JPH08269091A - 新規ペプチド及びそれを有効成分とする骨疾患治療薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 骨疾患治療薬として有用な新規物質を提供す
ること。 【構成】 配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列
を有するペプチド及びその誘導体であって骨芽細胞に対
する増殖促進作用及び活性促進作用を有するペプチドを
提供した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規なペプチド及びそ
れを有効成分として含有する骨疾患治療薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】生体内には数多くの生理活性物質が存在
し、生体の正常な生命活動の維持に密接に関与している
ことは周知の事実である。それらの生体内生理活性物質
及び合成生理活性物質はそれら自身、新しい医薬として
の可能性を有すると共に、新たな医薬を開発するための
知見を提供するものでもある。従って、これらの生理活
性物質の探索は極めて重要なものである。

【０００３】一方、骨粗鬆症のような骨疾患の治療に
は、現在、カルシトニン、女性ホルモン及び活性化ビタ
ミンＤ3 等が用いられているが、その治療効果は必ずし
も満足できるものではない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、骨疾
患治療薬として有用な新規物質を提供することである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者は、骨形成に関
与する骨芽細胞に対し、その細胞の活性を促進する物質
を探索している際にこの作用を有する新規なペプチドを
見出し本発明を完成した。

【０００６】すなわち、本発明は、配列表の配列番号１
で示されるアミノ酸配列を有するペプチド及びその誘導
体であって骨芽細胞に対する増殖促進作用及び活性促進
作用を有するペプチドを提供する。また、本発明は、上
記本発明のペプチドを有効成分として含有する骨疾患治
療薬を提供する。

【０００７】以下、本発明を詳細に説明する。

【０００８】本発明のペプチドは、基本的に配列表の配
列番号１で示されるアミノ酸配列を有する。

【０００９】さらに、本発明の範囲には、配列表の配列
番号１で示されるアミノ酸配列を有する上記ペプチドに
加え、該ペプチドの誘導体であって骨芽細胞に対する増
殖促進作用及び活性促進作用を有するペプチドも包含さ
れる。例えば、上記ペプチドに、上記作用を損なわない
化学的な修飾を加えたものはここで言う「誘導体」に包
含される。例えば、ペプチドのＣ末端のカルボキシル基
をアミノ基に変えることにより生体内での安定性が高め
られることが知られているが、このような化学修飾を施
したものも本発明の範囲に含まれる。

【００１０】さらに、一般に生理活性を有するペプチド
において、その少数のアミノ酸が他のアミノ酸に置換
し、少数のアミノ酸が付加され、又は少数のアミノ酸が
欠失した場合でも、その生理活性が維持される場合があ
ることは当業者に周知の事実である。従って、本発明の
範囲には、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する
上記ペプチドを構成するアミノ酸のうち、少数のアミノ
酸が他のアミノ酸に置換し、少数のアミノ酸が付加さ
れ、又は少数のアミノ酸が欠失したものも本願発明で言
う「誘導体」に包含され、これらのうち、骨芽細胞に対
する増殖促進作用及び活性促進作用を有するペプチドは
本発明の範囲に含まれる。例えば、５個以下のアミノ酸
が付加、置換又は欠失したもの及びアミノ酸配列の相同
性が７０％以上であって骨芽細胞に対する増殖促進作用
及び活性促進作用を有するペプチドは本発明の範囲に含
まれる。なお、ペプチド誘導体が骨芽細胞に対する増殖
促進作用及び活性促進作用を有するか否かは、下記実施
例２及び４に記載した方法により調べることができる。

【００１１】配列番号１で示される本発明のペプチド
は、構成アミノ酸数が１６個と比較的小さいので、常法
に基づき化学合成により容易に製造することができる。
例えば、市販のペプチド合成機を用いて容易に製造する
ことができる。あるいは、該アミノ酸配列をコードする
ＤＮＡをＤＮＡ合成機により合成し、これを市販のクロ
ーニングベクターのクローニング部位に挿入し、これで
宿主微生物を形質転換し、培養するという、常法の遺伝
子工学的手法によっても容易に製造することができる。

【００１２】下記実施例において実験的に確認されたよ
うに、本発明のペプチドは骨芽細胞に対する増殖促進作
用及び活性促進作用を有する。従って、本発明のペプチ
ドは、骨粗鬆症のような骨疾患の治療薬として有用であ
る。本発明のペプチドにより治療可能な骨疾患として
は、骨粗鬆症の他に骨軟化症等を例示することができ
る。

【００１３】本発明のペプチドは、分子量も比較的小さ
いので、静脈投与、皮下投与及び筋肉内投与の他、製剤
化技術により経口投与及び経皮投与も可能である。

【００１４】投与量は、患者の状態に応じて適宜判断さ
れるが、通常、大人１日当たり、本発明のペプチド０．
１〜１０ｍｇ程度である。

【００１５】また、静脈内投与、皮下投与及び筋肉内投
与の場合、本発明のペプチドを、くえん酸緩衝液（ｐＨ
４〜６）又は酢酸緩衝液（ｐＨ４〜６）のような弱酸性
の緩衝液に溶解して投与することが好ましい。この場
合、緩衝液中のペプチドの濃度は通常０．１ｍｇ／ｍｌ
〜１０ｍｇ／ｍｌ程度である。また、経口投与及び経皮
投与の場合には、脂溶性の物質（例えば、ワセリン等）
に溶解し、吸収性の向上を図ることが望ましい。この場
合、本発明のペプチドの濃度は通常０．１ｍｇ／ｍｌ〜
１００ｍｇ／ｍｌ程度である。

【００１６】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。

【００１７】実施例１ ペプチドの製造 市販のペプチド合成機を用い、配列番号１に示されるア
ミノ酸配列を有するペプチドを合成した。

【００１８】実施例２ 骨芽細胞増殖促進作用 骨芽細胞であるラット由来ＲＯＳ細胞（入手先：ＡＴＣ
Ｃ）を１０％牛胎児血清を含むＦ１０培地（入手先：大
日本製薬）にて培養し、５％炭酸ガス加湿３７℃恒温器
内にて育成した。トリプシン処理により２４穴培養プレ
ートに１ｘ１０5 個／穴（well）蒔種し、コンフルーエ
ントになったところで培地を１％牛胎児血清Ｆ１０培地
に交換し、２４時間培養した。その後、実施例１で製造
した本発明のペプチドを１％牛胎児血清Ｆ１０培地に溶
解し、容量を変化させながらｗｅｌｌに加えてさらに２
４時間培養を継続した。培養後、本ペプチドによる細胞
の増殖促進効果をＭＴＴアッセイにより測定し、非処理
群に対する増殖促進効果を求めた。なお、ＭＴＴアッセ
イ及び増殖促進率の算出は具体的には次のように行っ
た。フナコシ（株）より市販されているＭＴＦ−Ｃｅｌ
ｌ−Ｇｒｏｗｔｈ Ａｓｓａｙ ｋｉｔの手順に従い、
本物質を用量を変化させながらウェルに加え一昼夜放置
後、生細胞のミトコンドリア中に存在する酵素によりＭ
ＴＴ（3-4,5Dimethylthiazol-2YL)-2,5Diphenyl Tetraz
olium bromide が暗青色のホルマザンに開裂する現象を
利用し比色法にて生細胞を計数した。本物質を加えない
対照群を１００％とし用量を変化させて加えた群の比色
度を求めると次のようになった。結果を下記表１に示
す。

【００１９】

【表１】

【００２０】表１から明らかなように、本発明のペプチ
ドは、骨芽細胞に対し増殖促進的に作用することが確認
された。従って、本発明のペプチドは骨量の増加に結び
つくものと考えられ、骨粗鬆症等の骨疾患の治療に対し
有用である。

【００２１】実施例３ 本ペプチドに対する骨芽細胞上
の受容体の存在 本ペプチドが骨芽細胞に対し増殖促進作用があることが
判明したことにより、骨芽細胞が本ペプチドに対する受
容体を持っていることが推察される。もし受容体が存在
するならば本ペプチドは生命にとり根源的な物質である
ことが考えられ、次に骨芽細胞に受容体が存在するか否
かを調査した。

【００２２】実施例１で得られたペプチドをビオチンで
標識し、実施例２と同様に培養したＲＯＳ細胞に一定量
に標識した本ペプチドを加え、さらに競合反応をさせる
ために非標識の本ペプチドを１０％牛胎児血清Ｆ１０培
地に溶解し、容量を変化させながら加えて競合反応を見
た。この実験操作は具体的には次のように行った。ＳＵ
ＭＩＬＯＮ社製の蛋白ビオチン化標識キットの手順に従
い本ペプチドをビオチン化し、ウェルに播種された一定
数の細胞に対し一定量のビオチン化ペプチドを加え非標
識ペプチド０〜０．５１２μｇ／wellを各々加え競合反
応を６時間行い、その後、細胞をＰＢＳにて洗浄しスト
レプトアビジンで標識したペルオキシダーゼで細胞表面
にある受容体に結合したビオチン化ペプチドに反応して
発色反応を見る。細胞表面に本ペプチドの受容体が存在
すれば非標識のペプチドと競合反応が起こり発色強度は
低下する。結果を下記表２に示す。

【００２３】

【表２】

【００２４】表２に示されるように、非標識体の添加量
に依存して加えた標識体に対する割合が変化しているの
で、骨芽細胞が本ペプチドに対する受容体を持っている
ことは明らかであり、本物質が根源的な役割を担ってい
ることが推察される。

【００２５】急性毒性試験 実施例１で作製したペプチドについて、ｄｄｙ雄性マウ
ス（体重４０〜４５ｇ）を用い、その急性毒性を試験し
た。本ペプチドを生理食塩水（ｐＨ６．０）に溶解し、
これをマウスの尾静脈より投与し、１４日間観察した。
投与量は１、１０、１００μｇ／ｋｇとした。この結果
を下記表３に示す。

【００２６】

【表３】

【００２７】以上の様に、１００μｇ／ｋｇまでの範囲
では死亡例は認められなかった。

【００２８】

【発明の効果】本発明により、新規なペプチドが提供さ
れた。本発明のペプチドは、上記実施例により実験的に
確認されたように、骨芽細胞に対し増殖促進作用及び活
性促進作用を有しており、骨疾患治療薬としての作用が
あることが明らかになった。

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１６ 配列の型：アミノ酸 配列 Lys Leu Thr Thr Ile Phe Pro Leu Asn Trp Lys Tyr Arg Lys Ala Leu 1 5 10 15

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１で示されるアミノ酸
   配列を有するペプチド及びその誘導体であって骨芽細胞
   に対する増殖促進作用及び活性促進作用を有するペプチ
   ド。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号１で示されるアミノ酸
   配列を有する請求項１記載のペプチド。
3. 【請求項３】 請求項１又は２記載のペプチドを有効成
   分として含有する骨疾患治療薬。