JPH08228791A - ストレプトアビジン様ポリペプチドの製造 - Google Patents

ストレプトアビジン様ポリペプチドの製造

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JPH08228791A JP8047976A JP4797696A JPH08228791A JP H08228791 A JPH08228791 A JP H08228791A JP 8047976 A JP8047976 A JP 8047976A JP 4797696 A JP4797696 A JP 4797696A JP H08228791 A JPH08228791 A JP H08228791A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 従来法によるストレプトアビジン産生におけ
る低収率を改善し、高純度のストレプトアビジン様ポリ
ペプチドおよびその誘導体を多量に供給して医薬および
その他の工業での種々の目的に使用することを可能為ら
しめる。 【解決手段】 ビオチンもしくはビオチン誘導体または
類縁体に結合し得るストレプトアビジンまたはその一部
をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡを調製
し、このＤＮＡを組換ＤＮＡ分子に組み込んで適当な宿
主を形質転換させ、その宿主を培養する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ストレプトアビジ
ン用ポリペプチドおよびその断片を製造するためのＤＮ
Ａ配列、組換ＤＮＡ分子および製造方法に関するもので
ある。さらに詳細には、本発明は、ストレプトアビジン
用ポリペプチドおよびその断片をコードするＤＮＡ配
列、並びにこれら配列を含有して適当な宿主中でこれら
ポリペプチドおよび断片を合成すると共に一つの具体例
ではこれらポリペプチドおよびこれに融合した他の生産
物を宿主細胞の膜を通して分泌させるのに使用する組換
ＤＮＡ分子に関するものである。
【０００２】本発明の他の具体例において、これらＤＮ
Ａ配列および組換ＤＮＡ分子は所望の蛋白、ポリペプチ
ド、ペプチドおよびアミノ酸との融合蛋白を製造するの
に使用することもでき、その際これら生産物をコードす
るＤＮＡ配列に結合させかつ得られたハイブリッド遺伝
子を適当な宿主で発現させる。使用する特定の構成およ
びストレプトアビジンＤＮＡ断片に応じて、これら融合
蛋白はこれらが産生された宿主の膜を通して分泌するこ
とができる。ここでも、使用する特定の構成およびスト
レプトアビジン断片に応じて、ビチオンおよびその誘導
体に対するストレプトアビジンの極めて強力な結合親和
性により特に容易に精製することができる。
【０００３】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】スト
レプトアビジンは、ストレプトミセス・アビジニイ（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎｉｉ）細菌およ
びその他のストレプトミセス菌種によって産生される構
成物質である〔Ｅ．Ｏ．スタップレー等、アンチマイク
ロビアル・エイジエンツ・アンド・ケモテラピー（１９
６３）、第２０−２７頁（Ｊ．Ｃ．シルベスター編（１
９６４）〕。これは約６０，０００ダルトンの分子量を
有する四元重合体として天然に生ずるものである。スト
レプトアビジンは、ビオチンおよびビオチン融合蛋白並
びにその同族体に対し強力な親和性を有することを特徴
とする。４族の同一なサブユニットのそれぞれは、単一
のビオチン結合部位を有する〔Ｋ．ホフマン等、プロシ
ーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、Ｕ
ＳＡ、第７７巻、第４６６６−６８頁（１９８０）〕；
Ｌ．チャイエストおよびＦ．Ｊ．ウルフ、アルキベス・
オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジック
ス、第１０６巻、第１−５頁（１９６４）〕 ビオチンに対する強力な親和性のため、ストレプトアビ
ジンは工業的にも基礎生物医学研究に応用してビオチン
要求性の酵素を研究するためにも幅広い用途を有し、さ
らにビオチニル化物質と一緒に使用してこれら物質と他
の物質との間の相互作用を研究するにも使用される
〔Ｋ．ホフマン、上記；同じくＥ．Ａ．バイエルおよび
Ｍ．ウィルチェック、メソッズ・オブ・バイオケミカル
・アナリシス、第２６巻、第１−４５頁（１９８０）；
Ｆ．Ｍ．フィン等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミ
ストリー、第２５５巻、第５７４２−４６頁（１９８
０）〕。現在、ストレプトアビジンは、これをストレプ
トミセス・アビジニイの細胞媒体から単離して工業的に
生産されている。ストレプトアビジニイからのストレプ
トアビジンの精製は、菌体培養物１ｌ当り僅か３〜４ｍ
ｇの極めて低い収率を与える。
【０００４】分子生物学における最近の進歩は、細菌宿
主において、異質蛋白を多量に産生することを可能にし
ている。これらは、たとえば白血球インタフェロン
〔Ｓ．ナガタ等、「ヒト白血球インタフェロン活性を有
するポリペプチドのイー・コリにおける合成」、ネイチ
ャー、第２８４巻、第３１６−２０頁（１９８０）〕ヒ
トＢ型肝炎ウイルスの抗原〔Ｃ．Ｊ．バレル等、「プラ
スミドｐＢＲ３２２にてクローン化したＢ型肝炎ウイル
スＤＮＡ配列の枯草菌における発現」、ネイチャー、第
２７９巻、第４３−４７頁（１９７９）およびＭ．パセ
ク等、「Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子およびイー・コリにお
けるその発現」、ネイチャー、第２８２巻、第５７５−
７９頁（１９７９）〕、ＳＶ４０ｔ抗原〔Ｔ．Ｍ．ロバ
ーツ等、「枯草菌における猿ウイルス４０ｔ抗原の合
成」、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サ
イエンス、ＵＳＡ、第７６巻、第５５９６−５６００頁
（１９７９）、およびＦＭＤウイルス抗原〔Ｈ．クッパ
ー等、「口蹄疫ウイルスの主抗原のｃＤＮＡクローン化
およびイー・コリにおけるその発現」、ネイチャー、第
３８９巻、第５５５−５９頁（１９８２）〕を包含す
る。
【０００５】一般に、これらの方法は、所望の蛋白、ポ
リペプチド、ペプチドもしくはアミノ酸をコードするＤ
ＮＡ配列を発現制御配列に作用結合させたことを特徴と
する組換ＤＮＡ分子の作成に頼っている。次いで、適当
な宿主をこれら分子で形質転換させて、発行により所望
の産生物を製造することができる。化学合成を介して製
造する以外のＤＮＡ配列については、この種の組換ＤＮ
Ａ分子の作成はしばしば所望の産生部物に対するメッセ
ンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）雛型の一本鎖ＤＮＡコ
ピー（「ｃＲＮＡ」）を生成させ、このｃＲＮＡを二重
鎖ＤＮＡに変換させ、かつこのＤＮＡを適当なクローン
化ビークルにおける適当な発現制御配列に作用結合させ
る工程からなっている。次いで、この組換ＤＮＡ分子を
使用して適当な宿主を形質転換させる。このような形質
転換は、適当な条件下で発行された際に所望の産生物を
生成することを可能にする。
【０００６】上記技術のその後の改良は、選択した蛋
白、ポリペプチド、ペプチドもしくはアミノ酸をこれが
産生された際に宿主細胞の膜を通して分泌させることを
可能にし、これは宿主により分泌されるような細胞外も
しくは外質キャリヤ蛋白からのＤＮＡ配列と選択される
蛋白、ポリペプチドもしくはアミノ酸をコードする異質
ＤＮＡ断片とよりなるハイブリッド遺伝子を形成し、発
現制御配列に作用結合されたハイブリッド遺伝子で宿主
を形質転換させ、かつ形質転換宿主を培養して、選択し
た蛋白、ポリペプチド、ペプチドもしくはアミノ酸を合
成かつ分泌させることからなっている。
【０００７】この種の技術は、たとえばＬ．ビラーカマ
ロフ等により開示されている〔「プロインシュリンを合
成する細菌クローン」、プロシーディング・ナショナル
・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第７５巻、第３７
２７−３１頁（１９７８）および米国特許４，４１１，
９９４号〕。しかしながら、この方法で作成された蛋
白、ポリペプチド、ペプチドもしくはアミノ酸は分泌に
よって細胞内蛋白および細胞の残骸から分離されるが、
さらに細胞媒体もしくは外質空間から回収せねばならな
い。一般に、この回収は所望する程効果的でも簡単でも
ない生成方式を含んでいる。さらに、これは一般に産生
物の損失をもたらす。
【０００８】本発明は上記の諸問題を解決することを企
図するものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】この詳細な説明において
は、次の定義を使用する：蛋白 ：５０個以上のアミノ酸の線状列を含有するポリペ
プチドであって、たとえば組織プラスミノーゲン活性化
物質、プロインシュリン、血清アルブミン、ヒト成長ホ
ルモン、上皮小体ホルモンおよびインタフェロンがあ
る。
【００１０】ポリペプチド：隣接アミノ酸のアミノ基と
カルボキシ基との間のペプチド結合により互いに連結さ
れたアミノ酸の線状列。
【００１１】蛋白もしくはポリペプチドの先駆体：信号
配列によって宿主細胞内で合成されるポリペプチドもし
くは蛋白であって、たとえばプレストレプトアビジン、
プレプロインシュリン、プレ血清アルブミン、プレ成長
ホルモン、プレ上皮小体ホルモンおよびプレインタフェ
ロンがある。成熟ポリペプチドもしくは蛋白は、その先
駆体の信号配列の喪失もしくは薄利（すなわち成熟）を
伴って宿主細胞膜を通して分泌される。
【００１２】ヌクレオチド：糖部分（ペントース）と燐
酸と含窒素複素環式塩基とよりなるＤＮＡもしくはＲＮ
Ａのモノマー単位の塩基はグルコシド炭素（ペントース
の１′炭素）を介して糖成分に結合され、塩基と糖との
この組合せはヌクレオチドである。塩基はヌクレオチド
を特性化する。４種のＤＮＡ塩基はアデニン
（「Ａ」）、グアニン（「Ｇ」）、シトシン（「Ｃ」）
およびチミン（「Ｔ」）である。４種のＲＮＡ塩基は
Ａ、Ｇ、Ｃおよびウラシル（「Ｕ」）である。
【００１３】ＤＮＡ配列：隣接するペントースの３′炭
素と５′炭素との間のホスホジエステル結合により互い
に連結されたヌクレオチドの線状列。
【００１４】コドン：：メッセンジャＲＮＡ（「ｍＲＮ
Ａ」）を介しアミノ酸、翻訳開始信号または翻訳停止信
号をコードする３個のヌクレオチド（トリプレット）の
ＤＮＡ配列。たとえば、ヌクレオチドトリプレットＴＴ
Ａ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡおよびＣＴＧはア
ミノ酸ロイシン（「Ｌｅｕ」）をコードし、ＴＡＧ、Ｔ
ＡＡおよびＴＧＡは翻訳停止信号であり、かつＡＴＧは
翻訳開始信号である。
【００１５】プラスミド：完全「レプリコン」からなる
非染色体の二重鎖ＤＮＡ配列であって、このプラスミド
は宿主細胞内で複製される。プラスミドを単細胞宿主生
物内に入れると、この生物の特性がプラスミドにおける
ＤＮＡの結果として変化しまたは形質転換する。テトラ
サイクリン耐性（ＴｅｔＲ）に関する遺伝子を有するプ
ラスミドは、テトラサイクリンに対し感受性であった宿
主細胞をテトラサイクリンに対し耐性のものに形質転換
させる。プラスミドにより形質転換された宿主細胞を
「形質転換体」と呼ぶ。
【００１６】ファージまたはバクテリオファージ：細菌
ウイルスであって、その多くは蛋白エンベロプもしくは
コートにカプセル化されたＤＮＡ配列を有する（「カプ
シド」）。
【００１７】クローン化ベヒクル：宿主内で１個もしく
は少数のエンドヌクレアーゼ認識部位を特徴とし、この
部位でＤＮＡ配列はＤＮＡの本質的な生物学機能、たと
えば複製、コート蛋白の産生、またはプロモータもしく
は結合部位の損失を伴なわずに決定可能に切断すること
ができ、かつ形質転換細胞の同定に使用するのに適した
標識、たとえばテトラサイクリン耐性もしくはアンピシ
リン耐性を有する。クローン化ベヒクルはベクターとし
ても知られる。
【００１８】宿主：クローン化ビークルにより形質転換
されてクローン化ビークルを複製させかつ他の生物学的
機能、たとえばプラスミドの遺伝子発現を介するポリペ
プチドもしくは蛋白の産生を達成させうる生物。
【００１９】コスミド：バクテリオファージλの凝集性
末端（「ｃｏｓ」）部位を有するプラスミド、コスミド
はｃｏｓ部位の存在によりλコート蛋白中へ封入して適
当な宿主に感染させるために使用することができる。そ
の外来ＤＮＡの大型断片に対する容量のため、コスミド
はクローン化ビークルとして有用である。
【００２０】発現：ポリペプチドもしくは蛋白を生産す
べく遺伝子により受ける過程。これは転写と翻訳との組
合せである。
【００２１】転写：遺伝子からｍＲＮＡを生成する過
程。
【００２２】翻訳：ｍＲＮＡから蛋白もしくはポリペプ
チドを産生する過程。
【００２３】プロモータ：遺伝子におけるＤＮＡの領域
であって、ここでＲＮＡポリメラーゼが結合しかつ転写
を開始する。プロモータは遺伝子のリボソーム結合部位
の前に位置する。
【００２４】リボソーム結合部位：リボソームに対する
ｍＲＮＡの結合を促進して翻訳を開始させうるｍＲＮＡ
上の部位をコードする遺伝子のＤＮＡ領域。このリボソ
ーム結合部位は、プロモータの後かつ遺伝子における翻
訳開始信号の前に位置する。
【００２５】遺伝子：ｍＲＮＡに対する雛型として特異
性蛋白、ポリペプチドもしくはペプチドに特徴的なアミ
ノ酸の配列をコードするＤＮＡ配列。
【００２６】発現制御配列：遺伝子に作用結合された
際、クローン化ビークルにおける遺伝子の発現を制御し
かつ調整するＤＮＡ配列。
【００２７】信号ＤＮＡ配列：ｍＲＮＡに対する雛型と
して、ポリペプチドもしくは蛋白のアミノ末端における
疎水性アミノ酸の配列、すなわちポリペプチドもしくは
蛋白の「信号配列」もしくは「疎水性リーダー配列」を
コードするポリペプチドもしくは蛋白のための遺伝子内
のＤＮＡ配列。信号ＤＮＡ配列は、成熟蛋白をポリペプ
チドとしてコードするＤＮＡ配列の直前かつ遺伝子の翻
訳開始信号（ＡＴＧ）の後におけるポリペプチドまたは
蛋白用の遺伝子に位置する。信号ＤＮＡ配列は、ポリペ
プチドもしくは蛋白の先駆体に特徴的であるポリペプチ
ドもしくは蛋白の信号配列をコードする。
【００２８】蛋白もしくはポリペプチドの先駆体におけ
る信号配列の一部のみがＤＮＡの膜細胞を通して移動す
べき蛋白もしくはポリペプチドの先駆体に対し必須であ
り、さらに先駆体の信号配列が適切に欠落して分泌に際
し成熟蛋白もしくはポリペプチドを形成するのに必要で
あると思われる。従って、「信号ＤＮＡ配列」という用
語は、分泌に対しかつ好ましくは宿主細胞内で産生され
た蛋白、ポリペプチドもしくはペプチドの先駆体の成熟
に対し必須な信号配列の部分をコードするＤＮＡ配列を
意味する。
【００２９】ストレプトアビジン様ポリペプチド：天然
ストレプトアビジンとほぼ免疫学上均等でありかつビオ
チンまたはビオチン誘導体もしくは同族体に結合しうる
ポリペプチドである。このポリペプチドは天然ストレプ
トアビジンの一部でないアミノ酸を含有することがで
き、あるいは天然ストレプトアビジンの一部のみを含有
することもできる。さらに、このポリペプチドは、これ
を産生した宿主が宿主産生されたポリペプチドを天然ス
トレプトアビジンの構造に変化させるのに必要とされる
適当な酵素を欠損することもあるので、天然ストレプト
アビジンとは同一でないこともある。
【００３０】本発明は、ＤＮＡ配列の少くとも一部がス
トレプトアビジン様ポリペプチドをコードすることを特
徴とする少なくとも１種のＤＮＡ配列を提供する。本発
明のＤＮＡ配列は、（ａ）ＳＡ３０４、ＳＡ３０７、Ｓ
Ａ３２４；（ｂ）前記ＤＮＡ配列のいずれかにハイブリ
ッド化しかつストレプトアビジン様ポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ配列、および（ｃ）前記ＤＮＡ配列のいず
れかによってコードされたポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列よりなる群から選択される。これらＤＮＡ配列
は、これらにより形質転換された宿主がストレプトアビ
ジン様ポリペプチドを産生することを可能にする。さら
に本発明は、ＤＮＡ配列の少なくとも一部が組織プラス
ミノーゲン活性化物質（「ＴＰＡ」）に対し末端結合し
たストレプトアビジン様ポリペプチドよりなる融合蛋白
をコードすることを特徴とする少なくとも１種のハイブ
リッドＤＮＡ配列を提供する。本発明のこの面における
ＤＮＡ配列は、（ａ）ＳＡＴ９７２４、ＳＡＴ７０２
１；（ｂ）前記ＤＮＡ配列のいずれかにハイブリッド化
しかつ融合蛋白をコードするＤＮＡ配列、および（ｃ）
前記ＤＮＡ配列のいずれかによってコードされたポリペ
プチドをコードするＤＮＡ配列よりなる群から選択され
る。
【００３１】他の実施態様において、本発明は選択した
蛋白、ポリペプチド、ペプチドもしくはアミノ酸を産生
させかつ宿主細胞の膜を分泌させる方法を提供し、これ
は生成した融合蛋白を宿主の膜を通して分泌させるのに
充分なストレプトアビジン様ポリペプチドの部分をコー
ドするＤＮＡ配列と、選択された蛋白、ポリペプチド、
ペプチドもしくはアミノ酸をコードするＤＮＡ配列とよ
りなるハイブリッドＤＮＡ配列を発現させて行われる。
ハイブリッドＤＮＡ配列の発現に際し、このハイブリッ
ドＤＮＡ配列から発現された融合蛋白は、前記ハイブリ
ッドＤＮＡ配列により形質転換された宿主細胞の膜を通
して分泌される。次いで、これを融合蛋白として使用し
あるいは各種の化学法、酵素法、生物学的方法により切
断して所望の蛋白、ポリペプチド、ペプチドもしくはア
ミノ酸およびストレプトアビジン様ポリペプチドを産生
させることができる。
【００３２】さらに他の実施態様において、本発明はビ
オチンおよびその誘導体もしくは同族体に対するストレ
プトアビジン様ポリペプチドの結合親和性を利用して生
成しうる誘導体の製造方法を提供する。本発明のこの実
施態様においては、生成する融合蛋白をビオチンまたは
その誘導体もしくは同族体に結合させるのに充分なスト
レプトアビジン様ポリペプチドの部分をコードするＤＮ
Ａ配列と、選択された蛋白、ポリペプチド、ペプチドも
しくはアミノ酸をコードするＤＮＡ配列とよりなるハイ
ブリッドＤＮＡ配列を使用する。このハイブリッドＤＮ
Ａ配列の発現に際し、融合蛋白のストレプトアビジン部
分はビオチンまたはその誘導体もしくは同族体の１種に
結合することができる。次いで、ビオチンに結合しない
他の分泌蛋白もしくは汚染物を洗浄除去して融合蛋白を
ビオチンから溶出させることができる。次いで、選択し
た蛋白、ポリペプチド、ペプチドもしくはアミノ酸を融
合蛋白として使用し、あるいは必要に応じ慣用技術でス
トレプトアビジン様ポリペプチドから切断させることが
でき、かつストレプトアビジン様ポリペプチドおよび選
択した蛋白、ポリペプチド、ペプチドもしくはアミノ酸
を次いで別々に回収することができる。
【００３３】本発明の最も好適な実施態様においては、
融合蛋白を産生された宿主細胞から分泌させると共に、
ビオチンおよびその誘導体もしくは同族体に対するスト
レプトアビジン様ポリペプチドの結合親和性を利用して
精製することができる。この最も好適な実施態様におい
ては、生成する融合蛋白を宿主細胞の膜を通して分泌さ
せかつ生成する融合蛋白をビオチンまたはその融合蛋白
もしくは同族体に結合させるのに充分なプレストレプト
アビジン様ポリペプチドの部分をコードするＤＮＡ配列
と、選択した蛋白、ポリペプチド、ペプチドもしくはア
ミノ酸をコードするＤＮＡ配列とよりなるハイブリッド
遺伝子を使用する。
【００３４】
【発明の実施の形態】本発明の宿主細胞 任意多数の入手しうる周知の宿主細胞を、本発明の宿主
／発現ベクター組合せで使用することができる。特定宿
主の選択は、当業者により知られた多くのファクタに依
存する。これらは、たとえば選択される発現ベクターと
の適合性、ベクターに対するハイブリッドプラスミドに
よりコードされた蛋白の毒性、所望蛋白の回収容易性、
発現特性、生物安全性および価格を包含する。必ずしも
全ての宿主が本発明の発現ベクターおよび方法において
特定ＤＮＡ配列の発現に対し同等に有効であるとは限ら
ないことを理解した上で、これらファクタの調和を計ら
ねばならない。
【００３５】これら一般的指針内において有用な微生物
宿主は、イー・コリ、シュードモナス、細菌類、ストレ
プトミセス、酵母およびその他の真菌類の菌株、昆虫、
培養中の植物細胞もしくは動物細胞（ヒトを含む）また
は当業界で知られたその他の宿主を包含しうる。
【００３６】特に好ましくは、本発明に使用する宿主は
たとえばストレプトミセスのようなグラム陽性菌であ
る。グラム陽性菌は、外側細胞壁を持たない。したがっ
て、分泌される蛋白は、細胞膜を通して細胞媒体中へ直
接移動する。この特性は、たとえばイー・コリのような
グラム陽性菌を宿主細胞として使用する際必要とされる
ような外質空間から蛋白を単離する必要性を除去する。
蛋白は、全ゆる細胞を汚染物を含まないよう、細胞培地
から直接に精製することができる。好適なグラム陽性宿
主細胞はストレプトミセス・リビダンスである。
【００３７】本発明の発現制御配列 本発明のストレプトアビジンＤＮＡ配列またはハイブリ
ッドストレプトアビジン−異質ＤＮＡ配列を発現させる
には、これらＤＮＡ配列を発現制御配列に作用結合させ
ねばならない。この作用結合を、ＤＮＡ配列がクローン
化ビークル中へ挿入される前または後のいずれかに行う
方法は周知されている。
【００３８】本発明に有用な発現制御配列も周知されて
いる。これらにはイー・コリｌａｃ系、イー・コリ ｔ
ｒｐ系、イー・コリ β−ｌａｃ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ
系、バクテリオファージλの主オペレータおよびプロモ
ータ領域、フィラメント状一本鎖ＤＮＡファージの制御
領域、ストレプトミセス属菌または他のグラム陽性菌の
発現制御配列、並びに、原核もしくは真菌細胞およびそ
れらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが知られ
たその他の配列、またはその組合せが包含される。
【００３９】より好ましくは、グラム陽性菌において作
用する発現制御配列を使用する。特に好ましくは、スト
レプトミセス宿主を使用する場合には、ストレプトミセ
ス発現制御配列を使用する。
【００４０】本発明のクローン化ビークル 本発明によれば、宿主細胞中で複製することができかつ
ＤＮＡ断片を挿入しうる制限部位を有する任意のクロー
ン化ビークルを使用することができる。本発明に使用す
る好適なクローン化ビークルは、ストレプトミセスで複
製しうる多コピープラスミドである。
【００４１】本発明のストレプトアビジンＤＮＡ配列ま
たはハイブリッドストレプトアビジン−異質ＤＮＡ配列
が挿入されるクローン化ビークルにおける挿入部位の特
定位置は、選択される蛋白、ポリペプチド、ペプチドも
しくはアミノ酸を製造するのに臨界的でない。この点に
おいて、切断部位は、宿主内における複製を阻害しない
ようなクローン化ビークルの任意の個所に位置すること
ができる。
【００４２】所望の切断部位を作るために使用する制限
酵素は周知されている。これらは、たとえばＡｒａＩ、
ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ、ＨｉｎｃＩＩおよびＳａｕ３ａを包含する。
本発明の方法に使用するクローン化ビークルを所望の切
断部位で切断してこの部位にＤＮＡ配列を挿入するため
の方法も周知されている。
【００４３】本発明の方法によるＤＮＡ配列の発現 本発明の方法はストレプトアビジン様ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列あるいはストレプトアビジン様ポリ
ペプチドの一部をコードするＤＮＡ配列と所望の真核、
原核もしくはウイルス性蛋白、ポリペプチド、ペプチド
もしくはアミノ酸を種々の方法でコードするＤＮＡ配列
とよりなるハイブリッドＤＮＡ配列を発現させるべく使
用することができる。
【００４４】ストレプトアビジン様ポリペプチドを単独
で産生させることが望ましい本発明の具体例において
は、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列をクロ
ーン化ビークルにおける発現制御配列に作用結合させ
る。この構成においては、ＤＮＡ配列自信が開始信号で
開始しなければ、ストレプトアビジン様ポリペプチドを
コードするＤＮＡ配列の直前に翻訳開始信号が存在しな
ければならない。さらに、開始信号とストレプトアビジ
ン様ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の末端との間
には停止コドンが存在してはならない。次いで、生成す
る組換ＤＮＡ分子を使用して適当な宿主を形質転換さ
せ、かつこの形質転換宿主を慣用の発行し条件下で培養
して所望のストレプトアビジン様ポリペプチドを産生さ
せる。
【００４５】本発明によるこの面の好適具体例におい
て、融合したキャリヤ蛋白−ストレプトアビジン様ポリ
ペプチドをこれを産生した細胞から分泌させるのに充分
なキャリヤ蛋白信号配列の部分を含め、キャリヤ蛋白の
一部をコードするＤＮＡ配列は翻訳開始信号とストレプ
トアビジン様ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列との
間に存在する。キャリヤ蛋白自身をコードするＤＮＡ配
列なしに、キャリヤ蛋白信号ＤＮＡ配列のみが翻訳開始
信号とストレプトアビジン様ポリペプチドをコード化す
るＤＮＡ配列との間に存在する。特に好ましくは、翻訳
開始信号とストレプトアビジン様ポリペプチドをコード
するＤＮＡ配列と間に存在する信号ＤＮＡ配列はストレ
プトアビジン信号ＤＮＡ配列であり、その充分な部分が
存在するとストレプトアビジン様ポリペプチドを宿主細
胞から分泌させる。
【００４６】このようにしてストレプトアビジン様ポリ
ペプチドが産生され、かつ形質転換宿主から分泌され
る。好ましくは、信号配列は、その細胞からの分泌に際
し、ストレプトアビジン様ポリペプチドまたは融合キャ
リヤ蛋白−ストレプトアビジン様ポリペプチドから切断
される。キャリヤ蛋白の一部をストレプトアビジン様ポ
リペプチドに融合させる具体例においては、融合蛋白の
産生および単離の後にストレプトアビジン様ポリペプチ
ドを下記する公知方法によりキャリヤ蛋白から切断する
のが好ましい。
【００４７】非ストレプトアビジン様の蛋白、ポリペプ
チド、ペプチドもしくはアミノ酸を本発明の方法により
産生させることが望ましい本発明の具体例においては、
これら産生物をコードするＤＮＡ配列を、ストレプトア
ビジン様ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の少なく
とも一部より下流かつそれと同じ解読枠に結合させて、
ハイブリッドＤＮＡ配列を生成させる。次いで、生成し
たハイブリッドＤＮＡ配列をクローン化ビークルにおけ
る発現制御配列に作用結合させる。ここでも、この構成
において、ハイブリッドＤＮＡ配列自身が開始信号で開
始しなければ、ハイブリッドＤＮＡ配列の直前に翻訳開
始信号が存在せねばならない。さらに、開始信号とハイ
ブリッドＤＮＡ配列との末端との間に停止コドンが存在
してはならない。
【００４８】本発明によるこの面の種々の具体例におい
て、上記したキャリヤ蛋白／キャリヤ蛋白信号配列／ス
トレプトアビジン信号配列の組合せをコードするＤＮＡ
配列のいくつかまたは全部は、翻訳開始信号とハイブリ
ッドＤＮＡ配列との間に存在する。このようにして、ス
トレプトアビジン様ポリペプチドと非ストレプトアビジ
ン様の蛋白、ポリペプチド、ペプチドもしくはアミノ酸
とが末端結合してなる融合蛋白が産生され、かつ形質転
換宿主から分泌される。他の具体例においては、ストレ
プトアビジン信号ＤＮＡ配列を非ストレプトアビジン様
の蛋白、ポリペプチド、ペプチドもしくはアミノ酸をコ
ードするＤＮＡ配列に直接結合させて、宿主細胞からの
蛋白、ポリペプチド、ペプチドもしくはアミノ酸の分泌
を可能にする。上記全ての具体例において、好ましくは
信号配列を宿主細胞からの分泌に際し切断させる。キャ
リヤ蛋白の一部を融合蛋白に融合させる具体例において
は、融合蛋白を下記する公知方法により融合蛋白の産生
および単離の後にキャリヤ蛋白から切断するのが好まし
い。
【００４９】使用したストレプトアビジン様ポリペプチ
ドまたはプレストレプトアビジン様ポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ配列の適当な部分は、多くのファクタで決
定される。これらは、所望産生物をコードするＤＮＡ配
列の発現特性、所望産生物の分泌容易性、所望産生物の
最終用途、並びにストレプトアビジン配列を用いる分
泌、ストレプトアビジン結合を用いる生成またはその両
者が望ましいかどうか等の要因を包含する。
【００５０】たとえば、ストレプトアビジン信号配列を
用いて所望産生物を分泌させかつビオチンまたはビオチ
ン誘導体もしくは同族体に対するストレプトアビジン結
合を用いて生成する場合は、分泌を可能にするのに充分
なストレプトアビジン信号配列の部分およびビオチンま
たはその誘導体もしくは同族体の一種に対する列号を可
能にするのに充分な成熟ストレプトアビジンコード配列
の部分が必要とされる。
【００５１】さらに、非ストレプトアビジン様の蛋白、
ポリペプチド、ペプチドもしくはアミノ酸自身が必要で
あれば、ストレプトアビジン誘導配列を産生、分泌、精
製またはそれらの組合せの後に種々の手段で除去するこ
とができる。たとえば、融合蛋白は、所望産生物をスト
レプトアビジン様ポリペプチドから分離するのに有用な
化学的もしくは酵素的切断部位を有することができる。
本発明の他の具体例においては、この種の切断部位を融
合蛋白中へ組み込み、その際融合蛋白の望ましくない部
分をコードする領域と、望ましい部分をコードする領域
との間に１個もしくはそれ以上のコドンを持たないよう
にハイブリッドＤＮＡ配列を作成する。発現に際し、こ
れらコドンは所望の切断部位を生ぜしめる。
【００５２】ストレプトアビジンはメチオニン残基を持
たないので、融合蛋白を切断する好適手段（ただし所望
の蛋白、ポリペプチド、ペプチドもしくはアミノ酸もメ
チオニン残基を持たないものとする）は、ストレプトア
ビジン様ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と所望の
産生物をコードするＤＮＡ配列との間にＡＴＧコドン
（メチオニンをコードする）を有するハイブリッドＤＮ
Ａ配列を作成することである。次いで、この融合蛋白は
臭化シアノゲンでの処理により孤立メチオニン残基にお
いて切断することができる〔Ｅ．グロス，メソッズ・イ
ン・エンチモロジー，第１１巻，第２３８〜５５頁（１
９６７）参照〕。
【００５３】本発明の有用な異質ＤＮＡ配列としては、
動物およびヒトホルモン、たとえば各種ＩＦＮ−α、特
にα２、α５、α７、α８、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、
ヒトインシュリンおよび成長ホルモン、牛成長ホルモ
ン、豚成長ホルモンおよびエリスロポイエチン、ヒト血
液ファクタおよぴ組織プラスミノーゲン活性化物質、ウ
イルス性もしくは細菌性抗原、たとえばＨＢＶの核もし
くは表面抗原またはＦＭＤＶの抗原並びに原核、真核も
しくはウイルス性の他の有用なポリペプチドをコードす
るものがある。好ましくは、使用する異質ＤＮＡ断片
は、さらにその遺伝子翻訳停止信号をも含有し、特に好
ましくはその５′非コード領域の一部を含有する。
【００５４】本発明の産生物の精製 本発明の一層有利な具体例は、産生物がストレプトアビ
ジン様ポリペプチドであってもあるいはビオチンまたは
その誘導体もしくは同族体の一種に結合しうるのに充分
なストレプトアビジン様ポリペプチドの部分を有する融
合蛋白であっても、ビオチンまたはビオチン誘導体もし
くは同族体に結合させて精製されるものである。次い
で、未結合の汚染物を捨てかつ所望の産生物をビオチン
から回収する。勿論、ビオチン結合を使用して融合蛋白
のストレプトアビジン残基を、前記したように融合蛋白
の切断後に所望の産生物から分離することもできる。
【００５５】好ましくは、本発明のストレプトアビジン
様ポリペプチドは生物親和性クロマトグラフィーを用い
て精製される。特に好ましくは、クロマトグラフィー用
樹脂は、免疫ビオチン（すなわち、ビオチン同族体）を
アガロースまたは他の不活性マトリックスに共有結合さ
せて生成される〔ホフマン等、上記；Ｇ．ヘネイおよび
Ｇ．Ａ．オール、アナリチカル・バイオケミストリー、
第１１４巻、第９２−９６頁（１９８１）〕。
【００５６】ストレプトアビジンは未改変のビオチン−
アガロース樹脂に強力に結合して、極めて厳しい条件下
でのみ溶出することができる〔Ｐ．カトレカサスおよび
Ｍ．ウィルチェック、バイオケミカル・バイオフィジカ
ル・リサーチ・コミューニケーション、第３３巻、第２
３５−３９頁（１９６８）〕。したがって、ビオチン−
アガロースはストレプトアビジン様ポリペプチドを精製
する際使用するには不満足である。しかしながら、ビオ
チン−アガロースまたは同様な樹脂は、選択した蛋白、
ポリペプチド、ペプチドもしくはアミノ酸に結合したス
トレプトアビジン様ポリペプチドの融合蛋白を精製する
のに有用であり、この樹脂は選択した蛋白、ポリペプチ
ド、ペプチドもしくはアミノ酸の存在によりビオチンに
対し低い親和性を有する。
【００５７】ストレプトアビジンは塩基ｐＨにて免疫ビ
オチンに結合し、かつ高濃度の尿素の存在下で酸性ｐＨ
にて溶出される。特に好ましくは、ストレプトアビジン
様ポリペプチドは５ｍＭの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
１０．５、０．５Ｍ ＮａＣｌ）にて免疫ビオチン−ア
ガロースカラムに施され、かつ５０ｍＭの酢酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ３．８、１Ｍ尿素）で溶出される。
【００５８】
【実施例】本発明を一層良く理解するため、以下の実施
例により本発明を説明する。
【００５９】ストレプトアビジンＤＮＡ試料の作成 市販ストレプトアビジン（ＢＲＬ社から購入）の最初の
３８Ｎ−末端アミノ酸におけるアミノ酸配列を決定し
た。次いで、ストレプトアビジンにおけるアミノ末端の
一部（ｔｒｐ−ｔｙｒ−ａｓｎ−ｇｌｎ−ｌｅｕ）に対
応する１４−塩基試料（「ＳＡ−１」）を化学合成し
た。このＤＮＡ試料を使用して、下記するように作成さ
れたコスミド保存物をストレプトアビジン様ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ配列につきスクリーニングした。
【００６０】ＳＡ−１試料は１６倍の変質物であって、
次の配列を有した：
【００６１】Ｓ・アビジニイのコスミド保存物の作成 Ｓ・アビジニイ菌をＹＭＥ培地中で培養し、その細菌Ｄ
ＮＡを標準法で単離した〔Ｋ．Ｆ．チェーター等、カレ
ント・トピックス・イン・マイクロバイオロジー・アン
ド・イミュノロジー、第９６巻、第６９−７５頁（１９
８２）〕。次いで、ＤＮＡをＳａｕ３Ａにより部分切断
し、かつこれを塩勾配での遠心分離によって寸法分画し
た。コスミドｐＨＣ７９中へ挿入するため、２０Ｋｂよ
り大きい断片を集めた。
【００６２】ベーリンガ・マンハイム社により市販され
ているコスミドｐＨＣ７９は、アンピシリン耐性をコー
ドする遺伝子を含むプラスミドｐＢＲ３２２の部分と、
バクテリオファージλＤＮＡの相補末端をコードする
「ｃｏｓ」領域とよりなっている〔Ｂ．ホーンおよび
Ｊ．コリンス、ジィーン、第１１巻、第２９１−９８頁
（１９８０）〕。
【００６３】ｐＨＣ７９をＢａｍＨＩで線状化させ、こ
のＢａｍＨＩはプラスミドを単一の部位で切断すると共
に、Ｓａｕ３Ａ切断されたＤＮＡの末端に相補的な末端
を生成する。次いで、Ｓ・アビジニイ断片を線状化され
たｐＨＣ７９へ結合させた。得られた組換ＤＮＡ分子は
Ｓ・アビジニイ・コスミド保存物からなり、これらをλ
試験官内包装抽出物（アメルシャム社）に添加した。得
られた溶菌物を使用して、標準法によりイー・コリＫ−
１７菌株 ＥＤ８７６７にトランスフェクトした〔マニ
アチス等、モレキュラー・クローニング・ラボラトリー
・マニュアル、第２９５−３０５頁（マニアチス、フリ
ッチおよびサムブルック編（１９８２）〕。
【００６４】ＳＡ−１試料によるＳ・アビジニイのコス
ミド保存物のスクリーニング ストレプトアビジンをコードするＤＮＡ配列につき上記
保存物をスクリーニングするため、トランスフェクトし
たイー・コリ菌体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を
補充したＬＢ培地で３７℃にて増殖させた。コスミドｐ
ＨＣ７９はアンピシリン耐性をコードする遺伝子を有す
るので、ｐＨＣ７９を含有するイー・コリＫ−１２菌体
はアンピシリンの存在下で増殖するのに対し、ｐＨＣ７
９を含有しないＫ−１２菌体は増殖することができな
い。したがって、アンピシリン含有培地での増殖は、ｐ
ＨＣ７９を含有する宿主の選択を可能にする。
【００６５】２２００個のＡｍｐＲコロニーを選択し、
これらを９６穴のミクロ測定板の個々の穴部に吊り上げ
て入れた。選択した培養物を前記と同様に３７℃にて増
殖させ、かつこれらを９６本のフォークによりニトロセ
ルロースフィルタへ列としてプリントした。次いで、こ
れらコロニーを上記のように作成したＳＡ−１試料によ
り６×ＳＳＣ緩衝液（０．１％ＳＤＳ）にて３０℃で一
晩ハイブリッド化させ、その際グリュンスタインおよび
ホグネスのハイブリッド化法を使用した〔プロシーディ
ング・ナショナル・アカデミー・サイエンス・ＵＳＡ、
第７２巻、第３９６１−６５頁（１９７５）〕。２２０
０個のコロニーの内１個が、ＳＡ−１試料にハイブリッ
ド化したＤＮＡ配列を有した。（コロニー６２／Ｃ）。
【００６６】ストレプトアビジン関連ＤＮＡの単離 プラスミドＤＮＡをコロニー６２／Ｃから単離し、上記
と同様にしてＳＡ−１試料に対するそのハイブリッド化
を再確認した。このプラスミドＤＮＡ（ｐ６２／ｃ）
は、ｐＨＣ７９のＢａｍＨＩ部位に約４０ＫｂのＳ・ア
ビジニイＤＮＡの挿入物を含有した。次に、図１を参照
して、この４０Ｋｂ断片をＢａｍＨＩで切断し、かつ２
Ｋｂ断片を単離し、この断片もＳＡ−１にハイブリッド
化した。この２Ｋｂ断片をＳＡ３０４と呼ぶ。次いで、
プラスミドｐＵＣ８〔Ｊ．ビエラおよびＪ．メッシン
グ、ジーン、第１９巻、第２５９−６８頁（１９８
２）〕をＢａｍＨＩで線状化させて、ｌａｃプロモータ
から下流の１の位置で切断した。線状化したｐＵＣ８を
常法によりＳＡ３０４に結合させた。この結合は組換Ｄ
ＮＡ分子を生成し、これをｐＳＡ３０４と呼ぶ。
【００６７】ｐＳＡ３０４で形質転換させたイー・コリ
菌体はストレプトアビジン様ポリペプチドを産生し、こ
れを細胞膜を通して分泌することを見出した。しかしな
がら、この産生および分泌は、ＳＡ３０４がｐＵＣ８に
存在するｌａｃプロモータに作用結合されるような配向
で存在する時のみ生じた。これらの結果に基づき、ｐＳ
Ａ３０４は信号ＤＮＡ配列を含めストレプトアビジン様
ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に作用結合されて
その発現を制御するイー・コリｌａｃプロモータを含有
すると結論された。
【００６８】ストレプトアビジン信号ＤＮＡ配列の存在
を、ＳＡ３０７（下記に説明）のヌクレオチド配列決定
により確認した。さらに、Ｓ・アビジニイのストレプト
アビジン発現制御配列の存在を下記するＳ１地図化によ
って確認した。
【００６９】ストレプトアビジン様ポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ配列のＳＡ３０４における存在を、ｐＳＡ
３０４の部位を配列決定して確認した。ＳＡ３０４断片
におけるヌクレオチドＮｏ．６２３（Ａｌｕ）に近いヌ
クレオチド配列（図２〜５参照）は、ＳＡ−１試料の配
列と正確に一致した。このヌクレオチド配列は、さらに
ＳＡ−１試料に対応する領域から下流のストレプトアビ
ジンポリヌクレオチドの２０個のアミノ酸領域の蛋白配
列から予想されるものと一致した。
【００７０】ストレプトアビジン様ポリペプチドのヌク
レオチド配列の決定 再び図１を参照して、ストレプトアビジン様ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ断片を一層正確に位置決定しかつ
配列決定するため、ｐＳＡ３０４をＢａｍＨＩで処理し
た。断片ＳＡ３０４を再単離し、かつこれをあらかじめ
ＢａｍＨＩで線状化されたプラスミドｐＵＣ１３に結合
させた。プラスミドｐＵＣ１３は、ＢａｍＨＩ部位を直
接包囲するヌクレオチドが異なる配向で存在しかつ付加
的制限部位を有する以外は、ｐＵＣ８と同一である
（Ｊ．ビエラおよびＪ．メッシング、上記）。次いで、
生成したプラスミド（ｐＳＡ３０６）をＳｍａＩで制限
しかつ大きい断片を再結合すると、ＳＡ３０４の９００
塩基対断片を喪失してプラスミドｐＳＡ３０７を生成し
た。次いで、このｐＳＡ３０７をＢａｍＨＩおよびＳｍ
ａＩで処理し、かつ１．１Ｋｂ断片（「ＳＡ３０７」）
を単離した。この断片をマキサムおよびギルバードの方
法により配列決定した〔メソッズ・イン・エンチモロジ
ー、第６５巻、第４９９−５６０頁（１９８０）〕。こ
の配列（図２〜５）は、ヌクレオチドＮｏ．４８０にお
けるＡＴＧ翻訳開始信号と、ヌクレオチドＮｏ．１０３
０におけるＴＡＧ停止信号との間にストレプトアビジン
様ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片が存在すること
を示している。この配列は、さらに３５アミノ酸信号配
列をコードする信号ＤＮＡ配列の存在を示している。ス
トレプトアビジン発現制御配列の存在については、下記
するＳ１地図化によって確認した。
【００７１】イー・コリにおけるストレプトアビジン様
ポリペプチドの発現 ｐＳＡ３０４およびｐＳＡ３０７を使用して、標準法に
よりイー・コリＫ−１２菌体を形質転換させた。
【００７２】次いで、このように形質転換した生物の培
養物を、ストレプトアビジン様ポリペプチドの発現およ
び外質空間中への分泌につき免疫学的反応性とビオチン
結合活性とイー・コリ産生されたポリペプチドのＮ−末
端アミノ酸配列とによって試験した。ｐ−１５０ゲル濾
過クロマトグラフィーによって再精製したストレプトア
ビジンに対するウサギ抗−ストレプトアビジン抗体を生
成させた。抗血清は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
からニトロセルロースシートへ電気泳動した免疫斑点に
より判断して、市販のストレプトアビジンとＳ・アビジ
ニイ細胞媒体から精製されたストレプトアビジンとを識
別した〔Ｈ．トウビン等、プロシーディング・ナショナ
ル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第７６巻、第４
３５０−５４頁（１９７９）〕。
【００７３】ｐＳＡ３０４で形質転換されたイー・コリ
Ｋ−１２菌体の菌株ＪＭ８３を４０μｇ／ｍｌのアンピ
シリンを含有するＬＢ培地において３７℃にて約１８時
間培養した。冷浸透圧ショック技術〔Ｌ．Ａ．ヘッペ
ル、メソッグ・イン・エンチモロジー、第１２６巻、第
８４１−４７頁（１９６８）〕を用いて、外質空間から
蛋白を単離した。上記と同様に市販のストレプトアビジ
ンに対し生成させたウサギ抗血清は、浸透圧ショック流
体から単離された２種の主たる外質ポリペプチドをウエ
スタンブロットで識別した〔Ｈ．トウビン等、上記〕。
２種のストレプトアビジン様ポリペプチドの大きい方は
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定し
て約１７，５００ダルトンの見掛け分子量を有するのに
対し、市販ストレプトアビジンの見掛け分子量は１３，
５００ダルトンであった（図６）。２種のポリペプチド
の小さい方は１５，０００ダルトンの見掛け分子量を有
した。これら２種のストレプトアビジン様ポリペプチド
を免疫ビオチン−アガロースクロマトグラフィーカラム
から一緒に溶出させた。次いで、イー・コリ産生された
ストレプトアビジン様ポリペプチド（「エコアビジンメ
ジャー」および「エコアビジンマイナー」）を、１０ｍ
ＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０，０．９％ＮａＣ
ｌ）中で非変性条件下にｐ−１５０ゲル濾過クロマトグ
ラフィーにかけた。２種のエコアビジンは約８８，００
０ダルトンの見掛け分子量をもって移動した。この分子
量は、天然ストレプトアビジンと同様な天然四元重合体
構造に最もよく一致した。
【００７４】これらエコアビジンを、１０ｍＭトリスＨ
Ｃｌ緩衝液（Ｐｈ８，０．９％ ＮａＣｌ）の存在下に
ビオチン−アガロースおよびファロースＣＬ−６Ｂ（未
改変アガロース）のカラムクロマトグラフィーにかけ
た。これらエコアビジンはビオチン−アガロースに結合
したが、未改変アガロースには結合しなかった。さら
に、これらエコアビジンは、免疫ビオチンのカラムに結
合して天然ストレプトアビジンにより示される同様な溶
出パターンを示した〔Ｋ．ホフマン等、プロシーディン
グ・ナショナル・アカデミー・サイエンス・ＵＳＡ、第
７７巻、第４６６６−６８頁（１９８０）〕。
【００７５】さらに、天然ストレプトアビジンと両形態
のエコアビジンとの間の差を、アプライド・ビオシステ
ムスの気相アミノ酸配列決定装置を用いて、エコアビジ
ンポリペプチドのアミノ末端を配列決定することにより
確認した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よりメジャー型およびマイナー型のエコアビジンを分離
し、これらポリペプチドを電気溶出させ、かつそれぞれ
のアミノ末端のアミノ酸配列を別々に決定した。これら
エコアビジンは天然の成熟ストレプトアビジンには存在
しないアミノ末端に１３個のアミノ酸を含有し、次いで
天然ストレプトアビジンと同一の１２個のアミノ酸を含
有した。エコアビジンメジャーおよびエコアビジンマイ
ナーの両者は同一アミノ末端を有するがことなる見掛け
分子量を有するので、これらはカルボキシル末端が相違
するはずである。ヒドロキシルアミン切断に際し、エコ
アビジンメジャーは、エコアビジンマイナーと同様な見
掛け分子量を有する形態に変化する。これは、２種の形
態がカルボキシル末端においてのみ相違するという推定
に一致する。蛋白配列は、ＳＡ３０７の対応する領域の
ヌクレオチド配列から予想されるものと正確に一致し、
ストレプトアビジン信号配列の２２アミノ酸断片のイー
・コリにおける切断を確認した。かくして、ストレプト
アビジン信号配列の１３アミノ酸断片は、両形態の成熟
エコアビジンに残在する。
【００７６】エコアビジンを、放射能標識したビオチン
を結合するその能力によって分析した〔Ｓ．Ｇ．コレン
マンおよびＢ．Ｗ．オーマレー、メソッズ・エンチモロ
ジー、第１８Ａ巻、第４２７−３０頁（１９７０）〕。
精製したエコアビジンの収量は培地１ｌ当り約３０ｍｇ
であり、これはＳ・アビジニイから作成される天然スト
レプトアビジンの収量の７．５〜１０倍の増加である。
ｐＳＡ３０７で形質転換させかつ上記と同様に分析した
イー・コリ菌体は、同様なレベルのストレプトアビジン
を産生した。
【００７７】上記ｐＳＡ３０４と同様にして、ｐＳＡ３
０７−形質転換イー・コリ菌体におけるストレプトアビ
ジン様ＤＮＡ断片の発現を制御する発現制御配列は、イ
ー・コリｌａｃプロモータであることを確認した。
【００７８】Ｓ・リビダンスにおけるストレプトアビジ
ン様ポリペプチドの発現 さらに、ストレプトアビジン様ポリペプチドをコードす
るＤＮＡ配列を、ストレプトアビジン発現制御配列の制
御下で、グラム陽性菌ストレプトミセス・リビダンスに
て複製し得る発現ベクターにクローン化させた。ｐＳＡ
３０４はＳ・リビダンスで複製しなかったので、ｐＳＡ
３０４とｐＩＪ７０２とよりなる共体プラスミドを作成
した。このプラスミドにおいて、ストレプトアビジンＤ
ＮＡ配列はＳＡ３０４、すなわち挿入ＤＮＡ配列のすぐ
上流に位置するｌａｃプロモータと、ＳＡ３０４に存在
するストレプトアビジン発現制御配列との両者に作用結
合する。
【００７９】次に、図７を参照して、ｐＳＡ３０４をＰ
ｓｔＩで線状化させ、かつ線状化したプラスミドを牛腸
内ホスファターゼで処理して再環化を防止した。次い
で、ｐＩＪ７０２をＰｓｔＩにより線状化させ〔Ｅ．キ
ャッツ等、ジャーナル・オブ・ゼネラル・マイクロバイ
オロジー、第１２９巻、第２７０３−１４頁（１９８
３）〕、かつこれを線状化ｐＳＡ３０４に結合させた。
このプラスミドｐＩＪ７０２はチオストレプトン耐性に
対するストレプトミセス標識遺伝子を含有すると共に、
ストレプトミセス宿主細胞にて増殖し得るレプリコンを
含有する。
【００８０】結合混合物によりイー・コリＪＭ８３菌体
を形質転換させ、かつ前記と同様にアンピシリンの存在
下に培養した。共体プラスミドｐＳＡ３７２１を含有す
る１個のＡｍｐＲコロニーを単離した。
【００８１】ｐＳＡ３７２１を単離し、かつこれを使用
してストレプトミセス・リビダンスを形質転換させた。
チオストレプトン耐性につきスクリーニングし、８種の
コロニーを単離した。各コロニーを２μｇ／ｍｌのチオ
ストレプトンを含有するＲ２ＹＥ培地において、８日間
まで邪魔板振とうフラスコにて３０℃で培養した。菌体
と培地とを種々の時間で収穫し、かつ上記の免疫学的分
析およびビオチン結合分析によりストレプトアビジン様
ポリペプチドの産生およびその細胞培地内への分泌につ
き試験した。形質転換したＳ・リビダンスは、これら分
析において天然ストレプトアビジンと同一に挙動するポ
リペプチドを産生し、かつ細胞培地中へ分泌することが
見出された。産生のレベルは培地１ｍｌ当り約２５０ｍ
ｇの蛋白であり、これはＳ・アビジニイの産生よりも約
６０〜８０倍の増加であった。ストレプトアビジン様Ｄ
ＮＡ配列は、Ｓ１地図化実験を行うことによりＳＡ３０
４断片に存在するストレプトアビジン発現制御配列の制
御下にあることを確認し〔Ａ．Ｊ．バークおよびＰ．
Ａ．シャープ、セル、第１２巻、第７２１−３２頁（１
９７７）〕、このことはＲＮＡ転写がＳ・アビジニイお
よびｐＳＡ３７２１における同じ部位で開始することを
示している。
【００８２】Ｓ・リビダンスにより産生されかつ分泌さ
れたストレプトアビジン様ポリペプチドがｐＳＡ３７２
１組換ＤＮＡ分子に含有されるＤＮＡ断片の発現の結果
であることを確認するため、Ｓ・リビダンスｐＩＪ７０
２単独で同一条件下に形質転換させ、かつ上記と同様に
チオストレプトン耐性につき選択した。このように単離
したコロニーは、いずれも上記分析の何れで測定して
も、ストレプトアビジン様活性を有する蛋白を産生しな
かった。
【００８３】融合蛋白またはポリペプチドの産生 次いで選択された蛋白、ポリペプチド、ペプチドもしく
はアミノ酸をコードするＤＮＡ配列をプラスミドｐＳＡ
３０７中へ、ストレプトアビジン様ポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ配列の末端に位置する制限部位であるが、
その翻訳停止信号前かつその同じ解読枠において挿入
し、ハイブリッドＤＮＡ配列を作成した。この構造を得
るため、たとえばα−アンチトリプシン（「αＡＴ」）
をコードするＤＮＡ配列を使用した。ｐＵＬＢ１５２３
〔Ａ．ホレン等、ジーン、第２巻、第２２５−６４頁
（１９８３）〕をＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで処理し、
かつαＡＴの最初の２個のアミノ酸だけをコードする小
さいＤＮＡ断片を単離した。合成リンカをこの断片の
５′末端に付加させて、最初の２このアミノ酸をコード
するコドンを再形成させると共に、この断片の５′末端
にＮｃｏ制限部位を付加した。次いで、ＨｉｎｃＩＩで
の部分切断によりｐＳＡ３０４を線状化させた。Ｎｃｏ
リンカを線状化したｐＳＡ３０４に付加させ、かつＮｃ
ｏで切断して凝集性末端を生成させた。次いで、線状化
したｐＳＡ３０４をＰｓｔＩで処理した。ＨｉｎｃＩＩ
で切断されかつＳＡ３０４のヌクレオチド９９４にのみ
Ｎｃｏリンカを有する断片を選択した。αＡＴをコード
するＤＮＡ配列をこのＤＮＡ断片に結合させて、ストレ
プトアビジン様ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に
隣接してそれと同じ解読枠に挿入されたαＡＴを有する
組換ＤＮＡ分子を生成させた。
【００８４】イー・コリ Ｋ１２菌株細胞を得られた組
換ＤＮＡ分子で形質転換させ、かつこの形質転換体宿主
菌体を培養して、αＡＴに対し末端結合したストレプト
アビジン様ポリペプチドよりなる融合ポリペプチドを産
生させかつ宿主細胞膜を通して分泌させた。
【００８５】他のＤＮＡ配列も入手することができ、こ
れを本発明の方法に使用して選択された蛋白、ポリペプ
チド、ペプチドもしくはアミノ酸に結合されたストレプ
トアビジン様ポリペプチドよりなる融合蛋白を産生させ
ることができる。
【００８６】ストレプトミセスにおいて複製することが
できかつ融合ストレプトアビジン様αＡＴ蛋白を産生し
得るクローン化ビークルを作成するため、ハイブリッド
ＤＮＡ配列を有する組換ＤＮＡ分子をＰｓｔＩで線状化
させ、かつ線状化した組換ＤＮＡ分子を牛腸内ホスファ
ターゼで処理して再環化を防止した。次いで、ＰｓｔＩ
で線状化したｐＩＪ７０２を線状化した組換ＤＮＡ分子
に接合させて、ハイブリッドストレプトアビジン−αＡ
Ｔ ＤＮＡ配列を有する共体プラスミドを生成させた。
Ｓ・リビダンス菌体をこの共体プラスミドで形質転換さ
せ、かつ宿主細胞を培養してαＡＴに対し末端結合した
ストレプトアビジン様ポリペプチドよりなる融合蛋白を
産生させかつ宿主細胞膜を通して細胞媒体中へ分泌させ
た。
【００８７】本発明の他の実施例において、組織プラス
ミノーゲン活性化物質（「ＴＰＡ」）に対し末端結合し
たストレプトアビジン様ポリペプチドよりなる融合蛋白
をコードするハイブリッドＤＮＡ配列を作成した。
【００８８】図８を参照して、先ずストレプトアビジン
様ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含んだプラス
ミドを作成した。ｐＳＡ３０７をＨｉｎｃＩＩで処理し
て、ＳＡ３０７におけるヌクレオチドＮｏ．１７４およ
び９９４にて切断した（図２〜５）。次いで、Ｎｃｏリ
ンカをこの断片の両末端に付加させ、かつＮｃｏで切断
して凝集性末端を生成させた。この断片をＳＡ３２４と
呼ぶ。
【００８９】次いで、プラスミドｐＫＫ２３３−２
〔Ｊ．ブロシウス、私的通信〕をＮｃｏで線状化させ
た。この線状化したｐＫＫ２３３−２をＳＡ３０２に結
合して、プラスミドｐＳＡ３２４を生ぜしめた。イー・
コリＫ１２菌体をｐＳＡ３２４で形質転換させかつこの
形質転換宿主菌体を培養して、ストレプトアビジン様ポ
リペプチドを産生させると共に、宿主細胞膜を通して分
泌させた。ストレプトアビジン様ポリペプチドの産生は
ＩＰＴＧにより誘発された。これから結論されるよう
に、ｐＳＡ３２４は、ｐＫＫ２３３−２に存在するＴＲ
Ｃ発現制御配列に作用結合したストレプトアビジン様ポ
リペプチドをコードするＤＮＡ配列（信号ＤＮＡ配列を
も含む）を含有する。
【００９０】次いで、ＴＰＡをコードする配列を有する
プラスミドを作成した。プラスミドｐＴＰＡ２０は３′
末端におけるＢｇｌＩＩ制限部位とＴＰＡ遺伝子の５′
末端におけるＨｉｎｄＩＩＩ制限部位との間に挿入され
た成熟ＴＰＡをコードするＤＮＡ配列を有する。ｐＴＰ
Ａ２０をＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで処理し、か
つＴＰＡ断片を単離した。Ｎｃｏ−ＢｇｌＩＩのリンカ
をＴＰＡ遺伝子の５′末端に結合させた。次いで、ｐＫ
Ｋ２３３−２をＮｃｏおよびＨｉｎｄＩＩＩで処理し
た。大きい断片を単離しかつこれをＴＰＡ断片（「ｐＴ
ＰＡ１０１」）に結合させた。次いで、ｐＴＰＡ１０１
をＢａｍＨＩで切断し、ｌａｃＩ（ＴＲＣリプレッサ）
遺伝子を有する断片を挿入した。ｌａｃＩ遺伝子はＴＲ
Ｃプロモータのリプレッサをコードする。ｌａｃＩリプ
レッサの存在下にＴＲＣプロモータは、たとえばＩＰＴ
Ｇのような誘発剤を添加した際のみ転写を開始させ、宿
主細胞に添加されるＩＰＴＧのレベルを制御することに
より転写を開始または停止させることかできる。このプ
ラスミドをｐＴＰＡ１０２と呼ぶ。
【００９１】ハイブリッドストレプトアビジン−ＴＰＡ
のＤＮＡ配列を次のように作成した。ｐＳＡ３２４をＮ
ｃｏで処理してＳＡ３２４を単離した。次いで、ｐＴＰ
Ａ１０２をＮｃｏで線状化させ、かつ牛腸内ホスファタ
ーゼで処理して再環化を防止した。この線状化したｐＴ
ＰＡ１０２をＳＡ３２４に結合させた。このプラスミド
をｐＳＡＴ９７２４と呼び、かつそこに存在するハイブ
リッドＤＮＡ配列をＳＡＴ９７２４と呼ぶ。
【００９２】イー・コリＨＢ１０１をｐＳＡＴ９７２４
で形質転換させかつこの形質転換宿主を培養した。上記
免疫学的分析により融合ストレプトアビジン様−ＴＰＡ
蛋白の産生につき試験した〔Ｈ．トービン等、プロシー
ディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳ
Ａ、第７６巻、第４３５０−５４頁（１９７９）〕。形
質転換したイー・コリはストレプトアビジンとＴＰＡ免
疫反応制物質との両者を含有するポリペプチドを産生す
ることが判明した。この蛋白は約８０，０００ダルトン
の見掛け分子量を有した。これは、融合ストレプトアビ
ジン−ＴＰＡ蛋白の分子量に一致する。融合蛋白の産生
はＩＰＴＧにより誘発され、このことはハイブリッドＤ
ＮＡ配列がｐＫＫ２３３−２に存在するＴＲＣプロモー
タの制御下にあることを示している。
【００９３】次いで、Ｓ・リビダンスにおいて複製し得
るプラスミドを作成した。ｐＳＡＴ９７２４をＢａｍＨ
Ｉで切断し、かつこれをＢｇｌＩＩで線状化させたｐＩ
Ｊ７０２に結合させて、共体プラスミドｐＳＡＴ９７２
４およびｐＳＡＴ９７９０を生成させた。これらのプラ
スミドを使用してＳ・リビダンスを形質転換させ、次い
でこれを培養してＴＰＡに対し末端結合したストレプト
アビジン様ポリペプチドよりなる融合蛋白を産生させ、
かつ細胞媒体中へ分泌させた。
【００９４】本発明のさらに他の実施例において、ＴＰ
Ａに対し末端融合したストレプトアビジン様ポリペプチ
ドよりなる融合蛋白をストレプトアビジンにおいてのみ
産生するハイブリッドＤＮＡ配列を持った組換ＤＮＡ分
子を作成した。
【００９５】図９を参照して、ｐＳＡ３２４をＮｃｏで
処理し、かつストレプトアビジン様ポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ配列を持ったＳＡ３２４を再単離した。Ｔ
ＰＡをコードするＤＮＡ配列を含んだｐＳＡＴ７００１
をＮｃｏで線状化させて、ＴＰＡ遺伝子の前で切断し、
これをＳＡ３２４に結合させた。次いで、プラスミドｐ
ＳＡＴ７０２０を単離した。ヌクレオチド配列決定によ
りストレプトアビジン遺伝子はＴＰＡ遺伝子の前に適切
な配向で存在し、ＴＰＡに対し末端結合したストレプト
アビジン様ポリペプチドよりなる融合蛋白をコードする
ハイブリッドＤＮＡ配列を生成することを確認した。
【００９６】ＳＡ３２４の作成に際し除去されたＳＡ３
０４の最初の１７４ヌクレオチドを再構成するため、ｐ
ＳＡ３０７をＢａｍＨＩおよびＢｓｓＨ２で処理して、
ｓａ３０４のヌクレオチド４２２にて切断した（図２〜
５参照）。次いで、小さい断片を単離した。次に、ｐＳ
ＡＴ７０２０をＢａｍＨＩおよびＢｓｓＨ２で処理し、
かつ大きい断片を小さいｐＳＡ３０４断片に結合させ
た。得られたプラスミドをｐＳＡＴ７０２１と呼び、そ
こに存在するハイブリッドＤＮＡ配列をＳＡＴ７０２１
と呼ぶ次いで、ｐＳＡＴ７０２１をＢａｍＨＩで線状化
させ、かつ線状化したプラスミドを牛腸内ホスファター
ゼで処理して再環化を防止した。ＢｇｌＩＩ−線状化ｐ
ＩＪ７０２を線状化したｐＳＡＴ７０２１に結合して、
ハイブリッドストレプトアビジン−ＴＰＡ ＤＮＡ配列
を有する共体プラスミドｐＳＡＴ７０２６を生成させ
た。このｐＳＡＴ７０２６によりＳ・リビダンス菌体を
形質転換させた。細胞媒体から、上記の分析で測定して
ストレプトアビジンとＴＰＡとの両者の免疫学的活性を
有する融合蛋白を単離した。
【００９７】上記のようにｐＳＡＴ７０２１を作成した
が、同様なプラスミドを次のようにして一層容易に作成
することができた。図１０を参照して、部分的Ｈｉｎｃ
ＩＩ切断のみが生じるような条件下でｐＳＡ３０７をＨ
ｉｎｃＩＩで切断させた。Ｎｃｏリンカを加え、かつＮ
ｃｏおよびＢａｍＨＩで切断した。次いで、ストレプト
アビジン遺伝子の殆んどを含有する９９４ヌクレオチド
断片を単離した。ｐＴＰＡ１０１をＮｃｏおよびＨｉｎ
ｄＩＩＩで切断し、かつＴＰＡをコードするＤＮＡ断片
を単離した。これら２種の断片を結合させて、ＴＰＡ遺
伝子に対し末端結合しかつそれと同じ解読枠に存在する
ストレプトアビジン遺伝子よりなるハイブリッドＤＮＡ
配列を生成させた。次いで、ｐＵＣ１３をＢａｍＨＩお
よびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、かつ大きい断片をハイブ
リッドＤＮＡ配列に結合させた。これにより、ストレプ
トアビジン発現制御配列の制御下でハイブリッドストレ
プトアビジン−ｔｐａ遺伝子を有するプラスミドが生成
した。次いで、このプラスミドを使用して、ストレプト
ミセス中で複製し得る共体プラスミドを生成させた。
【００９８】次いで、標準技術により細胞媒体から分泌
蛋白を単離し（たとえば硫酸アンモニウム沈殿）、かつ
単離物を上記のように免疫ビオチン−アガロースのカラ
ムクロマトグラフィーにかけて融合蛋白を汚染蛋白から
分離した。融合蛋白を上記のように高ｐＨ−尿素緩衝液
で免疫ビオチン−アガロースから溶出させ、かつ選択し
た蛋白、ポリペプチド、ペプチドもしくはアミノ酸から
公知技術によってストレプトアビジン様ポリペプチドを
切断し、この公知方法はストレプトアビジンまたは選択
した蛋白もしくはポリペプチドの何れにおいても切断し
ない。たとえば所望蛋白がメチオニンを含まない場合に
は、臭化シアノゲンを切断剤として使用することができ
る。蛋白切断のための他の方法は上記に記載されてお
り、これを本発明の方法に使用することができる。
【００９９】次いで、ストレプトアビジン様ポリペプチ
ドを選択した蛋白、ポリペプチド、ペプチドもしくはア
ミノ酸から種々の手段によって、好ましくは免疫ビオチ
ン−アガロースのカラムクロマトグラフィーによって分
離した。この選択した蛋白、ポリペプチド、ペプチドも
しくはアミノ酸は免疫ビオチンに結合することなくカラ
ムを通過し、ストレプトアビジン様ポリペプチドを上記
と同様にカラムから溶出させた。ストレプトアビジン様
ポリペプチドおよび背選択した蛋白、ポリペプチド、ペ
プチドもしくはアミノ酸が十分に異なる分子量を有する
場合、これらはたとえば天然ポリアクリルアミドゲル電
気泳動またはモレキュラシーブクロマトグラフィーのよ
うな当業界で知られた幾つかの寸法決定技術により分離
することもできる。
【０１００】本発明の組換ＤＮＡ分子を有する微生物
は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（ロックビル、メリーランド）に寄託された培養物を例
として、次のように固定されている。３種の培養物を１
９８４年９月１０日付で寄託した： イー・コリＫ１２，菌株ＪＭ８３（ｐＳＡ３０４） イー・コリＫ１２，菌株ＪＭ８３（ｐＳＡ３０７） Ｓ・リビダンス（ｐＳＡ３７２１） これらの培養物には、それぞれ受託番号ＡＴＣＣ３９８
４５、ＡＴＣＣ３９８４６、およびＡＴＣＣ３９８４４
が付与された。
【０１０１】また、２種の培養物を１９７４年９月２６
日付けで寄託した： イー・コリＨＢ１０１（ｐＳＡＴ９７２４） Ｓ・リビダンス（ｐＳＡＴ７０２６） これらの培養物には、それぞれ受託番号ＡＴＣＣ３９８
８０、およびＡＴＣＣ３９８７９が付与された。
【０１０２】以上、本発明につき多くの実施例を示した
が、この基本構成を改変して本発明の方法および組成物
を用いる他の具体例を与えることもできる。したがっ
て、本発明の範囲は、上記実施例に示した特定具体例に
限定されることなく、多くの改変をなし得ることが了解
されよう。
【０１０３】
【発明の効果】本発明のＤＮＡ配列、組換ＤＮＡ分子、
宿主および方法を使用することにより、ストレプトアビ
ジン産生に関する他の公知方法に伴う従来の低収率を回
避することができる。したがって、高純度のストレプト
アビジン様ポリペプチドおよびその誘導体を多量に医薬
およびその他の工業で種々の目的に使用することを可能
にする。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のストレプトアビジン様ポリペプチドを
コードするＤＮＡ配列をもった発現ベクターｐＳＡ３０
４およびｐＳＡ３０７の製造例を示す略図である。
【図２】図３〜５と合わせて、ＳＡ３０７の一部のヌク
レオチド配列とストレプトアビジン様ポリペプチドをコ
ードする部分の領域のアミノ酸配列とを示し、アミノ酸
配列のラインｃはストレプトアビジン様ポリペプチドを
産生するよう転写される解読枠である。
【図３】図２、４および５と合わせて、ＳＡ３０７の一
部のヌクレオチド配列とストレプトアビジン様ポリペプ
チドをコードする部分の領域のアミノ酸配列とを示し、
アミノ酸配列のラインｃはストレプトアビジン様ポリペ
プチドを産生するよう転写される解読枠である。
【図４】図２、３および５と合わせて、ＳＡ３０７の一
部のヌクレオチド配列とストレプトアビジン様ポリペプ
チドをコードする部分の領域のアミノ酸配列とを示し、
アミノ酸配列のラインｃはストレプトアビジン様ポリペ
プチドを産生するよう転写される解読枠である。
【図５】図２〜４と合わせて、ＳＡ３０７の一部のヌク
レオチド配列とストレプトアビジン様ポリペプチドをコ
ードする部分の領域のアミノ酸配列とを示し、アミノ酸
配列のラインｃはストレプトアビジン様ポリペプチドを
産生するよう転写される解読枠である。
【図６】本発明のストレプトアビジン様ポリペプチドの
見掛け分子量を測定するのに使用したＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲルを示し、レーンａは再精製した市販スト
レプトアビジンの試料であり、レーンｂは上部から下部
まで順次に読んで４３Ｋｄ、２５．７Ｋｄ、１８．４Ｋ
ｄ、１４．３Ｋｄ、１２．３Ｋｄ、６．２Ｋｄおよび
３．０Ｋｄのバンドを有する蛋白標準の試料であり、レ
ーンｃはイー・コリにおいてＳＡ３０７の発現により産
生されたエコーアビジンであり、かつレーンｄはＳ．リ
ビダンスにおいてｐＳＡ３７２１の発現により産生され
たストレプトアビジン様ポリペプチドである。
【図７】本発明のストレプトアビジン様ポリペプチドを
コードするＤＮＡ配列を含んだ発現ベクターｐＳＡ３０
４の他の製造例の略図である。
【図８】本発明の融合したストレプトアビジン様組織プ
ラスミノーゲン活性化物質蛋白をコードするＤＮＡ配列
を持った発現ベクターの製造例の略図である。
【図９】本発明の融合したストレプトアビジン様組織プ
ラスミノーゲン活性化物質蛋白をコードするＤＮＡ配列
を持った発現ベクターの他の製造例の略図である。
【図１０】融合したストレプトアビジン様組織プラスミ
ノーゲン活性化物質蛋白をコードするＤＮＡ配列を持っ
た発現ベクターのさらに他の製造例の略図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ガーウィン，ジェフェリー エル アメリカ合衆国、マサチューセッツ 01730、ベドフォード、フレッチャー ロ ード 76

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ビオチンもしくはビオチン誘導体または
    類縁体に結合し得るストレプトアビジンまたはその一部
    をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡよりなる
    組換ＤＮＡ分子によって形質転換された宿主を培養する
    工程から成る、ビオチンもしくはビオチン誘導体または
    類縁体に結合し得るストレプトアビジンまたはその一部
    を製造する方法であって、前記ＤＮＡは、 (a)それぞれ受託番号ＡＴＣＣ３９８４５およびＡＴＣ
    Ｃ３９８４６により同定される形質転換イー・コリ Ｋ
    １２株中に保持され、かつヌクレオチド配列： ATGCGCAAGATCGTCGTTGCAGCCATCGCCGTTTCCCTGACCACGGTCTCGATTACGGCCAGCGCTTCGGCA GACCCCTCCAAGGACTCGAAGGCCCAGGTCTCGGCCGCCGAGGCCGGCATCACCGGCACCTGGTACAACCAG CTCGGCTCGACCTTCATCGTGACCGCGGGCGCCGACGGCGCCCTGACCGGAACCTACGAGTCGGCCGTCGGC AACGCCGAGAGCCGCTACGTCCTGACCGGTCGTTACGACAGCGCCCCGGCCACCGACGGCAGCGGCACCGCC CTCGGTTGGACGGTGGCCTGGAAGAATAACTACCGCAACGCCCACTCCGCGACCACGTGGAGCGGCCAGTAC GTCGGCGGCGCCGAGGCGAGGATCAACACCCAGTGGCTGCTGACCTCCGGCACCACCGAGGCCAACGCCTGG AAGTCCACGCTGGTCGGCCACGACACCTTCACCAAGGTGAAGCCGTCCGCCGCCTCCATCGACGCGGCGAAG AAGGCCGGCGTTCAACAACGGCAACCCGCTCGACGCCGTTCAGCAGTA; よりなる、プラスミドｐＳＡ３０４のＤＮＡ挿入物およ
    びプラスミドｐＳＡ３０７のＤＮＡ挿入物； (b)ヌクレオチド配列： ACGAAGTAACCGACAGGACTCGGCCATTCTTTGGCCGAAATTCCTTTGCAGAAAATGTTGTTGAGAACCCTC CGATGGCTAGTACGATTTACACCGAACATGTGCCCTTGGCAACCATCGACCCGGACCTCGACCATCCAGTTC TGCCGCCAAAGACACATGCCGCACTGCTGTTTGTTCACCGACACCGTCAGGTGCACGGCCGAGGTCACAAAC CTTGACGGGCGGGATACGGACGGCGCACGCCACAGCGCGCCCTCCGTCCCCCGCCGGGCAACAACTAGGGGA GTATTTTTCGTGTCTCACATGCGCAAGATCGTCGTTGCAGCCATCGCCGTTTCCCTGACCACGGTCTCGATT ACGGCCAGCGCTTCGGCAGACCCCTCCAAGGACTCGAAGGCCCAGGTCTCGGCCGCCGAGGCCGGCATCACC GGCACCTGGTACAACCAGCTCGGCTCGACCTTCATCGTGACCGCGGGCGCCGACGGCGCCCTGACCGGAACC TACGAGTCGGCCGTCGGCAACGCCGAGAGCCGCTACGTCCTGACCGGTCGTTACGACAGCGCCCCGGCCACC GACGGCAGCGGCACCGCCCTCGGTTGGACGGTGGCCTGGAAGAATAACTACCGCAACGCCCACTCCGCGACC ACGTGGAGCGGCCAGTACGTCGGCGGCGCCGAGGCGAGGATCAACACCCAGTGGCTGCTGACCTCCGGCACC ACCGAGGCCAACGCCTGGAAGTCCACGCTGGTCGGCCACGACACCTTCACCAAGGTGAAGCCGTCCGCCGCC TCCATCGACGCGGCGAAGAAGGCCGGCGT; よりなるプラスミドｐＳＡ３２４のＤＮＡ挿入物； (c)６×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ、３０℃、一晩の
    条件で前記(a),(b) に記載のいずれかのＤＮＡにハイブ
    リダイズし、かつビオチンもしくはビオチン誘導体また
    は類縁体に結合することができるポリペプチドをコード
    するＤＮＡ；および、 (d)前記(a),(b),(c) に記載のいずれかのＤＮＡと縮重
    関係にあり、かつ同じポリペプチドをコードするＤＮ
    Ａ、から成る群から選択される、ビオチンもしくはビオ
    チン誘導体または類縁体に結合し得るストレプトアビジ
    ンまたはその一部を製造する方法。
  2. 【請求項２】 前記ＤＮＡが、前記ＤＮＡによりコード
    されるポリペプチドを前記ＤＮＡの発現に際して前記Ｄ
    ＮＡによって形質転換された単細胞宿主の細胞膜を通過
    して分泌させるのに充分な、信号ＤＮＡの部分を含有す
    ることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記形質転換された宿主が、ストレプト
    ミセス リビダンス、他のストレプトミセス属菌、他の
    グラム陽性細菌、イー・コリ、シュードモナス属菌、バ
    チルス属菌、酵母、他の真菌類、動物および植物宿主細
    胞、およびヒト組織細胞の菌株または細胞株から成る群
    から選択されることを特徴とする、請求項１または２に
    記載の方法。
  4. 【請求項４】 ハイブリッドＤＮＡから成る少なくとも
    １つの組換ＤＮＡ分子で形質転換された宿主によって産
    生される融合蛋白質であって、前記ハイブリッドＤＮＡ
    は、前記融合蛋白質をコードするヌクレオチド配列を有
    し、かつ同じ読取り枠となるように末端どうしで結合さ
    れた少なくとも２つのＤＮＡよりなり、その第一のＤＮ
    Ａの少なくとも一部はストレプトアビジンまたはその一
    部をコードし、前記ストレプトアビジンまたはその一部
    はビオチンもしくはビオチン誘導体または類縁体に結合
    することができ、前記第一のＤＮＡの少なくとも一部
    は、 (a)それぞれ受託番号ＡＴＣＣ３９８４５およびＡＴＣ
    Ｃ３９８４６により同定される形質転換イー・コリ Ｋ
    １２株中に保持され、かつヌクレオチド配列： ATGCGCAAGATCGTCGTTGCAGCCATCGCCGTTTCCCTGACCACGGTCTCGATTACGGCCAGCGCTTCGGCA GACCCCTCCAAGGACTCGAAGGCCCAGGTCTCGGCCGCCGAGGCCGGCATCACCGGCACCTGGTACAACCAG CTCGGCTCGACCTTCATCGTGACCGCGGGCGCCGACGGCGCCCTGACCGGAACCTACGAGTCGGCCGTCGGC AACGCCGAGAGCCGCTACGTCCTGACCGGTCGTTACGACAGCGCCCCGGCCACCGACGGCAGCGGCACCGCC CTCGGTTGGACGGTGGCCTGGAAGAATAACTACCGCAACGCCCACTCCGCGACCACGTGGAGCGGCCAGTAC GTCGGCGGCGCCGAGGCGAGGATCAACACCCAGTGGCTGCTGACCTCCGGCACCACCGAGGCCAACGCCTGG AAGTCCACGCTGGTCGGCCACGACACCTTCACCAAGGTGAAGCCGTCCGCCGCCTCCATCGACGCGGCGAAG AAGGCCGGCGTTCAACAACGGCAACCCGCTCGACGCCGTTCAGCAGTA; よりなる、プラスミドｐＳＡ３０４のＤＮＡ挿入物およ
    びプラスミドｐＳＡ３０７のＤＮＡ挿入物； (b)ヌクレオチド配列： ACGAAGTAACCGACAGGACTCGGCCATTCTTTGGCCGAAATTCCTTTGCAGAAAATGTTGTTGAGAACCCTC CGATGGCTAGTACGATTTACACCGAACATGTGCCCTTGGCAACCATCGACCCGGACCTCGACCATCCAGTTC TGCCGCCAAAGACACATGCCGCACTGCTGTTTGTTCACCGACACCGTCAGGTGCACGGCCGAGGTCACAAAC CTTGACGGGCGGGATACGGACGGCGCACGCCACAGCGCGCCCTCCGTCCCCCGCCGGGCAACAACTAGGGGA GTATTTTTCGTGTCTCACATGCGCAAGATCGTCGTTGCAGCCATCGCCGTTTCCCTGACCACGGTCTCGATT ACGGCCAGCGCTTCGGCAGACCCCTCCAAGGACTCGAAGGCCCAGGTCTCGGCCGCCGAGGCCGGCATCACC GGCACCTGGTACAACCAGCTCGGCTCGACCTTCATCGTGACCGCGGGCGCCGACGGCGCCCTGACCGGAACC TACGAGTCGGCCGTCGGCAACGCCGAGAGCCGCTACGTCCTGACCGGTCGTTACGACAGCGCCCCGGCCACC GACGGCAGCGGCACCGCCCTCGGTTGGACGGTGGCCTGGAAGAATAACTACCGCAACGCCCACTCCGCGACC ACGTGGAGCGGCCAGTACGTCGGCGGCGCCGAGGCGAGGATCAACACCCAGTGGCTGCTGACCTCCGGCACC ACCGAGGCCAACGCCTGGAAGTCCACGCTGGTCGGCCACGACACCTTCACCAAGGTGAAGCCGTCCGCCGCC TCCATCGACGCGGCGAAGAAGGCCGGCGT; よりなるプラスミドｐＳＡ３２４のＤＮＡ挿入物； (c)６×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ、３０℃、一晩の
    条件で前記(a),(b) に記載のいずれかのＤＮＡにハイブ
    リダイズし、かつビオチンもしくはビオチン誘導体また
    は類縁体に結合することができるポリペプチドをコード
    するＤＮＡ；および、 (d)前記(a),(b),(c) に記載のいずれかのＤＮＡと縮重
    関係にあり、かつ同じポリペプチドをコードするＤＮ
    Ａ、から成る群から選択され、その第二のＤＮＡはもう
    １つの蛋白質、ペプチドまたはアミノ酸をコードし、前
    記ハイブリッドＤＮＡは、前記組換ＤＮＡ分子中で発現
    制御配列に作用的に結合されていることを特徴とする、
    融合蛋白質。
  5. 【請求項５】 前記ハイブリッドＤＮＡが、その融合蛋
    白質の分泌を生起するのに充分な信号ＤＮＡの部分を含
    有することを特徴とする、請求項４に記載の融合蛋白
    質。
  6. 【請求項６】 前記ハイブリッドＤＮＡが、その融合蛋
    白質の成熟を生起するのに充分な信号ＤＮＡの部分を含
    有することを特徴とする、請求項５に記載の融合蛋白
    質。
  7. 【請求項７】 ハイブリッドＤＮＡによってコードされ
    る融合蛋白質であって、前記ハイブリッドＤＮＡは、前
    記融合蛋白質をコードするヌクレオチド配列を有し、か
    つ同じ読取り枠となるように末端どうしで結合された少
    なくとも２つのＤＮＡよりなり、その第一のＤＮＡの少
    なくとも一部はストレプトアビジンまたはその一部をコ
    ードし、前記ストレプトアビジンまたはその一部はビオ
    チンもしくはビオチン誘導体または類縁体に結合するこ
    とができ、前記第一のＤＮＡの少なくとも一部は、 (a)それぞれ受託番号ＡＴＣＣ３９８４５およびＡＴＣ
    Ｃ３９８４６により同定される形質転換イー・コリ Ｋ
    １２株中に保持され、かつヌクレオチド配列： ATGCGCAAGATCGTCGTTGCAGCCATCGCCGTTTCCCTGACCACGGTCTCGATTACGGCCAGCGCTTCGGCA GACCCCTCCAAGGACTCGAAGGCCCAGGTCTCGGCCGCCGAGGCCGGCATCACCGGCACCTGGTACAACCAG CTCGGCTCGACCTTCATCGTGACCGCGGGCGCCGACGGCGCCCTGACCGGAACCTACGAGTCGGCCGTCGGC AACGCCGAGAGCCGCTACGTCCTGACCGGTCGTTACGACAGCGCCCCGGCCACCGACGGCAGCGGCACCGCC CTCGGTTGGACGGTGGCCTGGAAGAATAACTACCGCAACGCCCACTCCGCGACCACGTGGAGCGGCCAGTAC GTCGGCGGCGCCGAGGCGAGGATCAACACCCAGTGGCTGCTGACCTCCGGCACCACCGAGGCCAACGCCTGG AAGTCCACGCTGGTCGGCCACGACACCTTCACCAAGGTGAAGCCGTCCGCCGCCTCCATCGACGCGGCGAAG AAGGCCGGCGTTCAACAACGGCAACCCGCTCGACGCCGTTCAGCAGTA; よりなる、プラスミドｐＳＡ３０４のＤＮＡ挿入物およ
    びプラスミドｐＳＡ３０７のＤＮＡ挿入物； (b)ヌクレオチド配列： ACGAAGTAACCGACAGGACTCGGCCATTCTTTGGCCGAAATTCCTTTGCAGAAAATGTTGTTGAGAACCCTC CGATGGCTAGTACGATTTACACCGAACATGTGCCCTTGGCAACCATCGACCCGGACCTCGACCATCCAGTTC TGCCGCCAAAGACACATGCCGCACTGCTGTTTGTTCACCGACACCGTCAGGTGCACGGCCGAGGTCACAAAC CTTGACGGGCGGGATACGGACGGCGCACGCCACAGCGCGCCCTCCGTCCCCCGCCGGGCAACAACTAGGGGA GTATTTTTCGTGTCTCACATGCGCAAGATCGTCGTTGCAGCCATCGCCGTTTCCCTGACCACGGTCTCGATT ACGGCCAGCGCTTCGGCAGACCCCTCCAAGGACTCGAAGGCCCAGGTCTCGGCCGCCGAGGCCGGCATCACC GGCACCTGGTACAACCAGCTCGGCTCGACCTTCATCGTGACCGCGGGCGCCGACGGCGCCCTGACCGGAACC TACGAGTCGGCCGTCGGCAACGCCGAGAGCCGCTACGTCCTGACCGGTCGTTACGACAGCGCCCCGGCCACC GACGGCAGCGGCACCGCCCTCGGTTGGACGGTGGCCTGGAAGAATAACTACCGCAACGCCCACTCCGCGACC ACGTGGAGCGGCCAGTACGTCGGCGGCGCCGAGGCGAGGATCAACACCCAGTGGCTGCTGACCTCCGGCACC ACCGAGGCCAACGCCTGGAAGTCCACGCTGGTCGGCCACGACACCTTCACCAAGGTGAAGCCGTCCGCCGCC TCCATCGACGCGGCGAAGAAGGCCGGCGT; よりなるプラスミドｐＳＡ３２４のＤＮＡ挿入物； (c)６×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ、３０℃、一晩の
    条件で前記(a),(b) に記載のいずれかのＤＮＡにハイブ
    リダイズし、かつビオチンもしくはビオチン誘導体また
    は類縁体に結合することができるポリペプチドをコード
    するＤＮＡ；および、 (d)前記(a),(b),(c) に記載のいずれかのＤＮＡと縮重
    関係にあり、かつ同じポリペプチドをコードするＤＮ
    Ａ、から成る群から選択され、その第二のＤＮＡはもう
    １つの蛋白質、ペプチドまたはアミノ酸をコードし、前
    記ハイブリッドＤＮＡは、組換ＤＮＡ分子中で発現制御
    配列に作用的に結合されていることを特徴とする、融合
    蛋白質。
  8. 【請求項８】 前記ハイブリッドＤＮＡが、その融合蛋
    白質の分泌を生起するのに充分な信号ＤＮＡの部分を含
    有することを特徴とする、請求項７に記載の融合蛋白
    質。
  9. 【請求項９】 前記ハイブリッドＤＮＡが、その融合蛋
    白質の成熟を生起するのに充分な信号ＤＮＡの部分を含
    有することを特徴とする、請求項８に記載の融合蛋白
    質。
  10. 【請求項１０】 第二のＤＮＡによってコードされるポ
    リペプチドが、ヒトおよび動物インターフェロン、ヒト
    および動物成長ホルモン、ＦＭＤＶの抗原、ＨＢＶの抗
    原、ヒトインシュリン、ヒト血液ファクタ、組織プラス
    ミノーゲン活性化物質、およびエリスロポイエチンから
    成る群から選択されることを特徴とする、請求項７乃至
    ９のいずれかに記載の融合蛋白質。
  11. 【請求項１１】 ハイブリッドＤＮＡよりなる組換ＤＮ
    Ａ分子で形質転換された宿主を培養する工程から成る、
    融合蛋白質の製造方法であって、前記ハイブリッドＤＮ
    Ａは、前記融合蛋白質をコードするヌクレオチド配列を
    有し、かつ同じ読取り枠となるように末端どうしで結合
    された少なくとも２つのＤＮＡから成り、その第一のＤ
    ＮＡの少なくとも一部はストレプトアビジンまたはその
    一部をコードし、前記ストレプトアビジンまたはその一
    部は、ビオチンもしくはビオチン誘導体または類縁体に
    結合することができ、前記第一のＤＮＡの少なくとも一
    部は、 (a) それぞれ受託番号ＡＴＣＣ３９８４５およびＡＴＣ
    Ｃ３９８４６により同定される形質転換イー・コリ Ｋ
    １２株中に保持され、かつヌクレオチド配列： ATGCGCAAGATCGTCGTTGCAGCCATCGCCGTTTCCCTGACCACGGTCTCGATTACGGCCAGCGCTTCGGCA GACCCCTCCAAGGACTCGAAGGCCCAGGTCTCGGCCGCCGAGGCCGGCATCACCGGCACCTGGTACAACCAG CTCGGCTCGACCTTCATCGTGACCGCGGGCGCCGACGGCGCCCTGACCGGAACCTACGAGTCGGCCGTCGGC AACGCCGAGAGCCGCTACGTCCTGACCGGTCGTTACGACAGCGCCCCGGCCACCGACGGCAGCGGCACCGCC CTCGGTTGGACGGTGGCCTGGAAGAATAACTACCGCAACGCCCACTCCGCGACCACGTGGAGCGGCCAGTAC GTCGGCGGCGCCGAGGCGAGGATCAACACCCAGTGGCTGCTGACCTCCGGCACCACCGAGGCCAACGCCTGG AAGTCCACGCTGGTCGGCCACGACACCTTCACCAAGGTGAAGCCGTCCGCCGCCTCCATCGACGCGGCGAAG AAGGCCGGCGTTCAACAACGGCAACCCGCTCGACGCCGTTCAGCAGTA; よりなる、プラスミドｐＳＡ３０４のＤＮＡ挿入物およ
    びプラスミドｐＳＡ３０７のＤＮＡ挿入物； (b)ヌクレオチド配列： ACGAAGTAACCGACAGGACTCGGCCATTCTTTGGCCGAAATTCCTTTGCAGAAAATGTTGTTGAGAACCCTC CGATGGCTAGTACGATTTACACCGAACATGTGCCCTTGGCAACCATCGACCCGGACCTCGACCATCCAGTTC TGCCGCCAAAGACACATGCCGCACTGCTGTTTGTTCACCGACACCGTCAGGTGCACGGCCGAGGTCACAAAC CTTGACGGGCGGGATACGGACGGCGCACGCCACAGCGCGCCCTCCGTCCCCCGCCGGGCAACAACTAGGGGA GTATTTTTCGTGTCTCACATGCGCAAGATCGTCGTTGCAGCCATCGCCGTTTCCCTGACCACGGTCTCGATT ACGGCCAGCGCTTCGGCAGACCCCTCCAAGGACTCGAAGGCCCAGGTCTCGGCCGCCGAGGCCGGCATCACC GGCACCTGGTACAACCAGCTCGGCTCGACCTTCATCGTGACCGCGGGCGCCGACGGCGCCCTGACCGGAACC TACGAGTCGGCCGTCGGCAACGCCGAGAGCCGCTACGTCCTGACCGGTCGTTACGACAGCGCCCCGGCCACC GACGGCAGCGGCACCGCCCTCGGTTGGACGGTGGCCTGGAAGAATAACTACCGCAACGCCCACTCCGCGACC ACGTGGAGCGGCCAGTACGTCGGCGGCGCCGAGGCGAGGATCAACACCCAGTGGCTGCTGACCTCCGGCACC ACCGAGGCCAACGCCTGGAAGTCCACGCTGGTCGGCCACGACACCTTCACCAAGGTGAAGCCGTCCGCCGCC TCCATCGACGCGGCGAAGAAGGCCGGCGT; よりなるプラスミドｐＳＡ３２４のＤＮＡ挿入物； (c)６×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ、３０℃、一晩の
    条件で前記(a),(b) に記載のいずれかのＤＮＡにハイブ
    リダイズし、かつビオチンもしくはビオチン誘導体また
    は類縁体に結合することができるポリペプチドをコード
    するＤＮＡ；および、 (d)前記(a),(b),(c) に記載のいずれかのＤＮＡと縮重
    関係にあり、かつ同じポリペプチドをコードするＤＮ
    Ａ、から成る群から選択され、第二のＤＮＡはもう１つ
    の蛋白質、ペプチドまたはアミノ酸をコードし、前記ハ
    イブリッドＤＮＡは、前記組換ＤＮＡ分子中で発現制御
    配列に作用的に結合されていることを特徴とする、融合
    蛋白質の製造方法。
  12. 【請求項１２】 前記ハイブリッドＤＮＡが、融合蛋白
    質の分泌を生起するのに充分な信号ＤＮＡの部分を含有
    することを特徴とする、請求項１１に記載の製造方法。
  13. 【請求項１３】 前記ハイブリッドＤＮＡが、融合蛋白
    質の成熟を生起するのに充分な信号ＤＮＡの部分を含有
    することを特徴とする、請求項１２に記載の製造方法。
  14. 【請求項１４】 前記ハイブリッドＤＮＡが、ヒトおよ
    び動物インターフェロン、ヒトおよび動物成長ホルモ
    ン、ＦＭＤＶの抗原、ＨＢＶの抗原、ヒトインシュリ
    ン、ヒト血液ファクタ、組織プラスミノーゲン活性化物
    質、およびエリスロポイエチンから成る群から選択され
    るポリペプチドをコードする第二のＤＮＡを含有するこ
    とを特徴とする、請求項１１乃至１３のいずれかに記載
    の製造方法。
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