JPH0825894B2

JPH0825894B2 - 抗ウイルス剤

Info

Publication number: JPH0825894B2
Application number: JP62152088A
Authority: JP
Inventors: 稔大原; 義春小口; 謙一松永; 国孝広瀬; 淳二角地; 教文杉田; 孝雄古荘; 成明武藤; 浩一新村; 親雄吉汲; 正明高橋
Original assignee: 呉羽化学工業株式会社
Priority date: 1987-06-18
Filing date: 1987-06-18
Publication date: 1996-03-13
Anticipated expiration: 2011-03-13
Also published as: JPS63316733A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、緑藻類の特定の目に属する海草より採取し
た多糖体又は蛋白多糖体、および該多糖体又は蛋白多糖
体（以下本物質と略称する。）を有効活性成分とする抗
レトロウイルス剤、就中抗エイズウイルス剤に関する。

近年、AIDS（Acquired Immunodeficiency Syndrome）
といわれる一連の後天性免疫不全症候群が患者を死に至
らしめる重篤な病気として注目され、それに対する有効
な治療薬が渇望されている。現在、唯一のAIDS治療薬と
しては核酸誘導体の１つである３′−azido−３′−deo
xy thymidine（AZT）が知られているのみである。この
病気の原因はレトロウイルスの一種であるHIV（Human I
mmunodeficiency Virus）がヒトのT₄リンパ系細胞に吸
着することによって感染が始まり、他のリンパ系細胞に
次々に感染して免疫系を破壊することによって起こるこ
とが既に研究されている。本発明者らは、すでに免疫系
に対してBRM（Biological Response Modifier）の働き
をする多くの蛋白多糖体を見出している。このBRMの働
きをする多糖体又は蛋白多糖体が免疫系に及ぼす影響が
大きいことに注目して鋭意検討を重ねた結果、海草類の
中で紅藻類の特定の目に分類されている植物から抽出さ
れる物質にHIVのヒト由来リンパ系細胞への吸着阻害活
性、及びHIVの増殖過程の必須の酵素であるRTase（逆転
写酵素）阻害活性があることを見出して本発明を完成さ
せた。以下に詳しく実施例をあげて説明をする。

本発明にかかわっている海草は、緑藻類に分類される
もので、山田常雄他編集「岩波生物学辞典第３版」1983
年３月10日岩波書店発行の付録第14ページ以下の「植物
および菌類分類表」によると、特に緑藻類の中で、オオ
ヒゲマワリ目、ヨツメモ目、ヒビミドロ目、アオサ目、
カワノリ目、ヨコワミドロ目、シオグサ目、ミドリゲ
目、サヤミドロ目、カサノリ目、ホシミドロ目、ミル目
から選択された海草がかかわっている。

特にアオサ属、アオミドロ属、ミル属、カサノリ属が
好ましい。

本発明は、驚くべきことにこれら海藻からの抽出物が
HIVの吸着阻害活性、逆転写酵素活性阻害を有すること
を見出して本発明を完成させた。つまり緑藻類の中の海
草から抽出される本物質を有効成分とする抗レトロウイ
ルス剤に関するものである。

本物質は、緑藻類のオオヒゲマワリ目、ヨツメモ目、
ヒビミドロ目、アオサ目、カワノリ目、ヨコワミドロ
目、シオグサ目、ミドリゲ目、サヤミドロ目、カサノリ
目、ホシミドロ目、ミル目から選択される海草を水系溶
媒で抽出することにより得られる。

抽出に際して用いる水系溶媒とは水又は水に可溶な有
機溶媒、酸、塩基又は塩のいずれかを少量、例えば10％
程度以下含有する水溶液から選択される１種又は２種以
上の組合せよりなるものである。有機溶媒としてはメタ
ノール、エタノール、イソプロピルアルコールなどが主
として用いられる。酸としては、塩酸、硫酸、酢酸など
である。塩基としてはアンモニヤ、苛性ソーダ、苛性カ
リ、炭酸ソーダなどである。

抽出は原料（乾燥基準）に対して５倍乃至200倍量の
抽出液を使用し、通常は４℃乃至120℃で20分乃至20時
間処理するものである。

精製処理工程とは、塩析、透析、限外濾過、逆滲透処
理、ゲル濾過、有機溶媒による沈澱処理などの１種又は
２種以上の方法の適用により低分子物を除去することを
意味するものである。工学的には加圧による膜分離法で
ある限外濾過法、逆滲透処理法の単独又は組合せが特に
好ましい。又場合により塩析工程後これらの処理を行っ
てもよい。

塩析工程に用いる塩析剤は硫安、食塩、塩化カリ、炭
酸バリウム等であるが、硫安の使用が最も好ましい。又
塩析工程の後処理として透析、限外濾過、ゲル濾過、逆
滲透処理等のいずれか１つ又はこれらの２以上の工程の
組合せが必要である。

透析は通常セロファン膜、コロジオン膜などの半透膜
を用いて実施されるものである。ゲル濾過はデキストラ
ン又はポリアクリルアミドゲルなどの吸着剤を充填した
カラムを用いて実施する。セファデックス、バイオゲル
の名称で販売せられている充填剤が通常用いられる。

限外濾過、逆滲透圧法はいずれも加圧下で膜を用いて
分画する方法である。前者は0.5〜5Kg/cm²、後者は20〜
35Kg/cm²で行うのが通常である。

有機溶媒による沈澱法はメタノール、エタノール、イ
ソプロパノール、アセトンなどを用いるのが一般的であ
る。又、上記操作に加えて必要に応じイオン交換処理を
行っても良い。

上記精製操作が終った後は噴霧乾燥、凍結乾燥などで
水分を除去した後製品化するものである。

尚本物質をアルカリ性水溶液で処理すると、驚くべき
ことには抗レトロウイルス効果が増強されるので更に好
ましい。本物質を５倍乃至200倍量の0.01N乃至5N好まし
くは0.1乃至2Nのアルカリ性水溶液で、40℃乃至250℃、
好ましくは60℃乃至200℃、最も好ましくは100℃乃至15
0℃で、５分乃至２時間好ましくは10分乃至１時間処理
する。次に該処理液を中和し、精製処理工程を行なう。
精製処理工程は前記の塩析、透析、限外濾過、逆滲透処
理、ゲル濾過、有機溶媒による沈澱処理などの１種又は
２種以上の方法の適用により行なうことが出来る。条件
は前記と同じである。この精製操作が終った後は、噴霧
乾燥、凍結乾燥などで水分を除去した後製品化する。

また、本物質をジエチルアミノエチル（DEAE）−セル
ロース等のイオン交換セルロース等を用いたクロマトグ
ラフィーで更に精製を行うと、その吸着物質中塩、アル
カリ等で溶出される画分は抗レトロウイルス効果が強い
ものが得られるのでより好ましい。

本物質はα−ナフトール硫酸反応、インドール硫酸反
応、アンスロン硫酸反応、フェノール硫酸反応及び又は
ローリィ−フォーリン法、塩酸加水分解後のニンヒドリ
ン反応で陽性又は微陽性を示す。元素分析の結果、炭素
20〜55％、水素３〜９％、窒素16.0％未満を主成分とし
て含有する。

pHは6.0〜7.5を示す。

本物質の糖成分は少なくともグルコース、マンノー
ス、キシロースを含み、蛋白成分としては少なくともア
スパラギン酸、グルタミン酸、ロイシンを含有する。

赤外線吸収スペクトルを測定すると、3600〜3200cm^-1
付近に水酸基の吸収および又は、1700〜1600cm^-1付近に
はアミド基に由来する吸収を認めることが出来た。

本物質は水系溶媒に可溶で、有機溶媒に不溶である。
水系溶媒は水又は水を主体として水に可溶のアルコー
ル、酸、塩基等を含むものであり、有機溶媒はクロロホ
ルム、ベンゼン、エーテル等を言う。

本物質は白色、緑色又は褐色で分子量はゲル濾過クロ
マトグラフィーにより10³〜３×10⁶である。

ラット（呑竜系）４〜５週令、体重100〜150gのもの
を用い、本物質を1000mg/Kg経口投与し、７日間観察を
行ったが全匹生存していた。

本物質はその毒性が極めて低く且つ副作用も殆んど生
起しないなど安全な物質である。

一般にウイルスは、標的細胞に吸着し、ウイルスの核
酸が細胞内に注入され、さらに細胞のゲノムにインテグ
レートされる過程を経てウイルスが複製されることが知
られている。また、特にレトロウイルスについては、細
胞のゲノムにインテグレートされる前に、ウイルス由来
の核酸であるRNAから、逆転写酵素の作用によってDNAに
転写される過程が必要である。本発明者等は、本物質が
HIVのヒト由来リンパ系細胞への吸着および、それに引
き続く感染を阻害すること、および、逆転写酵素活性を
阻害することを見出した。すなわち、HIVを50〜1000μg
/mlの濃度の本物質で０℃にて２時間処理した後HIVを洗
浄し、MT−４細胞に加えて吸着させ、３日間培養後のHI
V抗原陽性細胞を測定する方法にて、本物質の効果を検
討したところ、本物質による前処理により、HIV抗原陽
性細胞がほとんど消失し、HIVのヒト由来リンパ系細胞
に対する強い吸着阻害効果が認められた。一方、本物質
の逆転写酵素活性に及ぼす影響をラット肝臓全メッセン
ジャーRNAを鋳型として測定したところ、本物質50〜100
0μg/mlの添加により強い逆転写酵素活性の阻害がみら
れた。

これらのことは、本物質がウイルスの感染を阻害する
作用をもつこと、逆に逆転写酵素をもつレトロウイルス
の感染を阻害すること、就中、HIV感染によって引き起
こされるAIDSに有効であることを示すものである。

抗ウイルス剤としてすでに使用されているAZTの場
合、正常細胞に対しても分裂阻害作用を示す副作用がみ
られるが、本物質は急性毒性も極めて低く、安全な物質
であり、ウイルス感染、特にレトロウイルス感染を阻害
する作用を示すことより抗レトロウイルス剤として有用
である。即ちウイルス感染症、特にレトロウイルス感染
症、就中AIDSに有効である。

本物質は、抗レトロウイルス剤として用いる場合、任
意の剤型にすることができる。又、投与も各経路で行な
われる。更に本発明の薬剤は、抗ウイルス剤として用い
られている前記のAZTなどとの併用においても効力を減
ずることがなく、これら他の薬剤との併用は有効な手段
として使用し得る。

経口投与の場合には、それに適用される錠剤、顆粒
剤、散剤、カプセル剤などは、それらの組成物中に製剤
上一般に使用される結合剤、包含剤、賦形剤、潤滑剤、
崩壊剤、湿潤剤のような添加物を含有していてもよく、
又経口用液体製剤として用いる場合は、内用水剤、振盪
合剤、懸濁液剤、乳剤、シロップ剤の形態であってもよ
く、又使用する前に再溶解させる乾燥生成物の形態であ
ってもよい。さらに、このような液体製剤は普通用いら
れる添加剤、保存剤のいずれを含有してもよい。注射用
の場合には、その組成物は安定剤、緩衝剤、保存剤、等
張化剤などの添加剤を含んでいてもよく、単位投与量ア
ンプル、又は多投与量容器中で提供される。なお、上記
組成物は水溶液、懸濁液、溶液、油性または水性ビヒク
ル中の乳液のような形態であってもよく、一方活性成分
は使用する前に適当なビヒクルたとえば発熱物質不含の
滅菌した水で再溶解させる粉末であってもよい。

本発明の抗レトロウイルス剤は人間及び動物に経口的
または非経口的に投与される。経口的投与は舌下投与を
包含する。非経口的投与は注射例えば皮下、筋肉、静脈
注射、点滴などを含む。本発明の抗レトロウイルス剤の
投与量は動物か人間により、また年齢、個人差、病状な
どに影響されるので、場合によっては下記範囲外の量を
投与する場合も生ずるが、一般に人間を対象とする場
合、本物質の経口投与量は体重1Kg、１日当り0.1〜1000
mg、好ましくは１〜100mgを１回から３回に分けて投与
する。

以下、実施例を示す。

実施例１緑藻類の中のアオサ目アオサ科内のアオサ粉末100gを
容量３のステンレス製タンクに入れ、1000mlの水を加
えて攪拌しつつ温度を90〜95℃に保った。約３時間抽出
したのち、室温まで冷却した。

抽出スラリーを遠心分離機により抽出液と残渣とに分
離した。更に残渣に0.4N−NaOH1000mlを加えて90〜95℃
にて３時間抽出したのち、室温まで冷却し、2N−HClでp
Hを7.0に調整後遠心分離し、抽出液と残渣に分離した。

抽出液は合し、減圧濃縮装置により、400gまで濃縮
し、限外濾過にて脱塩の後凍結乾燥により乾燥し、18g
の乾燥物（Ｂ）を得る。

実施例２緑藻類の中のホシミドロ目内アオミドロ粉末100gを容
量３のステンレス製タンクに入れ、1000mlの水を加え
て攪拌しつつ温度を90〜95℃に保った。約３時間抽出し
たのち、室温まで冷却した。

抽出スラリーを遠心分離機により抽出液と残渣とに分
離する。更に残渣に0.4N−NaOH1000mlを加えて90〜95℃
にて３時間抽出した後室温まで冷却し、2N−HClでpHを
7.0に調整後遠心分離し、抽出液と残渣に分離する。

抽出液は合し、減圧濃縮装置により400mlまで濃縮
し、限外濾過にて脱塩の後凍結乾燥により乾燥し、15g
の乾燥物（Ｃ）を得る。

実施例３緑藻類の中のミル目のミル粉末100gを容量３のステ
ンレス製タンクに入れ、2000mlの水を加えて攪拌しつつ
温度を90〜95℃に保った。約３時間抽出したのち、室温
まで冷却した。

抽出スラリーを遠心分離機により抽出液と残渣とに分
離した。更に残渣に0.4NNaOH2000mlを加えて90〜95℃に
て３時間抽出したのち、室温まで冷却し、2N−HClでpH
を7.0に調整後遠心分離し、抽出液と残渣に分離した。

抽出液は合し、減圧濃縮装置により400mlまで濃縮
し、限外濾過にて脱塩の後凍結乾燥により乾燥し、17g
の乾燥物（Ｄ）を得る。

実施例４カサノリ目のカサノリ粉末100gを容量３のステンレ
ス製タンクに入れ、2000mlの水を加えて攪拌しつつ温度
を90〜95℃に保った。約３時間抽出したのち、室温まで
冷却した。

抽出スラリーを遠心分離機により抽出液と残渣とに分
離した。更に残渣に0.4N−NaOH2000mlを加えて90〜95℃
にて３時間抽出したのち、室温まで冷却し、2N−HClでp
Hを7.0に調整後遠心分離し、抽出液と残渣に分離した。

抽出液は合し、減圧濃縮装置により400mlまで濃縮
し、限外濾過による脱塩の後凍結乾燥により乾燥し、19
gの乾燥物（Ｅ）を得る。

各種緑藻類より新しく抽出された物質の物理化学的性
質を示しているのが表−１の一覧である。本表におい
て、フェノール硫酸呈色反応は糖類の存在を表わし、ロ
ーリィ−フォーリン法はペプチド結合の存在を示してい
る。分子量についてはゲル濾過法によって平均的に多く
存在する画分を記載した。

実施例５実施例１〜４で得られた物質について、レトロウイル
スが特異的に保持する逆転写酵素の阻害度を以下の方法
により測定した。

本物質はすべて凍結乾燥品10mgを滅菌蒸留水10mlに溶
解した（濃度:1mg/ml）。

１μの20mM D.T.T.（ジチオスレイトール：シグマ
社製）、５μの５倍濃度酵素反応液（250mM Tris−HC
l（pH8.3）−250mM KCl−40mM MgCl₂）、１μの3d NT
P溶液（1mM dATP−1mM dGTP−1mM dTTP:シグマ社製）、
２μの100μg/mlオリゴ（dT）_12〜18（PL−biochemic
als社）、１μのメッセンジャーRNA（正常ラット肝臓
由来:1μg/μ）、0.5μのRNase Inhibitor（16unit
/μ：宝酒造社製）と１μの［α−³²P］dCTP（〜80
0Ci/mmol,10μCi/μ：アマシャムジャパン社製）を1.
5ml容量のエッペンドルフチューブに加え、37℃ウォー
ターバス中におく。

５分後、先に調製した1mg/ml濃度の本物質12.5μを
反応チューブに添加し、更に１μの逆転写酵素（７ユ
ニット／μ：宝酒造社製、Rousassociatedv irus由
来）を加え、最終反応液量を25μとして、37℃で反応
させた。

１時間後５μの反応液を2cm×2cmのDEAE紙（東洋濾
紙社製）にしみこませ、風乾後、濾紙１枚あたり10mlの
0.5M−Na₂HPO₄水溶液に浸し、振盪しながら濾紙上のDNA
合成に使用されなかった［α−³²P］dCTPを洗浄した
（この操作を５分間おきに５回実施した）。

その後10mlの液体シンチレーションカクテル（アマシ
ャムジャパン社製）の入っているガラスバイヤル瓶に上
記DEAE紙を入れ、シンチレーションカウンター（アロカ
社製）にて１分間放射活性（c.p.m.）をカウントした。

逆転写酵素活性阻害率（％）は以下の式により求め
た。

Co:本物質非添加の放射活性 Cs:本物質添加の放射活性各本物質の逆転写酵素（RTase）活性阻害率を表−１
に示す。

実施例６本物質によるHIV（AIDSウイルス）のヒトリンパ球へ
の吸着阻害は以下の方法により実施した（尚、すべての
操作は無菌条件下で行なった）。

HIV浮遊液1mlと本物質溶液（800μg/ml）1mlを試験管
に入れ、氷中に静置した。２時間後試験管から1mlのウ
イルス浮遊液をとり、ヒトリンパ球由来細胞株MT−４
［Jpn.J.Cancer Res.（Gann），28,219−229（1982）］
に多重感染度（M.O.I.）≒２でウイルスを吸着させた。
遠心（毎分2,000回転,10分間）後、上澄液をすて沈澱し
たMT−４細胞を20％FCSを含むRPMI1640（Gibco Laborat
ories,NY）中に、細胞濃度２×10⁵/mlになるように浮遊
させた。

96穴プレートに上記MT−４細胞浮遊液を100μずつ
分注して、空気中５％CO₂、37℃の条件下で培養した。
培養３日目に間接蛍光抗体法によりHIV吸着細胞と非吸
着細胞を算出した。

HIV吸着阻害率（％）を次式で求めた。

結果を表−１に示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者杉田教文東京都文京区春日２の10の13の402 (72)発明者古荘孝雄東京都町田市旭町１−６−13 (72)発明者武藤成明東京都葛飾区東堀切３の23の２ (72)発明者新村浩一埼玉県狭山市青柳63 新狭山ハイツ６− 104 (72)発明者吉汲親雄東京都国立市東２−19−46 (72)発明者高橋正明東京都港区高輪１−５−33−314 (56)参考文献特開昭57−192319（ＪＰ，Ａ) 特開昭58−15920（ＪＰ，Ａ) 特開昭61−78729（ＪＰ，Ａ) 特開昭61−197525（ＪＰ，Ａ)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】緑藻類の、オオヒゲマワリ目、ヨツメモ
目、ヒビミドロ目、アオサ目、カワリノ目、ヨコワミド
ロ目、シオグサ目、ミドリゲ目、サヤミドロ目、カサノ
リ目、ホシミドロ目、ミル目から選ばれる海草より生産
した多糖体又は蛋白多糖体を有効成分とする抗レトロウ
イルス剤。
【請求項２】アオサ属、アオミドロ属、ミル属、カサノ
リ属から選ばれる特許請求の範囲第１項に記載の抗レト
ロウイルス剤。
【請求項３】α−ナフトール硫酸反応、インドール硫酸
反応、アンスロン硫酸反応、フェノール硫酸反応及び又
はローリィ−フォーリン法、塩酸加水分解後のニンヒド
リン反応で陽性又は微陽性を示し、元素分析値として炭
素20〜55％、水素３〜９％、窒素16.0％未満を主成分と
して含有し、pHは6.0〜7.5を示し、糖成分として少なく
ともグルコース、マンノース、キシロースを含み、蛋白
成分としては少なくともアスパラギン酸、グルタミン
酸、ロイシンを含有し、3600〜3200cm^-1付近に水酸基の
赤外線吸収スペクトルの吸収および又は、1700〜1600cm
^-1付近にアミド基に由来する赤外線吸収スペクトルの吸
収を有し、水系溶媒に可溶で、有機溶媒に不溶であり、
白色、緑色又は褐色で分子量はゲル濾過クロマトグラフ
ィーにより10³〜３×10⁶である特許請求の範囲第１項又
は第２項に記載の抗レトロウイルス剤。
【請求項４】抗エイズウイルス剤であることを特徴とす
る特許請求の範囲第１項に記載の抗レトロウイルス剤。