JPH0827258B2 - 塩基配列決定装置 - Google Patents
塩基配列決定装置Info
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- JPH0827258B2 JPH0827258B2 JP3299917A JP29991791A JPH0827258B2 JP H0827258 B2 JPH0827258 B2 JP H0827258B2 JP 3299917 A JP3299917 A JP 3299917A JP 29991791 A JP29991791 A JP 29991791A JP H0827258 B2 JPH0827258 B2 JP H0827258B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は蛍光プライマー（標識と
して螢光物質を化学結合させたプライマー）を用いサン
ガーの方法で前処理された核酸断片試料を、ゲル電気泳
動装置のスラブ状ゲルのサンプル投入部に末端塩基別に
投入して同時に泳動させ、泳動方向と直交する方向に走
査される励起・検出系によって泳動途中で蛍光を検出し
て、データ処理装置で塩基配列を決定するオンライン式
の塩基配列決定装置に関するものである。
して螢光物質を化学結合させたプライマー）を用いサン
ガーの方法で前処理された核酸断片試料を、ゲル電気泳
動装置のスラブ状ゲルのサンプル投入部に末端塩基別に
投入して同時に泳動させ、泳動方向と直交する方向に走
査される励起・検出系によって泳動途中で蛍光を検出し
て、データ処理装置で塩基配列を決定するオンライン式
の塩基配列決定装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】スラブ状ゲルを用いたオンライン式の塩
基配列決定装置では、予めサンガー法によって処理した
核酸断片にその末端塩基の種類Ａ（アデニン）、Ｇ（グ
アニン）、Ｔ（チミン）、Ｃ（シトシン）に応じて別々
の泳動レーンで電気泳動させる。一般に、ゲル電気泳動
装置では泳動レーンによって泳動速度が異なる、いわゆ
るスマイリングと呼ばれる現象が生じる。スマイリング
が生じると、単に末端塩基Ａ，Ｇ，Ｔ，Ｃ別の泳動レー
ンの信号を順に読み取って塩基配列を決定したのでは、
配列の逆転を生じて配列の誤読に至る。
基配列決定装置では、予めサンガー法によって処理した
核酸断片にその末端塩基の種類Ａ（アデニン）、Ｇ（グ
アニン）、Ｔ（チミン）、Ｃ（シトシン）に応じて別々
の泳動レーンで電気泳動させる。一般に、ゲル電気泳動
装置では泳動レーンによって泳動速度が異なる、いわゆ
るスマイリングと呼ばれる現象が生じる。スマイリング
が生じると、単に末端塩基Ａ，Ｇ，Ｔ，Ｃ別の泳動レー
ンの信号を順に読み取って塩基配列を決定したのでは、
配列の逆転を生じて配列の誤読に至る。
【０００３】このスマイリングが生じる主な原因は、泳
動によるジュール熱の発生に起因する泳動レーンの温度
分布であると考えられている。そのため、スマイリング
を防止する方法として、泳動板に金属板を密着させて温
度の均一化を図ったり、泳動板を密閉可能な容器に収容
し、一定温度に制御した空気を流すことによって温度を
均一化する方法（特開平２−１４３１４５号公報参照）
などが検討されている。
動によるジュール熱の発生に起因する泳動レーンの温度
分布であると考えられている。そのため、スマイリング
を防止する方法として、泳動板に金属板を密着させて温
度の均一化を図ったり、泳動板を密閉可能な容器に収容
し、一定温度に制御した空気を流すことによって温度を
均一化する方法（特開平２−１４３１４５号公報参照）
などが検討されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】温度制御によりスマイ
リングを防止しようとすれば、例えば５００塩基と５０
１塩基との泳動度差は０.２％（＝１／５００）である
が、温度制御によってスマイリングによる泳動度差を
０.２％以下に抑えるためには、０.１℃以下の温度ムラ
に抑える必要があり、現実には困難である。また、泳動
ゲル中には触媒として電解質の過硫酸アンモニウムが含
まれていて、泳動に従ってこれが外部の電極バッファ側
に出てくるが、この電解質の濃度が場所により不均一で
ある場合には泳動レーンによりイオン強度の差ができ、
結果的にスマイリングを生じる。電解質濃度の不均一に
基づくスマイリングは温度制御によっては防止すること
はできない。
リングを防止しようとすれば、例えば５００塩基と５０
１塩基との泳動度差は０.２％（＝１／５００）である
が、温度制御によってスマイリングによる泳動度差を
０.２％以下に抑えるためには、０.１℃以下の温度ムラ
に抑える必要があり、現実には困難である。また、泳動
ゲル中には触媒として電解質の過硫酸アンモニウムが含
まれていて、泳動に従ってこれが外部の電極バッファ側
に出てくるが、この電解質の濃度が場所により不均一で
ある場合には泳動レーンによりイオン強度の差ができ、
結果的にスマイリングを生じる。電解質濃度の不均一に
基づくスマイリングは温度制御によっては防止すること
はできない。
【０００５】塩基配列の誤読につながる問題としては、
スマイリングの他にサンプル投入スロットの泳動レーン
による不均一も挙げられる。オンライン式の蛍光ＤＮＡ
配列決定装置について考えると、その泳動距離（サンプ
ル投入スロットと検出部との距離）は通常２００〜５０
０ｍｍ程度である。サンプル投入スロットの所ではゲル
作成時の水平度の悪さやスロット内での尿素の侵入など
により、サンプル投入部での１〜２ｍｍのサンプル位置
のずれは容易にあり得る。サンプル投入スロットでの１
ｍｍの差は泳動距離を５００ｍｍとしても０.２％（１
／５００）に相当し、これは５００塩基と５０１塩基の
泳動度の差に匹敵する。このような泳動度差はもとより
温度制御によっては防止することはできない。
スマイリングの他にサンプル投入スロットの泳動レーン
による不均一も挙げられる。オンライン式の蛍光ＤＮＡ
配列決定装置について考えると、その泳動距離（サンプ
ル投入スロットと検出部との距離）は通常２００〜５０
０ｍｍ程度である。サンプル投入スロットの所ではゲル
作成時の水平度の悪さやスロット内での尿素の侵入など
により、サンプル投入部での１〜２ｍｍのサンプル位置
のずれは容易にあり得る。サンプル投入スロットでの１
ｍｍの差は泳動距離を５００ｍｍとしても０.２％（１
／５００）に相当し、これは５００塩基と５０１塩基の
泳動度の差に匹敵する。このような泳動度差はもとより
温度制御によっては防止することはできない。
【０００６】本発明はスマイリングやその他の原因によ
ってレーン間に泳動度の差が存在しても、正しく塩基配
列を決定することのできる塩基配列決定装置を提供する
ことを目的とするものである。
ってレーン間に泳動度の差が存在しても、正しく塩基配
列を決定することのできる塩基配列決定装置を提供する
ことを目的とするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明の塩基配列決定装
置のデータ処理装置は、図１に示されるように、各泳動
レーンからの信号を時間に対して記憶する信号記憶手段
４０と、各泳動レーンについて信号の極大値を与える時
刻を検出する極大信号時刻検出手段４２と、その極大信
号時刻を記憶する極大信号時刻記憶手段４４と、４泳動
レーンのうちの１つを基準レーンとし、基準レーンの２
つの極大信号間に出現した他の３泳動レーンの極大信号
に対して泳動レーン間に移動度の差がないと仮定して基
準レーンの時間軸でそれらの極大信号の出現時刻を算出
する出現時刻推定手段４６と、出現時刻推定手段４６で
算出された前記３泳動レーンの極大信号時刻と現実の極
大信号時刻との比から較正係数を算出する較正係数算出
手段４８と、算出された較正係数を用い、較正係数の計
算に使用した時間領域以外の時間領域の信号の時間軸を
変換する手段１０１と、変換後の信号の出現時間間隔が
均一であるかどうかにより較正係数の妥当性を判定する
手段１０２と、妥当と判定された較正係数で前記３泳動
レーンの全時間軸を較正する全時間軸較正手段５０と、
較正された時間軸にもとづく４泳動レーンの極大信号時
刻から塩基配列を決定する塩基配列決定手段５２とを備
えている。出現時刻推定手段４６は、例えば基準レーン
の２つの極大信号間に他の３泳動レーンの極大信号が時
間的に等間隔で出現するとして計算を行なう。１０３は
手段１０２の判定の結果、その較正係数が妥当でないと
判定されたときに、計算領域を変えて較正係数を再計算
する手段である。１０４は設定された基準レーンについ
て他のレーンの較正係数が全て妥当と判定されないとき
に基準レーンを変更する手段である。
置のデータ処理装置は、図１に示されるように、各泳動
レーンからの信号を時間に対して記憶する信号記憶手段
４０と、各泳動レーンについて信号の極大値を与える時
刻を検出する極大信号時刻検出手段４２と、その極大信
号時刻を記憶する極大信号時刻記憶手段４４と、４泳動
レーンのうちの１つを基準レーンとし、基準レーンの２
つの極大信号間に出現した他の３泳動レーンの極大信号
に対して泳動レーン間に移動度の差がないと仮定して基
準レーンの時間軸でそれらの極大信号の出現時刻を算出
する出現時刻推定手段４６と、出現時刻推定手段４６で
算出された前記３泳動レーンの極大信号時刻と現実の極
大信号時刻との比から較正係数を算出する較正係数算出
手段４８と、算出された較正係数を用い、較正係数の計
算に使用した時間領域以外の時間領域の信号の時間軸を
変換する手段１０１と、変換後の信号の出現時間間隔が
均一であるかどうかにより較正係数の妥当性を判定する
手段１０２と、妥当と判定された較正係数で前記３泳動
レーンの全時間軸を較正する全時間軸較正手段５０と、
較正された時間軸にもとづく４泳動レーンの極大信号時
刻から塩基配列を決定する塩基配列決定手段５２とを備
えている。出現時刻推定手段４６は、例えば基準レーン
の２つの極大信号間に他の３泳動レーンの極大信号が時
間的に等間隔で出現するとして計算を行なう。１０３は
手段１０２の判定の結果、その較正係数が妥当でないと
判定されたときに、計算領域を変えて較正係数を再計算
する手段である。１０４は設定された基準レーンについ
て他のレーンの較正係数が全て妥当と判定されないとき
に基準レーンを変更する手段である。
【０００８】
【作用】オンライン式塩基配列決定装置では時間の経過
とともに短かい核酸断片から長い核酸断片の順に信号が
現われてくる。図５はこれを示したもので、レーン１，
２，３，４は本来は全く同一の１本の曲線になるべきも
のであるが、温度ムラによって曲線が分離しているもの
である。しかし、温度ムラが定常状態ならば、このよう
な場合でも、曲線は比例関係にあり、どの点でもａ1：
ａ2は一定となる。図５からわかるように、後に出てく
る長い核酸断片では信号自体もブロードな上にスマイリ
ングのために配列の誤読（配列の逆転）も起こりやすい
（図のサンプル点４，５，６）が、先に出てくる短かい
核酸断片では信号もシャープであり、スマイリングがあ
っても配列の逆転までには至らず、誤差とはならない
（図５のサンプル点１，２，３）。しかし、既に短かい
核酸断片が出ているときは、配列の逆転はないものの、
スマイリングがあれば本来出るべき位置（時間的にほぼ
等間隔の位置）からのずれが認められる。本発明では配
列の逆転の起こっていない範囲で今までに出た信号の位
置と信号が本来出るべきほぼ等間隔の位置とのずれから
各泳動レーンの時間軸の較正係数を求め、その較正係数
でそれから後の各々の泳動レーンに対する時間軸を較正
することにより正しい塩基配列を得る。
とともに短かい核酸断片から長い核酸断片の順に信号が
現われてくる。図５はこれを示したもので、レーン１，
２，３，４は本来は全く同一の１本の曲線になるべきも
のであるが、温度ムラによって曲線が分離しているもの
である。しかし、温度ムラが定常状態ならば、このよう
な場合でも、曲線は比例関係にあり、どの点でもａ1：
ａ2は一定となる。図５からわかるように、後に出てく
る長い核酸断片では信号自体もブロードな上にスマイリ
ングのために配列の誤読（配列の逆転）も起こりやすい
（図のサンプル点４，５，６）が、先に出てくる短かい
核酸断片では信号もシャープであり、スマイリングがあ
っても配列の逆転までには至らず、誤差とはならない
（図５のサンプル点１，２，３）。しかし、既に短かい
核酸断片が出ているときは、配列の逆転はないものの、
スマイリングがあれば本来出るべき位置（時間的にほぼ
等間隔の位置）からのずれが認められる。本発明では配
列の逆転の起こっていない範囲で今までに出た信号の位
置と信号が本来出るべきほぼ等間隔の位置とのずれから
各泳動レーンの時間軸の較正係数を求め、その較正係数
でそれから後の各々の泳動レーンに対する時間軸を較正
することにより正しい塩基配列を得る。
【０００９】また、このような装置では信号は正しく得
られるが、化学的な原因によりピークが複数のレーンに
同時に現われたり、あるいはピークの高さが不均一で正
しく信号が認識されず、判断が正しく行なわれないこと
もありうる。図１の手段１０１，１０２，１０３はいっ
たん計算された較正係数を他の時間領域に適用して妥当
性を確かめるためのものである。この確認作業により、
較正係数の精度がよくなり、結局、塩基配列決定の精度
を上げることになる。
られるが、化学的な原因によりピークが複数のレーンに
同時に現われたり、あるいはピークの高さが不均一で正
しく信号が認識されず、判断が正しく行なわれないこと
もありうる。図１の手段１０１，１０２，１０３はいっ
たん計算された較正係数を他の時間領域に適用して妥当
性を確かめるためのものである。この確認作業により、
較正係数の精度がよくなり、結局、塩基配列決定の精度
を上げることになる。
【００１０】
【実施例】図２は塩基配列決定装置の一実施例の全体図
を表わす。２はスラブ状泳動ゲルであり、ポリアクリル
アミドゲルが使用されている。泳動ゲル２の両端は電極
層４，６に浸され、電極層４，６には電解液が収容され
ている。電極層４，６の間には泳動電源８によって泳動
電圧が印加される。泳動ゲル２の一端には試料を注入す
るためのサンプル投入スロット１０が設けられており、
サンプル投入スロット１０の各々の所定の場所には末端
塩基別のサンプルが投入される。サンプルは蛍光物質で
あるＦＩＴＣにより既知の方法で標識化され、サンガー
法により末端に塩基Ａ，Ｇ，Ｔ，Ｃのそれぞれがくるよ
うに処理された４種類のＤＮＡ断片である。ＦＩＴＣは
４８８ｎｍの波長のアルゴンレーザで励起され、５２０
ｎｍの波長の蛍光を発する。泳動電源８が印加される
と、サンプルは泳動バンド１６となって泳動方向１４に
時間とともに泳動ゲル２中を泳動して分離されていき、
測定部に達する。
を表わす。２はスラブ状泳動ゲルであり、ポリアクリル
アミドゲルが使用されている。泳動ゲル２の両端は電極
層４，６に浸され、電極層４，６には電解液が収容され
ている。電極層４，６の間には泳動電源８によって泳動
電圧が印加される。泳動ゲル２の一端には試料を注入す
るためのサンプル投入スロット１０が設けられており、
サンプル投入スロット１０の各々の所定の場所には末端
塩基別のサンプルが投入される。サンプルは蛍光物質で
あるＦＩＴＣにより既知の方法で標識化され、サンガー
法により末端に塩基Ａ，Ｇ，Ｔ，Ｃのそれぞれがくるよ
うに処理された４種類のＤＮＡ断片である。ＦＩＴＣは
４８８ｎｍの波長のアルゴンレーザで励起され、５２０
ｎｍの波長の蛍光を発する。泳動電源８が印加される
と、サンプルは泳動バンド１６となって泳動方向１４に
時間とともに泳動ゲル２中を泳動して分離されていき、
測定部に達する。
【００１１】測定部には４８８ｎｍのレーザ光を発する
アルゴンレーザ１８からの励起光を集光レンズ２０とミ
ラー２１によって照射する励起系と、その励起光ビーム
が当たった所に泳動バンド１６があればその泳動バンド
１６の蛍光物質から発せられた蛍光を対物レンズ２２で
集め、５２０ｎｍの干渉フィルタ２４、集光レンズ２６
から光ファイバ束２７を経て光電子増倍管２８で検出す
る検出系とが設けられている。集光レンズ２０、ミラー
２１、対物レンズ２２、干渉フィルタ２４、集光レンズ
２６及び光ファイバ束２７を含む励起・検出系には、励
起光ビーム照射位置が泳動方向１４と直交する方向（走
査方向２９）の測定ライン上を一定時間ごとに走査する
ように機械的に移動する走査ステージ３０が備えられて
いる。
アルゴンレーザ１８からの励起光を集光レンズ２０とミ
ラー２１によって照射する励起系と、その励起光ビーム
が当たった所に泳動バンド１６があればその泳動バンド
１６の蛍光物質から発せられた蛍光を対物レンズ２２で
集め、５２０ｎｍの干渉フィルタ２４、集光レンズ２６
から光ファイバ束２７を経て光電子増倍管２８で検出す
る検出系とが設けられている。集光レンズ２０、ミラー
２１、対物レンズ２２、干渉フィルタ２４、集光レンズ
２６及び光ファイバ束２７を含む励起・検出系には、励
起光ビーム照射位置が泳動方向１４と直交する方向（走
査方向２９）の測定ライン上を一定時間ごとに走査する
ように機械的に移動する走査ステージ３０が備えられて
いる。
【００１２】光電子増倍管２８の検出信号（蛍光信号）
は増幅器及びＡ／Ｄ変換器３２を経てデータ処理装置で
ある信号処理マイクロコンピュータ３１に取り込まれ
る。マイクロコンピュータ３１にはまた、励起光ビーム
が泳動ゲル２上の測定部を照射するときに、その照射部
の位置に対応した信号が走査データとして取り込まれ
る。このようにして、走査方向に走査して得られた全蛍
光信号が場所情報とともにマイクロコンピュータ３１に
取り込まれる。
は増幅器及びＡ／Ｄ変換器３２を経てデータ処理装置で
ある信号処理マイクロコンピュータ３１に取り込まれ
る。マイクロコンピュータ３１にはまた、励起光ビーム
が泳動ゲル２上の測定部を照射するときに、その照射部
の位置に対応した信号が走査データとして取り込まれ
る。このようにして、走査方向に走査して得られた全蛍
光信号が場所情報とともにマイクロコンピュータ３１に
取り込まれる。
【００１３】次に、一実施例の動作を図３及び図４によ
り説明する。図２の塩基配列決定装置で得られる信号は
例えば図３に示されるようなものである。Ａ，Ｇ，Ｔ，
Ｃはそれぞれの泳動レーンに対応しており、横軸の時間
は光学系により泳動方向と直交する方向に走査を行なう
ときの走査数と一対一に対応している。図３は塩基長の
比較的短かい部分であって、塩基長１つ当たりの泳動速
度の差が比較的大きく、スマイリングが起こっていても
信号出現順序の逆転、即ち配列の誤読までには至らな
い。しかし、図３を詳細にみると、例えば、領域１内に
は、Ｇ，Ｃ，Ｇとピークが３個存在するので、このＡの
２つのピークの間に３個のピークが等間隔で現われると
して線を引いてみると、Ｇのピークはこの線より遅れ、
Ｃのピークはこの線より少し早く出現していることがわ
かる。また、領域２内で同様のことを行なうとＴがＡに
比べて遅れていることがわかる。
り説明する。図２の塩基配列決定装置で得られる信号は
例えば図３に示されるようなものである。Ａ，Ｇ，Ｔ，
Ｃはそれぞれの泳動レーンに対応しており、横軸の時間
は光学系により泳動方向と直交する方向に走査を行なう
ときの走査数と一対一に対応している。図３は塩基長の
比較的短かい部分であって、塩基長１つ当たりの泳動速
度の差が比較的大きく、スマイリングが起こっていても
信号出現順序の逆転、即ち配列の誤読までには至らな
い。しかし、図３を詳細にみると、例えば、領域１内に
は、Ｇ，Ｃ，Ｇとピークが３個存在するので、このＡの
２つのピークの間に３個のピークが等間隔で現われると
して線を引いてみると、Ｇのピークはこの線より遅れ、
Ｃのピークはこの線より少し早く出現していることがわ
かる。また、領域２内で同様のことを行なうとＴがＡに
比べて遅れていることがわかる。
【００１４】定電圧で泳動を行なわせる場合、図２のよ
うな構成ではピークの出現間隔は厳密には等間隔ではな
い。しかし、図３のように、ある泳動レーン、この場合
Ａの泳動レーンを基準レーンとしてその泳動レーンの２
つのピークの間で時間軸を較正するように操作を行なう
とすれば、基準レーンの２つのピーク間の間隔は最大で
も高々２０〜３０塩基分と考えられるので、このような
近似をしても出現順序が逆転するという誤差は生じな
い。図３の信号でも長時間が経過すればＡに比べてＧ，
Ｔは遅く、Ｃは早くピークが出現するので、いつかは出
現順序が逆転し、塩基配列決定に誤差を与えるのは明白
である。
うな構成ではピークの出現間隔は厳密には等間隔ではな
い。しかし、図３のように、ある泳動レーン、この場合
Ａの泳動レーンを基準レーンとしてその泳動レーンの２
つのピークの間で時間軸を較正するように操作を行なう
とすれば、基準レーンの２つのピーク間の間隔は最大で
も高々２０〜３０塩基分と考えられるので、このような
近似をしても出現順序が逆転するという誤差は生じな
い。図３の信号でも長時間が経過すればＡに比べてＧ，
Ｔは遅く、Ｃは早くピークが出現するので、いつかは出
現順序が逆転し、塩基配列決定に誤差を与えるのは明白
である。
【００１５】図４のフローチャートにもとづいて時間軸
の較正を行なうまでの手順を説明する。較正係数の計算 較正係数（基準レーンに対する他のレーンの移動度の
比）は、上述のようにピークが明瞭で、信号出現順序の
逆転の起こらない、ＤＮＡ断片の短かい部分で計算する
（ステップＳ２１，Ｓ２２，Ｓ２３，Ｓ２４）。基準レ
ーンは原則として任意に選ぶことができ、もしその選ん
だ基準レーンで較正係数を決定することができないとき
は、基準レーンを変更することができる（ステップＳ３
１）。しかし、実際にはレーンＧやＣではピークが接近
して現われることがあるので、そのような領域は基準レ
ーンから自動的に除かれるようにプログラムしておくこ
とができる。以下の説明ではレーンＡが基準レーンに選
ばれたと仮定する。
の較正を行なうまでの手順を説明する。較正係数の計算 較正係数（基準レーンに対する他のレーンの移動度の
比）は、上述のようにピークが明瞭で、信号出現順序の
逆転の起こらない、ＤＮＡ断片の短かい部分で計算する
（ステップＳ２１，Ｓ２２，Ｓ２３，Ｓ２４）。基準レ
ーンは原則として任意に選ぶことができ、もしその選ん
だ基準レーンで較正係数を決定することができないとき
は、基準レーンを変更することができる（ステップＳ３
１）。しかし、実際にはレーンＧやＣではピークが接近
して現われることがあるので、そのような領域は基準レ
ーンから自動的に除かれるようにプログラムしておくこ
とができる。以下の説明ではレーンＡが基準レーンに選
ばれたと仮定する。
【００１６】図３で、時間軸の各点は、レーンＡの隣接
した２つのピークの間という限定された区間（Ａ−Ａ領
域）内のピーク出現ピッチが一定（これを単位ピーク間
隔という）であると仮定して計算された予想ピーク出現
時刻を示している。例えば、領域１では単位ピーク間隔
＝（ｔａ2−ｔａ1）／４である。ここで、分母の４はレ
ーンＡの隣接ピーク間に現われるピーク数に対応してい
る。ピーク出現ピッチが一定という仮定は、塩基長を出
現時刻に対して図示するとＡ−Ａ領域（１０〜２０塩基
程度）内では直線で近似されることを意味している。予
想ピーク出現時刻と実際のピーク出現時刻との差はΔｔ
ｇ，Δｔｂ，Δｔｔとして示されている。第１サイクル
では計算領域を領域１と仮定し、レーンＧ及びレーンＣ
の較正係数はそれぞれΔｔｇ／ｔｇ及びΔｔｃ／ｔｃと
して計算される。レーンＴの較正係数は計算領域を領域
２に移す第２サイクルで計算される。
した２つのピークの間という限定された区間（Ａ−Ａ領
域）内のピーク出現ピッチが一定（これを単位ピーク間
隔という）であると仮定して計算された予想ピーク出現
時刻を示している。例えば、領域１では単位ピーク間隔
＝（ｔａ2−ｔａ1）／４である。ここで、分母の４はレ
ーンＡの隣接ピーク間に現われるピーク数に対応してい
る。ピーク出現ピッチが一定という仮定は、塩基長を出
現時刻に対して図示するとＡ−Ａ領域（１０〜２０塩基
程度）内では直線で近似されることを意味している。予
想ピーク出現時刻と実際のピーク出現時刻との差はΔｔ
ｇ，Δｔｂ，Δｔｔとして示されている。第１サイクル
では計算領域を領域１と仮定し、レーンＧ及びレーンＣ
の較正係数はそれぞれΔｔｇ／ｔｇ及びΔｔｃ／ｔｃと
して計算される。レーンＴの較正係数は計算領域を領域
２に移す第２サイクルで計算される。
【００１７】較正係数の検算 （ステップＳ２５，Ｓ２６，Ｓ２９） 算出された較正係数の検算は、較正係数の計算に使用し
た時間領域の次の時間領域又はその後の時間領域で行な
い、その較正係数を用いて信号の時間軸を変換し、変換
後の信号の出現時間間隔が均一であるかどうかにより較
正係数の妥当性を判定する。その具体的な手順は次のよ
うに行なう。 （１）検算しようとするレーン（第１サイクルではレー
ンＧとレーンＣ）の時間軸を計算された較正係数で割
る。
た時間領域の次の時間領域又はその後の時間領域で行な
い、その較正係数を用いて信号の時間軸を変換し、変換
後の信号の出現時間間隔が均一であるかどうかにより較
正係数の妥当性を判定する。その具体的な手順は次のよ
うに行なう。 （１）検算しようとするレーン（第１サイクルではレー
ンＧとレーンＣ）の時間軸を計算された較正係数で割
る。
【００１８】（２）検算しようとするレーンに次のピー
クをもつＡ−Ａ領域に含まれるピーク数を計算するため
に、Ａ−Ａ領域の長さを単位ピッチで割り、その商を整
数に丸める。ここでは、単位ピッチは全体を通して僅か
しか変化しないと仮定している。 レーンＧにおいて； 領域２のピーク数＝(ｔａ3−ｔａ2)／{(ｔａ2−ｔａ1)
／４}の整数 レーンＣにおいて； 領域３のピーク数＝(ｔａ4−ｔａ3)／{(ｔａ3−ｔａ2)
／３}の整数
クをもつＡ−Ａ領域に含まれるピーク数を計算するため
に、Ａ−Ａ領域の長さを単位ピッチで割り、その商を整
数に丸める。ここでは、単位ピッチは全体を通して僅か
しか変化しないと仮定している。 レーンＧにおいて； 領域２のピーク数＝(ｔａ3−ｔａ2)／{(ｔａ2−ｔａ1)
／４}の整数 レーンＣにおいて； 領域３のピーク数＝(ｔａ4−ｔａ3)／{(ｔａ3−ｔａ2)
／３}の整数
【００１９】（３）検算しようとするピーク（ｔｇ3’
やｔｃ2’）付近の単位ピーク間隔を見積もるために、
Ａ−Ａ領域の長さを（２）で求めたピーク数で割る。 領域２の単位ピッチ＝(ｔａ3−ｔａ2)／（領域２のピー
ク数） （この式はアルゴリズムを一般式で表現したものであっ
て、図３の例では(ｔａ3−ｔａ2)／３となる。） 領域３の単位ピーク間隔＝(ｔａ4−ｔａ3)／（領域３の
ピーク数）
やｔｃ2’）付近の単位ピーク間隔を見積もるために、
Ａ−Ａ領域の長さを（２）で求めたピーク数で割る。 領域２の単位ピッチ＝(ｔａ3−ｔａ2)／（領域２のピー
ク数） （この式はアルゴリズムを一般式で表現したものであっ
て、図３の例では(ｔａ3−ｔａ2)／３となる。） 領域３の単位ピーク間隔＝(ｔａ4−ｔａ3)／（領域３の
ピーク数）
【００２０】（４）検算しようとするピークと直前のＡ
ピークとの距離を（３）で求めた単位ピーク間隔で割
る。その割算の商から整数を引いた小数部分はピーク出
現の位相差を表わし、これによって妥当性を判断するこ
とができる。 レーンＧにおいて； 位相差＝［(ｔｇ3’−ｔａ2)／（領域２の単位ピッ
チ)］の小数部分 レーンＣにおいて； 位相差＝［(ｔｃ2’−ｔａ3)／（領域３の単位ピッ
チ)］の小数部分
ピークとの距離を（３）で求めた単位ピーク間隔で割
る。その割算の商から整数を引いた小数部分はピーク出
現の位相差を表わし、これによって妥当性を判断するこ
とができる。 レーンＧにおいて； 位相差＝［(ｔｇ3’−ｔａ2)／（領域２の単位ピッ
チ)］の小数部分 レーンＣにおいて； 位相差＝［(ｔｃ2’−ｔａ3)／（領域３の単位ピッ
チ)］の小数部分
【００２１】（５）もし（４）で求めた位相差（実験的
には許容誤差を時間軸の分解能の１単位とおく）が０又
は１に近ければ、算出された較正係数は正しいと判定さ
れる。もし、そうでなければ、算出された較正係数は正
しくないと判定され、計算用のＡ−Ａ領域が次の領域に
変更され、プログラムはステップＳ２４に戻って較正係
数を再度計算する（ステップＳ２６，Ｓ２９）。較正係
数の妥当性の判断を位相差の絶対値で行なっているが、
分散や標準偏差などで判断してもよい。
には許容誤差を時間軸の分解能の１単位とおく）が０又
は１に近ければ、算出された較正係数は正しいと判定さ
れる。もし、そうでなければ、算出された較正係数は正
しくないと判定され、計算用のＡ−Ａ領域が次の領域に
変更され、プログラムはステップＳ２４に戻って較正係
数を再度計算する（ステップＳ２６，Ｓ２９）。較正係
数の妥当性の判断を位相差の絶対値で行なっているが、
分散や標準偏差などで判断してもよい。
【００２２】基準レーンの変更（ステップＳ３１） 較正係数の計算と検算の操作を繰り返していって計算領
域が予め定められた短かいＤＮＡ断片の領域を越えてし
まった場合、基準レーンを替えて初めからやりなおしを
することができる。一例として、Ａ→Ｔ→Ｇ→Ｃの順に
変更するようにプログラムしておく。ここで、短かいＤ
ＮＡ断片領域とは、一例としては１５００〜２０１２走
査、すなわち２時間５分〜２時間４７分までの範囲であ
り、この範囲であればピーク出現順序の逆転は決して起
こらない。
域が予め定められた短かいＤＮＡ断片の領域を越えてし
まった場合、基準レーンを替えて初めからやりなおしを
することができる。一例として、Ａ→Ｔ→Ｇ→Ｃの順に
変更するようにプログラムしておく。ここで、短かいＤ
ＮＡ断片領域とは、一例としては１５００〜２０１２走
査、すなわち２時間５分〜２時間４７分までの範囲であ
り、この範囲であればピーク出現順序の逆転は決して起
こらない。
【００２３】時間軸変換（ステップＳ２８） 計算され、検算によって正しいと判定された較正係数を
用いて時間軸全体を変換し、変換されたデータから塩基
配列を決定する。
用いて時間軸全体を変換し、変換されたデータから塩基
配列を決定する。
【００２４】
【発明の効果】本発明ではＡ，Ｇ，Ｔ，Ｃの何れかを基
準レーンとし、他の３つの泳動レーンの時間軸を基準レ
ーンの２つのピーク間隔を基準にして較正するようにし
たので、スマイリングやその他の原因で泳動レーン間に
泳動速度差がある場合でも正しく塩基配列を決定するこ
とができる。そして、較正係数を検算して正しいものを
採用するので、塩基配列決定の精度が高くなる。温度分
布以外の原因によるスマイリングにも対応することがで
きる。周囲の空気制御により温度を均一化する従来の方
法と併用することもでき、その場合にはさらに精度が向
上する。
準レーンとし、他の３つの泳動レーンの時間軸を基準レ
ーンの２つのピーク間隔を基準にして較正するようにし
たので、スマイリングやその他の原因で泳動レーン間に
泳動速度差がある場合でも正しく塩基配列を決定するこ
とができる。そして、較正係数を検算して正しいものを
採用するので、塩基配列決定の精度が高くなる。温度分
布以外の原因によるスマイリングにも対応することがで
きる。周囲の空気制御により温度を均一化する従来の方
法と併用することもでき、その場合にはさらに精度が向
上する。
【図１】一実施例における信号処理マイクロコンピュー
タの機能を示すブロック図である。
タの機能を示すブロック図である。
【図２】一実施例を示す概略斜視図である。
【図３】一実施例で測定される各泳動レーンの信号を示
す図である。
す図である。
【図４】実施例の動作を示すフローチャート図である。
【図５】ピーク出現時刻とＤＮＡ断片塩基長との関係を
示す図である。
示す図である。
２ 泳動ゲル ４，６ 電極槽 ８ 泳動電源 １０ サンプル投入スロット １４ 泳動方向 １６ 泳動バンド １８ レーザ ２０，２６ 集光レンズ ２２ 対物レンズ ２４ 干渉フィルタ ２８ 光電子増倍管 ３０ マイクロコンピュータ ３２ Ａ／Ｄ変換器 ４０ 信号記憶手段 ４２ 極大信号時刻検出手段 ４４ 極大信号時刻記憶手段 ４６ 出現時刻推定手段 ４８ 較正係数算出手段 ５０ 全時間軸較正手段 ５２ 塩基配列決定手段 １０１ 時間軸較正手段 １０２ 検算手段 １０３ 再計算手段 １０４ 基準レーン変更手段
Claims (3)
- 【請求項１】 標識化された核酸断片試料を末端塩基の
種類別に４つの泳動レーンに分けて同時にゲル電気泳動
させながら核酸断片試料から出る信号を泳動方向と直交
する方向に走査してオンライン実時間で取得し、データ
処理装置で塩基配列を決定する塩基配列決定装置におい
て、データ処理装置は各泳動レーンからの信号を時間に
対して記憶する信号記憶手段と、各泳動レーンについて
信号の極大値を与える時刻を検出する極大信号時刻検出
手段と、その極大信号時刻を記憶する極大信号時刻記憶
手段と、４泳動レーンのうちの１つを基準レーンとし、
基準レーンの２つの極大信号間に出現した他の３泳動レ
ーンの極大信号に対して泳動レーン間に移動度の差がな
いと仮定して基準レーンの時間軸でそれらの極大信号の
出現時刻を算出する出現時刻推定手段と、出現時刻推定
手段で算出された前記３泳動レーンの極大信号時刻と現
実の極大信号時刻との比から較正係数を算出する較正係
数算出手段と、算出された較正係数を用い、較正係数の
計算に使用した時間領域以外の時間領域の信号の時間軸
を変換する手段と、変換後の信号の出現時間間隔が均一
であるかどうかにより較正係数の妥当性を判定する手段
と、妥当と判定された較正係数で前記３泳動レーンの全
時間軸を較正する全時間軸較正手段と、較正された時間
軸にもとづく４泳動レーンの極大信号時刻から塩基配列
を決定する塩基配列決定手段とを備えていることを特徴
とする塩基配列決定装置。 - 【請求項２】 較正係数の妥当性を判定する手段は、計
算されたピークの出現予想時刻と変換後の信号の実際の
出現時刻との差の分散又は標準偏差が一定値以上になっ
たときを不適当と判定する請求項１に記載の塩基配列決
定装置。 - 【請求項３】 設定された基準レーンについて他のレー
ンの較正係数が全て妥当と判定されないときは基準レー
ンを変更する手段を更に備えた請求項１又は２に記載の
塩基配列決定装置。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3299917A JPH0827258B2 (ja) | 1991-10-18 | 1991-10-18 | 塩基配列決定装置 |
| US07/961,533 US5419825A (en) | 1991-07-29 | 1992-10-15 | Base sequencing apparatus |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3299917A JPH0827258B2 (ja) | 1991-10-18 | 1991-10-18 | 塩基配列決定装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05107227A JPH05107227A (ja) | 1993-04-27 |
| JPH0827258B2 true JPH0827258B2 (ja) | 1996-03-21 |
Family
ID=17878491
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3299917A Expired - Fee Related JPH0827258B2 (ja) | 1991-07-29 | 1991-10-18 | 塩基配列決定装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0827258B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2602228B (en) * | 2019-09-17 | 2023-08-23 | Hitachi High Tech Corp | Biological sample analysis device and biological sample analysis method |
-
1991
- 1991-10-18 JP JP3299917A patent/JPH0827258B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05107227A (ja) | 1993-04-27 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |