JPH08245497A - Ｄ（−）−酒石酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】安価に大量供給可能なマレイン酸または無水マ
レイン酸から公知の方法で容易に合成できるシスエポキ
シコハク酸を、特定の微生物を用いて立体特異的に加水
分解し、化学工業用原料として重要なＤ（−）−酒石酸
を高収率で製造する方法を提供する。 【構成】シュードモナス属に属しシスエポキシコハク酸
のエポキシ環を加水分解してＤ（−）−酒石酸を生成し
うる能力を有する微生物の培養物またはその処理物とシ
スエポキシコハク酸とを溶液中で混合して反応させ、シ
スエポキシコハク酸を酵素的に変換してＤ（−）−酒石
酸を生成させることにより、Ｄ（−）−酒石酸を製造す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はＤ（−）−酒石酸の製造
方法に関する。詳しくは、生物学的反応を利用してシス
エポキシコハク酸を立体特異的に加水分解し、Ｄ（−）
−酒石酸に変換せしめることにより、化学工業用原料と
して重要なＤ（−）−酒石酸を工業的に有利に製造する
方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】Ｄ（−）−酒石酸は、光学活性な有機化
合物であり、例えば医農薬品またはそれらの製造中間体
等を合成する際などに利用される重要な化合物である。
しかし、Ｄ（−）−酒石酸は天然にはほとんど存在せ
ず、主としてＤＬ−酒石酸を光学分割することによって
得ているのが現状である。

【０００３】ところで、ＤＬ−酒石酸は、天然の酒石か
ら調製するか、フマル酸を過マンガン酸カリウム等で酸
化することにより得られるが、原材料の安定供給性、コ
スト等の問題から簡便さを欠くという問題があった。

【０００４】一方、生物の持つ反応特異性を利用して、
アルカリゲネス属に属する微生物を用いてシスエポキシ
コハク酸からＤ（−）−酒石酸を製造することに関する
報告（特開昭５０−１４５５８６号公報）があるが、十
分な生産性が得られていないのが現状であった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、Ｄ
（−）−酒石酸を、安価で且つ容易に供給しうる原料か
ら、高収率で製造する方法を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、安価に大
量供給が可能であるマレイン酸又は無水マレイン酸から
公知の方法で容易に合成できるシスエポキシコハク酸を
立体特異的に加水分解し、Ｄ（−）−酒石酸を高収率で
製造しうる方法について研究を重ねた結果、特定の微生
物を利用した生物学的反応によりかかる目的が達成され
ることを見出し、本発明を完成するに至った。

【０００７】即ち、本発明の要旨は、シュードモナス属
に属しシスエポキシコハク酸のエポキシ環を加水分解し
てＤ（−）−酒石酸を生成しうる能力を有する微生物の
培養物またはその処理物を用いて、シスエポキシコハク
酸を酵素的に変換してＤ（−）−酒石酸を生成させるこ
とを特徴とする、Ｄ（−）−酒石酸の製造方法、に存す
る。

【０００８】以下、本発明につき詳細に説明する。原料
として用いられるシスエポキシコハク酸は、例えばＪ．
Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２４，５４（１９５９）や、特公
昭５１−２０４９０号、同５４−２９４８６号、特開平
６−２７１５５７号等の各公報等に記載の方法に従い、
マレイン酸または無水マレイン酸を過酸化水素によりエ
ポキシ化することによって得られる。シスエポキシコハ
ク酸は遊離の酸または適宜の塩として反応に供される。
塩としては、本発明の反応を阻害しないものならいずれ
でもよいが、経済性等を考慮するとアンモニウム塩、カ
リウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩等の１価又は２
価の塩が好ましい。

【０００９】本発明に用いられる微生物は、シュードモ
ナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属し、且つシスエ
ポキシコハク酸のエポキシ環を加水分解してＤ（−）−
酒石酸を生成しうる能力を有する微生物であり、この条
件を満たすものであれば特に制限されないが、具体的に
は、シュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｐｕｔｉｄａ）、特に本発明者らが自然界より分離し
たシュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｐｕｔｉｄａ）ＭＣＩ ３０３７株（以下、「本菌株」
または「ＭＣＩ ３０３７株」と略すことがある。）が
挙げられる。

【００１０】ＭＣＩ ３０３７株の菌学的性質は、以下
の通りである。 ａ．形態的性質 普通寒天培地（栄研）上、３０℃、２４時間培養 （１）細胞の形及び大きさ；桿状／０．７〜１．０×
２．０〜４．０μｍ （２）細胞の多形性；なし （３）運動性；あり／複数の極鞭毛 （４）胞子の有無；なし ｂ．培養的性質 （１）肉汁寒天平培養；３０℃、２４時間の培養で半レ
ンズ状の円形コロニーを形成する。色調は黄味白〜うす
橙色、不透明でコロニー表面は平滑である。 （２）肉汁液体培養；良好な生育を示し強い混濁が見ら
れるが、液面における膜の形成は見られない。 （３）肉汁ゼラチン穿刺培養；２２℃培養では穿刺線に
沿って線状に生育するが、ゼラチンの液化は見られな
い。 （４）リトマス・ミルク；酸の生成、ペプトン化及び凝
固などの変化は見られなかった。 ｃ．生理学的性質 （１）グラム染色 陰性 （２）硝酸塩の還元 陰性 （３）脱膣反応 陰性 （４）ＭＲテスト 陰性 （５）ＶＰテスト 陰性 （６）インドールの生成 陰性 （７）硫化水素の生成 陰性 （８）デンプンの加水分解 陰性 （９）クエン酸の利用 陽性 （１０）色素の生成；キングＢ培地上で螢光色素生成 （１１）ウレアーゼ 陰性 （１２）オキシダーゼ 陽性 （１３）カタラーゼ 陽性 （１４）生育の範囲：温度＝９〜３７℃、ｐＨ＝５〜１
０ （１５）酸素に対する態度；嫌気条件下で生育せず （１６）Ｏ−Ｆテスト 酸化 （１７）糖類からの酸の生成 Ｌ−アラビノース ＋ Ｄ−キシロース ＋ Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−マンノース ＋ Ｄ−フラクトース ＋ Ｄ−ガラクトース ＋ マルトース − シュークロース − ラクトース − トレハロース − Ｄ−ソルビトール − Ｄ−マンニトール ＋ イノシトール − グリセリン ＋ デンプン − （＋：酸を生成する、−：酸を生成しない） （１８）アルギニンの加水分解 陽性 （１９）エスクリンの加水分解 陰性 （２０）β−ガラクトシダーゼ 陰性 （２１）有機酸の資化性 グルコン酸カリウム ＋ ｎ−カプリン酸 ＋ アジピン酸 − ＤＬ−リンゴ酸 ＋ 酢酸フェニル ＋ （＋：資化する、−：資化しない） （２２）ベンゼン環の開裂；オルト型 ｄ．化学分類学的性質 （１）ＤＮＡ中のＧ＋Ｃ含量；５９．３％ （２）イソプレノイドキノン；ユビキノン Ｑ９ （３）菌体脂肪酸 Ｃ１２：０ Ｃ１６：０ Ｃ１６：１ Ｃ１８：０ △Ｃ１７：０ ２ＯＨ−Ｃ１２：０ ３ＯＨ−Ｃ１０：０ ｅ．分類学的考察 （１）科レベルの同定 本菌株（ＭＣＩ ３０３７株）は、１）好気性のグラム
陰性桿菌であり、２）オキシダーゼ及びカタラーゼ陽
性、３）複数の極鞭毛によって運動性を有する、４）Ｏ
−Ｆテストではグルコースを酸化的に利用する、５）Ｄ
ＮＡ中の（Ｇ＋Ｃ）含量は５９．３％を示す、などの性
質を示した。

【００１１】Ｃｏｗａｎ ａｎｄ Ｓｔｅｅｌの医学細
菌同定の手引き第３版（１９９３）及びバージェイズマ
ニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー
［Bergey's Manual of Systematic Bacteriology］第１
巻、１４０〜２１９頁（１９８４）によると、以上の性
質から本菌株はシュードモナダーシー（Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｄａｃｅａ）科に帰属することが判明した。 （２）属及び種レベルの同定 さらに本菌株は、６）キングＢ培地上で黄緑色の螢光色
素を生成する、７）ベンゼン環の開裂はオルト型、８）
ゼラチンの液化能を持たない、９）トレハロース、ソル
ビトール、イノシトールなどの糖から酸を生成しない、
１０）イソプレノイドキノンはユビキノンＱ９を有す
る、１０）菌体脂肪酸として２ＯＨ−Ｃ１２：０及び３
ＯＨ−Ｃ１０：０を持つなどの特徴を示した。これらの
特徴は、本菌株がシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ）属に属するシュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）であることを示唆した。

【００１２】以上のことから、本菌株ＭＣＩ３０３７株
をシュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｐｕｔｉｄａ）と同定した。なおＭＣＩ３０３７株は工
業技術院生命工学工業技術研究所に生命研菌第１４５４
８号（ＦＥＲＭ Ｐ−１４５４８）として寄託されてい
る。

【００１３】本発明においては、上述した微生物を用い
てシスエポキシコハク酸のエポキシ環を酵素的に加水分
解してＤ（−）−酒石酸へ変換するが、その際には培養
した微生物菌体自身（生菌体または乾燥菌体）を用いて
もよいし、またその処理物を用いてもよい。

【００１４】ここで、「処理物」とは、微生物菌体の抽
出物もしくは微生物菌体の磨砕物、またはさらにそれを
硫安分別、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過等
の公知の方法により分離精製して得られる、エポキシ環
の加水分解反応を触媒する酵素の粗精製物または精製物
を意味する。

【００１５】微生物の培養は液体培養、または固体培養
のいずれでも良いが、工業的には液体培地による通気撹
拌培養が便利である。培養に用いる培地は、該微生物が
生育し、シスエポキシコハク酸をＤ（−）−酒石酸へ変
換する酵素を生成しうるものであればどのようなもので
もよい。たとえば炭素源としては、グルコース、フルク
トースなどの糖類をはじめ、アルコール類、有機酸類、
コーンステープリカー、廃糖蜜などが用いられる。窒素
源としてはアンモニア塩、硝酸塩、尿素などが用いられ
る。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウ
ム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いら
れる。

【００１６】また、酵母エキス、ビタミン、ヌクレオチ
ドなどの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。
更に、酵素を誘導させるために、培養開始時あるいは培
養途中にシスエポキシコハク酸を培地中に添加しておく
と有利である。

【００１７】培地のｐＨは５〜１０、好ましくは６〜
９、培養温度は１０〜３７℃、好ましくは２５〜３５℃
でおよそ１〜７日間好気的に培養する。本発明において
微生物の処理物を用いる場合は、例えば当該微生物の培
養物をそのまま又はそれから遠心分離、濾過等で集め、
これを水又は緩衝液に懸濁したものを用いる。

【００１８】本発明においては、上述した微生物の培養
物またはその処理物とシスエポキシコハク酸とを溶液中
で混合することにより反応させる。反応液中のシスエポ
キシコハク酸の濃度は特に限定されないが、培養物や処
理物の活性を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが
有利である。好ましい濃度は、３０重量％以下である。

【００１９】反応は静置、撹拌、振盪のいずれの方法で
行ってもよいが、効率よく反応を行うためには撹拌ある
いは振盪が好ましい。また、当該微生物の培養物または
処理物を適当な支持体に固定化してカラムに充填し、シ
スエポキシコハク酸溶液を流す方法も利用できる。反応
の温度は１０〜６０℃、好ましくは２０〜５０℃、ｐＨ
は５〜９、好ましくは６〜８で行う。

【００２０】以上のようにして培地中あるいは反応液中
に生成したＤ（−）−酒石酸は、公知の方法により分離
精製される。具体的には、菌体を分離除去した後、塩化
カルシウム、炭酸カルシウム等のカルシウム塩を加えて
Ｄ（−）−酒石酸として沈殿させ、これを濾過、水洗し
た後、硫酸でｐＨ１．８に調製して沈殿を除くことによ
り得られるＤ（−）−酒石酸溶液を減圧濃縮してＤ
（−）−酒石酸の結晶を析出させる方法、または、菌体
を分離除去した後の液を塩基性イオン交換樹脂に吸着さ
せ、洗浄後ギ酸等で溶出して得られる溶出液を減圧濃縮
してＤ（−）−酒石酸の結晶を析出させる方法等があ
る。

【００２１】このようにして得られるＤ（−）−酒石酸
のシスエポキシコハク酸からの変換率は、適当な反応条
件を選べば、９９％以上とすることができる。

【００２２】

【実施例】以下に、実施例により本発明を更に具体的に
述べるが、本発明はその要旨を越えない限り、以下に記
載する方法に限定されるものではない。 ＜実施例＞シスエポキシコハク酸１％、硫酸アンモニウ
ム０．２％、リン酸１カリウム０．１４％、リン酸２ナ
トリウム（１２水和物）０．３１％、硫酸マグネシウム
（７水和物）０．０５％、硫酸第一鉄０．００１％、酵
母エキス０．１％を含み、ｐＨ７．０に調整した液体培
地１００ｍｌを１２０℃で２０分間滅菌したものに、Ｍ
ＣＩ３０３７株を植菌し、３０℃で２４時間振盪培養し
た。培養液から菌体を遠心分離により集め、５０ｍｌの
水に懸濁した。

【００２３】一方、基質のシスエポキシコハク酸１．３
２ｇを水に溶かし、水酸化ナトリウムでｐＨ８としてか
ら水で５０ｍｌとし、上記菌体懸濁液とあわせて１００
ｍｌとして５０℃で５時間反応させた。

【００２４】この反応液を分析したところ、シスエポキ
シコハク酸の５２．６％が酒石酸に変換していたことが
わかった。さらに３０℃で１０時間反応させた後の反応
液を分析したところ、シスエポキシコハク酸の９９．６
％が酒石酸に変換していたことがわかった。

【００２５】尚、この酒石酸への変換率は、高速液体ク
ロマトグラフィー［分析カラム：ＭＣＩＧＥＬ ＣＫ０
８Ｅ（三菱化学（株）製）］を用いて市販試薬の酒石酸
を標準として反応液中の酒石酸濃度を測定し、反応開始
時のシスエポキシコハク酸の仕込量から、以下の式に基
づいて算出したものである。

【００２６】

【数１】 この反応液から菌体を遠心分離により除去した後、１Ｍ
塩化カルシウム溶液を１１ｍｌ添加し、４℃で一夜おい
てから生じた沈殿を遠心分離により集めた。得られた沈
殿を５０ｍｌの水に懸濁した後、再度遠心分離により沈
殿を集めた。この沈殿を５０ｍｌの水に懸濁した後、１
Ｎ硫酸溶液を加えてｐＨ１．８にし、再度遠心分離にか
けて得られる上清を減圧濃縮し、０．９３ｇの酒石酸の
結晶を得た。

【００２７】得られた酒石酸の結晶を濃度１０％の水溶
液とし、その水溶液の旋光度をＪＡＳＣＯ ＤＩＰ−３
７０（日本分光（株）製）を用いて測定温度２５℃にて
測定したところ、旋光度−１５．３を示した。標準とし
て、市販のＤ（−）−酒石酸の旋光度を同様の方法で測
定したところ、−１５．６であった。

【００２８】このように、得られた酒石酸の旋光度は標
準のＤ（−）−酒石酸の旋光度とよく一致し、本実施例
で得られた酒石酸がＤ（−）−酒石酸であることが確認
された。

【００２９】

【発明の効果】本発明の方法によれば、安価に大量供給
可能なマレイン酸または無水マレイン酸から公知の方法
で容易に合成できるシスエポキシコハク酸を、特定の微
生物を用いて立体特異的に加水分解することにより、化
学工業用原料として重要なＤ（−）−酒石酸を高収率で
製造することができる。具体的には、適当な反応条件を
選べば、Ｄ（−）−酒石酸への変換率９９％以上を達成
することができる。

【００３０】また、従来のアルカリゲネス属に属する微
生物を用いた場合に比べて、反応のための菌体の濃縮率
が低く、より高い生産性を得ることができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 川口 俊哉 神奈川県横浜市青葉区鴨志田町1000番地 三菱化学株式会社横浜総合研究所内

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】シュードモナス属に属しシスエポキシコハ
   ク酸のエポキシ環を加水分解してＤ（−）−酒石酸を生
   成しうる能力を有する微生物の培養物またはその処理物
   を用いて、シスエポキシコハク酸を酵素的に変換してＤ
   （−）−酒石酸を生成することを特徴とする、Ｄ（−）
   −酒石酸の製造方法。
2. 【請求項２】シュードモナス属に属しシスエポキシコハ
   ク酸のエポキシ環を加水分解してＤ（−）−酒石酸を生
   成しうる能力を有する微生物が、シュードモナス プチ
   ダであることを特徴とする、請求項１記載の製造方法。