijssen（Laboratory techniques in biochemistry
and molecular biology；Vol 15，Elsevier Sciences P
ublishers B．V.，Amsterdam-New York-Oxford，1988）
に記載のような異種二官能性リンカーを用いて調製され
る。合成的に調製した抗原（Ｆ１＋２ペプチド；Behrin
gwerke AG より入手）のアミノ末端にシステインを付加
した（ＥＰ ０ ３０３ ９８３参照）。ペプチドのＮ−
末端システインのＳＨ基と、結合する酵素のＮ−末端の
アミノ官能基の間の結合はｍ−マレイミドブチリル−Ｎ
−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（ＭＢＳ；Serva
より）を用いて行う。酵素／酵素結合体の形成を回避す
るために、実際のカップリングの前にＮ-エチルマレイ
ミド（ＮＥＭ；Servaより）を用いて酵素上の遊離ＳＨ
基はすべて保護される。
【００２９】ｂ） ＳＨ−保護酵素の調製 ８.８mgの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）ある
いは１５mgのアルカリホスファターゼ（ＡＰ）（両者と
もBehringer Mannheimより入手）を１mlのカップリング
緩衝液（０.１mol／リットル リン酸ナトリウム緩衝
液、５mM ＥＤＴＡ、pH６.０；ＡＰの場合さらに１mmol
／リットルＭｇＣｌ2および１μmol／リットルＺｎＣｌ
2）中に溶解させる。０.１mlのＮＥＭ溶液（Ｎ,Ｎ−ジ
メチルホルムアミド中１８mg／ml）を室温で撹拌しなが
ら滴加する。容器を密閉し室温で１時間撹拌しながらイ
ンキュベートする．ついで溶液を反応緩衝液（０.１ mo
l／リットル リン酸ナトリウム緩衝液、pH８.０；ＡＰ
の場合さらに１mmol／リットルＭｇＣｌ2および１μmol
／リットルＺｎＣｌ2）に対して透析し、必要な場合はC
entrikons（Amiconより；排除サイズ＜１０kD）で約１m
lに濃縮する。
いは１５mgのアルカリホスファターゼ（ＡＰ）（両者と
もBehringer Mannheimより入手）を１mlのカップリング
緩衝液（０.１mol／リットル リン酸ナトリウム緩衝
液、５mM ＥＤＴＡ、pH６.０；ＡＰの場合さらに１mmol
／リットルＭｇＣｌ2および１μmol／リットルＺｎＣｌ
2）中に溶解させる。０.１mlのＮＥＭ溶液（Ｎ,Ｎ−ジ
メチルホルムアミド中１８mg／ml）を室温で撹拌しなが
ら滴加する。容器を密閉し室温で１時間撹拌しながらイ
ンキュベートする．ついで溶液を反応緩衝液（０.１ mo
l／リットル リン酸ナトリウム緩衝液、pH８.０；ＡＰ
の場合さらに１mmol／リットルＭｇＣｌ2および１μmol
／リットルＺｎＣｌ2）に対して透析し、必要な場合はC
entrikons（Amiconより；排除サイズ＜１０kD）で約１m
lに濃縮する。
【００３０】ｃ） 酵素への反応性マレイミド官能基の
挿入 ０.１mlのＭＢＳ溶液（Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド中
１００mg／mlのｍ−マレイミドブチリル−Ｎ−ヒドロキ
シコハク酸イミドエステル）を実施例１ｂ）からの反応
緩衝液約１ml中のＳＨ−保護酵素に、室温で撹拌しなが
ら滴加する．混合物を１時間撹拌し、溶液をカップリン
グ緩衝液（０.１mol／リットル リン酸ナトリウム緩衝
液、５mM ＥＤＴＡ、pH６.０；ＡＰの場合さらに１mmol
／リットルＭｇＣｌ2および１μmol／リットルＺｎＣｌ
2）に対して透析する。必要な場合には、活性化酵素溶
液をCentrikons（Amiconより）を用いて約２mlに濃縮す
る。
挿入 ０.１mlのＭＢＳ溶液（Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド中
１００mg／mlのｍ−マレイミドブチリル−Ｎ−ヒドロキ
シコハク酸イミドエステル）を実施例１ｂ）からの反応
緩衝液約１ml中のＳＨ−保護酵素に、室温で撹拌しなが
ら滴加する．混合物を１時間撹拌し、溶液をカップリン
グ緩衝液（０.１mol／リットル リン酸ナトリウム緩衝
液、５mM ＥＤＴＡ、pH６.０；ＡＰの場合さらに１mmol
／リットルＭｇＣｌ2および１μmol／リットルＺｎＣｌ
2）に対して透析する。必要な場合には、活性化酵素溶
液をCentrikons（Amiconより）を用いて約２mlに濃縮す
る。
【００３１】ｄ） ペプチドの活性化酵素へのカップリ
ング Ｆ１＋２ペプチド２mgを、２mlのカップリング緩衝液
（０.１mol／リットルリン酸ナトリウム緩衝液、５mM
ＥＤＴＡ、pH６.０；ＡＰの場合さらに１mmol／リット
ルＭｇＣｌ2および１μmol／リットルＺｎＣｌ2）中に
溶解する。実施例１ｂ．ｃ）からの活性化酵素溶液２ml
をついで撹拌しながら添加する。密閉した容器を室温で
１時間、撹拌しながらインキュベートする。
ング Ｆ１＋２ペプチド２mgを、２mlのカップリング緩衝液
（０.１mol／リットルリン酸ナトリウム緩衝液、５mM
ＥＤＴＡ、pH６.０；ＡＰの場合さらに１mmol／リット
ルＭｇＣｌ2および１μmol／リットルＺｎＣｌ2）中に
溶解する。実施例１ｂ．ｃ）からの活性化酵素溶液２ml
をついで撹拌しながら添加する。密閉した容器を室温で
１時間、撹拌しながらインキュベートする。
【００３２】ｅ） 残留マレイミド基の飽和 新たに調製された４００μlのシステイン溶液（０.１mo
l／リットル リン酸ナトリウム緩衝液、５mM ＥＤＴ
Ａ、pH６.０中１０mmol／リットル；ＡＰの場合には、
さらに１mmol／リットルＭｇＣｌ2および１μmol／リッ
トルＺｎＣｌ2）を実施例１ｂ．ｄ）からのカップリン
グ溶液に添加し、ついで混合物を約１０分間撹拌する。
l／リットル リン酸ナトリウム緩衝液、５mM ＥＤＴ
Ａ、pH６.０中１０mmol／リットル；ＡＰの場合には、
さらに１mmol／リットルＭｇＣｌ2および１μmol／リッ
トルＺｎＣｌ2）を実施例１ｂ．ｄ）からのカップリン
グ溶液に添加し、ついで混合物を約１０分間撹拌する。
【００３３】ｆ） Ｆ１＋２ペプチド／酵素結合体の透
析および保存 実施例１ｂ．ｅ）からのカップリング溶液を結合体透析
メジウム（５mmol／リットル トリス塩酸塩、０.９ｇ／
リットル フェノール、pH７.４；ＡＰの場合さらに１mm
ol／リットルＭｇＣｌ2および１μmol／リットルＺｎＣ
ｌ2）に対して透析し、−２０℃で保存する。
析および保存 実施例１ｂ．ｅ）からのカップリング溶液を結合体透析
メジウム（５mmol／リットル トリス塩酸塩、０.９ｇ／
リットル フェノール、pH７.４；ＡＰの場合さらに１mm
ol／リットルＭｇＣｌ2および１μmol／リットルＺｎＣ
ｌ2）に対して透析し、−２０℃で保存する。
【００３４】実施例１ｃ） Ｆ１＋２ペプチド／ＰＯＤ結合体を用いるＦ１＋２ペプ
チドの直接測定 ２５μｌのＦ１＋２ペプチド（サンプル）を、実施例１
に従って調製してその保存溶液を試験メジウム（０.０
２mol／リットル トリス塩酸塩、９ｇ／リットルＮａＣ
ｌ、０.５ｇ／リットルTween２０、pH８.２）中１：３
０に希釈した抗−Ｆ１＋２ラテックス試薬５０μlに添
加し、この混合物を＋３７℃で１５分間インキュベート
する。ついで２５μlのＦ１＋２ペプチド／ＰＯＤ結合
体（実施例１ｂに従い西洋ワサビペルオキシダーゼを用
いて調製；試験メジウム中１：５０００に希釈）を混合
し、この新たな混合物を＋３７℃でさらに１０分間イン
キュベートする。ヤギ抗−ウサギ抗体溶液（Behringwer
keより；１０mmol／リットル トリス塩酸塩、０.４５ｇ
／リットルＮａＣｌ、０.２５ｇ／リットルTween２０、
５０ｇ／リットル ポリエチレングリコール６０００、p
H８.０中０.０５６ｇ／リットル）を添加し、混合物を
＋３７℃でさらに３分間インキュベートする。沈澱した
粒子をついで、３分間、４００×ｇでの遠心分離によっ
て分離する。１０μlの上清を採取し、１００μlのＰＯ
Ｄ基質溶液（Behringwerke AGより）と室温暗所で３０
分間インキュベートする。１００μlの０.５Ｎ硫酸を添
加して基質反応を停止させ、吸光度を４９２nmで測定す
る。１.９〜１９１９０nmol／リットルのＦ１＋２ペプ
チドの測定範囲で得られた吸光度を表１に掲げる。
チドの直接測定 ２５μｌのＦ１＋２ペプチド（サンプル）を、実施例１
に従って調製してその保存溶液を試験メジウム（０.０
２mol／リットル トリス塩酸塩、９ｇ／リットルＮａＣ
ｌ、０.５ｇ／リットルTween２０、pH８.２）中１：３
０に希釈した抗−Ｆ１＋２ラテックス試薬５０μlに添
加し、この混合物を＋３７℃で１５分間インキュベート
する。ついで２５μlのＦ１＋２ペプチド／ＰＯＤ結合
体（実施例１ｂに従い西洋ワサビペルオキシダーゼを用
いて調製；試験メジウム中１：５０００に希釈）を混合
し、この新たな混合物を＋３７℃でさらに１０分間イン
キュベートする。ヤギ抗−ウサギ抗体溶液（Behringwer
keより；１０mmol／リットル トリス塩酸塩、０.４５ｇ
／リットルＮａＣｌ、０.２５ｇ／リットルTween２０、
５０ｇ／リットル ポリエチレングリコール６０００、p
H８.０中０.０５６ｇ／リットル）を添加し、混合物を
＋３７℃でさらに３分間インキュベートする。沈澱した
粒子をついで、３分間、４００×ｇでの遠心分離によっ
て分離する。１０μlの上清を採取し、１００μlのＰＯ
Ｄ基質溶液（Behringwerke AGより）と室温暗所で３０
分間インキュベートする。１００μlの０.５Ｎ硫酸を添
加して基質反応を停止させ、吸光度を４９２nmで測定す
る。１.９〜１９１９０nmol／リットルのＦ１＋２ペプ
チドの測定範囲で得られた吸光度を表１に掲げる。
【００３５】この実験デザインは検査室においてエッペ
ンドルフ管中で行われた。このデザインはまた、臨床化
学用遠心分離分析装置を適当にプログラムすればそれを
用いて行うことも可能であり、したがって自動化の可能
性も提供される。
ンドルフ管中で行われた。このデザインはまた、臨床化
学用遠心分離分析装置を適当にプログラムすればそれを
用いて行うことも可能であり、したがって自動化の可能
性も提供される。
【００３６】
【表１】
【００３７】実施例２ 本発明に従って固相を沈澱させることによる分析感度の
上昇 標準曲線はＦ１＋２ペプチドを濃度範囲１.９〜１９１
９０nmol／リットルで用い、実施例１ｃ）の試験デザイ
ンを使用してプロットした。実施例３の試験デザインか
らの変法として抗−ウサギ抗体での抗−Ｆ１＋２ラテッ
クス試薬の沈澱を行わずに測定を実施した。さらに遠心
分離条件を加速度（２００〜４００×ｇ）および持続時
間（２〜１０分間）に関して変動させた。結果は表１に
まとめる。
上昇 標準曲線はＦ１＋２ペプチドを濃度範囲１.９〜１９１
９０nmol／リットルで用い、実施例１ｃ）の試験デザイ
ンを使用してプロットした。実施例３の試験デザインか
らの変法として抗−ウサギ抗体での抗−Ｆ１＋２ラテッ
クス試薬の沈澱を行わずに測定を実施した。さらに遠心
分離条件を加速度（２００〜４００×ｇ）および持続時
間（２〜１０分間）に関して変動させた。結果は表１に
まとめる。
【００３８】とくに、臨床化学用遠心分離分析器で通常
得られる低遠心加速では、固相を本発明に従って沈澱さ
せた場合にのみＦ１＋２の測定が可能である（図１）。
標準曲線は沈澱抗体が添加された場合の方が急峻であ
り、すなわち、より良好な精度および感度が得られる。
さらに、バックグラウンド（Ｆ１＋２ペプチド非添加）
がより低下し、すなわちシグナル対バックグランド比の
改善が認められる。被検物質および被検物質／酵素結合
体の拡散経路が可能な限り短くなることを保証するため
インキュベーション相または混合相で固相が沈澱しては
ならないことから、沈澱試薬の不存在下にはほとんど沈
降がないこともまた有用である。しかしながら、この差
は高遠心加速時にも持続する（図２および３）。沈降は
加速度と時間の積によって決定されるので、分析感度は
加速度の長時間の継続（図４；沈澱抗体の存在下、２０
０×ｇで２〜１０分間）ならびに加速度の増強（図５、
沈澱抗体の存在下、２００〜８００×ｇで５分間）の両
者によって達成することができる。
得られる低遠心加速では、固相を本発明に従って沈澱さ
せた場合にのみＦ１＋２の測定が可能である（図１）。
標準曲線は沈澱抗体が添加された場合の方が急峻であ
り、すなわち、より良好な精度および感度が得られる。
さらに、バックグラウンド（Ｆ１＋２ペプチド非添加）
がより低下し、すなわちシグナル対バックグランド比の
改善が認められる。被検物質および被検物質／酵素結合
体の拡散経路が可能な限り短くなることを保証するため
インキュベーション相または混合相で固相が沈澱しては
ならないことから、沈澱試薬の不存在下にはほとんど沈
降がないこともまた有用である。しかしながら、この差
は高遠心加速時にも持続する（図２および３）。沈降は
加速度と時間の積によって決定されるので、分析感度は
加速度の長時間の継続（図４；沈澱抗体の存在下、２０
０×ｇで２〜１０分間）ならびに加速度の増強（図５、
沈澱抗体の存在下、２００〜８００×ｇで５分間）の両
者によって達成することができる。
【００３９】実施例３ ラッテックス試薬濃度の変化による測定範囲の調整 一般に、例２に述べたような、遠心加速度および／また
は遠心持続の増大による分析感度および精度を向上させ
る能力は、装置のデザインによって制限される。これに
加えて、遠心分離時間が長すぎるとその試験の単位時間
処理能力が実質的に低下する。ラテックス試薬の量を減
少させこれに応じて被検物質／酵素結合体の量も減少さ
せることによって測定範囲を変更することの方がかなり
有利である。
は遠心持続の増大による分析感度および精度を向上させ
る能力は、装置のデザインによって制限される。これに
加えて、遠心分離時間が長すぎるとその試験の単位時間
処理能力が実質的に低下する。ラテックス試薬の量を減
少させこれに応じて被検物質／酵素結合体の量も減少さ
せることによって測定範囲を変更することの方がかなり
有利である。
【００４０】０.６〜５７５７５nmol／リットルの範囲
での標準曲線を、新規な方法に従い、Ｆ１＋２ペプチド
を用いて作成した。実施例１ｃ）の試験デザインからの
変法として、１：１５または１：３０に希釈した抗−Ｆ
１＋２ラテックス試薬および１：３０００または１：５
０００に希釈したＦ１＋２ペプチド／ＰＯＤ結合体を用
いて試験を行った。さらに、遠心分離は３０００×ｇで
行った。しかしながら、基質のインキュベーションは１
５分のみに限定した。反応試薬（固相および結合体）を
大幅に希釈した結果として、測定可能領域、すなわち分
析感度は約５０〜５０,０００nmolから約２〜２０００n
molに移動した（表２）。これは図６に明瞭に示されて
いる。図中には、結合体の濃度差によりグラフ表示中に
バックグランドシグナル（０ng／ml）による修正を行っ
た。
での標準曲線を、新規な方法に従い、Ｆ１＋２ペプチド
を用いて作成した。実施例１ｃ）の試験デザインからの
変法として、１：１５または１：３０に希釈した抗−Ｆ
１＋２ラテックス試薬および１：３０００または１：５
０００に希釈したＦ１＋２ペプチド／ＰＯＤ結合体を用
いて試験を行った。さらに、遠心分離は３０００×ｇで
行った。しかしながら、基質のインキュベーションは１
５分のみに限定した。反応試薬（固相および結合体）を
大幅に希釈した結果として、測定可能領域、すなわち分
析感度は約５０〜５０,０００nmolから約２〜２０００n
molに移動した（表２）。これは図６に明瞭に示されて
いる。図中には、結合体の濃度差によりグラフ表示中に
バックグランドシグナル（０ng／ml）による修正を行っ
た。
【００４１】
【表２】
【００４２】実施例４ 下流増幅反応を用いるＦ１＋２ペプチドの測定 分析感度を上昇させるため、上清に残留する酵素活性を
直接測定せずそれに代えて増幅反応の下流挿入により測
定した。Harborn，St.らの系〔Anal．Biochem.206：119
-124(1992)；PCT WO 90/01559〕を増幅に用いた。この
系は、脱リン酸化型の場合にアミノ酸オキシダーゼの補
酵素としてのみ働くリン酸化フラビンアデニンジヌクレ
オチドの切断を基盤とするものである。アミノ酸オキシ
ダーゼの活性は、アミノ酸の酸化時に放出されその一部
は添加されたペルオキシダーゼの基質として働く過酸化
水素によって検出される。ペルオキシダーゼはその基質
（４−アミノアンチピレンおよび３,５−ジクロロ−２
−ヒドロキシベンゼンスルホネート）を変換して、最終
的に５４０nmで測定可能な呈色反応を生ずる。この呈色
反応が結局、形成される補酵素の量に直接依存し、この
補酵素がアポ−アミノ酸オキシダーゼの活性を実質的に
増幅させる。補酵素はホスファターゼによって遊離さ
れ、この理由から、この場合はＦ１＋２ペプチド／ＡＰ
結合体が例２に記載のようにして調製され、新規方法に
従って使用された。検出反応に必要な他の試薬はLondon
Biotechnology，Londonからそのまま使用できる形で入
手した。
直接測定せずそれに代えて増幅反応の下流挿入により測
定した。Harborn，St.らの系〔Anal．Biochem.206：119
-124(1992)；PCT WO 90/01559〕を増幅に用いた。この
系は、脱リン酸化型の場合にアミノ酸オキシダーゼの補
酵素としてのみ働くリン酸化フラビンアデニンジヌクレ
オチドの切断を基盤とするものである。アミノ酸オキシ
ダーゼの活性は、アミノ酸の酸化時に放出されその一部
は添加されたペルオキシダーゼの基質として働く過酸化
水素によって検出される。ペルオキシダーゼはその基質
（４−アミノアンチピレンおよび３,５−ジクロロ−２
−ヒドロキシベンゼンスルホネート）を変換して、最終
的に５４０nmで測定可能な呈色反応を生ずる。この呈色
反応が結局、形成される補酵素の量に直接依存し、この
補酵素がアポ−アミノ酸オキシダーゼの活性を実質的に
増幅させる。補酵素はホスファターゼによって遊離さ
れ、この理由から、この場合はＦ１＋２ペプチド／ＡＰ
結合体が例２に記載のようにして調製され、新規方法に
従って使用された。検出反応に必要な他の試薬はLondon
Biotechnology，Londonからそのまま使用できる形で入
手した。
【００４３】実施例１ｃ）の記載のように試験を実施し
たが、抗−Ｆ１＋２ラッテックス試薬および、それに対
応してＦ１＋２ペプチド／ＡＰ結合体の濃度は、それぞ
れ開始溶液を１：５００および１：１０,０００に希釈
し、実施例３に比較してさらに低下させた。増幅系を用
いた場合と用いない場合（実施例３より）のＦ１＋２ペ
プチドの検出結果を表３に比較する。関連試験−特異的
バックグラウンド（０値）について補正後の結果の比較
を図７に示す。上清中に残存する結合体を検出するため
の付加的連鎖反応の使用は、この例では、検出感度に約
２nmol／リットルから少なくとも０.２nmol／リットル
への改善を生じる。
たが、抗−Ｆ１＋２ラッテックス試薬および、それに対
応してＦ１＋２ペプチド／ＡＰ結合体の濃度は、それぞ
れ開始溶液を１：５００および１：１０,０００に希釈
し、実施例３に比較してさらに低下させた。増幅系を用
いた場合と用いない場合（実施例３より）のＦ１＋２ペ
プチドの検出結果を表３に比較する。関連試験−特異的
バックグラウンド（０値）について補正後の結果の比較
を図７に示す。上清中に残存する結合体を検出するため
の付加的連鎖反応の使用は、この例では、検出感度に約
２nmol／リットルから少なくとも０.２nmol／リットル
への改善を生じる。
【００４４】
【表３】
【図１】新規方法において固相を結合可能なリガンドと
ともに遠心力２００×ｇおよび遠心分離時間５分で沈澱
させる効果を示す図であり、本発明に従って固相を沈澱
させた場合（実線）および沈澱させなかった場合（破
線）、混合物中のＦ１＋２ペプチドの濃度が検出反応に
おいて得られる４９２nmでの吸光度に及ぼす影響を示
す。
ともに遠心力２００×ｇおよび遠心分離時間５分で沈澱
させる効果を示す図であり、本発明に従って固相を沈澱
させた場合（実線）および沈澱させなかった場合（破
線）、混合物中のＦ１＋２ペプチドの濃度が検出反応に
おいて得られる４９２nmでの吸光度に及ぼす影響を示
す。
【図２】新規方法において固相を結合可能なリガンドと
ともに遠心力４００×ｇおよび遠心分離時間５分で沈澱
させる効果を示す図であり、本発明に従って固相を沈澱
させた場合（実線）および沈澱させなかった場合（破
線）、混合物中のＦ１＋２ペプチドの濃度が検出反応に
おいて得られる４９２nmでの吸光度に及ぼす影響を示
す。
ともに遠心力４００×ｇおよび遠心分離時間５分で沈澱
させる効果を示す図であり、本発明に従って固相を沈澱
させた場合（実線）および沈澱させなかった場合（破
線）、混合物中のＦ１＋２ペプチドの濃度が検出反応に
おいて得られる４９２nmでの吸光度に及ぼす影響を示
す。
【図３】新規方法において固相を結合可能なリガンドと
ともに遠心力８００×ｇおよび遠心分離時間５分で沈澱
させる効果を示す図であり、本発明に従って固相を沈澱
させた場合（実線）および沈澱させなかった場合（破
線）、混合物中のＦ１＋２ペプチドの濃度が検出反応に
おいて得られる492 nmでの吸光度に及ぼす影響を示す。
ともに遠心力８００×ｇおよび遠心分離時間５分で沈澱
させる効果を示す図であり、本発明に従って固相を沈澱
させた場合（実線）および沈澱させなかった場合（破
線）、混合物中のＦ１＋２ペプチドの濃度が検出反応に
おいて得られる492 nmでの吸光度に及ぼす影響を示す。
【図４】新規方法においてＦ１＋２ペプチドを用いた検
出反応の、遠心力２００×ｇでの遠心分離の持続に対す
る依存性を示す図であり、沈澱した固相を２分間（点
線）、５分間（破線）および１０分間(実線)遠心分離し
た場合、検出反応で得られる４９２nmの吸光度に対する
混合物中Ｆ１＋２ペプチドの濃度の影響を示す。
出反応の、遠心力２００×ｇでの遠心分離の持続に対す
る依存性を示す図であり、沈澱した固相を２分間（点
線）、５分間（破線）および１０分間(実線)遠心分離し
た場合、検出反応で得られる４９２nmの吸光度に対する
混合物中Ｆ１＋２ペプチドの濃度の影響を示す。
【図５】新規方法においてＦ１＋２ペプチドを用いた検
出反応の、５分間の遠心分離時に適用された遠心力に対
する依存性を示す図であり、２００×ｇ（点線）、４０
０×ｇ（破線）および８００×ｇ（実線）で遠心分離し
た場合、検出反応で得られる４９２nmの吸光度に対す
る、混合物中のＦ１＋２ペプチドの濃度の影響を示す。
出反応の、５分間の遠心分離時に適用された遠心力に対
する依存性を示す図であり、２００×ｇ（点線）、４０
０×ｇ（破線）および８００×ｇ（実線）で遠心分離し
た場合、検出反応で得られる４９２nmの吸光度に対す
る、混合物中のＦ１＋２ペプチドの濃度の影響を示す。
【図６】新規方法において、反応成分の濃度変化がＦ１
＋２ペプチド検出の測定可能域および感度に及ぼす影響
を示す図であり、抗−Ｆ１＋２ラテックス試薬およびＦ
１＋２ペプチド／ＰＯＤ結合体のそれぞれ１：３０およ
び１：５０００希釈を使用した場合（希釈混合物；実
線）ならびにそれぞれ１：１５および１：３０００希釈
を使用した場合（濃厚混合物；破線）に検出反応で得ら
れる４９２nmの吸光度に対する、混合物中のＦ１＋２ペ
プチドの濃度の、試験特異的バックグランド反応（０ng
／ml）を差し引いた値に及ぼす影響を示している。
＋２ペプチド検出の測定可能域および感度に及ぼす影響
を示す図であり、抗−Ｆ１＋２ラテックス試薬およびＦ
１＋２ペプチド／ＰＯＤ結合体のそれぞれ１：３０およ
び１：５０００希釈を使用した場合（希釈混合物；実
線）ならびにそれぞれ１：１５および１：３０００希釈
を使用した場合（濃厚混合物；破線）に検出反応で得ら
れる４９２nmの吸光度に対する、混合物中のＦ１＋２ペ
プチドの濃度の、試験特異的バックグランド反応（０ng
／ml）を差し引いた値に及ぼす影響を示している。
【図７】新規方法において検出感度を増幅するための下
流反応系の存在下および不存在下でのＦ１＋２ペプチド
検出を示す図であり、Ｆ１＋２ペプチド／西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ結合体を用いた非増幅検出において４９
２nmで得られた吸光度（破線）、およびＦ１＋２ペプチ
ド／アルカリホスファターゼ結合体を用いた増幅検出系
において５４０nmで得られた吸光度（実線）から試験特
異的バックグランド反応（混合物中にＦ１＋２ペプチド
は存在しない）を差し引いた値を示す。
流反応系の存在下および不存在下でのＦ１＋２ペプチド
検出を示す図であり、Ｆ１＋２ペプチド／西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ結合体を用いた非増幅検出において４９
２nmで得られた吸光度（破線）、およびＦ１＋２ペプチ
ド／アルカリホスファターゼ結合体を用いた増幅検出系
において５４０nmで得られた吸光度（実線）から試験特
異的バックグランド反応（混合物中にＦ１＋２ペプチド
は存在しない）を差し引いた値を示す。
Claims (24)
- 【請求項１】 生物学的液体サンプル中の被検物質の免
疫化学的検出方法において以下の工程、すなわち、 ａ） 被検物質の第一の非標識特異的結合パートナー
を、ピペットで吸引可能な粒状固相上に固定化する工
程、 ｂ） 固定化された非標識特異的結合パートナーにサン
プルを添加する工程、 ｃ） 反応混合物の１回目のインキュベーションを行う
工程、 ｄ） 標識された特異的検出物質（結合体）の既定量を
添加する工程、 ｅ） 反応混合物の２回目のインキュベーションを行う
工程、 ｆ） 以下の物質（沈殿物質） ｉ） 固相に向けられた特異的結合パートナー ii） 検出すべき物質に向けられた特異的結合パートナ
ー iii） 固相上に固定化された繋留物質に向けられた特
異的結合パートナー （これらの特異的結合パートナーは第一の特異的結合パ
ートナーとは異なる種からのものであることが好まし
い）よりなる群からの物質の少なくとも１種を添加して
固相を沈殿させる工程、 ｇ） 反応混合物を好ましくは１０〜１０００×ｇ、と
くに好ましくは２００〜８００×ｇで遠心分離する工
程、 ｈ） 工程ｇ）で生じた上清の少なくとも一部を第二の
測定チャンバーに移す工程、 ｉ） 第二の測定チャンバーにおいて検出反応を開始す
る工程、 ｊ） 検出反応から被検物質の濃度を決定する工程 を包含する方法。 - 【請求項２】 標識された特異的検出物質は標識された
被検物質である請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 標識された特異的検出物質は被検物質に
対する少なくとも１種の付加的な標識特異的結合パート
ナーである請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 検出すべき被検物質は１個または２個以
上の特異的エピトープを有するハプテンまたはタンパク
質である請求項１〜３の少なくとも一つに記載の方法。 - 【請求項５】 被検物質は１個のみの特異的エピトープ
を有するタンパク質である請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】 被検物質は、天然たとえば動物もしくは
ヒト材料から単離されたかまたは遺伝子操作もしくは合
成によって製造された請求項２に記載の方法。 - 【請求項７】 被検物質は検出が望まれる被検物質に部
分的にのみ一致するかまたは化学的もしくは生化学的に
改変されている請求項２に記載の方法。 - 【請求項８】 高親和性結合パートナーは以下の物質、
すなわち抗体、レクチン、アビジン、ストレプトアビジ
ン、ビオチン、もしくはそれらの誘導体、補体因子Ｃ
１、マンナン−結合タンパク質または補因子からなる群
より選択される請求項３に記載の方法。 - 【請求項９】 検出可能な標識は放射化学的に検出可能
な元素、蛍光もしくは化学発光化合物、または適当な二
次的反応によって検出可能な酵素もしくは補因子である
請求項１に記載の方法。 - 【請求項１０】 酵素、好ましくはアルカリホスファタ
ーゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼが標識として用
いられる請求項９に記載の方法。 - 【請求項１１】 免疫複合体の形成は硫酸デキストラン
および／またはポリエチレングリコールによって加速さ
れる請求項１に記載の方法。 - 【請求項１２】 沈殿物質は被検物質に向けられている
請求項２に記載の方法。 - 【請求項１３】 結合体は沈殿物質と反応しない標識さ
れた改変被検物質からなる請求項１２に記載の方法。 - 【請求項１４】 沈殿物質はさらに第一の非標識特異的
結合パートナーに付加的にカップリングされる物質に向
けられる請求項１に記載の方法。 - 【請求項１５】 沈殿物質は沈降速度を増大させるため
に、不溶性の固相上にそれ自体が固定化される請求項１
〜１４の一つに記載の方法。 - 【請求項１６】 第一の非標識特異的結合パートナーは
固相には結合しない請求項１５に記載の方法。 - 【請求項１７】 固定化に用いられる固相は、本技術分
野の熟練者にそれ自体既知の、ガラス、ゼラチン、アガ
ロース、脂質、赤血球、血小板、白血球、金属コロイド
および好ましくは磁化可能な合成材料のような粒子の群
より選択される請求項１５に記載の方法。 - 【請求項１８】 合成粒子は、ポリスチレン、ポリデキ
ストラン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ
化ビニリデン、ポリアクリルアミドまたはスチレン−ブ
タジレン、スチレン−メタクリル酸もしくはメタクリレ
ート−メタクリル酸の共重合体からなる群より選択され
る請求項１７に記載の方法。 - 【請求項１９】 沈殿物質は、抗体、レクチン、基質も
しくはその類縁体、アビジン、ストレプトアビジン、ビ
オチンもしくはその誘導体、補体因子Ｃ１、マンナン−
結合タンパク質、補因子または所望の反応パートナーと
の特異的結合に加わる他の物質である請求項１に記載の
方法。 - 【請求項２０】 沈殿物質は抗体である請求項１９に記
載の方法。 - 【請求項２１】 沈殿反応（ｆ）は反応メジウムを変更
することによって加速する請求項１に記載の方法。 - 【請求項２２】 分離はpHを変化えることにより加速す
る請求項２１に記載の方法。 - 【請求項２３】 細胞をピペットで吸引可能な粒状固相
として使用し、これらの細胞の１種または２種以上の表
面抗原に対する抗体を沈殿物質として使用する請求項１
に記載の方法。 - 【請求項２４】 磁化可能な粒子をピペットで吸引可能
な粒状固相として使用し、磁性粒子を沈殿物質として使
用するか、またはその逆の方法で、磁性粒子を固相とし
て使用し、他の磁性粒子または磁化可能な粒子を沈殿の
ために使用する請求項１に記載の方法。
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| DE4440487A DE4440487A1 (de) | 1994-11-12 | 1994-11-12 | Heterogener Immunoassay mittels präzipitierbarer Festphase |
| DE4440487:5 | 1994-11-12 |
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|---|---|
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ID=6533177
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|---|---|---|---|
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|---|---|
| US (1) | US6143575A (ja) |
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| CA (1) | CA2162660A1 (ja) |
| DE (2) | DE4440487A1 (ja) |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007155549A (ja) * | 2005-12-06 | 2007-06-21 | Hitachi Maxell Ltd | 赤外蛍光粒子を用いた定量方法 |
| JP2012198125A (ja) * | 2011-03-22 | 2012-10-18 | Sanyo Chem Ind Ltd | 免疫測定法 |
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|---|---|---|---|---|
| AU2001237068A1 (en) * | 2000-02-18 | 2001-08-27 | Jagat Narula | Detection of microbial deposition and immune response at the basement membrane |
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| ES2498790B2 (es) * | 2013-03-20 | 2015-06-25 | Dropsens, S.L. | Procedimiento para la detección magneto-electroquímica sin lavados de un analito en una muestra |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DD152424A1 (de) * | 1980-07-30 | 1981-11-25 | Manfred Ziegler | Verfahren zur trennung des freien und antikoerpergebundenen liganden fuer labelled-ligand-immunoassays |
| EP0101228B1 (en) * | 1982-08-06 | 1986-10-08 | International Institute Of Cellular And Molecular Pathology (Icp) | Particle agglutination assay of antigens |
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| US4636479A (en) * | 1983-04-20 | 1987-01-13 | Cooper-Lipotech, Inc. | Enhanced agglutination method and kit |
| US4554088A (en) * | 1983-05-12 | 1985-11-19 | Advanced Magnetics Inc. | Magnetic particles for use in separations |
| US4590169A (en) * | 1983-11-18 | 1986-05-20 | Beckman Instruments, Inc. | Direct particle agglutination immunoassays avoiding false negatives at high antigen concentrations |
| GB2158578B (en) * | 1984-05-08 | 1988-03-09 | Farmos Group Ltd | Immunometric method for the determination of a hapten |
| US4720465A (en) * | 1985-05-14 | 1988-01-19 | Fisher Scientific Company | Centrifugal kinetic agglutination assay |
| JPS6385358A (ja) * | 1986-09-29 | 1988-04-15 | Eiken Kagaku Kk | 血中遊離型トリヨ−ドサイロニンの酵素免疫測定法 |
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| JPH01312463A (ja) * | 1988-06-10 | 1989-12-18 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | 免疫学的測定法 |
| DE68910828T2 (de) * | 1988-08-02 | 1994-05-11 | London Biotechnology Ltd | Ein verstärkungs-testverfahren für hydrolase-enzyme. |
| DE69203080T2 (de) * | 1991-06-17 | 1996-02-01 | Dade International Inc., Deerfield, Ill. | Verfahren zur Herstellung magnetisch empfindlicherPolymerpartikel und ihre Anwendung. |
| DE4211351A1 (de) * | 1992-04-04 | 1993-10-07 | Behringwerke Ag | Verfahren zur Analyse partikelverstärkter Agglutinationsreaktionen auf Zentrifugalanalysatoren durch Bestimmung der Trübungsaufhellung |
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-
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-
1995
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- 1995-10-13 ES ES95116177T patent/ES2172547T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-10-13 DE DE59510050T patent/DE59510050D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-10-13 EP EP95116177A patent/EP0713094B1/de not_active Expired - Lifetime
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