JPH082298B2 - ポリペプチド前駆体を単離する方法 - Google Patents
ポリペプチド前駆体を単離する方法Info
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- JPH082298B2 JPH082298B2 JP60502346A JP50234685A JPH082298B2 JP H082298 B2 JPH082298 B2 JP H082298B2 JP 60502346 A JP60502346 A JP 60502346A JP 50234685 A JP50234685 A JP 50234685A JP H082298 B2 JPH082298 B2 JP H082298B2
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の技術分野 本発明は、遺伝子操作された生物体によって生成され
た実質的に不溶性の異種構造のポリペプチドを単離する
方法に関するものである。本発明は、不活性な蛋白質に
生物学的活性を回復させることに関する、すなわち、例
えば大腸菌（E.coli）のような宿主細胞内の合成又は単
離工程中に部分的に変成又は不活性化している蛋白質を
可溶化し、復元させて活性を回復させることにおいて、
使用する単離方法である。本発明方法は、遺伝子操作細
菌から不溶性キモシン前駆体を有効に単離することに用
い、前記前駆体から活性なキモシンを効率良く製造す
る。
た実質的に不溶性の異種構造のポリペプチドを単離する
方法に関するものである。本発明は、不活性な蛋白質に
生物学的活性を回復させることに関する、すなわち、例
えば大腸菌（E.coli）のような宿主細胞内の合成又は単
離工程中に部分的に変成又は不活性化している蛋白質を
可溶化し、復元させて活性を回復させることにおいて、
使用する単離方法である。本発明方法は、遺伝子操作細
菌から不溶性キモシン前駆体を有効に単離することに用
い、前記前駆体から活性なキモシンを効率良く製造す
る。
発明の背景 DNA組み換え技術の到来と共に、現在では外来の遺伝
子を微生物の中に導入し、それらの発現レベルを調節す
ることが可能である。
子を微生物の中に導入し、それらの発現レベルを調節す
ることが可能である。
しかし、その細菌固有のものでない余分のポリペプチ
ド又は蛋白質が合成されることはその生物の生存に悪い
影響を与えることがあり特にほかの宿主蛋白質よりも高
レベルで生産される時はその可能性が大である。ある場
合にはその宿主生物はクローン遺伝子の生産物を例えば
分解させるか、分泌して処分する機構を持ちそれによっ
てその細胞必須の代謝機構との相互作用を避ける。又
は、クローン遺伝子生成物が変換された立体配座を持
ち、そうすることによって正常な細胞の働きを妨害しな
いようにする。正常な翻訳結果又は翻訳後の結果を破壊
したり変形させること、蛋白質合成中の特別なコドン
（codon）使用形態および／又は宿主蛋白質−クローン
遺伝子生成物間の細胞内相互作用によっても、ポリペプ
チドの正常な折りたゝみ方や組み立て方が影響を受け、
そのために不活性な蛋白質の立体配座が生ずる。大腸菌
のような宿主生物においては外来の蛋白質が不自然に折
りたゝまれ、細胞内に沈積して、細胞封入体としての特
徴を持つ大きな不活性蛋白質凝集物を形成することが数
例見られる、［ウイリアムス（Williams）D.C.ほかサイ
エンス（science）215:687−689（1982）およびクライ
ド（Kleid）D.G.ほかサイエンス（science）214:1125−
1128（1981）］。
ド又は蛋白質が合成されることはその生物の生存に悪い
影響を与えることがあり特にほかの宿主蛋白質よりも高
レベルで生産される時はその可能性が大である。ある場
合にはその宿主生物はクローン遺伝子の生産物を例えば
分解させるか、分泌して処分する機構を持ちそれによっ
てその細胞必須の代謝機構との相互作用を避ける。又
は、クローン遺伝子生成物が変換された立体配座を持
ち、そうすることによって正常な細胞の働きを妨害しな
いようにする。正常な翻訳結果又は翻訳後の結果を破壊
したり変形させること、蛋白質合成中の特別なコドン
（codon）使用形態および／又は宿主蛋白質−クローン
遺伝子生成物間の細胞内相互作用によっても、ポリペプ
チドの正常な折りたゝみ方や組み立て方が影響を受け、
そのために不活性な蛋白質の立体配座が生ずる。大腸菌
のような宿主生物においては外来の蛋白質が不自然に折
りたゝまれ、細胞内に沈積して、細胞封入体としての特
徴を持つ大きな不活性蛋白質凝集物を形成することが数
例見られる、［ウイリアムス（Williams）D.C.ほかサイ
エンス（science）215:687−689（1982）およびクライ
ド（Kleid）D.G.ほかサイエンス（science）214:1125−
1128（1981）］。
生来の（活性な）蛋白質は可逆的な変成を受けること
が明らかにされている、［アンフィンセン（Anfinsen）
C.,サイエンス（science）181:223−230（1973）および
ロンドン、Ｊほか、ヨーロピアン ジャーナル バイオ
ケミストリー（Eur.J.Biochemistry）47:409−415（197
4）］。蛋白質は８モルの尿素を添加することによって
変成されそして、尿素を取り除くとポリペプチドは自然
に復元する。アルカリ溶液もまた蛋白質可溶化剤として
使用可能であり又ある場合には短い培養時間で生来の蛋
白質を可逆的に変成することができる、［マクフィー
（Mcphie）P.ジャーナル オブ バイオロジカルケミス
トリー（J.of Biol.chem）257:689−693（1982）］。
が明らかにされている、［アンフィンセン（Anfinsen）
C.,サイエンス（science）181:223−230（1973）および
ロンドン、Ｊほか、ヨーロピアン ジャーナル バイオ
ケミストリー（Eur.J.Biochemistry）47:409−415（197
4）］。蛋白質は８モルの尿素を添加することによって
変成されそして、尿素を取り除くとポリペプチドは自然
に復元する。アルカリ溶液もまた蛋白質可溶化剤として
使用可能であり又ある場合には短い培養時間で生来の蛋
白質を可逆的に変成することができる、［マクフィー
（Mcphie）P.ジャーナル オブ バイオロジカルケミス
トリー（J.of Biol.chem）257:689−693（1982）］。
尿素はまた、組み換えDNA発現システムによる遺伝子
生成物の復元を助けるために使用されている。［エムタ
ージ（Emtage）J.S.ほか、米国ナショナルアカデミーサ
イエンス会報（Proc.Nat.Acad.Sci.USA）80:3671−3675
（1983）］。
生成物の復元を助けるために使用されている。［エムタ
ージ（Emtage）J.S.ほか、米国ナショナルアカデミーサ
イエンス会報（Proc.Nat.Acad.Sci.USA）80:3671−3675
（1983）］。
発明の概要 本発明は、遺伝子操作された生物体によって生成され
た実質的に不溶性の異種構造のポリペプチドを単離する
方法を提供するものである。本発明の方法を用いて、宿
主細胞から不溶性の前駆体蛋白質を単離し、前記蛋白質
を蛋白質可溶化能力のある可溶化剤中で可溶化させそし
てその可溶化剤を除去して蛋白質が熱力学的に安定であ
って生物学的に活性な配座をもつようにする。宿主細胞
例えば大腸菌から単離した蛋白質はその特色として、物
理的、化学的特性の自然環境から単離した同種の蛋白質
（仔牛の胃のプロキモシン）と異なっている。本発明を
実施することによって、すなわちポリペプチドが本来の
生物学的活性を保ちながら熱力学的に安定な形態を持ち
得るようにこの不活性な、又は変成した遺伝子生産物を
適当な可溶化剤中で可溶化し、その可溶化剤を除去する
ことによって単離蛋白質の物理的、化学的特性を自然発
生物のそれらと全く同じにすることができる。
た実質的に不溶性の異種構造のポリペプチドを単離する
方法を提供するものである。本発明の方法を用いて、宿
主細胞から不溶性の前駆体蛋白質を単離し、前記蛋白質
を蛋白質可溶化能力のある可溶化剤中で可溶化させそし
てその可溶化剤を除去して蛋白質が熱力学的に安定であ
って生物学的に活性な配座をもつようにする。宿主細胞
例えば大腸菌から単離した蛋白質はその特色として、物
理的、化学的特性の自然環境から単離した同種の蛋白質
（仔牛の胃のプロキモシン）と異なっている。本発明を
実施することによって、すなわちポリペプチドが本来の
生物学的活性を保ちながら熱力学的に安定な形態を持ち
得るようにこの不活性な、又は変成した遺伝子生産物を
適当な可溶化剤中で可溶化し、その可溶化剤を除去する
ことによって単離蛋白質の物理的、化学的特性を自然発
生物のそれらと全く同じにすることができる。
本発明の１つの骨子は蛋白質精製剤としてトリトン
（Triton）Ｘ−100（非イオン系洗滌剤）、可溶化と復
元用剤として尿素とアルカリを使用して活性キモシンを
製造する新しい方法である。したがって、本発明は新規
なかつ独創的な蛋白質復元手順である。
（Triton）Ｘ−100（非イオン系洗滌剤）、可溶化と復
元用剤として尿素とアルカリを使用して活性キモシンを
製造する新しい方法である。したがって、本発明は新規
なかつ独創的な蛋白質復元手順である。
本発明の実施例に使用し,JM83/PLC7として記述してい
る組み換えDNA発現システムおよびその宿主微生物はメ
リーランド（Maryland）州、ロックビル（Rockville）
のアメリカンタイプカルチャーコレクション/American
Type Culture Collectionに寄託されておりその取得番
号はATCC 39325である。
る組み換えDNA発現システムおよびその宿主微生物はメ
リーランド（Maryland）州、ロックビル（Rockville）
のアメリカンタイプカルチャーコレクション/American
Type Culture Collectionに寄託されておりその取得番
号はATCC 39325である。
図面の簡単な説明 第１図は大腸菌細胞断面の電子顕微鏡写真を示すもの
であり、（ａ）はプロキモシン細胞封入体（矢印）を含
有するもの、（ｂ）は細胞封入体を含有しない野生型細
菌のものである。
であり、（ａ）はプロキモシン細胞封入体（矢印）を含
有するもの、（ｂ）は細胞封入体を含有しない野生型細
菌のものである。
第２図は本発明において開示した方法の中の２つの方
法によりpWHA49プロキモシンを可溶化し、復元して得ら
れるミルク凝固活性の回復を示す。復元反応が行われる
希釈倍数（細胞ペースト1gからの物質／最終容積ml）に
対して単位容積当りの活性測定値をプロットしている。
法によりpWHA49プロキモシンを可溶化し、復元して得ら
れるミルク凝固活性の回復を示す。復元反応が行われる
希釈倍数（細胞ペースト1gからの物質／最終容積ml）に
対して単位容積当りの活性測定値をプロットしている。
第３図は、大腸菌合成プロキモシンから得られた蛋白
質のサンプルを含有するポリアクリルアミドゲルを示し
ておりこの中のサンプルには、親のE．Coli菌株CY15001
からの細胞の全蛋白質（１列目）；プロキモシン発現株
CY15001/pWHA49からの細胞の全蛋白質（２列目）；精製
し、復元したpWHA49プロキモシン［（３列目）、（lane
3）］;pH2.0で活性化後の精製、復元pWHA49プロキモシ
ン（４列目）;pH4.5で活性化後の精製、復元pWHA49プロ
キモシン（５列目）；精製仔牛プロキモシン（６列
目）;pH2.0で活性化後の精製仔牛プロキモシン（７列
目）;pH4.5で活性化後の精製仔牛プロキモシン（８列
目）がある。
質のサンプルを含有するポリアクリルアミドゲルを示し
ておりこの中のサンプルには、親のE．Coli菌株CY15001
からの細胞の全蛋白質（１列目）；プロキモシン発現株
CY15001/pWHA49からの細胞の全蛋白質（２列目）；精製
し、復元したpWHA49プロキモシン［（３列目）、（lane
3）］;pH2.0で活性化後の精製、復元pWHA49プロキモシ
ン（４列目）;pH4.5で活性化後の精製、復元pWHA49プロ
キモシン（５列目）；精製仔牛プロキモシン（６列
目）;pH2.0で活性化後の精製仔牛プロキモシン（７列
目）;pH4.5で活性化後の精製仔牛プロキモシン（８列
目）がある。
第４図は仔牛プロキモシン又はpWHA49プロキモシンか
らのモキシンとの反応が行われる前後のミルク基質から
の蛋白質サンプルを含有したポリアクリルアミドゲルを
示しており、この中のサンプルには分子量標識（１列
目）；未反応のミルク基質（２列目）;pWHA49擬キモシ
ンで凝固したミルク（３列目）;pWHA49キモシンで凝固
したミルク（４列）；仔牛キモシンで凝固したミルク
（５列）；およびトリプシンで凝固したミルク基質（６
列目）がある。矢印はキモシンによって分割され凝固反
応を開始したＫ−カゼイン蛋白質成分を示す。
らのモキシンとの反応が行われる前後のミルク基質から
の蛋白質サンプルを含有したポリアクリルアミドゲルを
示しており、この中のサンプルには分子量標識（１列
目）；未反応のミルク基質（２列目）;pWHA49擬キモシ
ンで凝固したミルク（３列目）;pWHA49キモシンで凝固
したミルク（４列）；仔牛キモシンで凝固したミルク
（５列）；およびトリプシンで凝固したミルク基質（６
列目）がある。矢印はキモシンによって分割され凝固反
応を開始したＫ−カゼイン蛋白質成分を示す。
発明の詳細な説明 本発明は、遺伝子操作された生物体によって生成され
た実質的に不溶性の異種構造のポリペプチドを単離する
方法を提供することを目的とする。本発明方法により単
離された不活性な蛋白質前駆体から、活性な蛋白質が有
効に製造できる。例えば、大腸菌から不溶性の、不活性
な及び／又は１部変成された状態で単離されたキモシン
前駆体蛋白質から活性な蛋白質を製造する方法におい
て、本方法が有効に用いられる（第１図参照）。「変
成」と言う語はその立体配座と生物学的活性が自然環境
から単離された同種の蛋白質と大きく異なる蛋白質の形
を指すものとする。以下にプロセスの詳細を説明する。
た実質的に不溶性の異種構造のポリペプチドを単離する
方法を提供することを目的とする。本発明方法により単
離された不活性な蛋白質前駆体から、活性な蛋白質が有
効に製造できる。例えば、大腸菌から不溶性の、不活性
な及び／又は１部変成された状態で単離されたキモシン
前駆体蛋白質から活性な蛋白質を製造する方法におい
て、本方法が有効に用いられる（第１図参照）。「変
成」と言う語はその立体配座と生物学的活性が自然環境
から単離された同種の蛋白質と大きく異なる蛋白質の形
を指すものとする。以下にプロセスの詳細を説明する。
細菌の細胞ペーストをリゾチームを含有した緩衝液に
再懸濁させる、そして細胞の溶解が起こるにつれて、細
菌のDNAのために溶液粘度が増大する。本発明において
は、DNAの音波破壊やフレンチプレス（French press）
のような物理的方法によって溶解物（1ysate）の粘度を
減少させることが重要である。細胞の不溶性部分を低速
の遠心分離によって分離する。不溶性部分を緩衝液中に
再懸濁し、トリトン（Triton）Ｘ−100「Rohm＆Haas C
o.製、α−［４−（1,1,3,3−テトラメチルブチル）フ
ェニル］−ω−ヒドロキシノナ（オキシ−1,2−エタン
ジイル）とα−［４−（1,1,3,3−テトラメチルブチ
ル）フェニル］−ω−ヒドロキシデカ（オキシ−1,2−
エタンジイル）の混合物］（非イオン性洗滌剤）を含有
した溶液と２から20時間混合する。この洗滌剤はキモシ
ン前駆体蛋白質を可溶化しないが他の細菌蛋白質不純物
を可溶化させる。これらの不純物を遠心分離によって不
溶性のキモシン前駆体蛋白質から分離、除去する。この
不溶性部分を８モルの尿素に２から20時間、好ましくは
10から16時間、可溶化させ、それから好ましくはpHが1
0.5から11.5そして最も好ましくはpH11.0のアルカリ性
リン酸塩緩衝液に希釈し、５から30分間、最も好ましく
は10分間培養し、その後徐々に、pH8から９、好ましく
は8.3まで中和して１時間以上放置する。次いで５より
低いpHまで酸性にすると、仔牛の胃のキモシンと同じ特
性を有するミルク凝固活性が得られる。
再懸濁させる、そして細胞の溶解が起こるにつれて、細
菌のDNAのために溶液粘度が増大する。本発明において
は、DNAの音波破壊やフレンチプレス（French press）
のような物理的方法によって溶解物（1ysate）の粘度を
減少させることが重要である。細胞の不溶性部分を低速
の遠心分離によって分離する。不溶性部分を緩衝液中に
再懸濁し、トリトン（Triton）Ｘ−100「Rohm＆Haas C
o.製、α−［４−（1,1,3,3−テトラメチルブチル）フ
ェニル］−ω−ヒドロキシノナ（オキシ−1,2−エタン
ジイル）とα−［４−（1,1,3,3−テトラメチルブチ
ル）フェニル］−ω−ヒドロキシデカ（オキシ−1,2−
エタンジイル）の混合物］（非イオン性洗滌剤）を含有
した溶液と２から20時間混合する。この洗滌剤はキモシ
ン前駆体蛋白質を可溶化しないが他の細菌蛋白質不純物
を可溶化させる。これらの不純物を遠心分離によって不
溶性のキモシン前駆体蛋白質から分離、除去する。この
不溶性部分を８モルの尿素に２から20時間、好ましくは
10から16時間、可溶化させ、それから好ましくはpHが1
0.5から11.5そして最も好ましくはpH11.0のアルカリ性
リン酸塩緩衝液に希釈し、５から30分間、最も好ましく
は10分間培養し、その後徐々に、pH8から９、好ましく
は8.3まで中和して１時間以上放置する。次いで５より
低いpHまで酸性にすると、仔牛の胃のキモシンと同じ特
性を有するミルク凝固活性が得られる。
本発明により活性キモシンを効果的に回収するには、
数段階の特殊な工程が必要である。第一に、音波処理
（細胞の溶解後）とトリトンＸ−100による抽出（遠心
分離によって不溶性蛋白質を集めた後）の組み合わせが
本方法によっては必須である。
数段階の特殊な工程が必要である。第一に、音波処理
（細胞の溶解後）とトリトンＸ−100による抽出（遠心
分離によって不溶性蛋白質を集めた後）の組み合わせが
本方法によっては必須である。
次の第１表に、各種前駆体復元手順による活性キモシ
ン回収の有効性の比較を例示する。
ン回収の有効性の比較を例示する。
第１表により明らかなように、トリトンＸ−100によ
る抽出を除外する場合は活性な生成物は極く僅かしか回
収できない（最高値の10パーセント未満）。別の非イオ
ン性洗滌剤、トウイーン（Tween）−20にとり代えて
も、活性生成物を高レベルで回収することは容易ではな
い。細菌のDNAを膵臓のデオキシリボヌクレアーゼで酵
素消化して、初めの細胞溶解物の粘度を低下させても、
キモシン前駆体蛋白質活性化後の活性度の収率は低い結
果になる。そして、この生産物収率はトリトンＸ−100
による抽出を行っても改善されない。したがって細菌の
溶解物を物理的に破壊すること（音波による）とそれに
続くトリトンＸ−100による抽出の組み合わせは本発明
のための新規なそして予想外の必要条件である。
る抽出を除外する場合は活性な生成物は極く僅かしか回
収できない（最高値の10パーセント未満）。別の非イオ
ン性洗滌剤、トウイーン（Tween）−20にとり代えて
も、活性生成物を高レベルで回収することは容易ではな
い。細菌のDNAを膵臓のデオキシリボヌクレアーゼで酵
素消化して、初めの細胞溶解物の粘度を低下させても、
キモシン前駆体蛋白質活性化後の活性度の収率は低い結
果になる。そして、この生産物収率はトリトンＸ−100
による抽出を行っても改善されない。したがって細菌の
溶解物を物理的に破壊すること（音波による）とそれに
続くトリトンＸ−100による抽出の組み合わせは本発明
のための新規なそして予想外の必要条件である。
本方法の主な特徴の中の第２は、キモシン前駆体蛋白
質を可溶化し、復元するのに尿素とアルカリ性pH緩衝液
を組み合わせて使用することである。８モルの尿素又は
アルカリ単独の溶液中で不溶性キモシン前駆体蛋白質は
完全に可溶化する。しかし、これ等の薬剤をそれぞれ単
独に使用すると、多くの不利な点が生ずる。尿素による
可溶化は非常に速かであるが尿素からの復元には、非常
にゆっくりとした透析過程が必要になる。アルカリによ
る可溶化は尿素の時より遅く、pH11.0の培養20分後に蛋
白質の不可逆的不活性化が始まり、その時間はキモシン
先駆体蛋白質を完全に可溶化させるのに必要な時間とほ
ゞ同じであるため複数なものとなる。酸性にすることに
よって、アルカリ性pHからの復元が速くなる。我々は、
この２つの操作を単純に組み合わせることによって最終
生成物中に回収されたキモシンの活性が大巾に増大する
ことを認めた（第２図参照）。尿素溶液中での高速可溶
化とアルカリ性pH緩衝液中への希釈と組み合わせる、そ
してpHの中和によって高速度の復元が行われる。
質を可溶化し、復元するのに尿素とアルカリ性pH緩衝液
を組み合わせて使用することである。８モルの尿素又は
アルカリ単独の溶液中で不溶性キモシン前駆体蛋白質は
完全に可溶化する。しかし、これ等の薬剤をそれぞれ単
独に使用すると、多くの不利な点が生ずる。尿素による
可溶化は非常に速かであるが尿素からの復元には、非常
にゆっくりとした透析過程が必要になる。アルカリによ
る可溶化は尿素の時より遅く、pH11.0の培養20分後に蛋
白質の不可逆的不活性化が始まり、その時間はキモシン
先駆体蛋白質を完全に可溶化させるのに必要な時間とほ
ゞ同じであるため複数なものとなる。酸性にすることに
よって、アルカリ性pHからの復元が速くなる。我々は、
この２つの操作を単純に組み合わせることによって最終
生成物中に回収されたキモシンの活性が大巾に増大する
ことを認めた（第２図参照）。尿素溶液中での高速可溶
化とアルカリ性pH緩衝液中への希釈と組み合わせる、そ
してpHの中和によって高速度の復元が行われる。
精製仔牛プロキモシン復元の成否は復元反応中のプロ
キモシンの濃度に依存する。同様に、大腸菌から単離さ
れた不活性キモシン前駆体からの活性キモシンの効果的
な回収は尿素可溶化物質のアルカリ性pH緩衝液への希釈
の程度に応じて増加する（第４図参照）。本発明によっ
て得られるキモシン活性の最高レベルは大腸菌溶解物中
のキモシン前駆体蛋白質の濃度および仔牛の胃のキモシ
ン固有の既知活性に基づいて予測した最高値の80パーセ
ント以上である。
キモシンの濃度に依存する。同様に、大腸菌から単離さ
れた不活性キモシン前駆体からの活性キモシンの効果的
な回収は尿素可溶化物質のアルカリ性pH緩衝液への希釈
の程度に応じて増加する（第４図参照）。本発明によっ
て得られるキモシン活性の最高レベルは大腸菌溶解物中
のキモシン前駆体蛋白質の濃度および仔牛の胃のキモシ
ン固有の既知活性に基づいて予測した最高値の80パーセ
ント以上である。
実施例 プロキモシンをコードする真核生物構造遺伝子を含有
するプラスミドpWHA49をつくった。このプラスミドを公
知の方法を使って大腸菌の変換用に使用した。pWHA49を
含有する大腸菌株CY15001の凍結細胞ペースト10グラム
を25ミリモルのトリス（Tris）−HC1 pH8,10ミリモルの
EDTA,1ミリグラム/1ミリリットルのリゾチームを含有し
た100ミリリットル中に懸濁させた。短時間の培養の
後、溶解細胞をさらに音波処理によって破壊した。10,0
00×ｇで10分間遠心分離の後、最終濃度８パーセントの
トリトンＸ−100洗滌剤［ジグマケミカル（Sigma Chemi
cal Co.）］を使って、１晩、小球形細胞破片の洗滌剤
抽出を行ってpWHA49で暗号付けされたプロキモシン蛋白
質の部分精製を行った。この操作の後に、PWHA49プロキ
モシン蛋白質が不溶性の微粒子小球型物の中に残留し
た。
するプラスミドpWHA49をつくった。このプラスミドを公
知の方法を使って大腸菌の変換用に使用した。pWHA49を
含有する大腸菌株CY15001の凍結細胞ペースト10グラム
を25ミリモルのトリス（Tris）−HC1 pH8,10ミリモルの
EDTA,1ミリグラム/1ミリリットルのリゾチームを含有し
た100ミリリットル中に懸濁させた。短時間の培養の
後、溶解細胞をさらに音波処理によって破壊した。10,0
00×ｇで10分間遠心分離の後、最終濃度８パーセントの
トリトンＸ−100洗滌剤［ジグマケミカル（Sigma Chemi
cal Co.）］を使って、１晩、小球形細胞破片の洗滌剤
抽出を行ってpWHA49で暗号付けされたプロキモシン蛋白
質の部分精製を行った。この操作の後に、PWHA49プロキ
モシン蛋白質が不溶性の微粒子小球型物の中に残留し
た。
本物の仔牛プロキモシンは可溶性酵素であり、酸処理
によって急速にミルクを効率良く凝固させる形のものに
活性化される。上述の通り単離された大腸菌合成pWHA49
プロキモシンは不溶性であり酸処理の後でも酵素的活性
を示さなかった。
によって急速にミルクを効率良く凝固させる形のものに
活性化される。上述の通り単離された大腸菌合成pWHA49
プロキモシンは不溶性であり酸処理の後でも酵素的活性
を示さなかった。
このpWHA49プロキモシン小球形物をpH7.5の10ミリモ
ルリン酸ナトリウム緩衝液6.3ミリリットルに懸濁させ
た。固体の尿素を６から８モルの最終濃度になるまで添
加してこの懸濁液を完全に可溶化させる、そして、その
後16時間室温で混合する。
ルリン酸ナトリウム緩衝液6.3ミリリットルに懸濁させ
た。固体の尿素を６から８モルの最終濃度になるまで添
加してこの懸濁液を完全に可溶化させる、そして、その
後16時間室温で混合する。
この結果得られる透明な溶液をpH11.0の25ミリモルン
酸ナトリウム緩衝液の100容（1000ミリリットル）中に
希釈し、完全に混合し、10分間室温で放置した。その
後、0.2Nの塩酸を３分間にわたって滴下してこの溶液の
pHを8.3にした。
酸ナトリウム緩衝液の100容（1000ミリリットル）中に
希釈し、完全に混合し、10分間室温で放置した。その
後、0.2Nの塩酸を３分間にわたって滴下してこの溶液の
pHを8.3にした。
この結果得られた溶液を室温で１時間以上放置し、そ
の後、1.5より大で5.0より低いpHまで酸性にすると、キ
モシンのミルク凝固活性が生じた。
の後、1.5より大で5.0より低いpHまで酸性にすると、キ
モシンのミルク凝固活性が生じた。
生来の仔牛プロキモシンおよびpWHA49プロキモシンを
酸活性化すると、同じ大きさの蛋白質が得られた。すな
わち、pH2で処理すると、分子量が約38,500の擬キモシ
ンが得られ、pH4.5で処理すると分子量36,00のキモシン
が得られた（第３図参照）。復元し、活性化した生成物
は天然仔牛キモシンに特異な活性の50から95パーセント
を保持しており同じ有限基質特異性を持っている（第４
図参照）。
酸活性化すると、同じ大きさの蛋白質が得られた。すな
わち、pH2で処理すると、分子量が約38,500の擬キモシ
ンが得られ、pH4.5で処理すると分子量36,00のキモシン
が得られた（第３図参照）。復元し、活性化した生成物
は天然仔牛キモシンに特異な活性の50から95パーセント
を保持しており同じ有限基質特異性を持っている（第４
図参照）。
尿素とアルカリを利用する方法では、単独に薬剤を使
う方法に比較してプロキモシンの復元が優れていること
が実証された（第２図参照）。
う方法に比較してプロキモシンの復元が優れていること
が実証された（第２図参照）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 国際公開第83／04418号パンフレット Ｇｅｎｅ，29，（1984）Ｐ．41−49 Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｉ，Ａｃａｄ，Ｓｃ ｉ，ＵＳＡ，80（1983）Ｐ．3671−3675
Claims (3)
- 【請求項１】遺伝子操作された微生物によって生成さ
れ、物理的破壊を受けたその微生物体の溶解物から分離
された、実質的に不溶性の異種構造のポリペプチドを単
離する方法であって、 ａ）ポリペプチドを、非イオン性洗滌剤を含有する溶液
に接触させ、ポリペプチドの不溶性を維持しながら不純
物を溶解させ、そして ｂ）可溶性不純物から不溶性ポリペプチドを分離する ことから成る方法。 - 【請求項２】前記微生物が大腸菌である、特許請求の範
囲第１項に記載の方法。 - 【請求項３】非イオン性洗絛剤が、α−［４−（1,1,3,
3−テトラメチルブチル）フェニル］−ω−ヒドロキシ
ノナ（オキシ−1,2−エタンジイル）とα−［４−（1,
1,3,3−テトラメチルブチル）フェニル］−ω−ヒドロ
キシデカ（オキシ−1,2−エタンジイル）の混合物であ
る、特許請求の範囲第１項または第２項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US60949584A | 1984-05-11 | 1984-05-11 | |
| US609495 | 1984-05-11 | ||
| PCT/US1985/000858 WO1985005377A1 (en) | 1984-05-11 | 1985-05-08 | An efficient process for producing active chymosin from a precursor protein synthesized in bacteria |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61502167A JPS61502167A (ja) | 1986-10-02 |
| JPH082298B2 true JPH082298B2 (ja) | 1996-01-17 |
Family
ID=24441051
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60502346A Expired - Fee Related JPH082298B2 (ja) | 1984-05-11 | 1985-05-08 | ポリペプチド前駆体を単離する方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0183776B2 (ja) |
| JP (1) | JPH082298B2 (ja) |
| AT (1) | ATE71147T1 (ja) |
| AU (1) | AU4403885A (ja) |
| CA (1) | CA1335719C (ja) |
| DE (1) | DE3585081D1 (ja) |
| WO (1) | WO1985005377A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4786501A (en) * | 1985-07-15 | 1988-11-22 | International Minerals & Chemical Corp. | Cylindrical implants for the controlled release of growth hormones |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH082298A (ja) * | 1994-06-16 | 1996-01-09 | Araco Corp | シートクッション長可変機構 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4666847A (en) * | 1981-01-16 | 1987-05-19 | Collaborative Research, Inc. | Recombinant DNA means and method |
| IE53517B1 (en) * | 1981-06-17 | 1988-12-07 | Celltech Ltd | Process for the production of a polypeptide |
| BR8205954A (pt) * | 1981-10-14 | 1983-09-13 | Unilever Nv | Sequencia de dna,plasmidio recombinante,cultura bacteriana e microorganismos |
| EP0123928A3 (en) * | 1983-03-31 | 1986-02-05 | Codon Genetic Engineering Laboratories | Recombinant dna coding for a polypeptide displaying milk clotting activity |
| US4721673A (en) * | 1983-09-01 | 1988-01-26 | Genex Corporation | Recovery and activation process for microbially produced calf prochymosin |
-
1985
- 1985-05-08 AT AT85902779T patent/ATE71147T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-05-08 EP EP85902779A patent/EP0183776B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-05-08 JP JP60502346A patent/JPH082298B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1985-05-08 AU AU44038/85A patent/AU4403885A/en not_active Abandoned
- 1985-05-08 DE DE8585902779T patent/DE3585081D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1985-05-08 WO PCT/US1985/000858 patent/WO1985005377A1/en not_active Ceased
- 1985-05-10 CA CA000481224A patent/CA1335719C/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH082298A (ja) * | 1994-06-16 | 1996-01-09 | Araco Corp | シートクッション長可変機構 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Ｇｅｎｅ，２９，（１９８４）Ｐ．４１−４９ |
| Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｉ，Ａｃａｄ，Ｓｃｉ，ＵＳＡ，８０（１９８３）Ｐ．３６７１−３６７５ |
| 国際公開第８３／０４４１８号パンフレット |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0183776B1 (en) | 1992-01-02 |
| JPS61502167A (ja) | 1986-10-02 |
| EP0183776B2 (en) | 2000-09-13 |
| WO1985005377A1 (en) | 1985-12-05 |
| DE3585081D1 (de) | 1992-02-13 |
| CA1335719C (en) | 1995-05-30 |
| ATE71147T1 (de) | 1992-01-15 |
| AU4403885A (en) | 1985-12-13 |
| EP0183776A4 (en) | 1988-05-19 |
| EP0183776A1 (en) | 1986-06-11 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |