JPS6253928A - 放出が制御されたインプラント及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、受容者に制御した連続的な割合で生物活性組
換え成長ホルモンを投与するよ５に適合させた制御放出
組織片の製造方法に関する。さらに詳しくは、本発明は
、ＤＮＡ技術により製造した牛の成長ホルモンおよび豚
の成長ホルモンを制御放出装置での使用に適した形に精
製する方法に関する。

成長ホルモンは、脂肪、炭水化物および鉱物代謝の他、
蛋白質代謝の調節に関わっている蛋白質である。成長ホ
ルモンは、体内のエネルギー生産のために脂肪酸の使用
割合を増加させ炭水化物の使用割合を減少させることに
よる他に、細胞の蛋白質合成速度を増加させ、かつ蛋白
質合成を減少させることによって代謝プロセスに影響ヲ
及ぼしている。

牛の成長ホルモン（ＢＧＩ（）および豚の成長ホルモン
（ＰＧＨ）は１９１個のアミノ酸残基を含む蛋白質であ
る。これらの蛋白質はアミノ末端に付いた２６個の付加
的アミノ酸残基を有する「”前成長ホルモン」として前
部脳下垂体で合成される。

これら２６のアミノ酸残基の配列は、脳下垂体からの分
泌に先立って分割され、成熟ホルモンを生じる。脳下垂
体からの精製したＢＧＨを使っ７ｃ夷地試験では、ホル
モンを投与した雌牛の乳汁生産が増加し、飼料−乳汁変
換が改善されることが証明された〔マクリン、Ｌ、Ｊ、
（Ｍａｃｈｌｉｎ、　Ｌ、Ｊ、）、ジャーナルオブティ
リーサイエンス（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆｏａｉｒｙ　５
ｃｉｅｎｃｅ　）、５６：５７５〜５８０（１９７３）
）。

このホルモンの潜在的経済価値は、手頃な費用で商業重
置のＢＧＨを得ることに関心を起こさせた。

天然ＰＧＨの実地試験では、ホルモンを受けている若豚
は成長速度が増加することが明らかになったＯ そのため、近年、多くの研究は、組換えＤＮＡ技術を使
ってこれら商業的価値のあるホルモンを微生物学的に合
成しようということに焦点をおいている。当業界で周知
の遺伝子分校系形成および操作技術が、ＢＧＨおよびＰ
ＧＨの合成を支配することのできる組換え発現ベクトル
の製造に使用されている。例えば、調節システムに関連
したＢＧＨ−暗号化ＣＤＮＡで形質変換した微生物は所
望のホルモンを製造することが明らかになってい９：１
９〜３０［１９８１：））は、ｐＢＲ３２２−暗号化β
−ラクタマーゼの部分を有する融解蛋白質としての十分
な長さのＢＧＭポリペプチドの大腸菌（Ｌ、　ｃｎｊ−
）における分枝系形成および低レベルの頼現を報告した
。ヨーロッパ特許公開第０１（１３３９５号には、削除
されたアミノ酸末端部分を変化させるＢＧＨペプチドを
暗号化するベクトルを含む幾つかの発現ベクトルの構築
が記載されている。削除された成熟ホルモンの末端部分
を変化させるＢＧＨは、生理活性を保持し、かつ、上記
の発現システムにおいて完全なホルモンよりはるかに高
い水準で発現されることがわかった。

従来、ＢＧＨの牛への投与およびＰＧＨの豚への投与は
、かろうじて成功しているにすぎない。

当業界で周知の薬剤の放出方法には、ロ経、鼻。

直腸９局所および非経口注入経路の投与がある。

しかし、これらの方法で牛や豚に薬剤を投与することは
、毎日を基準にして大集団の家畜の各々に薬剤を投与す
るのに費用と時間が太いにかかるという理由から不都合
である。

皮下注射組織片は、各家畜に組換えＢＧＨおよびＰＣＨ
の持続した有効な投与蓋を投与する代替方法を提供する
。組織片は、ホルモンを通す保護壁で囲まれたホルモン
貯蔵器を有している。これらの放出システムの利点は、
長期間にわたり家畜へのホルモンの制御されかつ予測で
きる放出割合を提供することにある。不幸なことに、我
々は、発酵培地中の組換え微生物が製造するＢＧＨおよ
びＰＧＨな含む制御された放出考案は、内植後、膨潤や
部分的壊変を受けやすいことを発見した。

この現象は組織片中のホルモンを希釈し、ホルモンの放
出割合に逆の影響を及ぼす。従って、制御された放出組
織片に有効に組み入れることのできる形で組換え成長ホ
ルモンを製造する方法の商業的必要はまだ続いている。

本発明は、受容体動物への成長ホルモンの制御されかつ
持続的な投与のための改良された組織片に関する。組織
片は、組換えＤＮＡ技術で製造した成長促進量の動物成
長ホルモンを含有する圧縮組成物から作られる。より詳
細には、本発明は、組換えＤＮＡ技術で製造した牛の成
長ホルモンおよび豚の成長ホルモンを、制御された放出
組織片での使用に適した形に精製し濃縮する方法に関す
る。動物への成長ホルモン投与のための制御された放出
組織片の製造方法も開示する。本発明の方法は、成長ホ
ルモンの塩レベルをｉ量で５％未満に低下させると、組
換え成長ホルモンを制御−放出組織片へ組み入れる場合
に従来出合っていた膨潤問題を除去できるという我々の
発見に基づくものである。天然の成長ホルモンと違って
組換え生成物は、回収操作で使用する緩衝液中の塩の結
果として大いに存在する多量の塩を含んでいる。

塩の大部分を除去することに加え、本発明は、生理学的
環境において湿った場合に組織片内の生理学的ｐＨが７
．４という結果になる緩簀塩の存在下、組換え成長ホル
モンを製造する方法に関する。

本発明のこの様相は、組織片とその生体内環境との間の
ｐＨ勾配が発展するのを防ぐ。

本発明の方法に従うと、発酵培地中の形質変換体微生物
から回収される動物成長ホルモンを、成長ホルモン中に
存在する塩の量が５チ未満になるまで塩基性から生理学
的ｐＨまでのｐＨを有する透析緩衝液に対して透析する
。塩を除去するための透析以外の方法、例えばサイズ排
除クロマトグラフィーでも、低塩生成物が生成しうる。

このように製造した低塩成長ホルモンを凍結乾燥した後
、生物相容性ポリマーと混合し、皮下注射で内植しうる
単位投与量の形に圧縮することのできる組成物を製造す
る。［生理学的ｐＨＪとは、ｐＨ約７．４のことを言う
。

我々は、動物に投与するための制御された放出組織片に
適した成長ホルモンの新規製造法を開発した。より詳細
には、本発明は、塩を除去し、組換えＤＮＡ技術で製造
した牛の成長ホルモンあるいは豚の成長ホルモンを濃縮
し、結果的に皮下注射内植のための制御された放出組織
片での使用に適した組成物を得る方法を提供するもので
ある。

本明細書で使用しているように、「牛の成長ホルモン」
、ＩＢＧＨＪ、「豚の成長ホルモン」、およびｌ’−Ｐ
ＧＨＪには、例えば、削除されたホルモンのアミノ末端
の変化部分を有するような、またはポリペプチドの生物
活性を破壊しないＢＧＨおよびＰＧＨ配列における様々
な置換や修飾を受けるようなホルモンの断片が含まれる
。ホルモンの様々なアミノ末端部分が欠けているＢＧＨ
およびＰＧＨポリペプチドは、生物活性を保持している
ことが明らかになっている。

ＢＧＨおよびＰＧＨ遺伝子の分枝系形成および微生物に
よる発現は、従来の分子生物学の技術を使って行うこと
ができる。形質変換した微生物中にＢＧＨおよびＰＧＨ
を発現させるプラスミドは、成長ホルモン−暗号化に適
したプラスミドであればどれでもよい。宿主微生物はダ
ラム陽性またはダラム陰性のどちらでもよい。ダラム陰
性微生物には、エシェリヒア属（Ｈｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ　）から選択したものが含まれる。グラム陽性微生物
としては１、−＜　ｆ　Ａ／　、ｔ、属（即μ↓即）お
よびストレプトマイシろ属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
）から選択したものが挙げられる。使用する正確な宿主
微生物は重要ではない。

本発明の方法で使用するＢＧＨを製造する際、−我々は
、第１プラスミド、ｐＬ−ｍｕ−△９Ｃ１４３で形質変
換した大腸菌（Ｅ、ｃｏｌり宿主菌株ＨＢＩＯＩまたは
ＭＣ１０６１を使用したが、この第１プラスミドは、フ
ァージラムダプロモーターおよび第２プラスミド、ｐＣ
Ｉ８５７の支配下で、９個のＮ−末端アミノ酸を欠いた
牛の成長ホルモンを指定するもので、かつＮ−末端にセ
リンのコドンを有しており、第２プラスミドは温度感受
性ファージラムダリプレッサー蛋白質の遺伝情報を指定
する。この種の形質変換体菌株の構築については、ヨー
ロッパ特許公開第０１（１３３９５号に詳細に記載され
ている。大腸菌（澤ｏ１ｉ）　Ｉ　Ｍ　Ｃ隘１と同定さ
れたＨＢＩＯＩ形質変換体菌株は、メリーランド州、ロ
ックビルの米国基準培養保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ　
’ｌ”ｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ
　）に登録番号ＡＴＣＣ５３（１３０として寄託された
。

しかし、本発明の方法は、どんな寄主／ベクトルの組合
せで製造した組換えＢＧＨの精製にも等しく適用できる
ことは容易に明らかであろう。

ＰＧＨの製造では、我々は、第１プラスミド、ｐＬ−ｍ
ｕ−Δ７５ＧＨ１で形質変換した大腸菌（旦−５（（Ｌ
↓）宿主菌株ＨＢＩＯＩを使用したが、この第１プラス
ミドは、７アージラムダプロモーターおよび第２プラス
ミド、ＰＣｌ３５７の支配下で、７個のＮ−末端アミノ
酸を欠いた豚の成長ホルモンの遺伝情報を指定し、第２
プラスミドは、本発明の方法においてＰＧＨな制御する
ために用いる温度感受性リプレッサーを指定する。大腸
菌（Ｅ。

ｃｏｌｉ）　Ｉ　Ｍ　ＣＮａ　２と同定されたこの形質
変換体菌株は、メリーランド州、ロックビルの米国基準
培養保存機関（ＡｍｅｒｉＣａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔ
ｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に登録番号５３（１３
１として寄託された。

分校系を形成した組換えＢＧＨまたはＰＧＨ遺伝子の微
生物培養における発現の後、成長ホルモン製剤を様々な
予備的分画技術を使って回収してもよい。形質変換体微
生物により十分な量の組換えＢＧＨまたはＰＧＨが発現
した場合は、通常、細胞、を遠心分離により大部分の培
地から分離する。

このように、発現蛋白質は、大腸菌のような非分泌宿主
の場合には細胞から、あるいは枯草菌ＣＢ。

５ｕｔ）ｔｉｌｉｓ）のような分泌宿主の場合には培地
から得られる。大腸菌などの非分泌宿主の場合、蛋白質
を放出させるために細胞を崩壊しなくてはならない。例
えばフレンチプレス、あるいはマントン−ガラリンホモ
ジナイザーを使りて機械的に崩壊させることもできるし
、また化学的に崩壊させることもできる。本発明の精製
方法を受ける組成物には（微生物が製造した蛋白質の他
に）形質変換体宿主微生物によって発現したその他の蛋
白質、宿主微生物の残存構造蛋白質、内毒素を含む微生
物中間代謝物、発酵培地の残存成分、および発酵や発現
の結果生じるその他の残存物質が含まれてもよい。細胞
破壊が完了してから、ＢＧＨまたはＰＧＨを細胞破片か
ら分離し、不純物を遠心分離、大規模クロマトグラフィ
ー、およびバッチ抽出法などの方法により分離してもよ
い。

前に示したように、本発明の回収操作の段階は、組換え
ＢＧＨまたはＰＧＨを透析し、次いで凍結乾燥するもの
である。本明細書中で使用しているように、“透析”と
は、半透過性膜の片側に所望の成長ホルモン分子を保持
しながら、塩イオンを選択的にその膜を通して輸送する
ことによって成長ホルモン溶液から塩を除去する技術を
言う。様々な型の装置を使って、周知の透析法を用いる
ことができる。例えば、蛋白質溶液中の小分子は中空フ
ァイバー限外濾過システムを使って、透析あるいは限外
濾過することかできる。この方法では、低イオン強度の
透析緩衝液を半透過性中空ファイバーの束に通す。ファ
イバーをとりまく蛋白質溶液中の小分子は、蛋白質溶液
のイオン強度を低下させるように膜状ファイバー壁を通
ることができる０ 小規模透過のための従来の透過技術は、組換えＢＧＨ試
料欠緩衝液に添加し、この混合液を半透過性透析管の端
をそれぞれ結んで作った嚢の中に入れるものである。Ｂ
ＧＨを入れた密封管を、ＢＧＨが少くとも９５％塩を含
まなくなるまで徐々に・低い濃度の緩衝液に対して透析
する。緩衝液は塩化ナトリウムを含まないのが好ましい
。透析緩衝液のｐＨな９．６〜１０．０の範囲内、好適
には９．８に維持する。温度は一般に５〜１５℃の範囲
に保つ。特に有用な緩衝液は、組成が２５ｍＭＮａＨ（
Ｎ）、、２１　ｍＭ　　Ｎａ２ＣＯ，の炭酸水素ナトリ
ウム／炭酸す）　ＩＪウムである。この緩衝液は「コー
ネル緩衝マイナス塩化ナトリウム」と呼ばれており、記
号ＣＢ−で示される。ＢＧＨは二濃縮緩衝液から希釈緩
衝液へ直接透析してもよ（、あるいははるかに希釈の少
ない緩衝液から希釈緩衝液へ段階的透析によって透析し
てもよい。これらの方法は、塩を除去し、イオン強度を
低下させるのに有効である。

大規模のＢＧＨ処理に有用な方法では、ＢＧＨの精製希
釈溶液（一般には１．０■／ｄ未満）を、分子量１０，
０００未満の分子の大部分を通す膜を使った交差流動膜
ｆ過装置（アミコンＤＣ−１０装置など）で１．０■／
Ｍ以上に濃縮する。その結果得られたｐｉ（９，０のエ
タノールアミン緩衝液６０ｍＭ中の濃縮生成物溶液を、
同様の膜装置を用いて、２容量の５０多強度ＣＢ−″、
次に５容量の２％強度ＣＢ−に対し透析する。その結果
得られる２チＣＢ−緩衝液中の生成物保持物を次にさら
に５〜２０■／ｄの最終生成物濃度に濃縮する凍結乾燥
する前にこの最終濃縮物を遠心分離Ｋかけて不純物をと
り除き、次いで０．２μの微孔１過を行う。

上記の方法は一般に、６０〜８０チの回収効率を達成で
き、得られる凍結乾燥生成物は５−未満の塩を含む（ｐ
Ｈ９−８）。

凍結段階では、ＢＧＨ溶液な浅皿に入れ、高真空小室の
棚に置（。冷凍中は棚を約−４０℃の温度に冷凍し続け
る。水物質の昇華中は棚の温度を約２５℃に保つ。

精製方法の各工程の後、組換え成長ホルモン生成物の同
定を適切な方法で確認することかできる。

簡便な方法は、生成物を溶解し、生物−放射線蛋白質検
定、および放射線受容体検定を行うものである。

豚の成長ホルモンは、ＢＧＨで用いた前述の方法によっ
て回収できる。しかし、ＰＣＨの好適な方法では、約７
．４の生理学的ｐＨを有する緩衝液に対してＰＧＨ試料
を透析する必要がある。この緩衝液の組成は以下の通り
である。

２〜５ｍＭトリス ｐＨ＝Ｈｃｌで調整した７、４ トリス＝（トリス（ハイドロキシメチル）アミノ−メタ
ン） ＰＧＨな処理するための好適な方法では、ＰＧＨの精製
希釈溶液（一般には１．０■／　ｍｉ未満）を、分子量
１０，０００未満のほとんどの分子を通す膜を用いて交
差流動膜ｆ過装置（アミコンＤ　Ｃ−１０装置など）で
１．０■／−以上になるように濃縮する。得られたｐＨ
９，０のエタノールアミン緩衝液６０　ｍＭ中の濃縮生
成物溶液を同様の膜装置を使って、５容量の２〜５ｍＭ
濃度、ｐＨ７，４のトリス緩衝液に対して透析する。

その結果得られる２〜５ｍＭトリス緩衝液中の生成物保
持物を次にさらに５〜２０　ｍｇ　／　ｒｎｌの最終濃
度に濃縮する凍結乾燥する前に、最終濃縮物を遠心分離
にかけて不純物を取り除き、次いで０．２μの微孔ｆ過
にかける。

前述の方法により、ｐＨ７，４の塩が５％未満の最終凍
結乾燥生成物が製造される。回収率はＣＢ−緩衝液のＰ
ＧＨ仕上げに匹敵するが、ＢＧＨの場合より低い。

透析の後、Ｐ（、Ｈ溶液をＢＧＨで述べたように凍結乾
燥する。

凍結乾燥したＢＧＨまたはＰＧＨは、以下の節に述べる
ように皮下注射投与用の組織片に組入れることかできる
。

固体組織片からの成長ホルモン（ＧＨ）を制御して投与
するためには、ＧＨ，充てん剤としてのポリマー、およ
びその他適切な添加剤から成るマトリックスを得ること
が有利である。ポリマー性充てん剤はＧＨと生物相溶性
および相溶性があることが重要である。例えば、ポリマ
ーがあまりに疎水性であると、ＧＨと強く結合しすぎて
、蛋白質は容易に放出されない。極端な場合には、ＧＨ
は疎水性マトリックスにより変性して、不活性になって
しまうこともある。反対に、ポリマーがあまりに親水性
である場合には、組織片への水の侵透が急速になりうる
。湿った組織片はＧＨの凝集を促進する場合があり、そ
の結果、溶解性および／または生物活性が低下しうる。

従って、理想的なポリマー性充てん剤は、疎水力と親和
力との間の平衡を示すものでなければならない。

エチルセルロース（ＥＣ）は、ＧＨを含む組織片のポリ
マー性充てん剤の要件に適合する市販の水溶性ポリマー
である。これは、水酸基を部分的にエーテル化したセル
ロースの誘導体である。水酸基はポリマーに親水性を与
えるが、エーテル基は疎水性を与える。ＥＣのもう一つ
の利点は、湿った組織片中のＧＨな安定させ、蛋白質の
凝集を最小限にとどめる無置換水酸基の存在である。第
三の利点はＥＣが、錠剤調製において結合剤として働く
ことである。マトリックス中のＥＣの量を調節すること
により、固体ペレットの凝固を抑制することができろ。

これは１組織片への水の侵透およびペレットの崩壊を抑
制するために使用することができる。

こわれやすい蛋白質であるＧＨは、有機溶媒と接触する
と簡単に変性する。従来の錠剤調製では通常、薬剤をポ
リマー性充てん剤と混合し、乾燥して粒状にする。これ
は、個体組織片としてのＧＨの製造には望ましくない。

ＥＣは、ＧＨと共に乾燥状態で作り出せ、従って、有機
溶媒にさらされて損害を受ける可能性を避けることがで
きろという利点がある。

要約すると、ＥＣは、ＧＨを含む固体組織片の製造に非
常に有効でありうる。ＥＣの量は、必要な放出プロフィ
ルの型によって１０〜５０チの範囲で変化させることが
できる。また、シヨ糖、ラクトース、ステアリン酸マグ
ネシウム等、従来の様々な目的の錠剤調製に使用されて
いるその他の適当な添加物と組合せて使用することもで
きる。

唯一の図面について言うと、ＢＧＭを組合わせた代表的
な制御放出組織片は、次のように製造することができる
。ＢＧＨ（７５部；粒径：１５０〜２５０ミクロン）お
よびＥＣ（２５部；粒径：１５０〜２５０ミクロン）を
ポルテックス振とう器を用いてバイアル中で混合する。

マトリックスをストーク機械を使ってペレット状にし、
重さ５０■、直径４．９　ｍｍ　、長さ３．９ｍｍの円
柱状ペレットを得ろ。ペレットを微孔性ポリエチレン（
ＭＰＥ）管に入れ、管の端を無孔性ポリエチレン膜で密
封する。得られるＧＨの制御放出用の円筒状組織片を、
唯一の図面の簡単な説明する。円筒状組織片には、微孔
性ポリエチレン膜の放出表面１２が円筒の長さに沿って
取り囲んでいる中央核ペレット１０がある。円筒の端に
無孔性ポリエチレンの非放出性表面１４がある。

家畜での皮下注射内植では、ＭＰＥの放出表面１２が組
織片の外へのＢ　Ｇ　Ｈの拡散速度を低下させる障害物
の役を果たし、その結果ホルモンが長期間にわたって放
出されることになる。所望ならば、その他の微孔性ポリ
マー膜をＭＰＥの代わりに使用してもよい。これらの例
としては、エチルセルロース、ポリカプロラクトン、お
よびポリメチルメタクリレートの微孔性膜が挙げられる
。無孔性ポリエチレン（またはその他の無孔性ポリマー
）の非放出表面１４は、ＢＧＨが組織片の端を通って放
出するのを防ぐのに役立つ。

以下の実施例は本発明をさらに説明するのに役立つが、
本発明はそれに限定されるものではない。

実施例１ ２８℃の発酵培地で培地のＡ３５０が５０〜６０になる
まで生長させた後、温度を４２℃に上げてＢＧＨを発現
させた大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ　）　（ＭＣ１０６１）形
質変換細胞を溶解して△９　　ＢＧＨを得た。不要な細
胞物質を除去し、従来の蛋白質溶解・精製技術によって
回収した後、濃度１００　ｐｐｍの△９ＢＧＨ水溶液１
５００−が得られた。この溶液を、分子［５０００以下
の分子を通す膜を通して限外濾過を行ない、３５０−に
濃縮した。溶液を遠心分離にかけて不純物を取り除き、
上澄み液を限外濾過により３２献に濃縮した。次にこの
溶液を約３２０ｄのＣＢ−緩衝液（２５ｍ　Ｍ　　Ｎａ
ＨＣＯｓ、２１ｍＭ　　Ｎａ２ＣＣ）５、ｐＨ９，８）
に対する袋透析により透析した。溶液を分子［１０，０
００以下の分子を通す膜を通して限外濾過し、６．２ｄ
に濃縮した。溶液を遠心分離と０．２μ微孔性フイルタ
ーを通しての濾過により清澄にし蛋白質濃度が１１．４
■／　ｍｌの溶液６．２−を得た。試料をＩ　Ｘ　ＣＢ
−巾約２■／−に希釈し、１０１１１７の試料を、１６
００ｍ１ＩＸＣＢ−ｐＨ９，６７に対してスペクトロポ
ア１（６，０００〜ｓ、ｏｏｏダルトン切断）管で一晩
透析した。塩を除去するために生成物をざらに以下のよ
うに透析した〇 生成物の１−試料を、０．２　Ｘ　ＣＢ−に対して４時
間、次いで０．０５　Ｘ　ＣＢ−に対して４時間、そし
て最後に０．０１　Ｘ　ＣＢ−に対して一晩、段階的に
透析した。生成物のもう１つの１ｄ試料を０．０１ＸＣ
’Ｂに対しズ直接透析した。透析後、各々の袋を逆転し
て混合した。

１ゴアリコートを各透析袋からとり出し、シラン化ガラ
ス液体−シンテレーションノくイアルヲ分けるために移
転した。試料を乾燥した氷−アセトン中でシェル冷凍し
、約７ミクロンＨｇの圧力で一晩凍結乾燥した。

各々を透析し、次いで凍結乾燥した後、生成物の試料を
リン酸塩緩衝塩化ナトＩＪウム水溶液（１０ｍＭ　Ｎａ
２ＨＰＯ，，１０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯイ１４０ｍＭ　Ｎ
ａＣ１゜ｐＨ７，４）中に溶解し、生成物の純度を生物
−放射線蛋白質検定および放射線受容体検定により決定
した。Ｊ、ロス（Ｊ、　Ｒｏｔｈ　）　、メソッドイン
エンザイムノロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ　）、ピ、（１９７５）、６６〜８１（第
４章）が記載しているように、放射線受容体検定はＢＧ
Ｈを含む試験試料と既知濃度の１２５■−標識ＢＧＨの
試料を妊娠ウサギの肝臓膜成長ホルモン受容体の小移粒
小胞の懸濁液で培養する。遠心分離により結合標識を未
結合標識から分離し、結合標識を含む遠心分離ペレット
をカンマカウンターに入れる。ＢＧＨの滴定量を、標準
曲線と比較することにより決定する。

溶解度および放射線受容体結合性験の結果を、直接また
は段階的方法で透析した試料の他、透析を行なわなかっ
た試料についても表１に示す。Δ９ＢＧＨをリン酸塩緩
衝塩化ナトリウム水溶液中で透析、凍結乾燥および溶解
した結果、ホルモンの溶解度が９２％以上保持され、ホ
ルモンが９５％回収され、かつ、放射線受容体結合性が
保持できた。

実施例２ 発酵培地で生育させた大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　　Ｉ　
Ｍ　Ｃ嵐１細胞（ＡＴＣＣ５３（１３０）から、６０ｍ
Ｍエタノールアミン緩衝液中、濃度が約１５０■／Ｌの
精製△９ＢＧＨ１００Ａを得た。分子量１０゜０００以
下の分子のほとんどを通す膜を備えた交差−流動膜濾過
装置（例えば、アミコンＤＣ−１０）で、溶液を約２１
００■／Ｌに濃縮した。その結果得られたｐＨ９，０の
６０ｍＭエタノールアミン緩衝液中の濃縮生成物溶液を
、２Ｘ容量の５０係強度ＣＢ−緩衝液、次いで５容量の
２％ＣＢ−緩衝液に対して透析した。得られた２％ＣＢ
−緩衝液中の保持物をさらにアミコンＤＣ−１０装置で
濃縮し、最終的価値１４■／ｍ７！とした。凍結乾燥を
行う前に、最終濃縮物を遠心分離および０．２　ミクロ
ン微孔性フィルターを通しての濾過を行って不純物を取
り除いた。

濾過溶液を凍結乾燥して、５％未満の塩を含有し、かつ
、脱イオン化水に添加した場合にはｐＨ９，８の溶液と
なる生成物を得た。

上記の操作により約９０％の収率が得られたが、より代
表的な収率は６０〜８０％である。

実施例３ 発酵培地で生育させた大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｉ　Ｍ
　Ｃ１’１＆１２細胞（ＡＴＣＣ５３（１３０）から、
６０ｍＭエタノールアミン緩衝液中、濃度が約８０■／
Ｌの精製△７ＰＧＨ６３−６を得た。分子ｉ　１０，０
００以下の分子のほとんどを通す膜を備えた交差−流動
膜ｆ過装置（例えば、アミコンＣＤ−１０）で溶液を約
８００■／Ｌに濃縮した。その結果得られたｐＨ９，０
の６０ｍＭエタノールアミン緩衝液中の濃縮生成物溶液
を５Ｘ容量の０度２〜５ｍＭ、ｐＨ７，４のトリス・Ｈ
ＣＩ緩衝液に対して透析したつ得られた２〜５ｍＭ）！
Ｊス緩衝液中の生成物保持物を次にさらにアミコンＤＣ
−１０装置で濃縮し、最終価値を２．５〜２０ｍｇ／ｍ
ｌとした。凍結乾燥を行なう前に、最終濃縮物を遠心分
離および０．２ミクロン微孔性フィルターを通しての濾
過により清澄にした。

濾過溶液を凍結乾燥させると、５％未満の塩を含有して
おり、かつ脱イオン化水に添加した場合にはｐＨ７，４
の溶液となる生成物を得た。

ｐＨ７，４の緩衝塩の存在するＰＧＨの組織片を約ｐＨ
７，４の体液で湿らせた場合、組織片からのＰＧＨのは
るかに予測できる放出速度を考慮すると、ｐＨの勾配は
ほとんど、または全（存在しないはずである。

上記の操作では、少くとも６０チ以上の収率が得られた
。

実施例４ 成長ホルモン組織片の製造のための製剤を次の成分から
調製した。

成　　　分　　　　　　　　　　　重量％ＢＧＨまたは
ＰＧＨ３０ シヨ糖　　　　　　　　　４０ エチルセルロース　　　　　３０ この成分ナパイアル中でポルテックススターラーを便っ
て混合する。混合液をストーク機械を使ってペレット状
にし、重量５０■、直径４．０　ｍｍ長さ３．９ｍｍの
円筒状ペレットを得る。ペレットを微孔性ポリエチレン
管に入れ、その端を無孔性ポリエチレンで密封する。

【図面の簡単な説明】

図面は、動物への成長ホルモンの制御された放出投与の
ための円筒状組織片の断面図である。 １０・・・中央核ペレット、１２・・・放出表面、１４
・・・非放出表面。 特許出願人　　インターナシ９ナル・ミネラルズ・アン
ド・ケミカル・コーボレイション 代理人　弁理士　　　１）　澤　　博　　昭　（外２名
）手続補正書（自発）

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）発酵培地中の形質転換体微生物から動物成
   長ホルモンを回収すること、ただし、該形質転換体微生
   物は該動物成長ホルモンの遺伝情報を指定する発現性遺
   伝子を含有するものとすること、（ｂ）前記発酵培地か
   ら回収した成長ホルモン中に存在する塩の量が５％未満
   になるまで該動物成長ホルモンを塩基性もしくは生理学
   的ｐＨの透析緩衝液に対して透析して低塩成長ホルモン
   を製造すること、 （ｃ）前記低塩成長ホルモンを凍結乾燥させること、 （ｄ）凍結乾燥した低塩成長ホルモンを相溶性ポリマー
   と混合して圧縮性組成物を製造すること、（ｅ）前記組
   成物を、皮下注射で内植することのできる単位投与量の
   形に圧縮することから成る、成長ホルモンを動物に投与
   するための制御された放出組織片の製造方法。
2. （２）成長ホルモンを牛の成長ホルモンおよび豚の成長
   ホルモンから選択する特許請求の範囲第１項に記載の方
   法。
3. （３）成長ホルモンは牛の成長ホルモンであり、かつ成
   長ホルモンをＣＢ＾−緩衝液の進行性希釈物に対して透
   析するが、透析緩衝液のｐＨは約９．８である特許請求
   の範囲第１項に記載の方法。
4. （４）成長ホルモンをＣＢ＾−緩衝液の１Ｘ、０．２０
   Ｘ、０．０５Ｘおよび０．０１Ｘ希釈物に対して透析す
   る特許請求の範囲第１項に記載の方法。
5. （５）成長ホルモンは牛の成長ホルモンであり、かつ成
   長ホルモンをＣＢ＾−緩衝液の０．０１Ｘ、または０．
   ０２Ｘ希釈物に対して直接透析するが、透析緩衝液のｐ
   Ｈは約９．８である特許請求の範囲第１項に記載の方法
   。
6. （６）成長ホルモンは豚の成長ホルモンであり、透析緩
   衝液はｐＨ約７．４の２〜５ｍＭトリスである特許請求
   の範囲第１項に記載の方法。
7. （７）ポリマーはエチルセルロースである特許請求の範
   囲第１項に記載の方法。
8. （８）形質転換体微生物中のホルモンを指定する遺伝子
   の発現により製造した動物成長ホルモン、該成長ホルモ
   ンは５％未満の塩を含むものとする、および相溶性ポリ
   マーとから成る一般に円筒形の圧縮組成物から成り、該
   組成物は円筒の長さに沿って微孔性ポリマー膜で囲まれ
   ており、かつその末端が無孔性ポリマー膜で密閉されて
   いるものとする、受容者に成長ホルモンを制御しかつ連
   続して投与するための組織片。
9. （９）成長ホルモンを牛の成長ホルモンおよび豚の成長
   ホルモンから選択する特許請求の範囲第８項に記載の組
   織片。
10. （１０）相溶性ポリマーはエチルセルロースである特許
    請求の範囲第９項に記載の組織片。
11. （１１）圧縮組成物が、３０重量％の成長ホルモン、３
    ０重量％のエチルセルロースおよび４０重量％のショ糖
    を含む特許請求の範囲第９項に記載の組織片。
12. （１２）微孔性ポリマーは微孔性ポリエチレンであり、
    無孔性ポリマーは無孔性ポリエチレンである特許請求の
    範囲第９項に記載の組織片。
13. （１３）組換え成長ホルモンの緩衝溶液を、成長ホルモ
    ン中に存在する塩の量が５％未満になるまで塩基性ｐＨ
    あるいは生理学的ｐＨの透析緩衝液に対して透析するこ
    と、および透析した成長ホルモン溶液を凍結乾燥するこ
    とから成る、生物学的に活性な成長ホルモンを皮下注射
    投与用の組織片に取り込むのに適した形に精製および濃
    縮する方法。
14. （１４）成長ホルモンを牛の成長ホルモンおよび豚の成
    長ホルモンから選択する特許請求の範囲第１３項の方法
    。
15. （１５）成長ホルモンは牛の成長ホルモンであり、かつ
    成長ホルモンを塩化ナトリウムを含まないコーネル緩衝
    液の進行性希釈物に対して透析するが、透析緩衝液のｐ
    Ｈは約９．８である特許請求の範囲第１４項に記載の方
    法。
16. （１６）成長ホルモンをＣＢ＾−緩衝液の１Ｘ、０．２
    ０Ｘ、０．０５Ｘおよび０．０１Ｘ希釈物に対して継続
    的に透析する特許請求の範囲第１５項に記載の方法。
17. （１７）成長ホルモンをＣＢ＾−緩衝液の０．０１Ｘま
    たは０．０２Ｘ希釈物に対して直接的に透析するが、透
    析緩衝液のｐＨは約９．８である特許請求の範囲第１５
    項に記載の方法。
18. （１８）成長ホルモンは豚の成長ホルモンであり、透析
    緩衝液はｐＨ約７．４の２〜５ｍＭトリスである特許請
    求の範囲第１４項に記載の方法。