JPH09227590A - ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 高いオピオイド活性を有していて、少量の投
与で、鎮痛、麻酔、情動、記憶、呼吸、脈動、体温、消
化管機能、摂食、免疫、インシュリンやソマトスタチン
等のホルモンの分泌調節、電解質の吸収促進、心筋の収
縮調節機能を示し、鎮痛麻酔剤、催眠剤、抗健忘剤、抗
不安剤、消化管ホルモン分泌促進剤、電解質の吸収促進
剤、胃腸輸送筋収縮による下痢改善剤等として利用でき
る物質を提供すること。 【解決手段】 式：Xaa−Tyr−Tyr−Pro−Thr（式中Xaa
はD-AlaまたはD-Ser）で表される本発明のペプチド及び
その塩、式：D-Ala−Tyr−Tyr−Pro−Thr-NH₂で表され
る本発明のペプチド及びその塩、並びに式：D-Ala−Tyr
−Tyr−Proで表される本発明のペプチド及びその塩は、
高いオピオイド活性を有しており、上記の目的のために
有効に使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、オピオイド活性を
有するペプチドおよびその塩、並びに当該ペプチドおよ
びその塩を有効成分として含むオピオイド活性を有する
剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】食品中には高次の生命活動に関与する多
数の生体調節因子が存在することが広く知られるように
なっており、それらの生体調節因子を健康の増進、病気
の予防や治療、老化の予防等に積極的に利用することが
近年色々試みられるようになっている。そのような生体
調節因子としては神経系、消化吸収系、循環系、生体防
御・免疫系、内分泌系、細胞分化・増殖系等に作用する
種々の因子が知られている。それらのうちで、ある種の
食品蛋白質中には神経系に作用してモルヒネ様の麻酔、
鎮痛作用等（いわゆるオピオイド活性）を有するペプチ
ド単位が存在していることが明らかになっており、その
ようなペプチドはオピオイドペプチドと一般に称されて
いる。

【０００３】オピオイドペプチドは消化管や消化管ホル
モン分泌に対して影響を有することが知られており、小
麦グルテンの分解物を経口投与した場合に食物の腸内滞
留時間の延長、血中のインシュリンやソマトスタチン量
の上昇等のオピオイド活性を示すということが報告され
ている。このような知見をベースとして、本発明者らは
小麦グルテンを加水分解し、その生成物からオピオイド
活性を有する新規なペプチドを分取することができ、先
に出願した（特開平５−８６０９４号公報）。

【０００４】

【発明の内容】上記のような状況下に、本発明者らはオ
ピオイド活性を有するペプチドについて更に研究を進め
てきた。その結果、本発明者らが先に発明した上記の特
開平５−８６０９４号公報に記載している配列番号４で
表されるペプチドにおいて、そのＮ末端のアミノ酸であ
るグリシン（Gly）をＤ−アラニン（D-Ala）またはＤ−
セリン（D-Ser）で置換して得られる配列番号１で表さ
れるペプチドが配列番号４で表されるペプチドに比べて
一層高いオピオイド活性を有していることを見出した。
さらに、本発明者らは、今回本発明者らの見出した配列
番号１で表されるペプチドにおいて、そのＮ末端がＤ−
アラニン（D-Ala）であるペプチドのＣ末端をアミド化
した得られる配列番号２で表されるペプチドも高いオピ
オイド活性を有することを見出した。またさらに、上記
の特開平５−８６０９４号公報に記載されている配列番
号５で表されるペプチドにおいて、そのＮ末端のアミノ
酸であるグリシン（Gly）をＤ−アラニン（D-Ala）で置
換して得られる配列番号３で表されるペプチドも高いオ
ピオイド活性を有することを見出し、それらの知見に基
づいて本発明を完成した。

【０００５】したがって、本発明は、配列番号１で表さ
れるペプチドおよびその塩（ただし配列番号１において
位置１のXaaはD-AlaまたはD-Serを表す）である。

【０００６】そして、本発明は、配列番号２で表される
Ｃ末端がアミド化されたペプチドおよびその塩（ただし
配列番号２において位置１のXaaはD-Ala、位置５のXaa
はアミド化されたThrを表す）である。

【０００７】さらに、本発明は、配列番号３で表される
ペプチドおよびその塩（ただし配列番号３において位置
１のXaaはD-Alaを表す）である。

【０００８】またさらに、本発明は、配列番号１で表さ
れるペプチドおよびその塩（ただし配列番号１において
位置１のXaaはD-AlaまたはD-Serを表す）、配列番号２
で表されるＣ末端がアミド化されたペプチドおよび塩
（ただし配列番号２において位置１のXaaはD-Ala、位置
５のXaaはアミド化されたThrを表す）並びに配列番号３
で表されるペプチドおよびその塩（ただし配列番号３に
おいて位置１のXaaはD-Alaを表す）の１種または２種以
上を有効成分として含むオピオイド活性を有する剤であ
る。

【０００９】

【発明の実施の形態】以下に本発明について詳細に説明
する。配列番号１で表されるペプチドは、そのＮ末端か
ら順にXaa（Ｄ−アラニンまたはＤ−セリン）、チロシ
ン(Tyr）、チロシン(Tyr）、プロリン（Pro）およびト
レオニン（Thr）の５個のアミノ酸が結合しているペン
タペプチドである。そして、配列番号２で表されるペプ
チドは、そのＮ末端から順にＤ−アラニン（D-Ala）、
チロシン(Tyr）、チロシン(Tyr）、プロリン（Pro）お
よびトレオニン（Thr）の５個のアミノ酸が結合し、そ
のＣ末端のトレオニン（Thr）がアミド化されているペ
ンタペプチドである。さらに、配列番号３で表されるペ
プチドは、そのＮ末端から順にＤ−アラニン（D-Al
a）、チロシン(Tyr）、チロシン(Tyr）およびプロリン
（Pro）の４個のアミノ酸が結合しているテトラペプチ
ドである。

【００１０】配列番号１または配列番号２で表される本
発明のペプチドにおいては、そのＮ末端のアミノ酸がＤ
−アラニンまたはＤ−セリンであることが必要である
が、残りの４個のアミノ酸は、Ｌ−アミノ酸およびＤ−
アミノ酸のいずれでもよい。例えば、残りの４個のアミ
ノ酸の全部がＬ−アミノ酸からなっていてもまたはＤ−
アミノ酸のみからなっていてもよく、或は残りの４個の
アミノ酸のうちのいずれかがＬ−アミノ酸でそれ以外が
Ｄ−アミノ酸からなっていてもよい。また、配列番号３
で表される本発明のペプチドにおいて、そのＮ末端のア
ミノ酸がＤ−アラニンであることが必要であるが、残り
の３個のアミノ酸は、Ｌ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸
のいずれでもよい。例えば、残りの３個のアミノ酸の全
部がＬ−アミノ酸からなっていてもまたはＤ−アミノ酸
のみからなっていてもよく、或は残りの３個のアミノ酸
のうちのいずれかがＬ−アミノ酸でそれ以外がＤ−アミ
ノ酸からなっていてもよい。そして、いずれのペプチド
も化学合成によって容易に製造することができる。

【００１１】また、本発明における「オピオイド活性を
有する剤」とは、鎮痛、麻酔、鎮静、情動、記憶、呼
吸、脈動、体温、消化管機能、摂食、免疫、インシュリ
ンやソマトスタチン等のホルモンの分泌調節、電解質の
吸収促進、心筋の収縮調節等に関与するいわゆるオピオ
イド活性として認識されている活性を有する剤をいう。

【００１２】本発明のペプチドおよびその塩は、配列番
号１、配列番号２または配列番号３で表されるアミノ酸
配列を有する限りどのような方法で製造してもよい。本
発明のペプチドの製造法の例を配列番号１における位置
１のXaaがＤ−アラニンである配列番号６で表されるペ
プチドを例に挙げて以下に説明する。

【００１３】配列番号６で表される本発明のペプチドの
製造法 米国バイオサーチ社のＳＡＭ ＴＷＯ 型自動ペプチド合
成装置を使用して同装置の標準プロトコールにしたがっ
て合成を行う。すなわち、Boc（ブトキシカルボニル)−
Thr(Bzl)−樹脂を４５％トリフルオロ酢酸を含むデブロ
ック液で処理した後に、Boc−Proをジイソプロピルカル
ボジイミドの存在下でカップリングさせる。以下、上記
と同様にデブロッキングした後に、Boc−Tyr(Cl₂−Bz
l)、Boc−Tyr(Cl₂−Bzl)およびBoc−D-Alaを順次カップ
リングさせて、Boc−D-Ala−Tyr(Cl₂−Bzl)−Tyr(Cl₂−
Bzl)−Pro−Thr(Bzl)−樹脂を得る。このペプチド樹脂
を１０％アニソールを含むフッ化水素中に入れて０℃で
１時間撹拌する。フッ化水素を留去した後、エーテルで
残渣を洗浄し、３０％酢酸でペプチドを抽出する。抽出
して得た粗ペプチドをＯＤＳカラムによる高速液体クロ
マトグラフィーを使用することにより、配列番号６で表
されるペプチドを得る。また、本発明のペプチドである
配列番号７で表されるペプチド、配列番号２で表される
ペプチドおよび配列番号３で表されるペプチドも上記と
同様の操作により合成および精製することにより得られ
る。

【００１４】そして、配列番号１、配列番号２または配
列番号３で表される本発明のペプチドおよびその塩は、
オピオイド活性を有しているので、それらのペプチドお
よびその塩を有効成分として含有する剤は、例えば、鎮
痛麻酔剤、催眠剤、抗健忘剤、抗不安剤、消化管ホルモ
ン促進剤、電解質吸収促進剤、腸管ぜん動抑制による下
痢改善剤等として、人間および種々の動物に投与するこ
とができ、特に鎮痛剤、鎮静麻酔剤、催眠剤、抗健忘
剤、抗不安剤として有効である。 その際に、配列番号１、配列番号２および配列番号３で
表される本発明のペプチドおよびその塩は、１種類のみ
を使用してもまたは２種以上のペプチドを含む混合物の
形態で使用してもよい。本発明のオピオイド活性を有す
る剤の好適な投与量は、投与される人間や動物の年令、
体重、性別、症状、動物の種類等の種々の条件によって
異なり得る。

【００１５】そして、本発明のオピオイド活性を有する
剤は経口および非経口のいずれによっても投与可能であ
り、更に単独で投与しても、また製薬工業において通常
使用されている固体担体や液状担体と一緒に投与しても
よく、或は他の薬剤と混合または組合わせて使用するこ
ともできる。また投与形態は、錠剤、丸剤、顆粒剤、カ
プセル、散剤、水溶液、注射剤等の任意の形態が可能で
ある。

【００１６】

【実施例】以下に、本発明を例を挙げて具体的に説明す
るが本発明はそれらによって限定されない。 《実施例 １》 （１） 配列番号６で表されるペプチドを以下の方法で
合成した。市販のBoc(ブトキシカルボニル)−Thr（Bz
l）−樹脂(置換率０.３ｍｅｑ／ｇ)１ｇと４５％トリフ
ルオロ酢酸および２.５％アニソールを含む塩化メチレ
ン２０ｍｌをバイオサーチ社のペプチド合成装置 ＳＡ
Ｍ ＴＷＯの反応槽の中で室温で２５分間反応させてBoc
基を除去した。次にBoc基の除去されたThr（Bzl）−樹
脂を塩化メチレンで洗浄し、次いで１０％のジイソプロ
ピルエチルアミンを含む塩化メチレンにより中和した
後、更に塩化メチレンで洗浄した。この樹脂に０.４Ｍ
Boc−Proのジメチルホルムアミド溶液５ｍｌ、０．４Ｍ
ジイソプロピルカルボジイミドの塩化メチレン溶液５ｍ
ｌを混合して反応槽に入れて室温で２時間撹拌下に反応
させた。

【００１７】（２） 上記（１）で得られた樹脂を、順
にジメチルホルムアミド、塩化メチレン、ジイソプロピ
ルエチルアミンを１０％含有する塩化メチレン、塩化メ
チレン、および塩化メチレン／ジメチルホルムアミド混
合液で洗浄して、Boc−Pro−Thr（Bzl）−樹脂を得た。
引き続き上記と同様にして、Boc基の除去、Bocアミノ酸
のカップリングを繰り返して、Boc−D-Ala−Tyr（Cl₂−
Bzl）−Tyr（Cl₂−Bzl）−Pro−Thr（Bzl）−樹脂から
なる生成物を得た。

【００１８】（３） 上記（２）で得られた生成物を１
０％のアニソールを含有するフッ化水素２０ｍｌに入れ
て０℃で２時間撹拌してペプチドを樹脂から遊離させ
た。その後、フッ化水素を減圧留去し、残渣を３０％酢
酸で抽出し、凍結乾燥して粗ペプチド１２０ｍｇを得
た。これをナカライテスク株式会社製のオクタデシルシ
ラン（ＯＤＳ）カラムであるＣｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ₁₈
−ＡＲを用いた逆相クロマトグラフィーにより精製して
最終生成物３０ｍｇを得た。

【００１９】（４） 上記（３）で得られた最終生成物
のアミノ酸組成を常法により調べたところ、そのアミノ
酸組成（モル比）は、Ala：Tyr：Pro：Thr＝１：２：
１：１であった。更にアプライドシステム社製のプロテ
インシーケンサー４７７−Ａ型により分析したところ、
配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するペプチドで
あることが判明した。またシリカゲルプレートによる薄
層クロマトグラフィーでＲｆ値を求めたところ、ブタノ
ール：酢酸：ピリジン：水＝１５：３：１０：１２の展
開溶媒を使用した場合の該生成物の薄層クロマトグラフ
ィーのＲｆ値は０．６４であった。

【００２０】《実施例 ２》配列番号７で表されるペプ
チドの場合も、配列番号６で表されるペプチドの場合と
同様にして、市販のBoc−Thr（Bzl）−樹脂(置換率０．
３ｍｅｑ／ｇ)０．８ｇから最終生成物３０ｍｇを得
た。そのアミノ酸組成（モル比）は、Ser：Tyr：Pro：T
hr＝１：２：１：１であった。そして実施例１で使用し
たプロテインシーケンサーにより分析したところ、配列
番号７で表されるアミノ酸配列を有するペプチドである
ことが判明した。また実施例１と同様にして求めたこの
生成物の薄層クロマトグラフィーのＲｆ値は０．５９で
あった。

【００２１】《実施例 ３》配列番号２で表されるペプ
チドの場合は、市販のメチルベンズヒドリルアミン樹脂
(置換率０．２５ｍｅｑ／ｇ)０．８ｇに、０．４Ｍ Boc
−Thr（Bzl）のジメチルホルムアミド溶液５ｍｌ、０．
４Ｍジイソプロピルカルボジイミドの塩化メチレン溶液
５ｍｌを混合して反応槽に入れて室温で２時間撹拌下に
反応させ、以下配列番号６で表されるペプチドの場合と
同様にして最終生成物２５ｍｇを得た。そのアミノ酸組
成（モル比）は、Ala：Tyr：Pro：Thr＝１：２：１：１
であった。そして実施例１で使用したプロテインシーケ
ンサーにより分析したところ、配列番号２で表されるア
ミノ酸配列を有するペプチドであることが判明した。ま
た実施例１と同様にして求めたこの生成物の薄層クロマ
トグラフィーのＲｆ値は０．７４であった。

【００２２】《実施例 ４》配列番号３で表されるペプ
チドの場合は配列番号６で表されるペプチドの場合と同
様にして、市販のBoc−Pro−樹脂（置換率０．４ｍｅｑ
／ｇ）０．７５ｇから最終生成物３５ｍｇを得た。その
アミノ酸組成（モル比）は、Ala：Tyr：Pro＝１：２：
１であった。そして実施例１で使用したプロテインシー
ケンサーにより分析シタところ、配列番号３で表される
アミノ酸配列を有するペプチドであることが判明した。
また実施例１と同様にして求めたこの生成物の薄層クロ
マトグラフィーのＲｆ値は０．６５であった。

【００２３】上記の実施例１〜４で得られた配列番号
６、配列番号７、配列番号２および配列番号３で表され
るペプチドのオピオイド活性を次のようにして測定した
ところ、下記の表１に示すとおりであった。また、下記
の表１には参考のため、本出願人の出願に係る上記した
特開平５−８６０９４号で得られた配列番号４で表され
るペプチドおよび配列番号５で表されるペプチドのオピ
オイド活性を併記する。

【００２４】オピオイド活性の測定法 体重３０〜３５ｇのＩＣＲ系の雄マウスより摘出した２
本の輸精管をアイソトニックトランスデューサー（日本
光電工業株式会社製:ＴＢ ６１２−Ｔ）に接続して０.
２ｇの張力をかける。３６℃に保温した２ｍｌ容量のマ
グヌス管内に、Ｋrebs等張液（ＮａＣｌ １１８ｍＭ、
ＫＣｌ ４．７５ｍＭ、ＣａＣｌ₂ ２．５４ｍＭ、Ｎａ
ＨＣＯ₃ ２５ｍＭ、ＫＨ_２ＰＯ₄ １．１９ｍＭ、グルコ
ース１１ｍＭ）を満たしたものの中に輸精管を浸して、
ボンベから通気（０₂ ９５％:ＣＯ₂５％）を行った。こ
のようにして約２時間安定化させた後、３０Ｖで１ｍse
cの電気刺激を与え、マウス輸精管を電気収縮させた。
電気収縮が安定した後、アミノペプチダーゼ阻害剤等を
含むインヒビター５０μｌを加え、上記の実施例１〜４
で得られた配列番号６、配列番号７、配列番号２および
配列番号３で表されるペプチドを添加し、マウス輸精管
の電気収縮の変化をレコーダーで記録した。オピオイド
活性はペプチド添加後の電気収縮の抑制と１０^-４Ｍナ
ロキソン２０μｌ添加による抑制の解除によって判定し
た。そしてマウス輸精管の電気収縮を５０％抑制する濃
度(ＩＣ₅₀)を測定した。

【００２５】

【表１】 ペプチドの種類 オピオイド活性(ＩＣ₅₀)(μＭ) 配列番号６のペプチド（本発明） １．２ 配列番号７のペプチド（本発明） ８．１ 配列番号２のペプチド（本発明） １３．９ 配列番号３のペプチド（本発明） １７．０ 配列番号４のペプチド（参考） ４０．０ 配列番号５のペプチド（参考） ７０．０

【００２６】上記の表１の結果から、配列番号１、配列
番号２または配列番号３で表される本発明のペプチド
（すなわち配列番号６、配列番号７、配列番号２および
配列番号３で表されるペプチド）は、高いオピオイド活
性を有している本出願人が先に発明した配列番号４およ
び配列番号５で表されるペプチドと比べた場合に、それ
よりも一層低い濃度でＩＣ₅₀を達成でき、したがって一
層高いオピオイド活性を有することがわかる。

【００２７】

【発明の効果】配列番号１で表される本発明のペプチ
ド、配列番号２で表される本発明のペプチドおよび配列
番号３で表される本発明のペプチド並びにそれらの塩
は、高いオピオイド活性を有しているので、該ペプチド
およびその塩を有効成分とする剤は極めて少量の投与
で、鎮痛、麻酔、情動、記憶、呼吸、脈動、体温、消化
管機能、摂食、免疫、インシュリンやソマトスタチン等
のホルモンの分泌調節、電解質の吸収促進、心筋の収縮
調節機能を示す可能性があるため、鎮痛麻酔剤、催眠
剤、抗健忘剤、抗不安剤、消化管ホルモン分泌促進剤、
電解質の吸収促進剤、胃腸輸送筋収縮による下痢改善剤
としての利用が期待でき、特に鎮痛麻酔剤、鎮静剤、抗
健忘剤、抗不安剤としての効果が大きい。そして、本発
明のペプチドおよびその塩は５個または４個のアミノ酸
が配列しただけの極めて簡単な構造を有する低分子量化
合物であるので、化学合成によって簡単に製造すること
ができる。

【００２８】

【配列表】

【００２９】配列番号：１ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 特徴を表す記号：Xaa 存在位置：１ 他の情報：XaaはD-AlaまたはD-Ser

【００３０】配列番号：２ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 特徴を表す記号：Xaa 存在位置：１ 他の情報：XaaはD-Ala 特徴を表す記号：Xaa 存在位置：５ 他の情報：Xaaはアミド化されたThr

【００３１】配列番号：３ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 特徴を表す記号：Xaa 存在位置：１ 他の情報：XaaはD-Ala

【００３２】配列番号：４ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【００３３】配列番号：５ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【００３４】配列番号：６ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 特徴を表す記号：Xaa 存在位置：１ 他の情報：XaaはD-Ala

【００３５】配列番号：７ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 特徴を表す記号：Xaa 存在位置：１ 他の情報：XaaはD-Ser

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 7/06 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＡＱ // Ｃ０７Ｋ 105:00

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１で表されるペプチドおよびそ
   の塩（ただし配列番号１において位置１のXaaはD-Alaま
   たはD-Serを表す）。
2. 【請求項２】 配列番号２で表されるＣ末端がアミド化
   されたペプチドおよびその塩（ただし配列番号２におい
   て位置１のXaaはD-Ala、位置５のXaaはアミド化されたT
   hrを表す）。
3. 【請求項３】 配列番号３で表されるペプチドおよびそ
   の塩（ただし配列番号３において位置１のXaaはD-Alaを
   表す）。
4. 【請求項４】 配列番号１で表されるペプチドおよびそ
   の塩（ただし配列番号１において位置１のXaaはD-Alaま
   たはD-Serを表す）、配列番号２で表されるＣ末端がア
   ミド化されたペプチドおよび塩（ただし配列番号２にお
   いて位置１のXaaはD-Ala、位置５のXaaはアミド化され
   たThrを表す）並びに配列番号３で表されるペプチドお
   よびその塩（ただし配列番号３において位置１のXaaはD
   -Alaを表す）の１種または２種以上を有効成分として含
   むオピオイド活性を有する剤。