JPH082314B2 - グラム陰性菌の増殖培地に遺伝子生成物を輸送する方法 - Google Patents

グラム陰性菌の増殖培地に遺伝子生成物を輸送する方法

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JPH082314B2
JPH082314B2 JP61296510A JP29651086A JPH082314B2 JP H082314 B2 JPH082314 B2 JP H082314B2 JP 61296510 A JP61296510 A JP 61296510A JP 29651086 A JP29651086 A JP 29651086A JP H082314 B2 JPH082314 B2 JP H082314B2
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Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の目的〕 産業上の利用分野 本発明は組換体DNA技術の使用及び大腸菌（Escherich
ia coli,略称E.coli）の増殖培地へ遺伝子生成物を発現
輸送する大腸菌の使用に関するものである。従って、本
発明は大腸菌中に蛋白質を発現させ該蛋白質の細胞外分
泌をもたらす方法を提供する。本発明はまた組換体DNA
構造及びプラスミド媒介体（ベクター）並びに該組換体
DNA構造を含む大腸菌を提供する。本発明はさらに本発
明の方法によって得られる蛋白質にも及ぶ。
従来の技術 それにより新規な組換体DNA構造が構成され原子核な
いし成熟核宿主細胞中に導入されうる比較的新しい組換
体DNA技術は非常に多数の蛋白質の製造を論理的に可能
にした。異型遺伝子生成物を製造するための細菌の使用
はさもなければ天然源からかなりの費用で得ることしか
できない蛋白質の取得を可能にした。細菌中で製造され
たヒトに由来するポリペプチド類のよく知られた例はヒ
ト成長ホルモン（hGH），インシユリン，α−インター
フエロン，γ−インターフエロン，ソマトスタチン及び
ソマトメジン類（インシユリン様発育因子）である。
外来遺伝子を発現させるための細菌の使用は蛋白質分
解によるポリペプチドの安定性、発現の程度、誤つた折
重ね（folding）に相関する蛋白質生成物の精製及び精
製後の蛋白質の生物学的活性の欠除も含めた多くの実際
的及び生物学的問題に直面した。これらの問題を解くた
め、任意の遺伝子生成物を発現させるため充分特徴付け
られている腸細菌である大腸菌（E.coli）を使用できる
よう各種の技術が開発された。これらの方法には発現の
程度を調整できる様々なプロモーターの使用、細胞内で
は通常不安定な蛋白質を安定化するための遺伝子融合、
及び還元性環境がその形成を困難にしている細胞質とは
対照的に二硫化物橋が形成されうる細胞質周囲空間へ細
胞質から蛋白質を転座させるためのシグナルペプチド類
の使用が含まれる。大腸菌の細胞質中に発現された構造
中のシステイン橋を有する蛋白質はこれらの橋が形成さ
れにくいために普通正確な三次構造を有さない。このこ
とは潜在的に生産過剰時のポリペプチドの沈殿、もし細
胞中に沈殿しなかつた場合の急速な蛋白質分解劣化及び
発現され精製されたポリペプチドの生物学的活性の不在
に至りうる。このことはプロインシユリン，インシユリ
ンＡ鎖，インシユリンＢ鎖，インシユリン様発育因子及
び組織特異性プロスミノゲン活性化因子（ｔ−PA）を発
現させる場合の大腸菌中に観察されてきた。この問題を
克服するため、ポリペプチドは精製後再生させるか正確
な折重ねが潜在的に達成されうる大腸菌の細胞質周囲空
間へ分泌させる必要があつた。折重ね及び安定性につい
て言及したものとは別の細菌遺伝子発現及び分泌の一つ
の他の観点はグラム陽性菌の使用である。これらの微生
物はグラム陰性対応体と比較して細胞の細胞質を取り囲
む膜構造の異なる機構を有する。グラム陽性原子核細胞
は単に一つの細胞膜を有するのみであり、分泌された蛋
白質は増殖培地へ輸送されるが、グラム陰性大腸菌にお
ける分泌は細胞の細胞質を取り囲む二重膜層のため蛋白
質を細胞質周囲空間に位置させる。グラム陽性菌を使用
することにより、分泌された遺伝子生成物は生成物のダ
ウンストリームプロセツシングを促進するであろう増殖
培地から集められうる。かくして、工業的プロセスにお
けるグラム陽性菌の使用の重要性はこの分泌プロセスに
相関しているが、他の観点から、発現系が大腸菌につい
てより開発されているという単なる理由から充分特徴付
けられた大腸菌を大規模遺伝子生成物生産において使用
することが優先するであろう。
発明が解決しようとする問題点 本発明は工業的プロセスにおける大腸菌の使用の適用
における制限に対する解決を提供する。本発明は遺伝子
生成物が大腸菌から増殖培地に定量的に分泌されること
を可能にする。グラム陰性菌における蛋白質の輸送を得
るためのこの遺伝子学的手段は所望の遺伝子生成物の発
現が熱衝撃応答による繊維状増殖の誘発及びこの応答が
細胞質周囲に位置する蛋白質の増殖培地への定量的な漏
出を与えることに基ずいている。本発明の基礎につき以
下説明する。
シグナルペプチド類が原子核細胞及び成熟細胞いずれ
かにおいても膜を通して分泌されるはずの発現された蛋
白質のＮ末端中に存在することがよく知られている。こ
のシグナルペプチドは20〜40個のアミノ酸からなり、転
座プロセス中に開裂される。多くの蛋白質因子はこの分
泌プロセスに相関しているが、分子機構は完全な詳細ま
で分つていない。良好なモデルが無理なく現実に近づい
て提供されてはいる。
本発明をブドウ球菌性蛋白質Ａを引用して以下に説明
する。この蛋白質は病原性細菌黄色ブドウ球菌（Staphy
lo coccus aureus,略称S.aureus）の細菌壁成分として
知られており、ヒトも含めたほとんどの哺乳動物からの
特定な群の抗体の一定領域とそれが特異的に結合するこ
とによりよく知られている。蛋白質Ａはまたその構造に
おいて非常に反復性があることが知られており、連結し
た反復中に位置する各領域中に約58個のアミノ酸からな
る５個の領域は全て個別に免疫グロブリン類（例えばヒ
トIgG）と結合する機能を有する。DNA水準において、蛋
白質Ａの細胞質からの転座を行なう役割のあるシグナル
配列はこれら５種のIgG結合領域の前に存在することが
示された。このシグナル配列はまた大腸菌中でも機能す
ることが見出されており、かくして蛋白質Ａは蛋白質Ａ
の遺伝子の導入後細胞質周囲空間中に見出される。
本発明の基礎をなす研究において、蛋白質Ａのフラグ
メントＢを遮断された分泌をもたらすシグナル配列のす
ぐ後に置いた。明白な結論はフラグメントＢ及びＥ間の
アミノ酸配列における差異は分泌プロセスに重要である
ことである。蛋白質ＡのこのフラグメントＢを発現させ
る大腸菌は不完全な細胞分裂のため繊維状に増殖する。
このことは以前細胞内に沈殿する。大腸菌で発現された
蛋白質について観察された。本発明において、本発明者
らはβ−ラクタマーゼのように細胞質周囲空間に位置し
た蛋白質が増殖培地に漏出していることを見出した。フ
ラグメントSEを発現させる場合、このＥフラグメントが
ほぼ全量大腸菌の増殖培地へ輸送されることが驚くべき
ことに発見された。このことはまた細胞の繊維状増殖に
も相関性がある。（程度に差はあるが）繊維状増殖を誘
発することが見出された他のフラグメントはフラグメン
トSEE及びSEBである。蛋白質Ａの全てのこれらのより小
さなフラグメントは細胞質周囲蛋白質の増殖培地への輸
送に至る細胞分裂の欠陥をなぜか誘発する。
ヒトインシユリン様発育因子１（IGF−１）、しなわ
ち、70種のアミノ酸からなる発育因子をコード化する遺
伝子にSEEを融合させてSEE−IGF−１を生じさせる際、
遺伝子生成物を増殖培地から回収させうることが見出さ
れた。またこの実験において、細胞の繊維状形態が観察
できた。
全ての上述の実験は第９図に示したようなＡ型媒介体
中で行なつた。Ａ型媒介体はβ−ラクタマーゼ（bla）
遺伝子に対向する蛋白質Ａ誘導遺伝子転写を有するpRIT
4に基ずく。SEE−IGF−１をＢ型媒介体中に入れる際、
発現水準はＡ型配向に比較して20〜40倍高い。Ｂ型媒介
体はβ−ラクタマーゼ遺伝子（bla）と同一方向におい
て蛋白質Ａ誘導遺伝子転写を有するpEMBLに基ずく。こ
れらの細胞における繊維状増殖は非常に顕著である。増
殖培地への輸送は非常に困難である。
今回の結果は本発明の遺伝子生成物の増殖培地への輸
送は大腸菌細胞の繊維状増殖に相関し、また発現水準は
この誘発に相関させうることを示している。
Ａ型媒介体中のSEDABCからなる蛋白質Ａ遺伝子は30〜
42℃で増殖させた。熱衝撃応答を得るのに充分高い。よ
り高温では、発現水準は20〜40倍高く、増殖培地への輸
送は効率的である。
本発明に至る研究から引き出された結論は大腸菌の繊
維状増殖は増殖培地への細胞質周囲蛋白質の輸送を与え
ることである。繊維状増殖が蛋白質Ａプロモーター及び
シグナル配列を保持する大腸菌細胞中で誘発され、プラ
スミド媒介体中のフラグメントの配向により、あるいは
発現された蛋白質Ａ部分の大きさにより、本発明では細
胞質周囲蛋白質の増殖培地への様々異なる水準の輸送が
得られる。
本発明の基本液概念はこの分野において重要な進展を
なすものである。なぜならば、大腸菌中の繊維状増殖の
誘発は蛋白質Ａシグナル配列及びプロモーターの後に置
かれたとき高い発現及び効率的な分泌を持たらすからで
ある。
本発明はこの発現−分泌系の挙動における観察に関す
る生物学的説明に基ずくわけではないことに留意ありた
い。
本発明は何ら特定の理論に制約されるわけではない
が、本発明者らはなされた観察に関する合理的な説明を
有する。
蛋白質Ａ遺伝子は大腸菌においてそれ自体熱衝撃遺伝
子である。このことは蛋白質Ａは発育性非熱衝撃応答中
よりも熱衝撃応答中により転写されることを意味する。
この現象の理由はシグマ32様プロモーターが見出される
蛋白質Ａ遺伝子中の先に報告した大腸菌様プロモーター
の上流で見出される。このことはシグマ32プロモーター
配列は熱衝撃遺伝子について示唆された意見一致配列と
相同であることを示唆した。熱衝撃応答を引受けるシグ
マ32因子は一緒に通常大腸菌中で17個の遺伝子を転写し
ている。
熱衝撃応答は大腸菌細胞がストレスを受けるとき誘引
される。誤つて折重られた蛋白質が主要誘引作用であり
かつこの誘発は熱,4％EtOH,酸化性剤，解読誤りまた適
切な三次構造を得ることができない外来蛋白質の生産を
持たらす化学薬品により行ないうることが示唆される。
本発明の場合において、蛋白質Ａの小さなフラグメン
トまたは最初からの大量生産は熱衝撃応答を誘引してい
る。この応答が誘引されるとき、蛋白質Ａ遺伝子は更に
転写され、より顕著な誘引となる。この熱衝撃応答はま
た細胞分裂の欠陥、すなわちいわゆる繊維状増殖も与え
ている。この開示において、またこのタイプの増殖も増
殖培地への細胞質周囲生成物の輸送を与えることが示さ
れている。
30℃または42℃でＡ型媒介体中で蛋白質Ａ遺伝子を有
する大腸菌株を増殖させることにより、本明細書中では
この温度の誘発が高い発現と輸送を与えることが示され
ており、このことは生物学的説明を支持し、優れた誘発
系を与えている。このことは菌株は低温で増殖させるこ
とができ低水準で生産し、そして細胞塊が生成されてし
まつた後で温度を42℃に移し、その後生成物の生産が起
き、そして生成物もまた分泌されることを意味してい
る。
熱衝撃はまたLaと命名したATP依存性プロテアーゼも
誘引している。従つて、生産はその遺伝子中の突然変異
としてLaプロテアーゼに欠けた菌株中で優先的に起きる
であろう。
〔発明の構成〕
問題を解決するための手段 従って、本発明は大腸菌中に蛋白質を発現させ、そし
てその細胞外分泌を与える方法を提供し、この方法は （ａ）プロモーター、転座及びプロセッシングを可能と
するシグナル配列及び発現させるべき所望の蛋白質をコ
ードする構造遺伝子を含む組換体DNA構造を大腸菌中に
導入し、 （ｂ）大腸菌を繊維状増殖（filamentous growth）が生
じるような条件下で培養し、そして （ｃ）細胞外分泌された蛋白質を回収する 工程を含む。このような方法において、所望の蛋白質の
発現は好ましくは繊維状増殖のものと同一の転写調節下
にある。本発明方法の一つの実施態様において、転写調
節はシグマ−32蛋白質因子を発現させるhtpRの誘発に基
づく。
作用効果 先に指摘した通り、本発明の概念は繊維状増殖をもた
らす条件下で大腸菌を増殖させることに基ずく。このよ
うな繊維状増殖は組換体DNA構造の性質及びそれから発
現される蛋白質による。繊維状増殖はまた外部誘発にも
または両者の組合せによつてもよい。かくして、繊維状
増殖は熱衝撃応答を誘発する培養における温度上昇によ
り起こされうるが、これはまたエタノールのような培養
培地変性剤中に導入することによつても起こされる。
宿主細胞中で上で定義したように組換体DNA構造によ
り発現された蛋白質は外来または誤つて折重られたと細
胞により認められるという事実により、これは細胞中で
lon反応を誘発できる。
組換体DNA構造は様々な方法で、細菌中に導入されう
る。かくして、それは細菌の染色体DNA中に導入されう
る。あるいはプラスミド媒介体中に導入されうる。
本発明方法の好ましい実施態様において、組換体DNA
構造は単一配列として蛋白質のものを含有している。シ
グナル配列に隣接して構造遺伝子は回収されるべき成熟
蛋白質のＮ末端アミノ酸残基をコード化する開裂領域を
含有している。このような開裂領域は少なくとも６個の
アミノ酸残基をコード化するよう構成されうる。該残基
は好ましくはAla Gln His Asp Glu Alaである。
本発明方法において、構造遺伝子は蛋白質ＡのE,EE及
びEB領域から選択された遺伝子を含むことができる。構
造遺伝子はまた生産遺伝子、例えばインシユリン様発育
因子（IGF−１）をコード化するものを含むことができ
る。
プロモーター，シグナル配列及び開裂領域を含有する
構造遺伝子を含む組換体DNA構造であつて、該構造遺伝
子が式 （Ｅ）ｎ（Ｂ）ｍ−Ｙ （式中、ｎは１以上の整数であり、ｍは整数であり、Ｙ
は所望の蛋白質をコード化すうDNA配列であり、そして
Ｅ及びＢは蛋白質Ａ領域Ａ領域Ｅ及びＢに対する遺伝子
である）で表わされ、但し天然蛋白質Ａをコード化する
ものから構造遺伝子を除外する組換体DNA構造を提供す
る。このような構造において、ｎは１であつてよく、ｍ
は０であつてよく、あるいはｎが２であつてｍが０であ
つてもよい。特定な実施態様において、ｎ及びｍはいず
れも１であつてよい。
本発明の好ましい実施態様において、組換体DNA構造
はｎが２であり、ｍが０であり、そしてＹがIGF−１ま
たはIGF−２をコード化する遺伝子であるものである。
本発明はまた上と同一の意義を有する組換体DNA構造
を含むプラスミド媒介体も包含する。このようなプラス
ミド媒介体はpEMBL9から発生するものであつてもよい。
他の観点によると、本発明は組換体DNA構造をその染
色体中に保持するか又は該組換体DNA構造を含有するプ
ラスミド媒介体を保持するこのような組換体DNA構造を
含有する大腸菌、例えば大腸菌HB101を包含する。
本発明の更に別の観点によれば、本発明の概念を用い
て製造された蛋白質が提供される。
本発明を添付図面を参照して特定な実施例により更に
例示する。
第１図はその異なるコード化領域を示す蛋白質Ａ遺伝
子の模式図である。Ｓはシグナル配列であり、Ａ〜Ｅは
IgG結合領域であり、そしてＸはIgG結合活性に欠けるＣ
末端部である。
第２図は蛋白質Ａ遺伝子を含有するプラスミド媒介体
pR1T4を例示している。mp9多重制限酵素リンカーが遺伝
子融合に関連したその実際的解読ワクと共に示されてい
る。CMLはクロルアンフエニコールアシルトランスフエ
ラーゼ遺伝子であり、Saは黄色ブドウ球菌を複製する原
型であり、Ecは大腸菌を複製する原型であり、AMPはβ
−ラクタマーゼ遺伝子であり、そしてProtAは蛋白質Ａ
遺伝子のIgG結合部分を示す。
第３図は第Ｉ部にて記載したように構成した異なるpA
S及びpASE媒介体である。CMLはクロルアンフエニコール
アシルトランスフエラーゼ遺伝子であり、ori Bsは枯草
菌（B.subtilis）及び黄色ブドウ球菌を複製する原型で
あり、ori Ecは大腸菌を複製する原型であり、AMPはβ
−ラクタマーゼ遺伝子であり、Ｓはシグナル配列であ
り、そしてＥは蛋白質ＡからのＥ領域である。
第４図は蛋白質Ａ遺伝子続いて多重制限酵素リンカー
を保持するプラスミド媒介体を示す。ProtAは蛋白質Ａ
のIgG結合領域をコード化する遺伝子である。TCはテト
ラサイクリン抵抗性をコード化する遺伝子であり、そし
てoriは大腸菌を複製する原型である。
第５図は蛋白質ＡのＢ領域をコード化する異なる遺伝
子フラグメントを示している。左への矢印は得られた異
なるBal31 クローンを示している。異なるBal31構成体
に結合されたEcoRIリンカーが示されている。Ｂ−0,B−
１及びＢ−２構成体としてEcoRI領域を超えてＢ領域に
入つたアミノ酸配列が示されている。右側はＢフラグメ
ントの３′末端におけるBimHIの位置が示されている。
また２種の可能な配向におけるストツプリンカー（第６
図）の翻訳停止も示されている。
第６図はストツプリンカーの配向とは独立して即時の
翻訳停止を生じさせるストツプリンカーを示している。
各配向に応じた３種の異なる解読ワークが示されてい
る。
第７図は天然蛋白質Ａにおける結合と比較したシグナ
ルペプチド及び異なるpASB構成体間の結合のアミノ酸配
列を示している。各アミノ酸配列上の矢印は大腸菌HB10
1から発現されたフラグメントのアミノ酸配列化により
分析されたプロセツシングの位置を示している。
第８図は合成IGF−１遺伝子のスクレオチド配列を示
している。合成フラグメントの側面を固めるEcoRI部位
及びHindIII部位が推論されたアミノ酸配列と共に示さ
れている。
第９図は異なる蛋白質Ａ誘導構成体を発現させるのに
用いられた２種のタイプのプラスミド媒介体を示してい
る。CMLはクロルアンフエニコールアシルトランスフエ
ラーゼ遺伝子であり、S.a.は黄色ブドウ球菌を複製する
原型であり、Ecは大腸菌を複製する原型であり、AMPは
β−ラクタマーゼ遺伝子であり、そしてProtAは線状図
に示したように異なる蛋白質Ａ構成体を示す。
実施例 以下、本発明を特定な実施例により更に例示するが、
これら実施例は本発明を限定するものではない。実施例
はヒトインシユリン様発育因子１（IGF−１）をコード
化する合成遺伝子に適用されかつSEEに融合されてSEE−
IGF−Ｉを形成する系の適用を示す。この蛋白質はまた
蛋白質Ａ遺伝子の少部分と同じ方法により分泌されかつ
Ｂ型媒介体において、発現水準が非常に高いことが見出
された。
媒介体pASEEはドイツ連邦共和国、ケツチンゲン（Got
tingen）のDcuttche Sammlung von MiRroorganismen（D
SM）に寄託番号大腸菌 RR1△M15において3593番として寄託された。
出発物質 細菌宿主 大腸菌K12の２種の異なる菌株を実施例中で
用いた。
HB101（Boyer,H.W.etal.J.Mol.Biol.,41,459−472（196
9））及び JM103（Messing,J.Methods Enzymol.,101,20−79（198
3）） （これらの菌株はスウエーデン、ストツクホルムのthe
Department of Biochemistry and Biotechnology,Royal
Institute of Technologyで入手できる。
クローン化媒介体 実施例中で使用したクローン化媒介体はpBR322（Boli
val,F.etal,Gene ２,93−13（1977）,pEMBL8（Dente et
al.,Nucl.Acids Res.11,1645（1933））,pEMBL9（Dente
etal,Nucl.Acida Res.11,1645（1983））,pRIT4（Nils
son,B,etal,EMBO J.4, 1075（1985））,pSPA 11（Uhlen
M.etal,Gene 23,369,（1983）），及びpSPA16（Uhlen
M.etal,J.Bacteriol.,159,713（1984））であつた。IGF
−１をコード化する合成遺伝子は別の個所（Elmblad,A.
etal,Third European Congress on Biotechnology III,
287−296,Verlag Chemie,Weinheim（1984））に記載さ
れている。実施中で構成されるプラスミド媒介体pASEE
はドイツ連邦共和国，ゲツテインゲンのDeutche Sammlu
ng von Microorganismen（DSM）に寄託番号DSMとして寄
託された。
緩衝液及び培地 コーテング用緩衝液： 1,.59gのNa2CO3,2.93gのNaHCO3
及び1.2gのNaN3を蒸留水で１に調製。
PBST:8.0gのNaCl,0.2gのKH2PO4,2.9gのNa2HPO4×12H2O,
0.2gのKCl,0.2mlのTween 20及び0.2gNaN3を蒸留水で１
に調製（pH7.4）。
TSB:30gのトリプシン系大豆汁を１に調製し、オート
クレープにかけた。
TBAB:30gのトリプシン系血液寒天基質を１に調製し、
オートクレープにかけた。
ONPG緩衝液： 15mM2−メルカプトエタノール及び1mM M
gCl2を含有する0.1M燐酸カリウム緩衝液、pH7.3中の2mM
o−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトシド（ONPG,シグ
マ製品NO.N−1127）。
通常方法 操作方法のうちあるものは実施例中で繰返し行なつ
た。他に特記しない限り、それらはそれらを行なう毎に
全く下記と同じように行なつた。
分子生物学において通常用いられる方法は記載されて
いない（例えば、市販の制限酵素、DNA結紮、Bal31エキ
ソヌクレアーゼ、S1ヌクレアーゼ及びKlenowポリメラー
ゼの使用）。
転換： プラスミドDNAによる大腸菌K12の転換は記載の
通りに行なつた。（Morrism,D,A.,Methods in Enzymolo
gy,Academic Press 68,326−331（1971）。転換体は70m
g/lアンビシリンを含有するプレート（TBAB）上で常法
により選択した。
プラスミドDNAの単離： プラスミドDNAをBirnbcim,H.
C.etal,Nucl,Acids Res.７,1513（1973）に記載された
ように単離した。多数の転換体をスクリーニングするた
め小規模製剤をKieser,T.,Plasmid12,19−36（1984）に
より記載されたのと全く同じように作成した。
セフアロース（Sepharose）6Bクロマトグラフイー:Bal3
1またはS1処理のため使用すべきプラスミドDNAを10mM T
ris,1mM EDTA及び500mM NaCl緩衝液中のセフアロース6B
ゲル過にかけた。この方法により、DNAはRNAから分離
される。
DNAフラグメントの溶離:DNAフラグメントのアガロース
またはポリアクリルアミドゲル片からの溶離をMaxam et
al,P.N.A.S.（USA），74,560−564（1977）により記載
されたのと全く同じように行なつた。
DNA配列化： DNA配列分析をSanger,F.etal.J.Mol.Bio
l.,143,161（1980）により記載されたのと全く同じよう
に行なつた。
蛋白質Ａの検出及び定量： 蛋白質Ａを定量するためEL
ISA試験（すなわち酵素結合免疫吸着剤分析）を用い
た。この試験は正味電荷（nct charge）を有さない特別
ミクロ滴定プレート（Titertek,オランダ、アムステル
スタツド）を使用する。溜めをコーチング緩衝液中のヒ
トIgG（Kah,AB,スウエーデン）でコーチングする。試料
を添加し、蛋白質Ａを溜め中に吸着されたIgGのFc部分
に結合させる。次いで、蛋白質Ａを、β−ガラクトシダ
ーゼ（Pharmasia AB,スウエーデン，ウブサラから）に
接合された抗蛋白質Ａ（ラビツトから）により分析す
る。
分析： ミクロ滴定プレートの溜めをコーチング緩衝液
中16ng/mlのヒトIgG溶液75μｌで満たし、プレートを室
温で少なくとも１時間培養する。溜めを100μｌのPBST
で３回洗浄し、50μｌの試料を各溜めに添加する。定量
のため、２倍希釈液を調製する。１時間温置後、溜めを
100μｌのPBSTで３回洗浄し、次いで50μｌの抗蛋白質
Ａ−β−ガラクトシダーゼを添加する（各溜めに添加さ
れた蛋白質Ａ結合能力の量は過剰の蛋白質Ａによる滴定
により検出された各溜めに添加されたIgGのモル量に対
応する）。45分間温置した後、溜めを100μｌのPBST3回
洗浄し、次いで125μｌのONPG緩衝液を添加する。20〜3
0分間温置した後、150μｌの0.1MNaOHを添加して反応を
停止させる。定量は既知濃度の蛋白質Ａ標準溶液の２倍
希釈液を試料の２倍希釈液と平行し流すことにより行な
う。405nmにおける吸収を光度計により各溜めについて
測定する。
β−ガラクトシダーゼ分析：β−ガラクトシダーゼの定
量をMiller,J.H.（Experiments in Molecular Genetic
s.Cold Spring Harbor,New York;Cold Spring Harbor L
aboratory,1972）により記載されたように基質としてｏ
−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトシド（ONPG,Sigma
製品NO,N−1127）を用いる比色法により分析した。反応
は405nmにおいて分光光度計で追跡した。
β−ラクタマーゼ分析： β−ラクタマーゼ活性の量を
Ｏ′Callaghan etal,Antimicrob. Agents Chemother,5
7，（1968）により記載されたのと全く同じように分光
光度計により決定した。
浸透衝撃： 細胞質周囲に位置する蛋白質をNossal et
al,J.Biol.Chem.241,3055（1965）に記載されたのと全
く同じように浸透衝撃により放出させた。
実施例 I.蛋白質Ａヌクレオチド配列の分析 蛋白質Ａ遺伝子は１個のIgG結合領域（領域E,D,A,B,
C）及び１個の細胞壁結合領域（領域Ｘ）を含む（第１
図）。これら２種の領域の前にシグナル配列がある。
シグナル配列の後及び領域Ｅの後各々に融合点を含有
する融合媒介体を作るためには、融合点の周囲のヌクレ
オチド配列を知ることが望ましい。
蛋白質Ａのヌクレオチド配列が知られている（Uhle′
n,M.etal,J.Biol.Chem.259,1695−1702（1984）。
シグナル配列（以下Ｓと称する）の後の融合点におい
て、Mst I制限酵素部位がある。領域Ｅの後、またMst I
制限酵素部位がある。以下に記載するように、Mst Iに
より適当なプラスミド媒介体中で蛋白質Ａ遺伝子を消化
させ、次いでリンカーを挿入することにより、一般的な
使用可能な媒介体が得られる。
II.pAS,pASE及びpASEEの構成 次の工程において、独特なEcoRI部位がＳ及びSE各々
に置かれたプラスミド媒介体の構成を記載している。ま
た、SEE及びEF領域の間にかつSEE構成体の後にEcoRI部
位を有するように構成されるかを記載している。
A.pAS,pASE及びpASEEプラスミド媒介体の構成 50μｇのpRIT4（Nilsson,B.etal,EMBO J.４,1075（19
85））（第２図）を5Uの制限酵素を用いてMstIで消化さ
せ、37℃で２時間温置した。65℃で30分間温置した後、
反応混合物を３種の別個の反応に分けた。異なる長さの
EcoRIリンカーを各反応に各々添加した。第一の試験管
に、８量体リンカーを添加し（GGAATTCC）第二の試験管
に10量体リンカーを添加し（CCGAATTCGG）、そして第三
の試験管に12量体リンカーを添加した（CCCGAATTCGG
G）。（通常方法に記載したように）結紮後、結紮混合
物を各々EcoRIで消化させ、次いで２μg/mlまで希釈
し、結紮した。通常方法に記載したように転換を行な
い、アンビシリン抵抗性被転換体を選択した。各反応に
おいて、２種の主要な型の媒介体が見出された。一方の
型はシグナル配列、その後にEcoRIリンカー及びmp9マル
チリンカーを含有している。ベクトルの他方の型は領域
Ｅの後でEcoRIリンカー、その後にmp9リンカーを含有し
ている。異なる長さでEcoRIを添加することにより、各
型の構成体について３種の解読ワクにおいてmp9 リン
カー制限部位が入手できる（第３図）。
第３図に示したこれら２種の型の媒介体とは別に、12
量体EcoRIリンカーを含有する実験において、もう１種
の型のプラスミド媒介体が回収できた。この構成体はSE
−12量体リンカーＥ−mp9リンカーを含有する。このよ
うにして、４種のアミノ酸が２種のＥ領域間にEcoRI制
限部位と同様に導入される。この媒介体はpASEEと命名
され、３型解読ワク中でmp9リンカーを有している（第
３図）。全ての構成体はDNA配列を用いてリンカー領域
上に確認できた。
III.B遺伝子フラグメントの構成 以下の実験はブドウ球菌性蛋白質Ａの領域Ｂをコード
化する遺伝子フラグメントのサブクローン化を記載して
いる。
出発物質、プラスミド媒介体pSPA11は領域Ｂから下流
の領域C117個の塩基対中に位置するSan3AI制限部位まで
の蛋白質Ａ遺伝子を有する。sSPA11の精製後、精製プラ
スミドを、Bal31処理における競合抑制剤として作用す
るRNAを含有しない純粋なプラスミドを得るためセフア
ロース6Bカラムに通した。約100μｇの精製pSPA11（第
４図）をEcoRIで消化させ領域Ｂから下流の117個の塩基
を開裂した。エクソヌクレアーゼBal31を通常方法に記
載したように製造した。Bal31消化の後、反応混合物をE
tOHで沈殿させ、0.5mMdNTPsの存在下で10UKlenowポリメ
ラーゼで処理することにより鈍末端を確実にした。異型
長のDNAをプールしたものをBamHI8量体リンカー（CGGAT
CCG）で結紮した。結紮後、反応混合物をBamHI及びHind
IIIで開裂した。HindIII部位は領域Ｂの79個の塩基対上
流に位置している。反応混合物を５％ポリアクリルアミ
ドゲル電気流動にかけることにより異型長のフラグメン
トを分離した。250個の塩基対付近のフラグメントをゲ
ルから切り出し、電気溶離させ、BamHI及びHindIIIで既
に開裂させたpEMBL9に結紮させた。大腸菌に転換後、JM
103白色コロニーをＸ−gal及び1PTGを含有するTBABプレ
ート上で分離した。領域Ｂから除去した４種のヌクレオ
チドを有するクローンを更に仕上げるために選択した
（第５図）。
このクローンからのプラスミドDNAを精製し、セフア
ロース6B上に流しRNAを除去した。約100μｇのプラスミ
ドDNAを更にHindIIIで消化させエクソヌクレアーゼBal3
1で通常方法中に記載したように処理した。鈍末端を確
実にするため、0.5mMdNTPの存在下で37℃で30分間Kleno
wポリメラーゼ（10U）で処理した後、反応混合物をEcoR
I10量体リンカー（CCGAATTCGG）に結紮した。EcoRI及び
BamHIで消化後、DNAを５％ポリアクリルアミドゲル電気
泳動に付した。179個の塩基対の所望の長さ付近の細片
を切り出し、電気溶離にかけた。溶離から単離したDNA
をEcoRI及びBamHIで消化させたpEMBL9に結紮した。大腸
菌JM103に転換した後、白色コロニーをＸ−gal及びIPTG
を含有するTBABプレート上で選択した。配列分析によ
り、３種の興味あるクローン（各々0,−１及び−２と言
及する）が見出され、これらを仕上げのため選択した。
数字（0,−１及び−２）は第５図に示したようにEcoRI
リンカーの結合の前に領域Ｂ中に消化されるヌクレオチ
ドの数を示す。
領域Ｂ中への３種の異なる解読ワクの３種のクローン
（以下Ｂ−０、Ｂ−１及びＢ−２と称する）をBamHIで
開裂した。BamHIの粘着性末端を通常方法中に記載した
ようにS1−ヌクレアーゼで除去した。第６図に示した翻
訳ストツプリンカーを各反応混合物に結紮した。各構成
体中のリジン残基は今や第６図に示したように入つてく
るストツプリンカーの配向に依存してGlyまたはAlaのい
ずれかで置換されよう。大腸菌JM103に転換後、下流に
結合されたストツプリンカーを有するＢフラグメントを
含有する単離されたクローンの配列分析を行なつた。配
列分析により、Ｂ−０はGly残基により、Ｂ−１はAla残
基により、そしてＢ−２はAla残基により終つているこ
とが分つた。
これらのフラグメントは今やＩに記載した媒介体のあ
るものにクローン化されることになる。
IV.pASEB,pASBI及びpASB2の構成 ＢのフラグメントはここでpAS及びpASEにクローン化
されることになつた。
約50μｇのＢ−0,B−１及びＢ−２及びストツプリン
カーを有する媒介体をEcoRI及びHindIIIで各々開裂し
た。HindIIIはストツプリンカーの直ちに後で開裂され
た。各媒介体からのＢフラグメントはポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動を用いて単離した。
Ｂ−１フラグメントをEcoRI及びHindIIIで開裂された
pAS2（第３図）に結紮した。大腸菌HB101に転換し、個
々のクローンからプラスミドDNAを制限分析した後、pAS
B−１プラスミド媒介体をシグナル配列の後に蛋白質Ａ
のフラグメントＢを有して単離できた。
Ｂ−１フラグメントをEcoRI及びHindIIIで開裂された
pAS3（第３図）に結紮した。大腸菌HB101に転換し、個
々のクローンからプラスミドDNAを制限分析した後、pAS
B−２プラスミド媒介体がシグナル配列の後にフラグメ
ントＢを有して単離できた。
pASB−１及びpASB−２間の差は第７図に示したように
EcoRIリンカーに存在する３種のアミノ酸である。
Ｂ−２フラグメントをEcoRI及びHindIIIで開裂された
pASE1（第３図）に結紮した。大腸菌HB101に転換し個々
のクローンからプラスミドDNAを制限分析した後pASEBプ
ラスミド媒介体が領域Ｅに結合された蛋白質Ａのフラグ
メントを有して単離できた。
V.pASEE−IGF−１の構成 この実験において、いかにしてヒトインシユリン様発
育因子Ｉ（IGF−Ｉ）をコード化する合成遺伝子を第Ｉ
部にて記載したpASEE媒介体にクローン化したかを示
す。
IGF−Ｉをコード化する合成遺伝子（第８図）（Elmbl
ad,A.etal,Third European Congress on Biotechnology
III,287−296 Verlag Chemie,Weinheim（1984）をpUC8
からEcoRI及びHind IIIで開裂した。IGF−Ｉをコード化
する遺伝子フラグメントをポリアクリルアミドゲル電気
泳動次いで電気溶離により単離した。
プラスミド媒介体pASEEをEcoRIで部分的に開裂させ、
線状化させた媒介体は１％アガロースゲル電気泳動から
単離した。電気溶離後、線状媒介体をHind IIIで消化さ
せ、次いで１％アガロースゲル電気泳動により単離し
た。IGF−ＩフラグメントをこのpASEE媒介体に結紮し、
そして次いで転換後、pASEE−IGF−ＩはpASE−IGF−Ｉ
の背景にて単離できた。pASEE−IGFIはシグナル配列の
後、IGF−Ｉに融合したEEをコード化している。
VI pE8EE−IGF−Ｉの構成 この部ではいかにしてSEE−IGF−Ｉが第Ｉ部にて記載
したpAS媒介体と比較してpEMBLの他の配向においてクロ
ーン化されるかを示している。
約50μｇのpASEE−IGF−Ｉ（第５部にて記載したよう
に）をTaqI及びHindIIIで開裂させた。制限エンドヌク
レアーゼTaqIは蛋白質Ａ遺伝子の翻訳出発から上流の17
9個の塩基対を開裂させ、HindIIIはIGF−Ｉ遺伝子の下
流を開裂させる。反応混合物を４％ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動にかけ、SEEIGFI−Ｉフラグメントを切り
出し電気溶離させた。
このフラグメントはAccl及びHindIIIで開裂されたpEM
BL8に結紮した。大腸菌HB101に転換した後、プラスミド
pE8EE−IGF−Ｉは制限分析により分析されたように単離
できた。
VII pE9EDABCの構成 この部ではいかにして逆配向において蛋白質ＡのIgG
結合部分を得るためにSEDABCをpEMBL9にクローン化させ
るかを示している。
プラスミド媒介体pRIT4をTagI及びEcoRIで開裂させ
た。制御エンドヌクレアーゼTaqIはTTG出発コドンから
上流の179個の塩基対を開裂し、EcoRIは蛋白質Ａの領域
Ｃ中で開裂させる。
このフラグメントはAccI及びEcoRIで開裂されたpEMBL
9に結紮した。大腸菌HB101に転換した後、プラスミド媒
介体pE9EDABCが単離できた。このプラスミドは複製の原
型から配向された蛋白質Ａ遺伝子を有していた。
VIII 蛋白質Ａ誘導フラグメントの大腸菌中の発現及び
局圧化 異なる蛋白質Ａ構成体を１晩増殖させ、蛋白質Ａ、β
−ガラクトシダーゼ（細胞内マーカー）及びβ−ラクタ
マーゼ（細胞質周囲空間マーカー）の発現水準及び局圧
化を測定した。プラスミドpASEEを、他の構成体と同じ
大腸菌株中に宿るように大腸菌HB101に転換した。１晩
の増殖の後、細胞を遠心分離した。細胞を浸透衝撃次い
で遠心分離で（通常方法に記載したように）処理した。
ペレット中のスフエロプラストを超音波処理することに
より細胞内蛋白質を放出させた。
媒介体の型（ＡまたはＢ）はβ−ラクタマーゼ（AM）
遺伝子に比較した蛋白質Ａ誘導構成体の配向を言及して
いる（第８図）。β−ガラトシダーゼ、β−ラクタマー
ゼ及び蛋白質Ａの分析方法を通常方法に記載したように
行なつた。
実験からの結果は第１表にみられる。
蛋白質Ａの小さなフラグメントは繊維状増殖並びに蛋
白質Ａ誘導フラグメントを包含して細胞質周囲に位置し
た蛋白質の漏出を誘発するとみている。
シグナル配列の直ちに後の領域Ｂを含有する遺伝子構
成体（pASB1及びpASB2）において、蛋白質Ａフラグメン
トの主要部分が細胞内画分中に見出される。結論はこの
挙動はシグナルペプチドを開裂除去するリーダーペプチ
ダーゼの不能によるものであり、そして翻訳されたＢペ
プチドは細胞質膜に付着するということである。
pASB1及びpASB2 プラスミド各々を保持する大腸菌培
養物から精製されたＢフラグメントの（通常のEdman分
解技術による）Ｎ末端配列化はシグナル配列中へのプロ
セツシング部位を明らかにし、リーダーペプチダーゼが
シグナルペプチドを開裂除去しないことを確認した（第
７図）。更に、高められた発現水準がこれらの構成体、
繊維状増殖並びに通常細胞質周囲にある蛋白質の細胞外
対応体への漏出から見られる。
pASEE−IGF−１ 構成体はまた細胞外ハイブリツド蛋
白質を与え、これは繊維状増殖と相関がある。
Ｂ型媒介体を表わす２種の構成体（pE8EE−IGF−Ｉ及
びpE8EDABC）は最も顕著な繊維状増殖を示す。
大腸菌HB101中に発現されたpE8EDABCは高い発現水準
並びに分泌を与え一方pRIT4は低い発現を与えることが
注目に値する。この高められた発現はpE9EDABC構成にお
いて上流Iac−プロモーターに依存することが主張でき
た。しかしながら、この繊維状増殖及び発現水準は（la
c−プロモーターから転写を誘発すると知られた）IPTG
の添加に依存しないことが示された。
この分泌から結論できることは蛋白質Ａプロモーター
及びシグナル配列に基ずく異なる構成体が繊維状増殖、
増殖培地への細胞質周囲蛋白質の輸送及び蛋白質Ａ構成
体から高められた発現を誘発することである。
繊維状増殖は大腸菌中の熱衝撃応答に相関しているの
で、次の実験は蛋白質Ａプロモーターからの高い発現は
熱衝撃応答によるのか、あるいは理由の分らない高い発
現が熱衝撃応答を与えるのかを知るために行なつた。
IX 熱衝撃による及びよらないHB101におけるpRIT4の発
現 プラスミドpRIT4はＡ型媒介体中で蛋白質ＡのIgG結合
部分を保持している（第２図、第９図及び第VII部）、
大腸菌HB101を１晩増殖するとき、蛋白質Ａは増殖培地
にわずかしか分泌されない（９％）。この蛋白質Ａ構成
体を、４％EtOH及び異なる酸化性剤が熱衝撃応答を得る
ためのよく知られた他の方法ではあるが、温度上昇とし
て熱衝撃を用いまたは用いず増殖させるよう選択した。
pRIT4を保持する大腸菌HB101を１晩増殖させた（30
℃）。１晩の培養物を70μg/mlアンピシリンを含有する
15mlの新しいTSB培地に接種し（150μｌ）、細胞は２個
の別個の振盪フラスコ中で2.5時間増殖させた。
培養物の一方を15mlのTSB（30℃）で希釈し、30℃で
温置した。他のフラスコに54℃で15mlのTSBを添加し、
フラスコを42℃で温置した。
切替時から３時間温置した後、細胞を遠心分離した。
細胞ペレツトを10mlのPBSTで１回洗浄し、5mlのPBSTで
再懸濁し、３×30秒（MSE超音波処理器中、ミクロチツ
プ、出力レベル６）超音波処理した。10分間16,000gで
遠心分離後、上澄液を集めた。
蛋白質Ａを培地中及び超音波処理画分中で定量し、細
胞質周囲及び細胞質中の全量に対応する。結果は以下の
通りであつた。
比較的低い発現が低い光学濃度（OD580）により立証
される。熱衝撃細胞培養物中の発現水準は20培高い。
これはもし蛋白質Ａ遺伝子自体の転写調節が熱衝撃応
答のものである場合のみ説明されうる。
本発明はわずか数種の特定な遺伝子を用いて本明細書
中に例示してきたが、本発明の基本概念はいかなる所望
の遺伝子をも発現させる遺伝子を必要とするものに適用
できる。かくして、例えばIGF−１を発現させるのに加
え、本発明は他の有用な蛋白質、例えば他の医薬として
有用な蛋白質、例を挙げればIGF−II、神経発育因子（N
GF）、皮膚発育因子（EGF）、血小板発育因子（PDGF）
のような他のソマトメジン類の製造に使用できる。本発
明の技術はまたアルフアー、ベーター及びガンマーイン
ターフエロン類、インターロイシン類、インシユリン、
ノイロペプチド類、胃腸ペプチド類、または他の興味あ
るペプチド類の製造に使用できる。
更に、本発明は宿主細胞として大腸菌の使用に限定さ
れるわけではなく、他の細菌性宿主細胞を用いても同様
に適用されることが観察される。
更に、蛋白質Ａから発したもの以外のシグナル配列が
使用できる。
【図面の簡単な説明】
第１図はその異なるコード化領域を示す蛋白質Ａ遺伝子
の模式図である。 第２図は蛋白質Ａ遺伝子を含有するプラスミド媒介体pR
IT4を例示している。 第３図は発明の詳細な説明の実施例第１部に記載したよ
うなpAS及びpASE媒介体である。 第４図は蛋白質Ａ遺伝子続いて多重制限酵素リンカーを
保持するプラスミド媒介体を示す。 第５図は蛋白質ＡのＢ領域をコード化する異なる遺伝子
フラグメントを示している。 第６図はストツプリンカーの配向とは独立して既時の翻
訳停止を生じさせるストツプリンカーを示している。 第７図は天然蛋白質Ａにおける結合と比較したシグナル
ペプチド及び異なるpASB構成体間の結合のアミノ酸配列
を示している。 第８図は合成IGF−Ｉ遺伝子のヌクレオチド配列を示し
ている。 第９図は異なる蛋白質Ａ誘導体を発現させるのに用いら
れる２種のタイプのプラスミド媒介体を示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 マジアス・ウーレン スエーデン国，ウプサラ，エス−752 35, エーブルス ロッツガータン ８アー (56)参考文献 Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊａｕｒｎａｌ，Ｖ ｏｌ，４ Ｎｏ．４（1985）Ｐ．1075−80

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（ａ）プロモーター、転座及びプロセッシ
    ングを可能とするシグナル配列及び発現させるべき所望
    の蛋白質をコードする構造遺伝子を含む組換体DNA構造
    を大腸菌中に導入し、 （ｂ）大腸菌を繊維状増殖が生じるような条件下で培養
    し、そして （ｃ）細胞外分泌された蛋白質を回収する 工程を含む大腸菌中に蛋白質を発現させ、そしてその細
    胞外分泌をもたらす方法。
  2. 【請求項２】工程（ｂ）における繊維状増殖は組換体DN
    A構造及びそれから発現される蛋白質Ａの性質による特
    許請求の範囲第（１）項記載の方法。
  3. 【請求項３】工程（ｂ）における繊維状増殖は外部誘発
    による特許請求の範囲第（１）項記載の方法。
  4. 【請求項４】工程（ｂ）における繊維状増殖は組換体DN
    A構造及びそれから発現される蛋白質Ａの性質及び外部
    誘発のいずれにもよる特許請求の範囲第（１）項記載の
    方法。
  5. 【請求項５】繊維状増殖は培養中の温度上昇により起こ
    される熱衝撃応答を誘発する特許請求の範囲第（３）項
    記載の方法。
  6. 【請求項６】繊維状増殖は培養培地中に変性剤を導入す
    ることにより起こされる特許請求の範囲第（３）項記載
    の方法。
  7. 【請求項７】組換体DNA構造はプラスミド媒介体により
    大腸菌中に導入される特許請求の範囲第（１）〜（６）
    項のいずれか一つの項記載の方法。
  8. 【請求項８】組換体DNA構造は大腸菌の染色体DNA中に導
    入される特許請求の範囲第（１）〜（６）項のいずれか
    一つの項記載の方法。
  9. 【請求項９】組換体DNA構造はシグナル配列として蛋白
    質Ａのものを含有する特許請求の範囲第（１）〜（８）
    項のいずれか一つの項記載の方法。
  10. 【請求項１０】シグナル配列に隣接した構造遺伝子は回
    収されるべき成熟蛋白質のＮ末端アミノ酸残基をコード
    する開裂領域を含有する特許請求の範囲第（９）項記載
    の方法。
  11. 【請求項１１】該開裂領域は少なくとも６個のアミノ酸
    残基をコードするように構成されている特許請求の範囲
    第（10）項記載の方法。
  12. 【請求項１２】該残基は Ala Gln His Asp Glu Ala である特許請求の範囲第（11）項記載の方法。
  13. 【請求項１３】構造遺伝子は蛋白質ＡのＥ、EE及びEB領
    域から選択された遺伝子を含む特許請求の範囲第（９）
    〜（12）項のいずれか一つの項記載の方法。
  14. 【請求項１４】構造遺伝子はインシュリン様発育因子１
    （IGF−１）をコードする遺伝子も含む特許請求の範囲
    第（13）項記載の方法。
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