JPH08266294A - フマル酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 マレイン酸異性化酵素を利用したフマル酸の
製造を、常温条件下及び高温条件下においても安定に行
うことができる方法提供する。 【構成】 ５０℃以上で最大活性を示すマレイン酸異性
化酵素を産生する微生物、例えば４０℃を越える温度で
生育可能なバチルス属に属し、マレイン酸異性化酵素活
性を有する微生物の菌体、またはこれらの微生物の培養
物から採取したマレイン酸異性化酵素の粗酵素画分もし
くは精製酵素をマレイン酸を含有する水性溶液に加え、
マレイン酸を異性化してフマル酸を生成せしめる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、フマル酸の製造方法に
関し、詳しくは、耐熱性のマレイン酸異性化酵素を産生
する好熱性（thermophilic）の微生物を利用してマレイ
ン酸を異性化することにより、アスパラギン酸、リンゴ
酸、アラニン等の各種ファインケミカルズの原料として
有用なフマル酸を製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】マレイン酸を異性化してフマル酸を製造
する方法としては、主に化学的方法が提案されているが
（米国特許第2,816,923号、同第2,955,136号、同第2,33
2,992号）、反応平衡によりフマル酸への変換率が制約
を受けること、この方法は高温反応であるためにマレイ
ン酸あるいはフマル酸の劣化が起こり、副生物を生成す
るため収率が低下するなどの問題点を有している。

【０００３】一方、酵素反応によるフマル酸の製造に関
しては、マレイン酸異性化酵素（maleate cis-trans-is
omerase）がマレイン酸をフマル酸へと異性化すること
が知られている。マレイン酸異性化酵素を産生する微生
物としては、例えばシュードモナス エスピー（Pseudo
monas sp.）[K. Otsuka, Agric.Biol.Chem., vol.25,N
o.9, p.726 (1961)]、アルカリゲネス・フェカリス（Al
caligenes faecalis）IB-14 [Takamura, Agric.Biol.Ch
em., Vol.33, p.718(1969)]、シュードモナス・フルオ
レッセンス（Pseudomonas fluorescens）ATCC23728 [Sc
her, J.Biol.Chem., Vol.244, p.1878(1969)]が知られ
ているものの、これらにより産生されるマレイン酸異性
化酵素は、酵素学的性質の一部が報告されているに過ぎ
ず、該酵素の正確な分子量、サブユニット構造、全アミ
ノ酸配列、全ＤＮＡ塩基配列などの詳細については未だ
明かではない。また、マレイン酸異性化酵素について、
産業上の応用的観点からの検討は本発明者らが知る限り
全くなされていない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】これまでに知られてい
るマレイン酸異性化酵素は、常温下においても不安定で
あり、高温下では活性が著しく低下する傾向が報告され
ている[Takamura, Agric.Biol.Chem., Vol.33, p.718(1
969)]。マレイン酸異性化酵素を用いたフマル酸の製造
過程においては、一般には反応温度を挙げることによ
り、反応速度が向上し、フマル酸の生産性が向上する
が、温度上昇に伴い触媒となる酵素が熱により失活し、
触媒としての寿命が短くなる。従って、高温条件下にお
いても安定に活性を保持し得る酵素を用いることによ
り、高生産性のフマル酸製造プロセスを構築することが
できる。

【０００５】本発明は、常温条件下はもちろんのこと、
高温条件下においても安定に活性を保持するマレイン酸
異性化酵素を利用したフマル酸の製造方法を提供するこ
とを課題とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、高温条件
下で生育し、かつ、マレイン酸異性化酵素活性を有する
微生物の分離を目的として鋭意研究を重ねた結果、高温
条件下でマレイン酸を炭素源として生育し、マレイン酸
異性化酵素活性を有する微生物の分離を試み、本発明を
完成するに至った。

【０００７】かくして本発明によれば、５０℃以上で最
大活性を示すマレイン酸異性化酵素を産生する微生物の
菌体、またはこの微生物の培養物から採取したマレイン
酸異性化酵素の粗酵素画分もしくは精製酵素をマレイン
酸を含有する水性溶液に加え、マレイン酸を異性化して
フマル酸を生成せしめることを特徴とするフマル酸の製
造方法が提供される。

【０００８】前記微生物としては、４０℃を越える温度
で生育可能なバチルス属に属する微生物が挙げられる。
ここでいう、「マレイン酸異性化酵素活性を有する微生
物」とは、それ自体自然界より分離された微生物、また
はこれらに変異処理をした誘導体株、あるいはこれらの
微生物由来のマレイン酸異性化酵素遺伝子を導入した形
質転換株をも意味する。

【０００９】また、「最大活性」とは、マレイン酸異性
化酵素の活性を種々の温度条件下で、W. Scher法〔W. S
cher and W. B. Jakoby, J. Biological Chem., Vol.21
1, p.1878 (1969)〕等により測定したときの、比活性の
最大値を意味する。

【００１０】以下、本発明についてさらに詳細に説明す
る。本発明の「マレイン酸異性化酵素（maleate cis-tr
ans-isomerase; EC5.2.1.1）」とは、マレイン酸（シス
型）を異性化してフマル酸（トランス型）を生成する反
応を触媒する酵素を意味する。

【００１１】本発明のマレイン酸異性化酵素活性を有す
る微生物の取得法としては、該酵素が構成的に発現する
か、または誘導物質あるいは温度等により誘導的に産生
されるなどの如何にかかわらず、培地で培養して得られ
る菌体又は培養液が該酵素活性を有していれば特に制限
されない。その一例を挙げれば、以下のような方法によ
って自然界より分離、取得することができる。

【００１２】（１）マレイン酸資化性菌の分離 自然界から採取した試料を、マレイン酸を炭素源とした
培地、例えば培地Ａ［組成：マレイン酸二ナトリウム
５ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．７ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄ １．４ｇ、
ＮＨ₄ＮＯ₃ １ｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．２ｇ、ビ
オチン ０．２ｍｇ、チアミン・塩酸塩 ０．２ｍｇ、
ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ２０ｍｇ、ＭｎＳＯ₄ ２０ｍ
ｇ、蒸留水 １Ｌ（ｐＨ７．２）］に入れ、４０〜７０
℃にて２〜４日間好気的に振とう培養する。培養後の培
養物を寒天２％を含む上記培地Ａの組成を有する平板培
地に塗抹し、４０〜７０℃にて２〜４日培養する。この
平板培地上に生育したコロニーを単離し、以下のマレイ
ン酸異性化酵素活性の検出試験に供し、マレイン酸異性
化酵素活性を有する微生物を選定する。

【００１３】（２）マレイン酸異性化酵素活性を有する
微生物の選定 上記（１）で単離された微生物を前記培地Ａを用い、４
０〜７０℃にて１〜２日間振とう培養し、遠心分離によ
り菌体を回収する。得られた菌体を反応液Ａ［組成：マ
レイン酸 ３０ｇ、２５％アンモニア水 ４０ｍｌ、Ｔ
ｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．５ｇ、蒸留水 １Ｌ］に懸
濁し、４０〜７０℃にて一夜振とう後、遠心分離により
上清液を回収する。得られた反応液上清について、フマ
ル酸の生成を確認することにより、マレイン酸異性化酵
素活性を有する微生物を選出することができる。

【００１４】フマル酸の確認方法としては特に制限はな
いが、有機酸分析カラムを用い紫外線検出機により検出
するＨＰＬＣ分析、ペーパークロマトグラフィー、ある
いはフマラーゼ、リンゴ酸脱水酵素、アスパルターゼ等
の酵素を利用する酵素学的方法等により確認することが
できる。

【００１５】このようにして取得できる微生物として、
本発明者により分離されたバチルス属に属する微生物、
例えば、バチルス・ステアロサーモフィラスＭＩ−１０
１株、同ＭＩ−１０２株、バチルス・ブレビスＭＩ−１
０３株、同ＭＩ−１０４株、バチルス エスピーＭＩ−
１０５株等を挙げることができる。これらの微生物は、
以下に詳述するような菌学的諸性質を有しており、いず
れも新規微生物と推定される。

【００１６】ア）ＭＩ−１０１株 １．形態学的性質 形態：桿菌 胞子 ：形成する（楕円形、位置：端立〜亜端立、胞子
嚢：非膨出） グラム染色性：陽性 運動性：なし

【００１７】２．生理的性質 酸素に対する態度 ：好気性 嫌気下での生育 ：生育せず カタラーゼ ：陽性 Ｖ−Ｐ反応 ：陰性 Ｖ−ＰブロスのｐＨ：５．６ グルコースからの酸の生成 ：陽性 グルコースからのガスの生成：陰性 ゼラチンの液化 ：陽性 デンプンの分解 ：陽性 クエン酸塩の利用 ：陰性 プロピオン酸塩の利用：陰性 卵黄反応 ：陰性 硝酸塩の還元 ：陽性 pH6.8での生育(ニュートリエントフ゛ロス)：陽性 pH5.7での生育 ：陰性 5%NaCl存在下での生育 ：陰性 7%NaCl存在下での生育 ：陰性 10℃での生育 ：陰性 30℃での生育 ：陰性 40℃での生育 ：陽性 55℃での生育 ：陽性 65℃での生育 ：陽性 70℃での生育 ：陽性 マレイン酸異性化酵素活性 ：あり 菌体内DNAのGC含量（モル%） ：42 %

【００１８】以上の菌学的諸性質を、バージェイズ・マ
ニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー
（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Vol.
2,［P.H.A.Sneath, N.S.Mair, M.E.Sharpe and J.G.Hol
(1986)Williams & Wilkins］）に従って調べたところ、
バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearot
hermophilus）に属する新規の菌株であることが判明し
た。本発明者らは、本菌をバチルス・サーモフィラスＭ
Ｉ−１０１株と命名した。尚、本菌は生命工学工業技術
研究所に受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１４８０１として寄
託されている。

【００１９】イ）ＭＩ−１０２株 １．形態学的性質 形態：桿菌 胞子 ：形成する（楕円形、位置：端立〜亜端立、胞子
嚢：非膨出） グラム染色性：陽性 運動性：あり

【００２０】２．生理的性質 酸素に対する態度 ：好気性 嫌気下での生育 ：生育せず カタラーゼ ：陽性 Ｖ−Ｐ反応 ：微弱 Ｖ−ＰブロスのｐＨ：５．５ グルコースからの酸の生成 ：陽性 グルコースからのガスの生成：陰性 ゼラチンの液化 ：陽性 デンプンの分解 ：陽性 クエン酸塩の利用 ：陽性 プロピオン酸塩の利用：陰性 卵黄反応 ：陰性 硝酸塩の還元 ：陽性 pH6.8での生育(ニュートリエントフ゛ロス)：陽性 pH5.7での生育 ：陽性 5%NaCl存在下での生育 ：陰性 7%NaCl存在下での生育 ：陰性 10℃での生育 ：陰性 30℃での生育 ：陰性 40℃での生育 ：陽性 55℃での生育 ：陽性 65℃での生育 ：陽性 70℃での生育 ：陽性 マレイン酸異性化酵素活性 ：あり 菌体内DNAのGC含量（モル%） ：54 %

【００２１】以上の菌学的諸性質を、バージェイズ・マ
ニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー
に従って調べたところ、バチルス・ステアロサーモフィ
ラス（Bacillus stearothermophilus）に属する新規の
菌株であることが判明した。本発明者らは、本菌をバチ
ルス・サーモフィラスＭＩ−１０２株と命名した。尚、
本菌は生命工学工業技術研究所に受託番号：ＦＥＲＭ
Ｐ−１４８０２として寄託されている。

【００２２】ウ）ＭＩ−１０３株 １．形態学的性質 形態：桿菌 胞子 ：形成する（楕円形、位置：端立〜亜端立、胞子
嚢：わずかに膨出） グラム染色性：陽性 運動性：あり

【００２３】２．生理的性質 酸素に対する態度 ：好気性 嫌気下での生育 ：生育せず カタラーゼ ：陽性 Ｖ−Ｐ反応 ：陰性 Ｖ−ＰブロスのｐＨ：７．２ グルコースからの酸の生成 ：陽性 グルコースからのガスの生成：陰性 ゼラチンの液化 ：陰性 デンプンの分解 ：陰性 クエン酸塩の利用 ：陽性 プロピオン酸塩の利用：陽性 卵黄反応 ：陰性 硝酸塩の還元 ：陽性 pH6.8での生育(ニュートリエントフ゛ロス)：陽性 pH5.7での生育 ：陰性 5%NaCl存在下での生育 ：陰性 7%NaCl存在下での生育 ：陰性 10℃での生育 ：陰性 30℃での生育 ：陽性 40℃での生育 ：陽性 55℃での生育 ：陽性 65℃での生育 ：陰性 70℃での生育 ：陰性 マレイン酸異性化酵素活性 ：あり 菌体内DNAのGC含量（モル%） ：51 %

【００２４】以上の菌学的諸性質を、バージェイズ・マ
ニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー
に従って調べたところ、バチルス・ブレビス（Bacillus
brevis）に属する新規の菌株であることが判明した。
本発明者らは、本菌をバチルス・ブレビスＭＩ−１０３
株と命名した。尚、本菌は生命工学工業技術研究所に受
託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１４８０３として寄託されてい
る。

【００２５】エ）ＭＩ−１０４株 １．形態学的性質 形態：桿菌 胞子 ：形成する（楕円形、位置：端立〜亜端立、胞子
嚢：わずかに膨出）。

【００２６】グラム染色性：陽性 運動性：あり

【００２７】２．生理的性質 酸素に対する態度 ：好気性 嫌気下での生育 ：生育せず カタラーゼ ：陽性 Ｖ−Ｐ反応 ：陰性 Ｖ−ＰブロスのｐＨ：７．２ グルコースからの酸の生成 ：陽性 グルコースからのガスの生成：陰性 ゼラチンの液化 ：陰性 デンプンの分解 ：陰性 クエン酸塩の利用 ：陽性 プロピオン酸塩の利用：陽性 卵黄反応 ：陰性 硝酸塩の還元 ：陽性 pH6.8での生育(ニュートリエントフ゛ロス)：陽性 pH5.7での生育 ：陰性 5%NaCl存在下での生育 ：陰性 7%NaCl存在下での生育 ：陰性 10℃での生育 ：陰性 30℃での生育 ：陽性 40℃での生育 ：陽性 55℃での生育 ：陽性 65℃での生育 ：陰性 マレイン酸異性化酵素活性 ：あり 菌体内DNAのGC含量（モル%） ：50 %

【００２８】以上の菌学的諸性質を、バージェイズ・マ
ニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー
に従って調べたところ、バチルス・ブレビス（Bacillus
brevis）に属する新規の菌株であることが判明した。
本発明者らは、本菌をバチルス・ブレビスＭＩ−１０４
株と命名した。尚、本菌は生命工学工業技術研究所に受
託寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１４８０４として寄託され
ている。

【００２９】オ）ＭＩ−１０５株 １．形態学的性質 形態：桿菌 胞子 ：形成する（楕円形、位置：端立〜亜端立、胞子
嚢：わずかに膨出）。

【００３０】グラム染色性：陽性 運動性：あり

【００３１】２．生理的性質 酸素に対する態度 ：好気性 カタラーゼ ：陽性 30℃での生育 ：陰性 40℃での生育 ：陽性 55℃での生育 ：陽性 マレイン酸異性化酵素活性 ：あり

【００３２】以上の菌学的諸性質を、バージェイズ・マ
ニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー
に従って調べたところ、バチルス（Bacillus）属に属す
る新規の菌株であることが判明した。本発明者らは、本
菌をバチルス エスピーＭＩ−１０５株と命名した。
尚、本菌は生命工学工業技術研究所に受託番号：ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１４８０５として寄託されている。

【００３３】以下に本発明の微生物を用いマレイン酸異
性化酵素を製造させ、マレイン酸を異性化しフマル酸を
生成させる方法の一例を説明する。

【００３４】（３）マレイン酸異性化酵素の生産、及び
マレイン酸異性化酵素を用いたマレイン酸からのフマル
酸の製造 前記（２）のようにして分離したマレイン酸異性化酵素
活性を有する微生物菌体、またはこの微生物の培養物か
ら採取したマレイン酸異性化酵素の粗酵素画分もしくは
精製酵素をマレイン酸を含有する水性溶液に加えること
により、マレイン酸を異性化してフマル酸を生成せしめ
ることができる。ここで培養物とは、該微生物菌体又は
／及び培養後の培地（培地に液体培地を用いた場合には
その培養上清）をいう。

【００３５】本発明のマレイン酸のフマル酸への異性化
反応に用いられるマレイン酸異性化酵素としては、上記
培養菌体を培養した培養液から分離した菌体はもちろん
のこと、培養液、菌体の破砕物もしくは抽出物等も用い
ることができる。また、微生物菌体より得られる粗酵素
標品を用いてもよく、更に精製した酵素標品を使用して
もよい。更に、上記微生物菌体、その破砕物もしくは抽
出物、または精製酵素を担体に固定化したものも使用す
ることができる。本発明において、「微生物菌体、また
はマレイン酸異性化酵素の粗酵素画分もしくは精製酵素
をマレイン酸を含有する水性溶液に加える」とは、微生
物菌体又はマレイン酸異性化酵素を含有する水性溶液に
マレイン酸を加えること、更には、上記のような固定化
菌体又は固定化酵素を充填したカラムにマレイン酸を含
有する水性溶液を通液することを含む概念である。

【００３６】マレイン酸異性化酵素活性を有する微生物
の培養は、炭素源、窒素源、無機塩、各種ビタミン等を
含む通常の栄養培地で行うことができ、炭素源として
は、例えばマレイン酸、ブドウ糖、ショ糖、果糖、麦芽
糖等の糖類、エタノール、メタノール等のアルコール
類、クエン酸、マレイン酸等の有機酸類、廃糖蜜等、好
ましくはマレイン酸あるいはマレイン酸とその他の炭素
源を混合して用いられる。窒素源としては、例えばアン
モニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ア
ンモニウム、尿素等がそれぞれ単独もしくは混合して用
いられる。また、無機塩としては、例えばリン酸一水素
カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム等
が用いられる。この他にペプトン、肉エキス、酵母エキ
ス、コーンステイープリカー、カザミノ酸、ビオチン等
の各種ビタミン等の栄養素を培地に添加することができ
る。更に、マレイン酸、マロン酸、タートロン酸、シト
ラコン酸、メサコン酸等をマレイン酸異性化酵素の誘導
物質として培地に添加してもよい。

【００３７】培養条件は、通常、通気撹拌、振とう等の
好気条件下に、マレイン酸異性化酵素活性を有する微生
物の生育し得る温度であれば特に制限はなく、また、培
養途中のｐＨについても該微生物が生育し得るｐＨであ
れば特に制限はない。培養中のｐＨ調整は、酸またはア
ルカリを添加して行うことができる。

【００３８】かくして得られる培養物から遠心分離等に
より菌体を集めることにより、マレイン酸異性化酵素を
含有する菌体を取得することができる。微生物菌体から
マレイン酸異性化酵素を抽出、精製する方法は、公知の
酵素の精製法のいずれの方法も適用できる。例えば、菌
体の破壊法としては、超音波破砕、フレンチプレス、ホ
モジナイザー等を用いた機械的破壊法、リゾチームなど
を用いた酵素的破壊法を用いることができる。このよう
にして得られた菌体破壊物の可溶性画分またはその分画
物は、マレイン酸異性化酵素の粗酵素画分として使用す
ることができる。また、この粗酵素画分をさらに精製し
て得られる精製酵素を用いてもよい。粗酵素画分からの
マレイン酸異性化酵素の精製は、通常、（イ）沈澱法に
よる分離、例えば硫安沈澱法、（ロ）クロマトグラフィ
ーによる分離、例えばイオン交換クロマトグラフィー、
アフィニティー吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過クロ
マトグラフィー等、（ハ）電気泳動法による分離法、及
びこれらの方法の任意の組み合わせによって、実施する
ことができる。その一例は、試験例１に詳述する。

【００３９】上記の精製過程におけるマレイン酸異性化
酵素を含む画分の検出は、マレイン酸異性化酵素活性
を、大塚らの方法〔Agric. Biol. Chem., Vol.25, p.72
6 (1961)〕に従い、ブタ心臓由来フマラーゼ存在下、基
質マレイン酸の減少を２４０ｎｍの吸光度減少として測
定することにより、行うことができる。また、マレイン
酸異性化酵素活性は、W. Scher法によっても測定するこ
とができる。すなわち、精製したマレイン酸異性化酵素
を、反応液〔組成：２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ７．２）、０．５ｍＭジチオスレイトール、１０
ｍＭマレイン酸二ナトリウム〕に加え、各温度において
フマル酸の生成速度を２９０ｎｍの吸光度の増加速度と
して分光光度計を用いて１０分間測定することにより、
マレイン酸異性化酵素の比活性を求めることができる。

【００４０】精製されたマレイン酸異性化酵素の純度及
び分子量は、Davis法〔B. J. Davis, Ann. N. Y. Acad.
Sci., Vol.121, p.404 (1964)〕、あるいはLaemmli法
〔U.K. Laemmli, Nature, Vol.227, p.680 (1970)〕に
よるポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、このゲル
を、例えばクマシーブルー色素液〔組成：０．２％（ｖ
／ｖ）クマシーブリリアントブルーＲ２５０、４０％
（ｖ／ｖ）メタノール、１０％（ｖ／ｖ）酢酸〕、ある
いは市販の銀染色キット（例えば、和光純薬製）を用い
て染色し、タンパク質を検出することによって知ること
ができる。

【００４１】前記のようにして得られるマレイン酸異性
化酵素を産生する微生物の菌体を担体に固定化する場合
には、培養物から回収されたまま、あるいは適当な緩衝
液、例えば０．０２〜０．２Ｍ程度のリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６〜１０）等で洗浄された菌体を使用することができ
る。また、微生物菌体から上記のようにして抽出、精製
されたマレイン酸異性化酵素の粗酵素画分または精製酵
素を担体に固定化したものも、本発明のフマル酸の製造
方法に使用することができる。

【００４２】これら菌体、菌体破砕物、抽出物または精
製物の固定化は、それ自体既知の通常用いられている方
法に従い、アクリルアミドモノマー、アルギン酸、また
はカラギーナン等の適当な担体に固定化させる方法によ
り行うことができる。

【００４３】マレイン酸の異性化反応に用いる水性溶液
は、マレイン酸を含有する水溶液または適当な緩衝液、
例えば０．０２〜０．２Ｍ程度のリン酸緩衝液（ｐＨ６
〜１０）とすることができる。この水性溶液には、更に
菌体の細胞膜の物質透過性を高める目的で、トルエン、
キシレン、非イオン性界面活性剤等を０．０５〜２％
（ｗ／ｖ）添加することもできる。

【００４４】水性溶液中の反応原料となるマレイン酸濃
度は、０．１〜２Ｍ程度が適当である。マレイン酸の形
態は、酸あるいは塩の形態のみならず、その無水物物を
用いることもできる。無水マレイン酸は水溶液とするこ
とにより容易にマレイン酸に変換する。マレイン酸の塩
としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、アンモニ
ウム塩等を挙げることができる。

【００４５】上記の水性溶液における酵素反応温度およ
びｐＨは特に限定されないが、通常１０〜６０℃、好ま
しくは３０〜５０℃が適当であり、反応液中のｐＨは５
〜１０、好ましくは６〜９付近とすることができる。ま
た、ｐＨの調整は、酸またはアルカリを添加して行うこ
とができる。特に本発明の方法によれば、常温はもちろ
んのこと、４０℃を越える高温下でも安定したマレイン
酸の異性化反応を行うことができる。

【００４６】かくして得られるフマル酸を含有する水溶
液は、そのままファインケミカルズなどの各種有用物質
の製造原料として用いることができる。例えば、マレイ
ン酸の異性化反応を行った同一反応槽あるいは別途の反
応槽において、フマル酸を基質とする各種酵素あるいは
これらを含む菌体、例えばフマラーゼ、アスパルターゼ
等あるいはこれらの酵素を含む菌体を添加することによ
り、リンゴ酸、アスパラギン酸、アラニン等を製造する
こともできる。

【００４７】例えば、本発明のマレイン酸異性化酵素を
マレイン酸を含む水溶液に作用させた後、アンモニアイ
オン共存下にてアスパルターゼ（EC 4.3.1.1）を作用さ
せることによりアスパラギン酸を生成せしめることがで
きる。更に、このアスパラギン酸を含む水溶液にアスパ
ラギン酸脱炭酸酵素を作用させることによりアラニンを
生成せしめることができる。

【００４８】また、本発明のマレイン酸異性化酵素によ
り生成したフマル酸を含む水溶液にフマラーゼを作用さ
せることによりリンゴ酸を生成せしめることができる。
ここでいうアスパルターゼ、アスパラギン酸脱炭酸酵
素、フマラーゼとしては、これらの酵素活性を有してい
ればいずれの生物的起源のものも用いることができ、こ
れらの酵素を含有する細胞体、またはこれらの酵素の粗
酵素画分もしくは精製酵素など、酵素反応を行うことが
できれば、これまで公知のいずれの方法によっても作用
させることができる。

【００４９】上記の方法で生成したフマル酸は、限外濾
過膜分離、遠心分離等により、菌体およびその処理物と
分離した後、硫酸等電点沈澱法等の公知の方法で沈澱さ
せ、さらに水洗、乾燥することにより、結晶として採取
することができる。

【００５０】次に、本発明の微生物が産生するマレイン
酸異性化酵素の性質について、試験例により説明する。

【００５１】〔試験例１〕バチルス・ステγロサーモフ
ィラスＭＩ−１０１株が産生するマレイン酸異性化酵素
の精製および５０℃以上における酵素活性の測定 （１）マレイン酸異性化酵素の精製 ５Ｌ容ジャーファーメンターに、培地Ａ［組成：マレイ
ン酸二ナトリウム ５ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．７ｇ、Ｋ₂
ＨＰＯ₄ １．４ｇ、ＮＨ₄ＮＯ₃ １ｇ、ＭｇＳＯ₄・７
Ｈ₂Ｏ ０．２ｇ、ビオチン ０．２ｍｇ、チアミン・
塩酸塩 ０．２ｍｇ、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ２０ｍｇ、
ＭｎＳＯ₄ ２０ｍｇ、蒸留水 １Ｌ（ｐＨ７．２）］
３Ｌを入れ、１２１℃にて２０分間減菌処理したものに
後記実施例１で単離されたＭＩ−１０１株を植菌し、５
０℃にて２４時間振とう培養した。培養後、遠心分離
（３，０００×ｇ、４℃、２０分間）により培養液より
菌体を回収し、緩衝液Ａ［組成：２００ｍＭ リン酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ７．２）、０．５ｍＭ ジチオレイ
トール(threo-1,4-dimercapto-2,3-butanediol)］で洗
浄した。

【００５２】得られた菌体を再度緩衝液Ａに懸濁し、約
３０％（ｗ／ｖ）の菌体懸濁液を超音波破砕器（ブラン
ソン社）にかけ菌体を破壊した。次いで、この菌体破壊
物を遠心分離（１２，０００×ｇ，４℃、３０分間）に
かけ、マレイン酸異性化酵素を含有する粗酵素液として
上清を回収した。

【００５３】得られた粗酵素液につき、２．２％（ｗ／
ｖ）となるようにストレプトマイシン硫酸塩を添加し、
除核酸した後、常法により３０〜７０％硫安沈澱画分を
回収し、上記緩衝液Ａ（４℃）中にて一夜透析した。得
られた硫安画分を、緩衝液Ａにて平衡化したＤＥＡＥ-
Ｓｅｐｈａｃｅｌ（ファルマシア社）カラム（直径２．
６ｃｍ×３０ｃｍ）に吸着させ、同緩衝液Ａにて十分洗
浄後、塩化カリウムの直線濃度勾配（０〜０．２Ｍ）に
よって溶出した。尚、流速は２ｍｌ／分とし、各フラク
ションは１０ｍｌずつ分取した。マレイン酸異性化酵素
画分の検出は、マレイン酸異性化酵素活性を大塚らの方
法［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２
５，ｐ．７２６（１９６１）］に従い、ブタ心臓由来フ
マラーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）存在下で、４
５℃における基質マレイン酸の減少を、２４０ｎｍの吸
光度減少として分光光度計（ベッグマン社ＤＵ７５０
０）を用いて測定することにより行った。

【００５４】得られた活性画分を、限外濾過装置（東洋
濾紙製ＵＨＰ−４３Ｋ、分画分子量２０，０００）によ
り濃縮後、緩衝液Ａで平衡化されたゲル濾過カラム（フ
ァルマシア社製Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００、φ
ｌ．６×６０ｃｍ）にのせ、流速０．５ｍｌで溶出し
た。活性画分は上記と同様な方法で検出した。次に、得
られた活性画分を、緩衝液Ａで平衡化された陰イオン交
換カラム（ファルマシア社製Ｍｏｎｏ-Ｑ、φ１×１０
ｃｍ）にのせ、塩化カリウムの直線濃度勾配（０〜１
Ｍ）によって溶出し、得られた活性画分をマレイン酸異
性化酵素の精製画分とした。

【００５５】このマレイン酸異性化酵素の精製画分を、
前記のＤａｖｉｓ法およびＬａｅｍｍｌｉ法によるポリ
アクリルアミドゲル電気泳動にかけ、クマシーブルー色
素液［組成：０．２％（ｗ／ｖ）クマシーブリリアント
ブル−Ｒ２５０、４０％（ｖ／ｖ）メタノール、１０％
（ｖ／ｖ）酢酸］により染色したところ、いずれの方法
においても、ほぼ単一のバンドが検出された。

【００５６】（２）マレイン酸異性化酵素の活性測定 緩衝液Ａ １８５０μｌに、上記（１）で得られた精製
マレイン酸異性化酵素液５０μｌを加え、５０℃に保温
し、２００ｍＭマレイン酸二ナトリウム溶液１００μｌ
を添加混合することにより反応を開始した。反応速度
は、２９０ｎｍの吸光度増加速度を５分間、分光光度計
（ベックマン社製ＤＵ−７５００）で測定することによ
り、フマル酸生成速度とした。同様にして、４０℃、６
０℃における反応速度を測定した。各温度におけるマレ
イン酸異性化酵素活性は、５０℃における反応速度を１
００とした場合の相対活性として算出し、結果を表１に
示した。

【００５７】

【表１】

【００５８】表１の結果により、マレイン酸異性化酵素
の最大活性は、５０℃以上であることが確認された。

【００５９】〔試験例２〕バチルス・ステアロサーモフ
ィラスＭＩ−１０２株が産生するマレイン酸異性化酵素
の精製および５０℃以上における活性の測定 （１）マレイン酸異性化酵素の精製 試験例１と同様に、後記実施例１で単離されたＭＩ−１
０２株を培養し、得られた菌体により粗酵素液を調製
後、マレイン酸異性化酵素を精製し、精製画分を得た。

【００６０】（２）マレイン酸異性化酵素の活性測定 試験例１と同様に、上記（１）で得られた精製マレイン
酸異性化酵素画分につき、４０℃、５０℃、６０℃にお
けるマレイン酸異性化酵素活性を測定した。各温度にお
ける活性値は、５０℃における反応速度を１００とした
場合の相対活性として算出し、結果を表２に示した。

【００６１】

【表２】

【００６２】表２の結果により、マレイン酸異性化酵素
の最大活性は、５０℃以上であることが確認された。

【００６３】〔試験例３〕バチルス・ブレビスＭＩ−１
０３株が産生するマレイン酸異性化酵素の精製および５
０℃以上における活性の測定 （１）マレイン酸異性化酵素の精製 試験例１と同様に、後記実施例１で単離されたＭＩ−１
０３株を培養し、得られた菌体より粗酵素液を調製後、
マレイン酸異性化酵素を精製し、精製画分を得た。

【００６４】（２）マレイン酸異性化酵素の活性測定 試験例１と同様に、上記（１）で得られた精製マレイン
酸異性化酵素画分につき、４０℃、５０℃、６０℃にお
けるマレイン酸異性化酵素活性を測定した。各温度にお
ける活性値破、５０℃における反応速度を１００とした
場合の相対活性として算出し、結果を表３に示した。

【００６５】

【表３】

【００６６】表３の結果により、マレイン酸異性化酵素
の最大活性は、５０℃以上であることが確認された。

【００６７】〔試験例４〕バチルス・ブレビスＭＩ−１
０４株が産生するマレイン酸異性化酵素の精製および５
０℃以上における活性の測定 （１）マレイン酸異性化酵素の精製 試験例１と同様に、後記実施例１で単離されたＭＩ−１
０４株を培養し、得られた菌体より粗酵素液を調製後、
マレイン酸異性化酵素を精製し、精製画分を得た。

【００６８】（２）マレイン酸異性化酵素の精製 試験例１と同様に、上記（１）で得られた精製マレイン
酸異性化酵素画分につき、４０℃、５０℃、６０℃にお
けるマレイン酸異性化酵素活性を測定した。各温度にお
ける活性値は、５０℃における反応速度を１００とした
場合の相対活性として算出し、結果を表４に示した。

【００６９】

【表４】

【００７０】表４の結果により、マレイン酸異性化酵素
の最大活性は、５０℃であることが確認された。

【００７１】〔試験例５〕バチルス・エスピーＭＩ−１
０５株が産生するマレイン酸異性化酵素の精製および５
０℃における活性の測定 （１）マレイン酸異性化酵素の精製 試験例１と同様に、後記実施例１で単離されたＭＩ−１
０５株を培養し、得られた菌体より粗酵素液を調製後、
マレイン酸異性化酵素を精製し、精製画分を得た。

【００７２】（２）マレイン酸異性化酵素の精製 試験例１と同様に、上記（１）で得られた精製マレイン
酸異性化酵素画分につき、４０℃、５０℃、６０℃にお
けるマレイン酸異性化酵素活性を測定した。各温度にお
ける活性値は、５０℃における反応速度を１００とした
場合の相対活性として算出し、結果を表５に示した。

【００７３】

【表５】

【００７４】表５の結果により、マレイン酸異性化酵素
の最大活性は、５０℃であることが確認された。以上に
本発明を説明してきたが、下記の実施例により更に具体
的に説明する。しかしながら、実施例は本発明の具体的
な認識を得る一助とみなすべきのものであり、本発明の
範囲を何等限定するものではない。

【００７５】

【実施例】

〔実施例１〕マレイン酸異性化酵素活性を有する微生物
の分離 （１）マレイン酸資化性微生物の分離 自然界から採取した土壌試料を、培地Ａ［組成：マレイ
ン酸二ナトリウム ５ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．７ｇ、Ｋ₂
ＨＰＯ₄ １．４ｇ、ＮＨ₄ＮＯ₃ １ｇ、ＭｇＳＯ₄・７
Ｈ₂Ｏ ０．２ｇ、ビオチン ０．２ｍｇ、チアミン・
塩酸塩 ０．２ｍｇ、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ２０ｍｇ、
ＭｎＳＯ₄ ２０ｍｇ、蒸留水 １Ｌ（ｐＨ７．２）］
１０ｍｌに投入し、５０℃にて３日間好気的に振とう培
養し、この培養物１ｍｌを上記培地Ａ１０ｍｌに植え継
ぎ、更に３日間同様に振とう培養した。培養後の培養物
を寒天２％を含む上記培地Ａの組成を有する平板培地に
塗抹し、５０℃にて２日間培養した。この平板培地上に
生育したコロニーを単離した。

【００７６】（２）マレイン酸異性化酵素活性を有する
微生物の選定 上記（１）で単離された微生物を前記培地Ａ１００ｍｌ
を用い、５０℃にて１日振とう培養し、遠心分離（３，
０００×ｇ、４℃、２０分間）により菌体を回収後、
０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌで洗浄した。次いでこの洗
浄菌体を上記ＮａＣｌ液１ｍｌに懸濁し、反応液Ａ［組
成：マレイン酸ナトリウム ８４ｇ／ｌ、Triton X-100
１ｇ／ｌ］１ｍｌを添加後、５０℃にて一夜振とうし、
遠心分離により上清液を回収した。得られた反応上清液
について、有機酸分析カラム（島津製作所製ＳＣＲ−１
０１Ｈカラム）、ＵＶ検出器（２１０ｎｍ）を用いた高
速液体クロマトグラフィー分析（島津社製、ＬＣ-５
Ａ）に供した。上記（１）で分離された微生物の内、マ
レイン酸異性化酵素活性を有する微生物は、原料マレイ
ン酸のピークの他にフマル酸のピークが生じている微生
物として選出した。

【００７７】上記分離操作により得られたマレイン酸異
性化酵素活性を有する微生物のうちの５株について、前
期の如く更に菌学的諸性質を調べた結果、いずれも新規
菌株であることが判明し、それぞれバチルス・ステアロ
サーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）ＭＩ-
１０１株、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacill
us stearothermophilus）ＭＩ-１０２株、バチルス・ブ
レビス（Bacillus brevis）ＭＩ-１０３株、バチルス・
ブレビス（Bacillus brevis）ＭＩ-１０４株、バチルス
・エスピー（Bacillus sp.）ＭＩ-１０５株と命名し
た。

【００７８】〔実施例２〕バチルス・ステアロサーモフ
ィラスＭＩ-１０１によるフマル酸の製造 ５Ｌ容ジャーファーメンターに前記培地Ａ ３Ｌを入れ
１２１℃にて２０分間滅菌処理したものに、上記実施例
１で単離されたＭＩ-１０１株を植菌し、５０℃にて１
日振とう培養した。培養後、遠心分離（３，０００×
ｇ、４℃、２０分間）により培養液より菌体を回収し、
０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌで洗浄した。次いでこの洗
浄菌体５ｇ（湿重量）を０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ液
５０ｍｌに懸濁し、反応液Ａ［組成：マレイン酸ナトリ
ウム ８４ｇ／ｌ、Triton X-100 １ｇ／ｌ］５０ｍｌを
添加後、４５℃にて２４時間振とうした。反応終了後、
遠心分離により上清液を回収し、得られた反応上清液を
有機酸分析カラム（島津製作所製ＳＣＲ−１０１Ｈカラ
ム）、ＵＶ検出器（２１０ｎｍ）を用いた高速液体クロ
マトグラフィー分析（島津社製、ＬＣ-５Ａ）に供し
た。その結果、２３ｇ／Ｌのフマル酸が生成しているこ
とを確認した。尚、生成フマル酸の定量は、ピメリン酸
を内部標準物質として用いて行った。

【００７９】また、上記の反応液に濃硫酸を添加して酸
性にすることにより、約２．２ｇのフマル酸の結晶を得
た。

【００８０】〔実施例３〕バチルス・ステアロサーモフ
ィラスＭＩ-１０２によるフマル酸の製造 上記実施例２と同様に、上記実施例１で単離されたＭＩ
-１０２株を植菌し、５０℃にて１日振とう培養し、遠
心分離により菌体を回収後、０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣ
ｌで洗浄した。次いでこの洗浄菌体５ｇ（湿重量）を
０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ液５０ｍｌに懸濁し、上記
反応液Ａ ５０ｍｌを添加後、４５℃にて２４時間振と
うした。反応終了後、得られた反応上清液について、上
記実施例２と同様に高速液体クロマトグラフィー分析
（島津社製、ＬＣ-５Ａ）に供した。その結果、２５ｇ
／Ｌのフマル酸が生成していることを確認した。

【００８１】また、上記の反応液に濃硫酸を添加して酸
性にすることにより、約２．３ｇのフマル酸の結晶を得
た。

【００８２】〔実施例４〕バチルス・ブレビスＭＩ-１
０３によるフマル酸の製造 上記実施例２と同様に、上記実施例１で単離されたＭＩ
-１０３株を植菌し、５０℃にて１日振とう培養し、遠
心分離により菌体を回収後、０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣ
ｌで洗浄した。次いでこの洗浄菌体５ｇ（湿重量）を
０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ液５０ｍｌに懸濁し、上記
反応液Ａ ５０ｍｌを添加後、４５℃にて２４時間振と
うした。反応終了後、得られた反応上清液について、上
記実施例２と同様に高速液体クロマトグラフィー分析
（島津社製、ＬＣ-５Ａ）に供した。その結果、２０ｇ
／Ｌのフマル酸が生成していることを確認した。

【００８３】また、上記の反応液に濃硫酸を添加して酸
性にすることにより、約１．９ｇのフマル酸の結晶を得
た。

【００８４】〔実施例５〕バチルス・ブレビスＭＩ-１
０４によるフマル酸の製造 上記実施例２と同様に、上記実施例１で単離されたＭＩ
-１０４株を植菌し、５０℃にて１日振とう培養し、遠
心分離により菌体を回収後、０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣ
ｌで洗浄した。次いでこの洗浄菌体５ｇ（湿重量）を
０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ液５０ｍｌに懸濁し、上記
反応液Ａ ５０ｍｌを添加後、４５℃にて２４時間振と
うした。反応終了後、得られた反応上清液について、上
記実施例２と同様に高速液体クロマトグラフィー分析
（島津社製、ＬＣ-５Ａ）に供した。その結果、１９ｇ
／Ｌのフマル酸が生成していることを確認した。

【００８５】また、上記の反応液に濃硫酸を添加して酸
性にすることにより、約２．１ｇのフマル酸の結晶を得
た。

【００８６】〔実施例６〕バチルス・エスピーＭＩ-１
０５であるフマル酸の製造 上記実施例２と同様に、上記実施例１で単離されたＭＩ
-１０５株を植菌し、５０℃にて１日振とう培養し、遠
心分離により菌体を回収後、０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣ
ｌで洗浄した。次いでこの洗浄菌体５ｇ（湿重量）を
０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ液５０ｍｌに懸濁し、上記
反応液Ａ ５０ｍｌを添加後、４５℃にて２４時間振と
うした。反応終了後、得られた反応上清液について、上
記実施例２と同様に高速液体クロマトグラフィー分析
（島津社製、ＬＣ-５Ａ）に供した。その結果、２３ｇ
／Ｌのフマル酸が生成していることを確認した。

【００８７】また、上記の反応液に濃硫酸を添加して酸
性にすることにより、約２３ｇのフマル酸の結晶を得
た。

【００８８】〔参考例１〕バチルス・ステアロサーモフ
ィラスＭＩ-１０１を用いたマレイン酸からのアスパラ
ギン酸の製造 ５Ｌ容ジャーファーメンターに前記培地Ａ ３Ｌを入れ
１２１℃にて２０分間滅菌処理したものに、上記実施例
１で単離されたＭＩ-１０１株を植菌し、５０℃にて１
日振とう培養した。培養後、遠心分離（３，０００×
ｇ、４℃、２０分間）により培養液より菌体を回収し、
０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌで洗浄した。

【００８９】一方、アスパルターゼ活性を有する微生物
であるブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium
flavum）ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）
を培地Ｂ ３Ｌ［組成：尿素 ２ｇ，（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ７
ｇ，Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０.５ｇ，ＫＨ₂ＰＯ₄ ０.５ｇ, Ｍｇ
ＳＯ₄ ０.５ｇ, ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ６ｍｇ，ＭｎＳ
Ｏ₄・４〜６Ｈ₂Ｏ ６ｍｇ，酵母エキス ２.５ｇ，カザ
ミノ酸 ５ｇ，ビオチン２００μｇ，塩酸チアミン ２０
０μｇ，グルコース ２０ｇ，蒸留水 １Ｌ ］を用いて
３０℃にて対数増殖期後期まで同様に培養し、遠心分離
により菌体を集め、０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌで洗浄
した。

【００９０】次いで、得られた上記のＭＩ−１０１株お
よびＭＪ−２３３株のそれぞれの洗浄菌体各５ｇ（湿重
量）を０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ液５０ｍｌに懸濁
し、反応液［組成：マレイン酸 ３０ｇ、２５％アンモ
ニア水 ４０ｍｌ、Triton X-100 ０．５ｇ、蒸留水
１Ｌ］５０ｍｌを添加後、４５℃にて２４時間振とうし
た。反応終了後、遠心分離により上清液を回収し、得ら
れた反応上清液を薄層クロマトグラフィー［展開溶媒
n-ブタノール：酢酸：水＝４：１：１（容量比）、発色
剤：ニンヒドリン試薬］に供した。その結果、約２５ｇ
／Ｌのアスパラギン酸が生成していることを確認した。

【００９１】

【発明の効果】本発明により、常温条件下ではもちろん
のこと、高温条件下においてもマレイン酸からフマル酸
を効率よく、安定的に製造することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央８−３−１三菱化 学株式会社筑波研究所内

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ５０℃以上で最大活性を示すマレイン酸
   異性化酵素を産生する微生物の菌体、またはこの微生物
   の培養物から採取したマレイン酸異性化酵素の粗酵素画
   分もしくは精製酵素をマレイン酸を含有する水性溶液に
   加え、マレイン酸を異性化してフマル酸を生成せしめる
   ことを特徴とするフマル酸の製造方法。
2. 【請求項２】 前記微生物が、４０℃を越える温度で生
   育可能なバチルス属に属する微生物である請求項１記載
   のフマル酸の製造方法。
3. 【請求項３】 前記微生物がバチルス・ステアロサーモ
   フィラス（Bacillusstearothermophilus）である請求項
   ２記載のフマル酸の製造方法。
4. 【請求項４】 前記微生物が、バチルス・ブレビス（Ba
   cillus brevis）である請求項２記載のフマル酸の製造
   方法。
5. 【請求項５】 前記微生物がバチルス・ステアロサーモ
   フィラス（Bacillusstearothermophilus）ＭＩ-１０１
   である請求項３記載のフマル酸の製造方法。
6. 【請求項６】 前記微生物が、バチルス・ステアロサー
   モフィラス（Bacillus stearothermophilus）ＭＩ-１０
   ２である請求項３記載のフマル酸の製造方法。
7. 【請求項７】 前記微生物が、バチルス・ブレビス（Ba
   cillus brevis）ＭＩ-１０３である請求項４記載のフマ
   ル酸の製造方法。
8. 【請求項８】 前記微生物が、バチルス・ブレビス（Ba
   cillus brevis）ＭＩ-１０４である請求項４記載のフマ
   ル酸の製造方法。
9. 【請求項９】 前記微生物が、バチルス・エスピー（Ba
   cillus sp.）ＭＩ-１０５である請求項２記載のフマル
   酸の製造方法。