JPH0822820B2 - 放出が制御されたインプラント及びその製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、受容者に制御した連続的な割合で生物活性
組換え成長ホルモンを投与するように適合させた制御放
出組織片（インプラント）の製造方法に関する。さらに
詳しくは、本発明は、DNA技術により製造した牛の成長
ホルモンおよび豚の成長ホルモンを制御放出装置での使
用に適した形に精製する方法に関する。

成長ホルモンは、脂肪，炭水化物および鉱物代謝の
他、蛋白質代謝の調節に関わっている蛋白質である。成
長ホルモンは、体内のエネルギー生産のために脂肪酸の
使用割合を増加させ炭水化物の使用割合を減少させるこ
とによる他に、細胞の蛋白質合成速度を増加させ、かつ
蛋白質合成を減少させることによって代謝プロセスに影
響を及ぼしている。

牛の成長ホルモン（BGH）および豚の成長ホルモン（P
GH）は191個のアミノ酸残基を含む蛋白質である。これ
らの蛋白質はアミノ末端に付いた26個の付加的アミノ酸
残基を有する「前成長ホルモン」として前部脳下垂体で
合成される。これら26のアミノ酸残基の配列は、脳下垂
体からの分泌に先立って分割され、成熟ホルモンを生じ
る。脳下垂体からの精製したBGHを使った実地試験で
は、ホルモンを投与した雌牛の乳汁生産が増加し、飼料
−乳汁変換が改善されることが証明された〔マクリン、
L.J.（Machlin,L.J.）、ジャーナルオブディリーサイエ
ンス（Journal of Dairy Science）、56:575〜580（197
3）〕。このホルモンの潜在的経済価値は、手頃な費用
で商業的量のBGHを得ることに関心を起こさせた。天然P
GHの実地試験では、ホルモンを受けている若豚は成長速
度が増加することが明らかになった。

そのため、近年、多くの研究は、組換えDNA技術を使
ってこれら商業的価値のあるホルモンを微生物学的に合
成しようということに焦点をおいている。当業界で周知
の遺伝子分枝系形成および操作技術が、BGHおよびPGHの
合成を支配することのできる組換え発現ベクトルの製造
に使用されている。例えば、調節システムに関連したBG
H−暗号化cDNAで形質変換した微生物は所望のホルモン
を製造することが明らかになっている。ケシェット（Ke
shet）ら、（ヌークレィックアシッズリサーチ（Nuclei
c Acids Research）、９:19〜30〔1981〕）は、pBR322
−暗号化β−ラクタマーゼの部分を有する融解蛋白質と
しての十分な長さのBGHポリペプチドの大腸菌（E.col
i）における分枝系形成および低レベルの発現を報告し
た。ヨーロッパ特許公開第0103395号には、削除された
アミノ酸末端部分を変化させるBGHペプチドを暗号化す
るベクトルを含む幾つかの発現ベクトルの構築が記載さ
れている。削除された成熟ホルモンの末端部分を変化さ
せるBGHは、生理活性を保持し、かつ、上記の発現シス
テムにおいて完全なホルモンよりはるかに高い水準で発
現されることがわかった。

従来、BGHの牛への投与およびPGHの豚への投与は、か
ろうじて成功しているにすぎない。当業界で周知の薬剤
の放出方法には、口経，鼻，直腸、局所および非経口注
入経路の投与がある。しかし、これらの方法で牛や豚に
薬剤を投与することは、毎日を基準にして大集団の家畜
の各々に薬剤を投与するのに費用と時間が大いにかかる
という理由から不都合である。

皮下投与組織片は、各家畜に組換えBGHおよびPGHの持
続した有効な投与量を投与する代替方法を提供する。組
織片は、ホルモンを通す保護壁で囲まれたホルモン貯蔵
器を有している。これらの放出システムの利点は、長期
間にわたり家畜へのホルモンの制御されかつ予測できる
放出割合を提供することにある。不幸なことに、我々
は、発酵培地中の組換え微生物が製造するBGHおよびPGH
を含む制御された放出考案は、内植後、膨潤や部分的壊
変を受けやすいことを発見した。この現象は組織片中の
ホルモンを希釈し、ホルモンの放出割合に逆の影響を及
ぼす。従って、制御された放出組織片に有効に組み入れ
ることのできる形で組換え成長ホルモンを製造する方法
の商業的必要はまだ続いている。

本発明は、受容体動物への成長ホルモンの制御されか
つ持続的な投与のための改良された組織片に関する。組
織片は、組換えDNA技術で製造した成長促進量の動物成
長ホルモンを含有する圧縮組成物から作られる。より詳
細には、本発明は、組換えDNA技術で製造した牛の成長
ホルモンおよび豚の成長ホルモンを、制御された放出組
織片での使用に適した形に精製し濃縮する方法に関す
る。動物への成長ホルモン投与のための制御された放出
組織片の製造方法も開示する。本発明の方法は、成長ホ
ルモンの塩レベルを重量で５％未満に低下させると、組
換え成長ホルモンを制御−放出組織片へ組み入れる場合
に従来出合っていた膨潤問題を除去できるという我々の
発見に基づくものである。天然の成長ホルモンと違って
組換え生成物は、回収操作で使用する緩衝液中の塩の結
果として大いに存在する多量の塩を含んでいる。

塩の大部分を除去することに加え、本発明は、生理学
的環境において湿った場合に組織片内の生理学的pHが7.
4という結果になる緩衝塩の存在下、組換え成長ホルモ
ンを製造する方法に関する。本発明のこの様相は、組織
片とその生体内環境との間のpH勾配が発展するのを防
ぐ。

本発明の方法に従うと、発酵培地中の形質変換体微生
物から回収される動物成長ホルモンを、成長ホルモン中
に存在する塩の量が５％未満になるまで塩基性から生理
学的pHまでのpHを有する透析緩衝液に対して透析する。
塩を除去するための透析以外の方法、例えばサイズ排除
クロマトグラフィーでも、低塩生成物が生成しうる。こ
のように製造した低塩成長ホルモンを凍結乾燥した後、
生物相容性ポリマーと混合し、皮下に内植しうる単位投
与量の形に圧縮することのできる組成物を製造する。
「生理学的pH」とは、pH約7.4のことを言う。

我々は、動物に投与するための制御された放出組織片
に適した成長ホルモンの新規製造法を開発した。より詳
細には、本発明は、塩を除去し、組換えDNA技術で製造
した牛の成長ホルモンあるいは豚の成長ホルモンを濃縮
し、結果的に皮下内植のための制御された放出組織片で
の使用に適した組成物を得る方法を提供するものであ
る。本明細書で使用しているように、「牛の成長ホルモ
ン」、「BGH」、「豚の成長ホルモン」、および「PGH」
には、例えば、削除されたホルモンのアミノ末端の変化
部分を有するような、またはポリペプチドの生物活性を
破壊しないBGHおよびPGH配列における様々な置換や修飾
を受けるようなホルモンの断片が含まれる。ホルモンの
様々なアミノ末端部分が欠けているBGHおよびPGHポリペ
プチドは、生物活性を保持していることが明らかになっ
ている。

BGHおよびPGH遺伝子の分枝系形成および微生物による
発現は、従来の分子生物学の技術を使って行うことがで
きる。形質変換した微生物中にBGHおよびPGHを発現させ
るプラスミドは、成長ホルモン−暗号化に適したプラス
ミドであればどれでもよい。宿主微生物はグラム陽性ま
たはグラム陰性のどちらでもよい。グラム陰性微生物に
は、エシエリヒア属（Escherichia）から選択したもの
が含まれる。グラム陽性微生物としては、バチルス属
（Bacillus）およびストレプトマイシス属（Streptomyc
es）から選択したものが挙げられる。使用する正確な宿
主微生物は重要ではない。

本発明の方法で使用するBGHを製造する際、我々は、
第１プラスミド、pL−mu−Δ9C143で形質変換した大腸
菌（E.coli）宿主菌株HB101またはMC1061を使用した
が、この第１プラスミドは、ファージラムダプロモータ
ーおよび第２プラスミド、pCI857の支配下で、９個のＮ
−末端アミノ酸を欠いた牛の成長ホルモンを指定するも
ので、かつＮ−末端にセリンのコドンを有しており、第
２プラスミドは温度感受性ファージラムダリプレッサー
蛋白質の遺伝情報を指定する。この種の形質変換体菌株
の構築については、ヨーロッパ特許公開第0103395号に
詳細に記載されている。大腸菌（E.coli）IMCNo.1と同
定されたHB101形質変換体菌株は、メリーランド州、ロ
ックビルの米国基準培養保存機関（American Type Cult
ure Collection）に登録番号ATCC53030として寄託され
た。しかし、本発明の方法は、どんな寄主／ベクトルの
組合せで製造した組換えBGHの精製にも等しく適用でき
ることは容易に明らかであろう。

PGHの製造では、我々は、第１プラスミド、P_L−mu−
Δ7SGH、で形質変換した大腸菌（E.coli）宿主菌株HB10
1を使用したが、この第１プラスミドは、ファージラム
ダプロモーターおよび第２プラスミド、PCI857の支配下
で、７個のＮ−末端アミノ酸を欠いた豚の成長ホルモン
の遺伝情報を指定し、第２プラスミドは、本発明の方法
においてPGHを制御するために用いる温度感受性リプレ
ッサーを指定する。大腸菌（E.coli）IMCNo.2と同定さ
れたこの形質変換体菌株は、メリーランド州、ロックビ
ルの米国基準培養保存機関（American Type Culture Co
llection）に登録番号53031として寄託された。

分枝系を形成した組換えBGHまたはPGH遺伝子の微生物
培養における発現の後、成長ホルモン製剤を様々な予備
的分画技術を使って回収してもよい。形質変換体微生物
により十分な量の組換えBGHまたはPGHが発現した場合
は、通常、細胞を遠心分離により大部分の培地から分離
する。このように、発現蛋白質は、大腸菌のような非分
泌宿主の場合には細胞から、あるいは枯草菌（B.subtil
is）のような分泌宿主の場合には培地から得られる。大
腸菌などの非分泌宿主の場合、蛋白質を放出させるため
に細胞を崩壊しなくてはならない。例えばクレンチプレ
ス、あるいはマントン−ガウリンホモジナイザーを使っ
て機械的に崩壊させることもできるし、また化学的に崩
壊させることもできる。本発明の精製方法を受ける組成
物には（微生物が製造した蛋白質の他に）形質変換体宿
主微生物によって発現したその他の蛋白質、宿主微生物
の残存構造蛋白質、内毒素を含む微生物中間代謝物、発
酵培地の残存成分、および発酵や発現の結果生じるその
他の残存物質が含まれてもよい。細胞破壊が完了してか
ら、BGHまたはPGHを細胞破片から分離し、不純物を遠心
分離、大規模クロマトグラフィー、およびバッチ抽出法
などの方法により分離してもよい。

前に示したように、本発明の回収操作の段階は、組換
えBGHまたはPGHを透析し、次いで凍結乾燥するものであ
る。本明細書中で使用しているように、“透析”とは、
半透過性膜の片側に所望の成長ホルモン分子を保持しな
がら、塩イオンを選択的にその膜を通して輸送すること
によって成長ホルモン溶液から塩を除去する技術を言
う。様々な型の装置を使って、周知の透析法を用いるこ
とができる。例えば、蛋白質溶液中の小分子は中空ファ
イバー限外過システムを使って、透析あるいは限外
過することができる。この方法では、低イオン強度の透
析緩衝液を半透過性中空ファイバーの束に通す。ファイ
バーをとりまく蛋白質溶液中の小分子は、蛋白質溶液の
イオン強度を低下させるように膜状ファイバー壁を通る
ことができる。

小規模透過のための従来の透過技術は、組換えBGH試
料を緩衝液に添加し、この混合液を半透過性透析管の端
をそれぞれ結んで作った嚢の中に入れるものである。BG
Hを入れた密封管を、BGHが少くとも95％塩を含まなくな
るまで徐々に低い濃度の緩衝液に対して透析する。緩衝
液は塩化ナトリウムを含まないのが好ましい。透析緩衝
液のpHを9.6〜10.0の範囲内、好適には9.8に維持する。
温度は一般に５〜15℃の範囲に保つ。特に有用な緩衝液
は、組成が25mM NaHCO₃、21mM Na₂CO₃の炭酸水素ナト
リウム／炭酸ナトリウムである。この緩衝液は「コーネ
ル緩衝マイナス塩化ナトリウム」と呼ばれており、記号
CB^-で示される。BGHは、濃縮緩衝液から希釈緩衝液へ直
接透析してもよく、あるいははるかに希釈の少ない緩衝
液から希釈緩衝液へ段階的透析によって透析してもよ
い。これらの方法は、塩を除去し、イオン強度を低下さ
せるのに有効である。

大規模のBGH処理に有用な方法では、BGHの精製希釈溶
液（一般には1.0mg/ml未満）を、分子量10,000未満の分
子の大部分を通す膜を使った交差流動膜過装置（アミ
コンDC−10装置など）で1.0mg/ml以上に濃縮する。その
結果得られたpH9.0のエタノールアミン緩衝液60mM中の
濃縮生成物溶液を、同様の膜装置を用いて、２容量の50
％強度CB^-、次に５容量の２％強度CB^-に対し透析する。
その結果得られる２％CB^-緩衝液中の生成物保持物を次
にさらに５〜20mg/mlの最終生成物濃度に濃縮する凍結
乾燥する前にこの最終濃縮物を遠心分離にかけて不純物
をとり除き、次いで0.2μの微孔過を行う。

上記の方法は一般に、60〜80％の回収効率を達成で
き、得られる凍結乾燥生成物は５％未満の塩を含む（pH
9.8）。

凍結段階では、BGH溶液を浅皿に入れ、高真空小室の
棚に置く。冷凍中は棚を約−40℃の温度に冷凍し続け
る。水物質の昇華中は棚の温度を約25℃に保つ。

精製方法の各工程の後、組換え成長ホルモン生成物の
同定を適切な方法で確認することができる。簡便な方法
は、生成物を溶解し、生物−放射線蛋白質検定、および
放射線受容体検定を行うものである。

豚の成長ホルモンは、BGHで用いた前述の方法によっ
て回収できる。しかし、PGHの好適な方法では、約7.4の
生理学的pHを有する緩衝液に対してPGH試料を透析する
必要がある。この緩衝液の組成は以下の通りである。

２〜5mMトリス pH＝HClで調製した7.4 トリス＝（トリス（ハイドロキシメチル）アミノ−メタ
ン） PGHを処理するための好適な方法では、PGHの精製希釈
溶液（一般には1.0mg/ml未満）を、分子量10,000未満の
ほとんどの分子を通す膜を用いて交差流動膜過装置
（アミコンDC−10装置など）で1.0mg/ml以上になるよう
に濃縮する。得られたpH9.0のエタノールアミン緩衝液
6.0mM中の濃縮生成物溶液を同様の膜装置を使って、５
容量の２〜5mM濃度、pH7.4のトリス緩衝液に対して透析
する。

その結果得られる２〜5mMトリス緩衝液中の生成物保
持物を次にさらに５〜20mg/mlの最終濃度に濃縮する凍
結乾燥する前に、最終濃縮物を遠心分離にかけて不純物
を取り除き、次いで0.2μの微孔過にかける。

前述の方法により、pH7.4の塩が５％未満の最終凍結
乾燥生成物が製造される。回収率はCB^-緩衝液のPGH仕上
げに匹敵するが、BGHの場合より低い。

透析の後、PGH溶液をBGHで述べたように凍結乾燥す
る。

凍結乾燥したBGHまたはPGHは、以下の節に述べるよう
に皮下投与用の組織片に組入れることができる。

固体組織片からの成長ホルモン（GH）を制御して投与
するためには、GH、充てん剤としてのポリマー、および
その他適切な添加剤から成るマトリックスを得ることが
有利である。ポリマー性充てん剤はGHと生物相溶性およ
び相溶性があることが重要である。例えば、ポリマーが
あまりに疎水性であると、GHと強く結合しすぎて、蛋白
質は容易に放出されない。極端な場合には、GHは疎水性
マトリックスにより変性して、不活性になってしまうこ
ともある。反対に、ポリマーがあまりに親水性である場
合には、組織片への水の侵透が急速になりうる。湿った
組織片はGHの凝集を促進する場合があり、その結果、溶
解性および／または生物活性が低下しうる。従って、理
想的なポリマー性充てん剤は、疎水力と親和力との間の
平衡を示すものでなければならない。

エチルセルロース（EC）は、GHを含む組織片のポリマ
ー性充てん剤の要件に適合する市販の水溶性ポリマーで
ある。これは、水酸基を部分的にエーテル化したセルロ
ースの誘導体である。水酸基はポリマーに親水性を与え
るが、エーテル基は疎水性を与える。ECのもう一つの利
点は、湿った組織片中のGHを安定させ、蛋白質の凝集を
最小限にとどめる無置換水酸基の存在である。第三の利
点はECが、錠剤調製において結合剤として働くことであ
る。マトリックス中のECの量を調節することにより、固
体ペレットの凝固を抑制することができる。これは、組
織片への水の侵透およびペレットの崩壊を抑制するため
に使用することができる。

こわれやすい蛋白質であるGHは、有機溶媒と接触する
と簡単に変性する。従来の錠剤調製では通常、薬剤をポ
リマー性充てん剤と混合し、乾燥して粒状にする。これ
は、個体組織片としてのGHの製造には望ましくない。EC
は、GHと共に乾燥状態で作り出せ、従って、有機溶媒に
さらされて損害を受ける可能性を避けることができると
いう利点がある。

要約すると、ECは、GHを含む固体組織片の製造に非常
に有効でありうる。ECの量は、必要な放出プロフィルの
型によって10〜50％の範囲で変化させることができる。
また、ショ糖，ラクトース，ステアリン酸マグネシウム
等、従来の様々な目的の錠剤調製に使用されているその
他の適当な添加物と組合せて使用することもできる。

唯一の図面について言うと、BGHを組合わせた代表的
な制御放出組織片は、次のように製造することができ
る。BGH（75部；粒径:150〜250ミクロン）およびEC（25
部；粒径:150〜250ミクロン）をボルテックス振とう器
を用いてバイアル中で混合する。マトリックスをストー
ク機械を使ってペレット状にし、重さ50mg、直径4.0m
m、長さ3.9mmの円柱状ペレットを得る。ペレットを微孔
性ポリエチレン（MPE）管に入れ、管の端を無孔性ポリ
エチレン膜で密封する。得られるGHの制御放出用の円筒
状組織片を、唯一の図面の断面図で説明する。円筒状組
織片には、微孔性ポリエチレン膜の放出表面12が円筒の
長さに沿って取り囲んでいる中央核ペレット10がある。
円筒の端に無孔性ポリエチレンの非放出性表面14があ
る。

家畜での皮下注射内植では、MPEの放出表面12が組織
片の外へのBGHの拡散速度を低下させる障害物の役を果
たし、その結果ホルモンが長期間にわたって放出される
ことになる。所望ならば、その他の微孔性ポリマー膜を
MPEの代わりに使用してもよい。これらの例としては、
エチルセルロース、ポリカプロラクトン、およびポリメ
チルメタクリレートの微孔性膜が挙げられる。無孔性ポ
リエチレン（またはその他の無孔性ポリマー）の非放出
表面14は、BGHが組織片の端を通って放出するのを防ぐ
のに役立つ。

以下の実施例は本発明をさらに説明するのに役立つ
が、本発明はそれに限定されるものではない。

実施例１ 28℃の発酵培地で培地のA550が50〜60になるまで生長
させた後、温度を42℃に上げてBGHを発現させた大腸菌
（E.coli）（MC1061）形質変換細胞を溶解してΔ９ BG
Hを得た。不要な細胞物質を除去し、従来の蛋白質溶解
・精製技術によって回収した後、濃度100ppmのΔ9BGH水
溶液1500mlが得られた。この溶液を、分子量5000以下の
分子を通す膜を通して限外過を行ない、350mlに濃縮
した。溶液を遠心分離にかけて不純物を取り除き、上澄
み液を限外過により32mlに濃縮した。次にこの溶液を
約320mlのCB^-緩衝液（25mM NaHCO₃、21mM Na₂CO₃、pH
9.8）に対する袋透析により透析した。溶液を分子量10,
000以下の分子を通す膜を通して限外過し、6.2mlに濃
縮した。溶液を遠心分離と0.2μ微孔性フィルターを通
しての過により清澄にし蛋白質濃度が11.4mg/mlの溶
液6.2mlを得た。試料を1XCB^-中約2mg/mlに希釈し、10ml
の試料を、1600m１CB^-pH9.67に対してスペクトロポア
１（6,000〜8,000ダルトン切断）管で一晩透析した。塩
を除去するために生成物をさらに以下のように透析し
た。

生成物の1ml試料を、0.2XCB^-に対して４時間、次いで
0.05XCB^-に対して４時間、そして最後に0.01XCB^-に対し
て一晩、段階的に透析した。生成物のもう１つの1ml試
料を0.01XCB^-に対して直接透析した。透析後、各々の袋
を逆転して混合した。

1mlアリコートを各透析袋からとり出し、シラン化ガ
ラス液体−シンチレーションバイアルを分けるために移
転した。試料を乾燥した氷−アセトン中でシェル冷凍
し、約７ミクロンHgの圧力で一晩凍結乾燥した。

各々を透析し、次いで凍結乾燥した後、生成物の試料
をリン酸塩緩衝塩化ナトリウム水溶液（10mM Na₂HPO₄、
10mM NaH₂PO₄、140mM NaCl、pH7.4）中に溶解し、生成
物の純度を生物−放射線蛋白質検定および放射線受容体
検定により決定した。J.ロス（J.Roth）、メソッドイン
エンザイムノロジー（Methods in Enzymology）、37、
（1975）、66〜81（第４章）が記載しているように、放
射線受容体検定はBGHを含む試験試料と既知濃度の¹²⁵I
−標識BGHの試料を妊娠ウサギの肝臓膜成長ホルモン受
容体の小夥粒小胞の懸濁液で培養する。遠心分離により
結合標識を未結合標識から分離し、結合標識を含む遠心
分離ペレットをガンマカウンターに入れる。BGHの滴定
量を、標準曲線と比較することにより決定する。溶解度
および放射線受容体検定実験の結果を、直接または段階
的方法で透析した試料の他、透析を行なわなかった試料
についても表１に示す。Δ9BGHをリン酸塩緩衝塩化ナト
リウム水溶液中で透析，凍結乾燥および溶解した結果、
ホルモンの溶解度が92％以上保持され、ホルモンが95％
回収され、かつ、放射線受容体結合性が保持できた。

実施例２ 発酵培地で生育させた大腸菌（E.coli）IMCNo.1細胞
（ATCC53030）から、60mMエタノールアミン緩衝液中、
濃度が約150mg/Lの精製Δ9BGH100lを得た。分子量10,00
0以下の分子のほとんどを通す膜を備えた交差−流動膜
過装置（例えば、アミコンDC−10）で、溶液を約2100
mg/Lに濃縮した。その結果得られたpH9.0の60mMエタノ
ールアミン緩衝液中の濃縮生成物溶液を、2X容量の50％
強度CB^-緩衝液、次いで５容量の２％CB^-緩衝液に対して
透析した。得られた２％CB^-緩衝液中の保持物をさらに
アミコンDC−10装置で濃縮し、最終的価値14mg/mlとし
た。凍結乾燥を行う前に、最終濃縮物を遠心分離および
0.2ミクロン微孔性フィルターを通しての過を行って
不純物を取り除いた。

過溶液を凍結乾燥して、５％未満の塩を含有し、か
つ、脱イオン化水に添加した場合にはpH9.8の溶液とな
る生成物を得た。

上記の操作により約90％の収率が得られたが、より代
表的な収率は60〜80％である。

実施例３ 発酵培地で生育させた大腸菌（E.coli）IMCNo.2細胞
（ATCC53031）から、60mMエタノールアミン緩衝液中、
濃度が約80mg/Lの精製Δ7PGH63lを得た。分子量10,000
以下の分子のほとんどを通す膜を備えた交差−流動膜
過装置（例えば、アミコンCD−10）で、溶液を約800mg/
Lに濃縮した。その結果得られたpH9.0の60mMエタノール
アミン緩衝液中の濃縮生成物溶液を5X容量の濃度２〜5m
M、pH7.4のトリス・HCl緩衝液に対して透析した。得ら
れた２〜5mMトリス緩衝液中の生成物保持物を次にさら
にアミコンDC−10装置で濃縮し、最終的価値を2.5〜20m
g/mlとした。凍結乾燥を行なう前に、最終濃縮物を遠心
分離および0.2ミクロン微孔性フィルターを通しての
過により清澄にした。

過溶液を凍結乾燥させると、５％未満の塩を含有し
ており、かつ脱イオン化水に添加した場合にはpH7.4の
溶液となる生成物を得た。

pH7.4の緩衝塩の存在するPGHの組織片を約pH7.4の体
液で湿らせた場合、組織片からのPGHのはるかに予測で
きる放出速度を考慮すると、pHの勾配はほとんど、また
は全く存在しないはずである。

上記の操作では、少くとも60％以上の収率が得られ
た。

実施例４ 成長ホルモン組織片の製造のための製剤を次の成分か
ら調製した。成 分 重量％ BGHまたはPGH 30 ショ糖 40 エチルセルロース 30 この成分をバイアル中でボルテックススターラーを使
って混合する。混合液をストーク機械を使ってペレット
状にし、重量50mg、直径4.0mm長さ3.9mmの円筒状ペレッ
トを得る。ペレットを微孔性ポリエチレン管に入れ、そ
の端を無孔性ポリエチレンで密封する。

【図面の簡単な説明】

図面は、動物への成長ホルモンの制御された放出投与の
ための円筒状組織片の断面図である。 10…中央核ペレット、12…放出表面、14…非放出表面。

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ａ）発酵培地中の形質転換体微生物から
   動物成長ホルモンを回収すること、ただし、該形質転換
   体微生物は該動物成長ホルモンの遺伝情報を指定する発
   現性遺伝子を含有するものとすること、 （ｂ）前記発酵培地から回収した前記動物成長ホルモン
   中に存在する塩の量が５％未満になるまで該動物成長ホ
   ルモンを塩基性もしくは生理学的pHの透析緩衝液に対し
   て透析して低塩成長ホルモンを製造すること、 （ｃ）前記低塩成長ホルモンを凍結乾燥させること、 （ｄ）前記凍結乾燥した低塩成長ホルモンを相溶性ポリ
   マーと混合して圧縮性組成物を製造すること、 （ｅ）前記圧縮性組成物を、皮下に内植することのでき
   る単位投与量の形に圧縮することから成る、 成長ホルモンを動物に投与するための放出が制御された
   インプラントの製造方法。
2. 【請求項２】前記成長ホルモンを牛の成長ホルモンおよ
   び豚の成長ホルモンから選択する特許請求の範囲第１項
   に記載の方法。
3. 【請求項３】前記成長ホルモンは牛の成長ホルモンであ
   り、かつ前記成長ホルモンをCB^-緩衝液の進行性稀釈液
   に対して透析するが、透析緩衝液のpHは約9.8である特
   許請求の範囲第１項に記載の方法。
4. 【請求項４】前記成長ホルモンをCB^-緩衝液の1X、0.20
   X、0.05X及び0.01X稀釈液に対して順次透析する特許請
   求の範囲第１項に記載の方法。
5. 【請求項５】前記成長ホルモンは牛の成長ホルモンであ
   り、かつ前記成長ホルモンをCB^-緩衝液の0.01X、または
   0.02X稀釈液に対して直接透析するが、透析緩衝液のpH
   は約9.8である特許請求の範囲第１項に記載の方法。
6. 【請求項６】前記成長ホルモンは豚の成長ホルモンであ
   り、透析緩衝液はpH約7.4の２〜5mMトリスである特許請
   求の範囲第１項に記載の方法。
7. 【請求項７】前記相溶性ポリマーはエチルセルロースで
   ある特許請求の範囲第１項に記載の方法。
8. 【請求項８】形質転換体微生物中の成長ホルモンを指定
   する遺伝子の発現により生成された５％未満の塩を含む
   動物成長ホルモンと、相溶性ポリマーとを含む圧縮組成
   物から成る成長ホルモンを動物に投与するための放出が
   制御されたインプラント。
9. 【請求項９】前記圧縮組成物は円筒形であり、前記圧縮
   組成物は円筒の長さに沿って微孔性ポリマー膜で囲ま
   れ、その末端が無孔性ポリマー膜で密閉されている特許
   請求の範囲第８項に記載のインプラント。
10. 【請求項１０】前記成長ホルモンを牛の成長ホルモンお
    よび豚の成長ホルモンから選択する特許請求の範囲第９
    項に記載のインプラント。
11. 【請求項１１】前記相溶性ポリマーはエチルセルロース
    である特許請求の範囲第10項に記載のインプラント。
12. 【請求項１２】前記圧縮組成物が、30重量％の成長ホル
    モン、30重量％のエチルセルロースおよび40重量％のシ
    ョ糖を含む特許請求の範囲第10項に記載のインプラン
    ト。
13. 【請求項１３】前記微孔性ポリマーは微孔性ポリエチレ
    ンであり、前記無孔性ポリマーは無孔性ポリエチレンで
    ある特許請求の範囲第10項に記載のインプラント。