JPH08277300A - 抗リボヌクレオチドレダクターゼｒ２サブユニットモノクローナル抗体 - Google Patents
抗リボヌクレオチドレダクターゼｒ２サブユニットモノクローナル抗体Info
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- JPH08277300A JPH08277300A JP8019676A JP1967696A JPH08277300A JP H08277300 A JPH08277300 A JP H08277300A JP 8019676 A JP8019676 A JP 8019676A JP 1967696 A JP1967696 A JP 1967696A JP H08277300 A JPH08277300 A JP H08277300A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 リボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＮＲ）Ｒ
２サブユニットに特異的に反応し、且つＲＮＲの活性を
阻害する作用を有するモノクローナル抗体及び該抗体を
用いてＲＮＲのＲ２サブユニットを免疫学的に検出する
方法を提供する。 【解決手段】 本発明のモノクローナル抗体により、組
織診断や細胞診においてセルサイクルマーカーや増殖マ
ーカーとして有用なＲＮＲを免疫学的に検出することが
できるとともにＲＮＲ活性を阻害することができる。
２サブユニットに特異的に反応し、且つＲＮＲの活性を
阻害する作用を有するモノクローナル抗体及び該抗体を
用いてＲＮＲのＲ２サブユニットを免疫学的に検出する
方法を提供する。 【解決手段】 本発明のモノクローナル抗体により、組
織診断や細胞診においてセルサイクルマーカーや増殖マ
ーカーとして有用なＲＮＲを免疫学的に検出することが
できるとともにＲＮＲ活性を阻害することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、組織診断や細胞診
等において、セルサイクルマーカーや増殖マーカーとし
て有用なリボヌクレオチドレダクターゼＲ２サブユニッ
トに特異的に反応するモノクローナル抗体及び該抗体を
用いるリボヌクレオチドレダクターゼＲ２サブユニット
の免疫学的検出方法に関する。
等において、セルサイクルマーカーや増殖マーカーとし
て有用なリボヌクレオチドレダクターゼＲ２サブユニッ
トに特異的に反応するモノクローナル抗体及び該抗体を
用いるリボヌクレオチドレダクターゼＲ２サブユニット
の免疫学的検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】リボヌクレオチドレダクターゼ（以下、
ＲＮＲと略記する。）は、リボヌクレオシド２リン酸を
還元しＤＮＡの材料となるデオキシリボヌクレオシド２
リン酸を生成する酵素である。ＲＮＲ活性と細胞増殖速
度に強い相関が見られること、及び細胞内のデオキシリ
ボヌクレオチドのプールは少ないことなどから、ＲＮＲ
はＤＮＡ合成の律速段階を司り、その制御に関わってい
ると考えられている（Annu. Rev. Biochem.,48,133-15
8,1979 ）。
ＲＮＲと略記する。）は、リボヌクレオシド２リン酸を
還元しＤＮＡの材料となるデオキシリボヌクレオシド２
リン酸を生成する酵素である。ＲＮＲ活性と細胞増殖速
度に強い相関が見られること、及び細胞内のデオキシリ
ボヌクレオチドのプールは少ないことなどから、ＲＮＲ
はＤＮＡ合成の律速段階を司り、その制御に関わってい
ると考えられている（Annu. Rev. Biochem.,48,133-15
8,1979 ）。
【０００３】従って、ＲＮＲはセルサイクルマーカーや
増殖マーカーとして利用することができると考えられ
る。実際、ＲＮＲ活性はセルサイクルに依存的に増減
し、Ｇ０／Ｇ１期に低くＳ期に最高となることが知られ
ている。ＲＮＲは各々単独では全く活性を持たないＲ１
とＲ２の２つのサブユニットから構成されているが、Ｒ
１サブユニットの発現量は常に一定で十分量あり、ＲＮ
Ｒ活性はセルサイクル依存的に増減するＲ２サブユニッ
トの発現量によりコントロールされていることが報告さ
れている〔J.B.C., 256(18),9436-9440,1981〕。また、
ＲＮＲ活性はヒト腫瘍組織において正常組織より高いこ
とが報告されており（Life Science,28,1007-1014,198
1）、ＲＮＲは腫瘍マーカー又は腫瘍の増殖マーカーと
しても利用することができると考えられる。
増殖マーカーとして利用することができると考えられ
る。実際、ＲＮＲ活性はセルサイクルに依存的に増減
し、Ｇ０／Ｇ１期に低くＳ期に最高となることが知られ
ている。ＲＮＲは各々単独では全く活性を持たないＲ１
とＲ２の２つのサブユニットから構成されているが、Ｒ
１サブユニットの発現量は常に一定で十分量あり、ＲＮ
Ｒ活性はセルサイクル依存的に増減するＲ２サブユニッ
トの発現量によりコントロールされていることが報告さ
れている〔J.B.C., 256(18),9436-9440,1981〕。また、
ＲＮＲ活性はヒト腫瘍組織において正常組織より高いこ
とが報告されており（Life Science,28,1007-1014,198
1）、ＲＮＲは腫瘍マーカー又は腫瘍の増殖マーカーと
しても利用することができると考えられる。
【０００４】しかしながら、従来のＲＮＲ活性の測定法
（Analytical Biochemistry,34,123-130,1970)は煩雑で
あり、また組織における局在を調べる等の目的には不向
きであるため、特異的で簡便な検出方法が望まれてい
る。ＲＮＲに対するモノクローナル抗体としては、Ｒ１
サブユニットに対して反応し、ＲＮＲ活性を阻害する抗
体が知られている〔Acta Chem.Scand.,B36 (5),343,198
2 〕。Ｒ２サブユニットに対して反応するモノクローナ
ル抗体は知られている〔The EMBO Journal, 7 (6),161
5,1988 〕が、当該モノクローナル抗体はＲＮＲ活性を
阻害する作用を有していない。
（Analytical Biochemistry,34,123-130,1970)は煩雑で
あり、また組織における局在を調べる等の目的には不向
きであるため、特異的で簡便な検出方法が望まれてい
る。ＲＮＲに対するモノクローナル抗体としては、Ｒ１
サブユニットに対して反応し、ＲＮＲ活性を阻害する抗
体が知られている〔Acta Chem.Scand.,B36 (5),343,198
2 〕。Ｒ２サブユニットに対して反応するモノクローナ
ル抗体は知られている〔The EMBO Journal, 7 (6),161
5,1988 〕が、当該モノクローナル抗体はＲＮＲ活性を
阻害する作用を有していない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、セル
サイクルマーカーや増殖マーカーとして有用なＲＮＲの
Ｒ２サブユニットに特異的に反応するモノクローナル抗
体であって、ＲＮＲ活性を阻害する性質を有するモノク
ローナル抗体を提供することにある。本発明のモノクロ
ーナル抗体は、ＲＮＲに対する中和活性を有しており、
濃度依存的にＲＮＲ活性を阻害することができる。した
がって、本発明のモノクローナル抗体は細胞及び組織中
のＲＮＲのＲ２サブユニットを免疫学的に検出するだけ
でなく、ＲＮＲの細胞内での役割や生物学的機能の研究
に有効であり、癌の基礎研究に対する新たな知見を得る
ことができる。
サイクルマーカーや増殖マーカーとして有用なＲＮＲの
Ｒ２サブユニットに特異的に反応するモノクローナル抗
体であって、ＲＮＲ活性を阻害する性質を有するモノク
ローナル抗体を提供することにある。本発明のモノクロ
ーナル抗体は、ＲＮＲに対する中和活性を有しており、
濃度依存的にＲＮＲ活性を阻害することができる。した
がって、本発明のモノクローナル抗体は細胞及び組織中
のＲＮＲのＲ２サブユニットを免疫学的に検出するだけ
でなく、ＲＮＲの細胞内での役割や生物学的機能の研究
に有効であり、癌の基礎研究に対する新たな知見を得る
ことができる。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ヒトＲＮ
ＲのＲ２サブユニットのＣ末ペプチドを免疫原に用いて
ハイブリドーマを作製し、該ペプチドに特異的に反応す
るモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株を確立し、
該ハイブリドーマを培地中に培養するか動物に投与して
腹水癌化し、培養上清または腹水を採取することにより
モノクローナル抗体を得た。これを用いてウエスタンブ
ロッティングおよび免疫沈降反応を行ったところ、該モ
ノクローナル抗体がＲＮＲのＲ２サブユニットの分子量
に一致する４５Ｋダルトンの蛋白質に反応すること及び
該モノクローナル抗体がＲＮＲ活性を阻害する作用を有
することを見出した。さらに、該モノクローナル抗体を
用いて培養細胞や各種ヒト組織の免疫学的染色を行った
ところ、該抗体が細胞及びヒト組織中のＲＮＲを特異的
に検出しうることを見出し本発明を完成させた。
ＲのＲ２サブユニットのＣ末ペプチドを免疫原に用いて
ハイブリドーマを作製し、該ペプチドに特異的に反応す
るモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株を確立し、
該ハイブリドーマを培地中に培養するか動物に投与して
腹水癌化し、培養上清または腹水を採取することにより
モノクローナル抗体を得た。これを用いてウエスタンブ
ロッティングおよび免疫沈降反応を行ったところ、該モ
ノクローナル抗体がＲＮＲのＲ２サブユニットの分子量
に一致する４５Ｋダルトンの蛋白質に反応すること及び
該モノクローナル抗体がＲＮＲ活性を阻害する作用を有
することを見出した。さらに、該モノクローナル抗体を
用いて培養細胞や各種ヒト組織の免疫学的染色を行った
ところ、該抗体が細胞及びヒト組織中のＲＮＲを特異的
に検出しうることを見出し本発明を完成させた。
【０００７】本発明は、ＲＮＲのＲ２サブユニットに特
異的に反応し、且つＲＮＲ活性を阻害する作用を有する
モノクローナル抗体に関する。本発明のリボヌクレオチ
ドレダクターゼＲ２サブユニットに特異的に反応するモ
ノクローナル抗体（以下、抗ＲＮＲ・Ｒ２サブユニット
モノクローナル抗体という。）の具体例としては、ハイ
ブリドーマ細胞株ＫＭ１０５４が生産するモノクローナ
ル抗体ＫＭ１０５４をあげることができる。
異的に反応し、且つＲＮＲ活性を阻害する作用を有する
モノクローナル抗体に関する。本発明のリボヌクレオチ
ドレダクターゼＲ２サブユニットに特異的に反応するモ
ノクローナル抗体（以下、抗ＲＮＲ・Ｒ２サブユニット
モノクローナル抗体という。）の具体例としては、ハイ
ブリドーマ細胞株ＫＭ１０５４が生産するモノクローナ
ル抗体ＫＭ１０５４をあげることができる。
【０００８】
【発明の実施の形態】以下に本発明を詳細に説明する。 （１）動物の免疫と抗体産生細胞の調製 抗原として用いるペプチドは免疫原性を高める目的で、
キーホールリンペットヘモシアニン（以下、ＫＬＨと略
記する。）やウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略記
する。）などのキャリア蛋白質とグルタールアルデヒド
やＮ−（ｍ−マレイミドベンゾイルオキシ）スクシンイ
ミド（以下、ＭＢＳと略記する。）などの架橋剤を用い
て結合させる。
キーホールリンペットヘモシアニン（以下、ＫＬＨと略
記する。）やウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略記
する。）などのキャリア蛋白質とグルタールアルデヒド
やＮ−（ｍ−マレイミドベンゾイルオキシ）スクシンイ
ミド（以下、ＭＢＳと略記する。）などの架橋剤を用い
て結合させる。
【０００９】３〜２０週令のマウスまたはラットに、配
列番号１に示したアミノ酸配列を有するヒトＲＮＲのＲ
２サブユニットＣ末ペプチドの上記キャリア蛋白質との
コンジュゲートを免疫して、その動物の脾、リンパ節、
末梢血等より抗体産生細胞を採取する。免疫は、動物の
皮下あるいは静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバ
ント〔例えば、フロインドの完全アジュバント（Ｃｏｍ
ｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）ま
たは水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕
とともに抗原を投与することにより行う。抗原の投与
は、１回目の投与の後１〜２週間おきに５〜１０回行
う。各投与後３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、その
血清が抗原と反応することを酵素免疫測定法〔酵素免疫
測定法（ＥＬＩＳＡ法）：医学書院刊 １９７６年〕な
どで調べる。
列番号１に示したアミノ酸配列を有するヒトＲＮＲのＲ
２サブユニットＣ末ペプチドの上記キャリア蛋白質との
コンジュゲートを免疫して、その動物の脾、リンパ節、
末梢血等より抗体産生細胞を採取する。免疫は、動物の
皮下あるいは静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバ
ント〔例えば、フロインドの完全アジュバント（Ｃｏｍ
ｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）ま
たは水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕
とともに抗原を投与することにより行う。抗原の投与
は、１回目の投与の後１〜２週間おきに５〜１０回行
う。各投与後３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、その
血清が抗原と反応することを酵素免疫測定法〔酵素免疫
測定法（ＥＬＩＳＡ法）：医学書院刊 １９７６年〕な
どで調べる。
【００１０】免疫に用いたペプチドに対し、その血清が
十分な抗体価を示したマウスまたはラットを抗体産生細
胞の供給源として供する。抗体産生細胞と骨髄腫細胞の
融合に供するに当たっては、例えば、抗体産生細胞とし
て脾細胞を用いる場合は、抗原の最終投与後３〜７日目
に、免疫したマウスより脾臓を摘出し、脾細胞を採取す
る。脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピ
ンセットでほぐし、遠心分離（１，２００ｒｐｍ 、５
分間）した後、上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム
緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理して赤血球を
除去し、ＭＥＭ培地で３回洗浄して融合用脾細胞とす
る。
十分な抗体価を示したマウスまたはラットを抗体産生細
胞の供給源として供する。抗体産生細胞と骨髄腫細胞の
融合に供するに当たっては、例えば、抗体産生細胞とし
て脾細胞を用いる場合は、抗原の最終投与後３〜７日目
に、免疫したマウスより脾臓を摘出し、脾細胞を採取す
る。脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピ
ンセットでほぐし、遠心分離（１，２００ｒｐｍ 、５
分間）した後、上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム
緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理して赤血球を
除去し、ＭＥＭ培地で３回洗浄して融合用脾細胞とす
る。
【００１１】（２）骨髄腫細胞の調製 骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使
用する。例えば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬ
Ｂ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１
（Ｐ３−Ｕ１）〔カレント・トピックス・イン・ミクロ
バイオロジー・アンド・イムノロジー（Current Topics
in Microbiology and Immunology) 81,1-7 (1978)〕、
ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Euro
pean J. Immunology）6 , 511-519(1976) 〕、ＳＰ２／
０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）〔ネイチャー(Nature)276 ,
269-270(1978) 〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５
３）〔ジャーナル・オブ・イムノロジー(J. Immunolog
y) 123 , 1548-1550 (1979)〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８
（Ｘ６３）〔ネイチャー(Nature) 256, 495-497(1975)
〕などが用いられる。これらの細胞株は、８−アザグ
アニン培地〔ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン
（１．５ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（５×１０
-5Ｍ）、ジェンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）および牛
胎児血清（ＦＣＳ）（ＣＳＬ社製、１０％）を加えた培
地（以下、正常培地という。）に、さらに８−アザグア
ニン（１５μｇ／ｍｌ）を加えた培地〕で継代するが、
細胞融合の３〜４日前に正常培地に継代し、融合当日２
×１０7 個以上の細胞数を確保する。
用する。例えば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬ
Ｂ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１
（Ｐ３−Ｕ１）〔カレント・トピックス・イン・ミクロ
バイオロジー・アンド・イムノロジー（Current Topics
in Microbiology and Immunology) 81,1-7 (1978)〕、
ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Euro
pean J. Immunology）6 , 511-519(1976) 〕、ＳＰ２／
０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）〔ネイチャー(Nature)276 ,
269-270(1978) 〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５
３）〔ジャーナル・オブ・イムノロジー(J. Immunolog
y) 123 , 1548-1550 (1979)〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８
（Ｘ６３）〔ネイチャー(Nature) 256, 495-497(1975)
〕などが用いられる。これらの細胞株は、８−アザグ
アニン培地〔ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン
（１．５ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（５×１０
-5Ｍ）、ジェンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）および牛
胎児血清（ＦＣＳ）（ＣＳＬ社製、１０％）を加えた培
地（以下、正常培地という。）に、さらに８−アザグア
ニン（１５μｇ／ｍｌ）を加えた培地〕で継代するが、
細胞融合の３〜４日前に正常培地に継代し、融合当日２
×１０7 個以上の細胞数を確保する。
【００１２】（３）細胞融合 （１）で得られた抗体産生細胞と（２）で得られた骨髄
腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム
１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６
５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、
細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１に
なるよう混合し、遠心分離（１，２００ｒｐｍ、５分
間）した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐし
た後、攪拌しながら、３７℃で、ポリエチレングリコー
ル−１，０００（ＰＥＧ−１，０００）２ｇ、ＭＥＭ２
ｍｌおよびジメチルスルホキシド０．７ｍｌの混液０．
２〜１ｍｌ／１０8 抗体産生細胞を加え、１〜２分間毎
にＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回加えた後、ＭＥＭ培地を
加えて全量が５０ｍｌになるようにする。遠心分離（９
００ｒｐｍ、５分間）後、上清を捨て、ゆるやかに細胞
をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆ
るやかに細胞をＨＡＴ培地〔正常培地にヒポキサンチン
（１０-4Ｍ）、チミジン（１．５×１０-5Ｍ）およびア
ミノプテリン（４×１０-7Ｍ ）を加えた培地〕１００
ｍｌ中に懸濁する。この懸濁液を９６穴培養用プレート
に１００μｌ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ2 インキュベー
ター中、３７℃で７〜１４日間培養する。
腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム
１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６
５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、
細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１に
なるよう混合し、遠心分離（１，２００ｒｐｍ、５分
間）した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐし
た後、攪拌しながら、３７℃で、ポリエチレングリコー
ル−１，０００（ＰＥＧ−１，０００）２ｇ、ＭＥＭ２
ｍｌおよびジメチルスルホキシド０．７ｍｌの混液０．
２〜１ｍｌ／１０8 抗体産生細胞を加え、１〜２分間毎
にＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回加えた後、ＭＥＭ培地を
加えて全量が５０ｍｌになるようにする。遠心分離（９
００ｒｐｍ、５分間）後、上清を捨て、ゆるやかに細胞
をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆ
るやかに細胞をＨＡＴ培地〔正常培地にヒポキサンチン
（１０-4Ｍ）、チミジン（１．５×１０-5Ｍ）およびア
ミノプテリン（４×１０-7Ｍ ）を加えた培地〕１００
ｍｌ中に懸濁する。この懸濁液を９６穴培養用プレート
に１００μｌ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ2 インキュベー
ター中、３７℃で７〜１４日間培養する。
【００１３】培養後、培養上清の一部をとり、以下に述
べる酵素免疫測定法などにより、ヒトＲＮＲのＲ２サブ
ユニットのＣ末ペプチドに特異的に反応する穴を選択す
る。ついで、限界希釈法によりクローニングを２回繰り
返し〔１回目は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテ
リンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用す
る〕、安定して強い抗体価の認められたものを抗ＲＮＲ
・Ｒ２サブユニットモノクローナル抗体産生ハイブリド
ーマ株として選択する。当該ハイブリドーマ株の具体例
としては、ハイブリドーマ株ＫＭ１０５４、ＫＭ１０５
６およびＫＭ１０６０等が挙げられる。ハイブリドーマ
株ＫＭ１０５４は、平成６年１１月８日付で工業技術院
生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ ＢＰ−４８７５
として寄託されている。
べる酵素免疫測定法などにより、ヒトＲＮＲのＲ２サブ
ユニットのＣ末ペプチドに特異的に反応する穴を選択す
る。ついで、限界希釈法によりクローニングを２回繰り
返し〔１回目は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテ
リンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用す
る〕、安定して強い抗体価の認められたものを抗ＲＮＲ
・Ｒ２サブユニットモノクローナル抗体産生ハイブリド
ーマ株として選択する。当該ハイブリドーマ株の具体例
としては、ハイブリドーマ株ＫＭ１０５４、ＫＭ１０５
６およびＫＭ１０６０等が挙げられる。ハイブリドーマ
株ＫＭ１０５４は、平成６年１１月８日付で工業技術院
生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ ＢＰ−４８７５
として寄託されている。
【００１４】酵素免疫測定法 抗原として用いるＲＮＲのＲ２サブユニットのＣ末ペプ
チドは、免疫に用いたものとは異なる蛋白質をキャリア
蛋白質として用い、グルタールアルデヒドやＭＢＳなど
の架橋剤を用いて結合させる。ヒトＲＮＲのＲ２サブユ
ニットのＣ末ペプチドとキャリア蛋白質とのコンジュゲ
ート１〜５０μｇ／ｍｌを１０〜１００μｌ／穴ずつ９
６穴プレートに分注し、４℃で一晩放置してプレートに
吸着させる。ＢＳＡ溶液などでブロッキングした後、ハ
イブリドーマ培養上清を第一抗体として５０〜１００μ
ｌ／穴ずつ分注し、室温で２時間または４℃で一晩反応
させる。ＰＢＳまたはＰＢＳに０．０５％Ｔｗｅｅｎ−
２０を加えた溶液（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと略記す
る）で洗浄した後、第二抗体としてビオチン、酵素、化
学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗マウス
イムノグロブリン抗体もしくは抗ラットイムノグロブリ
ン抗体１〜５０μｇ／ｍｌを５０〜１００μｌ／穴ずつ
分注し、室温1 〜２時間反応させる。よく洗浄した後、
第二抗体の標識物質に応じた反応を行ない、ヒトＲＮＲ
のＲ２サブユニットのＣ末ペプチドに特異的に反応する
穴を抗ＲＮＲ・Ｒ２サブユニットモノクローナル抗体を
生産するハイブリドーマとして選択する。
チドは、免疫に用いたものとは異なる蛋白質をキャリア
蛋白質として用い、グルタールアルデヒドやＭＢＳなど
の架橋剤を用いて結合させる。ヒトＲＮＲのＲ２サブユ
ニットのＣ末ペプチドとキャリア蛋白質とのコンジュゲ
ート１〜５０μｇ／ｍｌを１０〜１００μｌ／穴ずつ９
６穴プレートに分注し、４℃で一晩放置してプレートに
吸着させる。ＢＳＡ溶液などでブロッキングした後、ハ
イブリドーマ培養上清を第一抗体として５０〜１００μ
ｌ／穴ずつ分注し、室温で２時間または４℃で一晩反応
させる。ＰＢＳまたはＰＢＳに０．０５％Ｔｗｅｅｎ−
２０を加えた溶液（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと略記す
る）で洗浄した後、第二抗体としてビオチン、酵素、化
学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗マウス
イムノグロブリン抗体もしくは抗ラットイムノグロブリ
ン抗体１〜５０μｇ／ｍｌを５０〜１００μｌ／穴ずつ
分注し、室温1 〜２時間反応させる。よく洗浄した後、
第二抗体の標識物質に応じた反応を行ない、ヒトＲＮＲ
のＲ２サブユニットのＣ末ペプチドに特異的に反応する
穴を抗ＲＮＲ・Ｒ２サブユニットモノクローナル抗体を
生産するハイブリドーマとして選択する。
【００１５】（４）モノクローナル抗体の調製 プリスタン処理〔２，６，１０，１４−テトラメチルペ
ンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍｌを腹腔内投
与し、２週間飼育する〕した８〜１０週令のマウスまた
はヌードマウスに、（３）で得られる抗ＲＮＲ・Ｒ２サ
ブユニットモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞
２×１０7 〜５×１０6 細胞／匹を腹腔内注射する。１
０〜２１日間でハイブリドーマは腹水癌化する。このマ
ウスから腹水を採取し、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、
５分間）して固形分を除去後、４０〜５０％飽和硫酸ア
ンモニウムで塩析し、カプリル酸沈殿法により精製モノ
クローナル抗体とするか、ＤＥＡＥ−セファロースカラ
ム、プロテインＡカラム又はセルロファインＧＳＬ２０
００（生化学工業社製）のカラムに通塔し、ＩｇＧまた
はＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
ンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍｌを腹腔内投
与し、２週間飼育する〕した８〜１０週令のマウスまた
はヌードマウスに、（３）で得られる抗ＲＮＲ・Ｒ２サ
ブユニットモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞
２×１０7 〜５×１０6 細胞／匹を腹腔内注射する。１
０〜２１日間でハイブリドーマは腹水癌化する。このマ
ウスから腹水を採取し、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、
５分間）して固形分を除去後、４０〜５０％飽和硫酸ア
ンモニウムで塩析し、カプリル酸沈殿法により精製モノ
クローナル抗体とするか、ＤＥＡＥ−セファロースカラ
ム、プロテインＡカラム又はセルロファインＧＳＬ２０
００（生化学工業社製）のカラムに通塔し、ＩｇＧまた
はＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
【００１６】抗体のサブクラスの決定は、マウスモノク
ローナル抗体タイピングキット（ザイメット社製）又は
ラットモノクローナル抗体タイピングキット（ノルディ
ック・イムノロジー社製）を用いて行う。蛋白量の定量
は、ローリー法および２８０ｎｍでの吸光度より算出す
る。
ローナル抗体タイピングキット（ザイメット社製）又は
ラットモノクローナル抗体タイピングキット（ノルディ
ック・イムノロジー社製）を用いて行う。蛋白量の定量
は、ローリー法および２８０ｎｍでの吸光度より算出す
る。
【００１７】（５）ウエスタンブロッティングを用いる
モノクローナル抗体の特異性の検討 （４）で得られる抗ＲＮＲ・Ｒ２サブユニットモノクロ
ーナル抗体の反応特異性を以下に示すウエスタンブロッ
ティングにより調べた。まず、ＨｅｌａＳ3 などのヒト
腫瘍細胞株より以下のようにしてＲＮＲ粗精製画分を調
製する。
モノクローナル抗体の特異性の検討 （４）で得られる抗ＲＮＲ・Ｒ２サブユニットモノクロ
ーナル抗体の反応特異性を以下に示すウエスタンブロッ
ティングにより調べた。まず、ＨｅｌａＳ3 などのヒト
腫瘍細胞株より以下のようにしてＲＮＲ粗精製画分を調
製する。
【００１８】ヒト腫瘍細胞よりホモジネートを調製し、
遠心分離して上清を採取する。最終濃度が０．６５％
（ｗ／ｖ）になるように硫酸ストレプトマイシン加え、
４℃で３０分間攪拌後、遠心分離して上清を採取する。
次に、最終濃度５０％飽和の硫酸アンモニウムを加え、
４℃で４５分間攪拌後、遠心分離して沈殿を採取する。
トリス−塩酸緩衝液〔５０ｍＭトリス−塩酸(Tris-HCl)
(pH7.6),０．１ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリ
ド(PMSF), ２ｍＭジチオスレイトール(DTT）〕に溶解
し、さらに同上の緩衝液で一晩透析したものをＲＮＲ粗
精製画分として用いる。
遠心分離して上清を採取する。最終濃度が０．６５％
（ｗ／ｖ）になるように硫酸ストレプトマイシン加え、
４℃で３０分間攪拌後、遠心分離して上清を採取する。
次に、最終濃度５０％飽和の硫酸アンモニウムを加え、
４℃で４５分間攪拌後、遠心分離して沈殿を採取する。
トリス−塩酸緩衝液〔５０ｍＭトリス−塩酸(Tris-HCl)
(pH7.6),０．１ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリ
ド(PMSF), ２ｍＭジチオスレイトール(DTT）〕に溶解
し、さらに同上の緩衝液で一晩透析したものをＲＮＲ粗
精製画分として用いる。
【００１９】上記のようにして調製したＲＮＲ粗精製画
分をＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE) に
より分画後、ポリビニリデンジフルオリド膜（以下、Ｐ
ＶＤＦ膜と略記する）にブロッティングする。１％ウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ（以下、ＢＳＡ
溶液と略記する）でブロッキング後、（４）で得られた
抗ＲＮＲ・Ｒ２サブユニットモノクローナル抗体１〜1
０μｇ／ｍｌを室温で２時間または４℃で一晩反応させ
る。ＰＢＳまたはＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎでよく洗浄した
後、第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質、放
射線化合物等で標識した抗マウスイムノグロブリン抗体
又は抗ラットイムノグロブリン抗体１〜５０μｇ／ｍｌ
を５０〜１００μｌ／穴ずつ分注し、室温で１〜２時間
反応させる。よく洗浄した後、第二抗体の標識物質に応
じた反応を行ない、抗ＲＮＲ・Ｒ２サブユニットモノク
ローナル抗体がＲＮＲのＲ２サブユニットの分子量に一
致する４５Ｋダルトンの蛋白質に反応することを確認す
る。
分をＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE) に
より分画後、ポリビニリデンジフルオリド膜（以下、Ｐ
ＶＤＦ膜と略記する）にブロッティングする。１％ウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ（以下、ＢＳＡ
溶液と略記する）でブロッキング後、（４）で得られた
抗ＲＮＲ・Ｒ２サブユニットモノクローナル抗体１〜1
０μｇ／ｍｌを室温で２時間または４℃で一晩反応させ
る。ＰＢＳまたはＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎでよく洗浄した
後、第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質、放
射線化合物等で標識した抗マウスイムノグロブリン抗体
又は抗ラットイムノグロブリン抗体１〜５０μｇ／ｍｌ
を５０〜１００μｌ／穴ずつ分注し、室温で１〜２時間
反応させる。よく洗浄した後、第二抗体の標識物質に応
じた反応を行ない、抗ＲＮＲ・Ｒ２サブユニットモノク
ローナル抗体がＲＮＲのＲ２サブユニットの分子量に一
致する４５Ｋダルトンの蛋白質に反応することを確認す
る。
【００２０】（６）免疫沈降反応を用いるモノクローナ
ル抗体の特異性の検討 （４）で得られる抗ＲＮＲ・Ｒ２サブユニットモノクロ
ーナル抗体の反応特異性を以下に示す免疫沈降反応によ
り調べた。ＥＩＡ用プレートに（４）で得られる抗ＲＮ
Ｒ・Ｒ２サブユニットモノクローナル抗体及び対照とな
る抗体の精製抗体５〜５０μｇ／ｍｌを５０〜２００μ
ｌ／穴となるように加え、４℃で一晩放置しプレートに
吸着させる。ＰＢＳで３回洗浄後、ＢＳＡ溶液を３００
μｌ／穴加えブロッキングする。ＲＮＲのＲ２サブユニ
ットのＣ末ペプチド（１００μｇ／ｍｌ）又はＰＢＳを
５０μｌ／穴で加えて室温で２時間反応させた後、Ｈｅ
ｌａＳ3 などのヒト腫瘍細胞株より調製したＲＮＲの粗
精製画分を１００μｌ／穴加えて混合し、４℃で一晩反
応させる。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、SDS-PAGE用サ
ンプルバッファー（５倍濃度溶液）を５０μｌ／穴加え
２時間室温で振とうする。ＰＢＳで５倍に希釈した後、
２０μｌ／レーンで SDS-PAGE を用いて分画後、常法に
よりＰＶＤＦ膜にブロッティングする。ＢＳＡ溶液など
でブロッキング後、抗ＲＮＲ・Ｒ２サブユニットモノク
ローナル抗体の精製抗体１〜１０μｇ／ｍｌを室温で２
時間反応させる。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄し、第二抗
体としてビオチン、酵素、化学発光物質、放射線化合物
等で標識した抗マウスイムノグロブリン抗体又は抗ラッ
トイムノグロブリン抗体１〜５０μｇ／ｍｌを加え、室
温で１〜２時間反応させる。０．０２％Ｔｗｅｅｎを含
むＰＢＳでよく洗浄した後、第二抗体の標識物質に応じ
た反応を行ない、抗ＲＮＲ・Ｒ２サブユニットモノクロ
ーナル抗体がＲＮＲのＲ２サブユニットの分子量に一致
する４５Ｋダルトンの蛋白質を沈降させることを確認す
る。
ル抗体の特異性の検討 （４）で得られる抗ＲＮＲ・Ｒ２サブユニットモノクロ
ーナル抗体の反応特異性を以下に示す免疫沈降反応によ
り調べた。ＥＩＡ用プレートに（４）で得られる抗ＲＮ
Ｒ・Ｒ２サブユニットモノクローナル抗体及び対照とな
る抗体の精製抗体５〜５０μｇ／ｍｌを５０〜２００μ
ｌ／穴となるように加え、４℃で一晩放置しプレートに
吸着させる。ＰＢＳで３回洗浄後、ＢＳＡ溶液を３００
μｌ／穴加えブロッキングする。ＲＮＲのＲ２サブユニ
ットのＣ末ペプチド（１００μｇ／ｍｌ）又はＰＢＳを
５０μｌ／穴で加えて室温で２時間反応させた後、Ｈｅ
ｌａＳ3 などのヒト腫瘍細胞株より調製したＲＮＲの粗
精製画分を１００μｌ／穴加えて混合し、４℃で一晩反
応させる。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、SDS-PAGE用サ
ンプルバッファー（５倍濃度溶液）を５０μｌ／穴加え
２時間室温で振とうする。ＰＢＳで５倍に希釈した後、
２０μｌ／レーンで SDS-PAGE を用いて分画後、常法に
よりＰＶＤＦ膜にブロッティングする。ＢＳＡ溶液など
でブロッキング後、抗ＲＮＲ・Ｒ２サブユニットモノク
ローナル抗体の精製抗体１〜１０μｇ／ｍｌを室温で２
時間反応させる。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄し、第二抗
体としてビオチン、酵素、化学発光物質、放射線化合物
等で標識した抗マウスイムノグロブリン抗体又は抗ラッ
トイムノグロブリン抗体１〜５０μｇ／ｍｌを加え、室
温で１〜２時間反応させる。０．０２％Ｔｗｅｅｎを含
むＰＢＳでよく洗浄した後、第二抗体の標識物質に応じ
た反応を行ない、抗ＲＮＲ・Ｒ２サブユニットモノクロ
ーナル抗体がＲＮＲのＲ２サブユニットの分子量に一致
する４５Ｋダルトンの蛋白質を沈降させることを確認す
る。
【００２１】（７）モノクローナル抗体のＲＮＲ活性阻
害の検討 Ｐ３８８細胞由来のＲＮＲ粗精製画分によるＣＤＰから
デオキシＣＤＰへの変換量をＲＮＲ活性の指標とし、抗
ＲＮＲ・Ｒ２サブユニットモノクローナル抗体がＲＮＲ
活性を阻害できるか否かを以下のようにして調べる。
（４）で得られる抗ＲＮＲ・Ｒ２サブユニットモノクロ
ーナル抗体の精製抗体を段階希釈して分注し、（５）と
同様の方法で調製したＰ３８８細胞由来のＲＮＲ粗精製
画分を混合して４℃で１〜２時間反応させる。そこにト
リチウムラベルしたＣＤＰを含む溶液を加え、３７℃で
３０分間反応させた後、９５℃で２分間煮沸して反応を
停止させる。さらにCrotalus adamanteus 由来のヘビ毒
を加えて３７℃で２時間インキュベートし、ヌクレオチ
ドをヌクレオシドに変換した後、遠心分離し上清をポリ
エチレンイミン−ボレート−セルロース[polyethylenei
mine(PEI)-borate-cellulose] シート上にスポットす
る。展開溶液（20mMギ酸アンモニウム：エタノール＝
６：４）を用いて展開し、乾燥後、ヌクレオシドとデオ
キシヌクレオシドに相当する部分を切り出し、液体シン
チレーションカウンターを用いて放射活性を測定する。
害の検討 Ｐ３８８細胞由来のＲＮＲ粗精製画分によるＣＤＰから
デオキシＣＤＰへの変換量をＲＮＲ活性の指標とし、抗
ＲＮＲ・Ｒ２サブユニットモノクローナル抗体がＲＮＲ
活性を阻害できるか否かを以下のようにして調べる。
（４）で得られる抗ＲＮＲ・Ｒ２サブユニットモノクロ
ーナル抗体の精製抗体を段階希釈して分注し、（５）と
同様の方法で調製したＰ３８８細胞由来のＲＮＲ粗精製
画分を混合して４℃で１〜２時間反応させる。そこにト
リチウムラベルしたＣＤＰを含む溶液を加え、３７℃で
３０分間反応させた後、９５℃で２分間煮沸して反応を
停止させる。さらにCrotalus adamanteus 由来のヘビ毒
を加えて３７℃で２時間インキュベートし、ヌクレオチ
ドをヌクレオシドに変換した後、遠心分離し上清をポリ
エチレンイミン−ボレート−セルロース[polyethylenei
mine(PEI)-borate-cellulose] シート上にスポットす
る。展開溶液（20mMギ酸アンモニウム：エタノール＝
６：４）を用いて展開し、乾燥後、ヌクレオシドとデオ
キシヌクレオシドに相当する部分を切り出し、液体シン
チレーションカウンターを用いて放射活性を測定する。
【００２２】（８）モノクローナル抗体を用いた免疫細
胞染色 浮遊細胞についてはそのまま、付着細胞についてはトリ
プシンＥＤＴＡ（０．１％トリプシン及び０．０２％Ｅ
ＤＴＡを含むＰＢＳ）で細胞をはがした後、１×１０6
個ずつ分注する。ＰＢＳで洗浄後、用時調製した４％パ
ラホルムアルデヒドを１００〜５００μｌずつ分注し、
室温で３０分間放置し固定する。ＰＢＳで洗浄後、細胞
膜の抗体透過性を上げるため、メタノールを１００〜５
００μｌずつ分注し、−２０℃で２分間処理する。ＰＢ
Ｓで洗浄後、１０％正常ヒト血清を１００〜５００μｌ
ずつ分注し室温で３０分間ブロッキングした後、（４）
で得られる抗ＲＮＲ・Ｒ２サブユニットモノクローナル
抗体の精製抗体１〜１０μｇ／ｍｌを加えて室温で３０
分間反応させる。ＰＢＳで洗浄後、ＦＩＴＣなどの蛍光
色素で標識した抗マウスイムノグロブリン抗体もしくは
抗ラットイムノグロブリン抗体１〜５０μｇ／ｍｌを１
００〜５００μｌずつ分注し、４℃で３０分間遮光して
反応させる。反応後、よくＰＢＳで洗浄した後、セルソ
ーターにより解析する。
胞染色 浮遊細胞についてはそのまま、付着細胞についてはトリ
プシンＥＤＴＡ（０．１％トリプシン及び０．０２％Ｅ
ＤＴＡを含むＰＢＳ）で細胞をはがした後、１×１０6
個ずつ分注する。ＰＢＳで洗浄後、用時調製した４％パ
ラホルムアルデヒドを１００〜５００μｌずつ分注し、
室温で３０分間放置し固定する。ＰＢＳで洗浄後、細胞
膜の抗体透過性を上げるため、メタノールを１００〜５
００μｌずつ分注し、−２０℃で２分間処理する。ＰＢ
Ｓで洗浄後、１０％正常ヒト血清を１００〜５００μｌ
ずつ分注し室温で３０分間ブロッキングした後、（４）
で得られる抗ＲＮＲ・Ｒ２サブユニットモノクローナル
抗体の精製抗体１〜１０μｇ／ｍｌを加えて室温で３０
分間反応させる。ＰＢＳで洗浄後、ＦＩＴＣなどの蛍光
色素で標識した抗マウスイムノグロブリン抗体もしくは
抗ラットイムノグロブリン抗体１〜５０μｇ／ｍｌを１
００〜５００μｌずつ分注し、４℃で３０分間遮光して
反応させる。反応後、よくＰＢＳで洗浄した後、セルソ
ーターにより解析する。
【００２３】抗体染色とＤＮＡ染色との２重染色を行う
場合には、抗体染色を上記のように行った後、０．２５
ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ（シグマ社製）及び０．１％Ｎ
Ｐ４０を含むＰＢＳを１×１０6 細胞あたり０．９ｍｌ
加え、３７℃で３０分間反応させる。さらに５００μｇ
／ｍｌのＰＩ（プロピウムイオダイト）及び１．０％Ｎ
Ｐ４０を含むＰＢＳを１×１０6 細胞あたり０．１ｍｌ
加えて混合し、氷冷中で２０分間以上反応させセルソー
ターで解析する。
場合には、抗体染色を上記のように行った後、０．２５
ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ（シグマ社製）及び０．１％Ｎ
Ｐ４０を含むＰＢＳを１×１０6 細胞あたり０．９ｍｌ
加え、３７℃で３０分間反応させる。さらに５００μｇ
／ｍｌのＰＩ（プロピウムイオダイト）及び１．０％Ｎ
Ｐ４０を含むＰＢＳを１×１０6 細胞あたり０．１ｍｌ
加えて混合し、氷冷中で２０分間以上反応させセルソー
ターで解析する。
【００２４】（９）モノクローナル抗体を用いた免疫組
織染色 ヒト各種組織のホリマリン固定パラフィン包埋組織を１
〜５ミクロンの厚さに薄切し、卵白アルブミンをコート
したスライドガラス上に固定する。キシレンで脱パラフ
ィン後、アルコール−水で段階的に親水化する。凍結切
片の場合には冷アセトン中で２０分間固定する。その
後、０. ３％過酸化水素を含むメタノール中で３０分間
処理し、内因性ペルオキシダーゼをブロックする。切片
をＰＢＳで洗浄後、希釈したウマ正常血清中で２０分間
ブロッキングし、（４）で得られる抗ＲＮＲ・Ｒ２サブ
ユニットモノクローナル抗体の精製抗体１〜1 ０μｇ／
ｍｌを４℃で１２時間反応させる。よく洗浄した後、第
二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質、放射線化
合物等で標識した抗マウスイムノグロブリン抗体又は抗
ラットイムノグロブリン抗体１〜５０μｇ／ｍｌを加え
て室温で３０分間反応させ、洗浄した後、第二抗体の標
識物質に応じた反応を行なう。氷冷中で反応を停止させ
た後、ホリマリン固定パラフィン包埋組織の場合にはヘ
マトキシレンで核染色し、アルコール−水およびキシレ
ンで脱水後、カナダバルサムで固定し、顕鏡する。凍結
切片の場合にはグリセリン−ＰＢＳで固定し、顕鏡す
る。
織染色 ヒト各種組織のホリマリン固定パラフィン包埋組織を１
〜５ミクロンの厚さに薄切し、卵白アルブミンをコート
したスライドガラス上に固定する。キシレンで脱パラフ
ィン後、アルコール−水で段階的に親水化する。凍結切
片の場合には冷アセトン中で２０分間固定する。その
後、０. ３％過酸化水素を含むメタノール中で３０分間
処理し、内因性ペルオキシダーゼをブロックする。切片
をＰＢＳで洗浄後、希釈したウマ正常血清中で２０分間
ブロッキングし、（４）で得られる抗ＲＮＲ・Ｒ２サブ
ユニットモノクローナル抗体の精製抗体１〜1 ０μｇ／
ｍｌを４℃で１２時間反応させる。よく洗浄した後、第
二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質、放射線化
合物等で標識した抗マウスイムノグロブリン抗体又は抗
ラットイムノグロブリン抗体１〜５０μｇ／ｍｌを加え
て室温で３０分間反応させ、洗浄した後、第二抗体の標
識物質に応じた反応を行なう。氷冷中で反応を停止させ
た後、ホリマリン固定パラフィン包埋組織の場合にはヘ
マトキシレンで核染色し、アルコール−水およびキシレ
ンで脱水後、カナダバルサムで固定し、顕鏡する。凍結
切片の場合にはグリセリン−ＰＢＳで固定し、顕鏡す
る。
【００２５】以下に本発明の実施例を示す。
【００２６】
実施例１ （１）免疫原の調製 配列番号１に示したアミノ酸配列を有するヒトＲＮＲの
Ｒ２サブユニットのＣ末ペプチドを合成した後、免疫原
性を高める目的で以下のようにしてＫＬＨ（カルビオケ
ム社製）とのコンジュゲートを作製し、免疫原とした。
Ｒ２サブユニットのＣ末ペプチドを合成した後、免疫原
性を高める目的で以下のようにしてＫＬＨ（カルビオケ
ム社製）とのコンジュゲートを作製し、免疫原とした。
【００２７】ＫＬＨをＰＢＳに溶解して１０ｍｇ／ｍｌ
となるようにし、１／１０容量の２５ｍｇ／ｍｌのＮ−
（ｍ−マレイミドベンゾイルオキシ）スクシンイミド
（ＭＢＳ；ナカライテスク社製）を滴下して３０分間反
応させた。予めＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ−
２５カラム（ファルマシア社製）で遊離のＭＢＳを除い
て得られたＫＬＨ−ＭＢＳの２．５ｍｇを０．１Ｍリン
酸ナトリウム緩衝液（pH7.0)に溶解したヒトＲＮＲのＲ
２サブユニットのＣ末ペプチド１ｍｇと混合し、室温で
３時間、攪拌して反応させた。反応後、０．５Ｍ塩化ナ
トリウムを含むＰＢＳで透析したものを免疫原とした。
となるようにし、１／１０容量の２５ｍｇ／ｍｌのＮ−
（ｍ−マレイミドベンゾイルオキシ）スクシンイミド
（ＭＢＳ；ナカライテスク社製）を滴下して３０分間反
応させた。予めＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ−
２５カラム（ファルマシア社製）で遊離のＭＢＳを除い
て得られたＫＬＨ−ＭＢＳの２．５ｍｇを０．１Ｍリン
酸ナトリウム緩衝液（pH7.0)に溶解したヒトＲＮＲのＲ
２サブユニットのＣ末ペプチド１ｍｇと混合し、室温で
３時間、攪拌して反応させた。反応後、０．５Ｍ塩化ナ
トリウムを含むＰＢＳで透析したものを免疫原とした。
【００２８】（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製 （１）で得られたヒトＲＮＲのＲ２サブユニットのＣ末
ペプチド−ＫＬＨコンジュゲート１００μｇをアルミニ
ウムゲル２ｍｇおよび百日咳ワクチン（千葉県血清研究
所製）１×１０9 細胞とともに５週令ＳＤ系雌ラットに
投与し、２週間後より１００μｇの上記コンジュゲート
を１週間に１回、計４回投与した。眼底静脈叢より採血
し、その血清抗体価を以下に示す酵素免疫測定法で調
べ、十分な抗体価を示したラットから最終免疫３日後に
脾臓を摘出した。
ペプチド−ＫＬＨコンジュゲート１００μｇをアルミニ
ウムゲル２ｍｇおよび百日咳ワクチン（千葉県血清研究
所製）１×１０9 細胞とともに５週令ＳＤ系雌ラットに
投与し、２週間後より１００μｇの上記コンジュゲート
を１週間に１回、計４回投与した。眼底静脈叢より採血
し、その血清抗体価を以下に示す酵素免疫測定法で調
べ、十分な抗体価を示したラットから最終免疫３日後に
脾臓を摘出した。
【００２９】脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細
断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（１，２００ｒｐ
ｍ、５分間）した後、上清を捨て、トリス−塩化アンモ
ニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理して赤
血球を除去し、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、細胞融合に用
いた。酵素免疫測定法 グルタールアルデヒド法を用い、酵素免疫測定用の抗原
として、ヒトＲＮＲ・Ｒ２サブユニットのＣ末ペプチド
のサイクログロブリン（ＴＨＹ）コンジュゲートを以下
のようにして作製した。
断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（１，２００ｒｐ
ｍ、５分間）した後、上清を捨て、トリス−塩化アンモ
ニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理して赤
血球を除去し、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、細胞融合に用
いた。酵素免疫測定法 グルタールアルデヒド法を用い、酵素免疫測定用の抗原
として、ヒトＲＮＲ・Ｒ２サブユニットのＣ末ペプチド
のサイクログロブリン（ＴＨＹ）コンジュゲートを以下
のようにして作製した。
【００３０】ヒトＲＮＲ・Ｒ２サブユニットのＣ末ペプ
チド１ｍｇを０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液に溶解
し、同じ緩衝液に溶解したＴＨＹ５ｍｇを加え、全量で
１ｍｌにした。攪拌下、０．０２Ｍグルタールアルデヒ
ド５４０μｌを滴下し、室温で５時間攪拌して反応させ
た。反応後、ＰＢＳで一晩透析したものを抗原として用
いた。
チド１ｍｇを０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液に溶解
し、同じ緩衝液に溶解したＴＨＹ５ｍｇを加え、全量で
１ｍｌにした。攪拌下、０．０２Ｍグルタールアルデヒ
ド５４０μｌを滴下し、室温で５時間攪拌して反応させ
た。反応後、ＰＢＳで一晩透析したものを抗原として用
いた。
【００３１】９６穴のＥＩＡ用プレート（グライナー社
製）に、上述のように調製したＴＨＹ−ヒトＲＮＲ・Ｒ
２サブユニットのＣ末ペプチドコンジュゲート又は対照
抗原としてＴＨＹ−ＳＯＸ４７−３（ＳＯＸ４７−３ペ
プチドとＴＨＹのコンジュゲート；配列番号２にＳＯＸ
４７−３ペプチドのアミノ酸配列を示した。）１０μｇ
／ｍｌを５０μｌ／穴ずつ分注し、４℃で一晩放置して
プレートに吸着させた。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−
ＰＢＳを１００μｌ／穴加え、室温で１時間反応させて
残っている活性基をブロックした。１％ＢＳＡ−ＰＢＳ
を捨て、ハイブリドーマの培養上清または免疫したラッ
トの抗血清を５０μｌ／穴ずつ分注し２時間反応させ
た。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ペルオキシダーゼ標
識ウサギ抗ラットイムノグロブリン（ダコ社製）を５０
μｌ／穴ずつ加えて室温で１時間反応させ、Ｔｗｅｅｎ
−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液〔２．２−アジノビ
ス（３−エチルベンゾチアゾール−６−スルホン酸）ア
ンモニウム〕を用いて発色させOD415nm の吸光度を吸光
度計（NJ2001; 日本インターメッド社製）で測定した。
製）に、上述のように調製したＴＨＹ−ヒトＲＮＲ・Ｒ
２サブユニットのＣ末ペプチドコンジュゲート又は対照
抗原としてＴＨＹ−ＳＯＸ４７−３（ＳＯＸ４７−３ペ
プチドとＴＨＹのコンジュゲート；配列番号２にＳＯＸ
４７−３ペプチドのアミノ酸配列を示した。）１０μｇ
／ｍｌを５０μｌ／穴ずつ分注し、４℃で一晩放置して
プレートに吸着させた。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−
ＰＢＳを１００μｌ／穴加え、室温で１時間反応させて
残っている活性基をブロックした。１％ＢＳＡ−ＰＢＳ
を捨て、ハイブリドーマの培養上清または免疫したラッ
トの抗血清を５０μｌ／穴ずつ分注し２時間反応させ
た。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ペルオキシダーゼ標
識ウサギ抗ラットイムノグロブリン（ダコ社製）を５０
μｌ／穴ずつ加えて室温で１時間反応させ、Ｔｗｅｅｎ
−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液〔２．２−アジノビ
ス（３−エチルベンゾチアゾール−６−スルホン酸）ア
ンモニウム〕を用いて発色させOD415nm の吸光度を吸光
度計（NJ2001; 日本インターメッド社製）で測定した。
【００３２】（３）マウス骨髄腫細胞の調製 ８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｕ１を
正常培地で培養し、細胞融合時に２×１０7 以上の細胞
を確保し、細胞融合に親株として供した。 （４）ハイブリドーマの作製 （２）で得られたマウス脾細胞と（３）で得られた骨髄
腫細胞とを１０：１になるよう混合し、遠心分離（１，
２００ｒｐｍ、５分間）した後、上清を捨て、沈澱した
細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、３７℃でポリ
エチレングリコール−１，０００（ＰＥＧ−１，００
０）２ｇ、ＭＥＭ培地２ｍｌおよびジメチルスルホキシ
ド０．７ｍｌの混液を１×１０8 マウス脾細胞当たり
０．２〜１ｍｌになるように加え、１〜２分間毎にＭＥ
Ｍ培地１〜２ｍｌを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて
全量が５０ｍｌになるようにした。遠心分離（９００ｒ
ｐｍ、５分間）後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐ
した後、メスピペットによる吸込み、吸出しでゆるやか
に細胞をＨＡＴ培地１００ｍｌ中に懸濁した。
正常培地で培養し、細胞融合時に２×１０7 以上の細胞
を確保し、細胞融合に親株として供した。 （４）ハイブリドーマの作製 （２）で得られたマウス脾細胞と（３）で得られた骨髄
腫細胞とを１０：１になるよう混合し、遠心分離（１，
２００ｒｐｍ、５分間）した後、上清を捨て、沈澱した
細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、３７℃でポリ
エチレングリコール−１，０００（ＰＥＧ−１，００
０）２ｇ、ＭＥＭ培地２ｍｌおよびジメチルスルホキシ
ド０．７ｍｌの混液を１×１０8 マウス脾細胞当たり
０．２〜１ｍｌになるように加え、１〜２分間毎にＭＥ
Ｍ培地１〜２ｍｌを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて
全量が５０ｍｌになるようにした。遠心分離（９００ｒ
ｐｍ、５分間）後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐ
した後、メスピペットによる吸込み、吸出しでゆるやか
に細胞をＨＡＴ培地１００ｍｌ中に懸濁した。
【００３３】この懸濁液を９６穴培養用プレートに１０
０μｌ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ2インキュベーター
中、３７℃で１０〜１４日間ＣＯ2 ５％下で培養した。
この培養上清を前記酵素免疫測定法で調べ、ＲＮＲのＲ
２サブユニットＣ末ペプチドに特異的に反応する穴を選
び、さらにＨＴ培地と正常培地に換え、２回クローニン
グを繰り返して、抗ＲＮＲ・Ｒ２サブユニットモノクロ
ーナル抗体を生産するハイブリドーマ株を確立した。そ
の結果、図１に示したようにハイブリドーマ株ＫＭ１０
５４、ＫＭ１０５６及びＫＭ１０６０が選択された。各
々のハイブリドーマが生産するモノクローナル抗体の抗
体クラスはサブクラスタイピングキットを用いた酵素免
疫測定法により決定した。その結果を第１表に示す。
０μｌ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ2インキュベーター
中、３７℃で１０〜１４日間ＣＯ2 ５％下で培養した。
この培養上清を前記酵素免疫測定法で調べ、ＲＮＲのＲ
２サブユニットＣ末ペプチドに特異的に反応する穴を選
び、さらにＨＴ培地と正常培地に換え、２回クローニン
グを繰り返して、抗ＲＮＲ・Ｒ２サブユニットモノクロ
ーナル抗体を生産するハイブリドーマ株を確立した。そ
の結果、図１に示したようにハイブリドーマ株ＫＭ１０
５４、ＫＭ１０５６及びＫＭ１０６０が選択された。各
々のハイブリドーマが生産するモノクローナル抗体の抗
体クラスはサブクラスタイピングキットを用いた酵素免
疫測定法により決定した。その結果を第１表に示す。
【００３４】
【表１】
【００３５】（５）モノクローナル抗体の精製 プリスタン処理した８週令ヌード雌マウス（Balb/c）に
（４）で得られたハイブリドーマを５〜２０×１０6 細
胞／匹それぞれ腹腔内注射した。１０〜２１日後に、ハ
イブリドーマは腹水癌化した。腹水のたまったマウスか
ら、腹水を採取（１〜８ｍｌ／匹）し、遠心分離（３，
０００ｒｐｍ、５分間）して固形分を除去した後、カプ
リル酸沈殿法（Antibodies-A Laboratory Manual,Cold
Spring Harbor Laboratory,1988 ）により精製し、精製
モノクローナル抗体とした。
（４）で得られたハイブリドーマを５〜２０×１０6 細
胞／匹それぞれ腹腔内注射した。１０〜２１日後に、ハ
イブリドーマは腹水癌化した。腹水のたまったマウスか
ら、腹水を採取（１〜８ｍｌ／匹）し、遠心分離（３，
０００ｒｐｍ、５分間）して固形分を除去した後、カプ
リル酸沈殿法（Antibodies-A Laboratory Manual,Cold
Spring Harbor Laboratory,1988 ）により精製し、精製
モノクローナル抗体とした。
【００３６】（６）ウエスタンブロッティングによるモ
ノクローナル抗体の特異性の検討 以下のようにしてＨｅｌａＳ3 細胞よりＲＮＲ粗精製画
分を調製した。ＨｅｌａＳ3 細胞１×１０9 個を細胞可
溶化バッファー〔２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．
６），１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，２ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ
ＰＭＳＦ〕３０ｍｌに懸濁し、３０分間氷冷下静置し
た後ホモジネートを調製した。３５，０００×ｇで３０
分間遠心分離して上清を採取し、最終濃度が０．６５％
（ｗ／ｖ）になるように硫酸ストレプトマイシンを加え
た。４℃で３０分間攪拌後、１３，０００×ｇで２０分
間遠心分離して上清を採取した。得られた上清に最終濃
度が５０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加え、
４℃で４５分間攪拌後、１３，０００×ｇで２０分間遠
心分離して沈殿を得た。これを４ｍｌのトリス−塩酸緩
衝液［５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．６），０．１ｍ
Ｍ ＰＭＳＦ，２ｍＭ ＤＴＴ］に溶解し、さらに同上
の緩衝液で一晩透析したものをＲＮＲ粗精製画分として
用いた。
ノクローナル抗体の特異性の検討 以下のようにしてＨｅｌａＳ3 細胞よりＲＮＲ粗精製画
分を調製した。ＨｅｌａＳ3 細胞１×１０9 個を細胞可
溶化バッファー〔２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．
６），１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，２ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ
ＰＭＳＦ〕３０ｍｌに懸濁し、３０分間氷冷下静置し
た後ホモジネートを調製した。３５，０００×ｇで３０
分間遠心分離して上清を採取し、最終濃度が０．６５％
（ｗ／ｖ）になるように硫酸ストレプトマイシンを加え
た。４℃で３０分間攪拌後、１３，０００×ｇで２０分
間遠心分離して上清を採取した。得られた上清に最終濃
度が５０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加え、
４℃で４５分間攪拌後、１３，０００×ｇで２０分間遠
心分離して沈殿を得た。これを４ｍｌのトリス−塩酸緩
衝液［５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．６），０．１ｍ
Ｍ ＰＭＳＦ，２ｍＭ ＤＴＴ］に溶解し、さらに同上
の緩衝液で一晩透析したものをＲＮＲ粗精製画分として
用いた。
【００３７】このＲＮＲ粗精製画分を４０μｇ／レーン
及び８μｇ／レーンでＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画後、常法
によりＰＶＤＦ膜にブロッティングした。１％ＢＳＡ−
ＰＢＳでブロッキング後、（５）で得られた抗ヒトＲＮ
Ｒ・Ｒ２サブユニットモノクローナル抗体ＫＭ１０５
４、ＫＭ１０５６、ＫＭ１０６０のそれぞれ１０μｇ／
ｍｌ及び対照抗体として正常ラット血清（１％ＢＳＡ−
ＰＢＳで５００倍に希釈したもの）を、室温で２時間ま
たは４℃で一晩反応させた。また、それぞれの抗体につ
いて、予めＲＮＲのＣ末ペプチド（最終濃度１０μｇ／
ｍｌ）と室温で１時間反応させたものも同様に反応させ
た。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳでよく洗浄した後、ペルオキシ
ダーゼ標識抗ラットイムノグロブリン抗体（ダコ社製）
を室温で１時間反応させた。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳでよく
洗浄した後よく液を除き、ＥＣＬ試薬（Amersham社製）
を加えて１分間反応させた。反応後、余分な試薬を除去
し、フィルムを１０秒〜２分間程度感光させ検出を行っ
た。その結果、図２に示すようにＫＭ１０５４、ＫＭ１
０５６及びＫＭ１０６０はいずれもＲＮＲ・Ｒ２サブユ
ニットの分子量に一致する４５Ｋダルトンの蛋白質に反
応したが、予めＲ２サブユニットのＣ末ペプチドと反応
させた抗体は、反応しなかった。
及び８μｇ／レーンでＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画後、常法
によりＰＶＤＦ膜にブロッティングした。１％ＢＳＡ−
ＰＢＳでブロッキング後、（５）で得られた抗ヒトＲＮ
Ｒ・Ｒ２サブユニットモノクローナル抗体ＫＭ１０５
４、ＫＭ１０５６、ＫＭ１０６０のそれぞれ１０μｇ／
ｍｌ及び対照抗体として正常ラット血清（１％ＢＳＡ−
ＰＢＳで５００倍に希釈したもの）を、室温で２時間ま
たは４℃で一晩反応させた。また、それぞれの抗体につ
いて、予めＲＮＲのＣ末ペプチド（最終濃度１０μｇ／
ｍｌ）と室温で１時間反応させたものも同様に反応させ
た。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳでよく洗浄した後、ペルオキシ
ダーゼ標識抗ラットイムノグロブリン抗体（ダコ社製）
を室温で１時間反応させた。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳでよく
洗浄した後よく液を除き、ＥＣＬ試薬（Amersham社製）
を加えて１分間反応させた。反応後、余分な試薬を除去
し、フィルムを１０秒〜２分間程度感光させ検出を行っ
た。その結果、図２に示すようにＫＭ１０５４、ＫＭ１
０５６及びＫＭ１０６０はいずれもＲＮＲ・Ｒ２サブユ
ニットの分子量に一致する４５Ｋダルトンの蛋白質に反
応したが、予めＲ２サブユニットのＣ末ペプチドと反応
させた抗体は、反応しなかった。
【００３８】（７）免疫沈降反応を用いるモノクローナ
ル抗体の特異性の検討 ＥＩＡ用プレートに抗ＲＮＲ・Ｒ２サブユニットモノク
ローナル抗体ＫＭ１０５４、ＫＭ１０５６、ＫＭ１０６
０及び対照抗体としてラットＩｇＧ抗体ＫＭ１０２４
（５０μｇ／ｍｌ）を２００μｌ／穴加え、４℃で一晩
プレートにコートした。［なお、ＫＭ１０２４について
の記載文献および寄託はないが、ＫＭ１０２４のかわり
に、全く同一の抗体であるＫＭ９８７を用いることもで
きる。ＫＭ９８７については、（J.B.C.268 (34) 2584
6, 1993）に記載されている。］ＰＢＳで３回洗浄後、
１％ＢＳＡ−ＰＢＳを３００μｌ／穴加え、室温で１時
間ブロッキングした。これにＲＮＲ・Ｒ２サブユニット
のＣ末ペプチド（１００μｇ／ｍｌ）またはＰＢＳを５
０μｌ／穴加えて室温で２時間反応させた後、ＲＮＲの
粗精製画分（７．６７ｍｇ／ｍｌ）を１００μｌ／穴加
えて混合し、４℃で一晩反応させた。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢ
Ｓで洗浄後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー
（２５％ ２−メルカプトエタノール添加、５倍濃度溶
液）を５０μｌ／穴加え、２時間室温で振とうした。Ｐ
ＢＳで５倍に希釈した後、各々２０μｌ／レーンでＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥで分画後、常法によりＰＶＤＦ膜にブロッ
ティングした。１％ＢＳＡを含むＰＢＳでブロッキング
後、抗体混合液（モノクローナル抗体ＫＭ１０５４、Ｋ
Ｍ１０５６、ＫＭ１０６０及びＫＭ１０２４を各々１０
μｇ／ｍｌを含む１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液）を室温で２
時間反応させた。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄し、ペルオ
キシダーゼ標識ウサギ抗ラットイムノグロブリン（ダコ
社製）を加えて室温で１時間反応させた後、（６）と同
様にしてＥＣＬ試薬を用いた反応を行い、検出を行っ
た。その結果、図３に示すようにモノクローナル抗体Ｋ
Ｍ１０５４とＫＭ１０５６のみがＲＮＲ・Ｒ２サブユニ
ットの分子量に一致する４５Ｋダルトンの蛋白質を沈降
させたが、予めＲ２サブユニットＣ末ペプチドと反応さ
せた抗体は、反応しなかった。
ル抗体の特異性の検討 ＥＩＡ用プレートに抗ＲＮＲ・Ｒ２サブユニットモノク
ローナル抗体ＫＭ１０５４、ＫＭ１０５６、ＫＭ１０６
０及び対照抗体としてラットＩｇＧ抗体ＫＭ１０２４
（５０μｇ／ｍｌ）を２００μｌ／穴加え、４℃で一晩
プレートにコートした。［なお、ＫＭ１０２４について
の記載文献および寄託はないが、ＫＭ１０２４のかわり
に、全く同一の抗体であるＫＭ９８７を用いることもで
きる。ＫＭ９８７については、（J.B.C.268 (34) 2584
6, 1993）に記載されている。］ＰＢＳで３回洗浄後、
１％ＢＳＡ−ＰＢＳを３００μｌ／穴加え、室温で１時
間ブロッキングした。これにＲＮＲ・Ｒ２サブユニット
のＣ末ペプチド（１００μｇ／ｍｌ）またはＰＢＳを５
０μｌ／穴加えて室温で２時間反応させた後、ＲＮＲの
粗精製画分（７．６７ｍｇ／ｍｌ）を１００μｌ／穴加
えて混合し、４℃で一晩反応させた。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢ
Ｓで洗浄後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー
（２５％ ２−メルカプトエタノール添加、５倍濃度溶
液）を５０μｌ／穴加え、２時間室温で振とうした。Ｐ
ＢＳで５倍に希釈した後、各々２０μｌ／レーンでＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥで分画後、常法によりＰＶＤＦ膜にブロッ
ティングした。１％ＢＳＡを含むＰＢＳでブロッキング
後、抗体混合液（モノクローナル抗体ＫＭ１０５４、Ｋ
Ｍ１０５６、ＫＭ１０６０及びＫＭ１０２４を各々１０
μｇ／ｍｌを含む１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液）を室温で２
時間反応させた。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄し、ペルオ
キシダーゼ標識ウサギ抗ラットイムノグロブリン（ダコ
社製）を加えて室温で１時間反応させた後、（６）と同
様にしてＥＣＬ試薬を用いた反応を行い、検出を行っ
た。その結果、図３に示すようにモノクローナル抗体Ｋ
Ｍ１０５４とＫＭ１０５６のみがＲＮＲ・Ｒ２サブユニ
ットの分子量に一致する４５Ｋダルトンの蛋白質を沈降
させたが、予めＲ２サブユニットＣ末ペプチドと反応さ
せた抗体は、反応しなかった。
【００３９】（８）モノクローナル抗体のＲＮＲ活性の
阻害作用 Ｐ３８８細胞由来のＲＮＲ粗精製画分によるＣＤＰから
デオキシＣＤＰへの変換量をＲＮＲ活性の指標とし、抗
ＲＮＲ・Ｒ２サブユニットモノクローナル抗体がＲＮＲ
活性を阻害できるか否かを以下のようにして調べた。
（５）で得られた抗ＲＮＲ・Ｒ２サブユニットモノクロ
ーナル抗体ＫＭ１０５４及びＫＭ１０５６の精製抗体を
０．１〜１００μｇ／ｍｌに段階希釈した後、５０μｌ
を採り、Ｐ３８８細胞由来のＲＮＲ粗精製画分０．７５
ｍｇ／５０μｌと混合して４℃で１〜２時間反応させ
た。これにトリチウムラベルしたＣＤＰを含む基質溶液
〔５ｍＭ ＡＴＰ，５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，５０ｍＭ Ｈ
ｅｐｅｓ（ｐＨ７．４），５ｍＭ ＤＴＴ，１０ｍＭ
ＮａＦ，０．５ｍＭ ＣＤＰ，3 Ｈ−ＣＤＰ １．２５
μＣｉ〕２５μｌを加え、３７℃で３０分間反応させた
後、９５℃で２分間煮沸して反応を停止させた。さらに
２０ｍｇ／ｍｌのCrotalus adamanteus 由来ヘビ毒２５
μｌを加えて３７℃で２時間インキュベートしてヌクレ
オチドをヌクレオシドに変換した後、９５℃で２分間煮
沸して反応を停止させた。遠心分離（５０００ｒｐｍ，
２分間）して得た上清１０μｌをポリエチレンイミン−
ボレート−セルロース〔polyethyleneimine(PEI)-borat
e-cellulose 〕シート上にスポットし、展開バッファー
（２０ｍＭギ酸アンモニウム：エタノール＝６：４）中
で展開し、乾燥後、ヌクレオシドとデオキシヌクレオシ
ドに相当する部分を切り出し、液体シンチレーションカ
ウンターで放射活性を測定した。その結果、図４に示す
ように、モノクローナル抗体ＫＭ１０５４及びＫＭ１０
５６はいずれも濃度依存的に、ＲＮＲ活性を阻害した。
阻害作用 Ｐ３８８細胞由来のＲＮＲ粗精製画分によるＣＤＰから
デオキシＣＤＰへの変換量をＲＮＲ活性の指標とし、抗
ＲＮＲ・Ｒ２サブユニットモノクローナル抗体がＲＮＲ
活性を阻害できるか否かを以下のようにして調べた。
（５）で得られた抗ＲＮＲ・Ｒ２サブユニットモノクロ
ーナル抗体ＫＭ１０５４及びＫＭ１０５６の精製抗体を
０．１〜１００μｇ／ｍｌに段階希釈した後、５０μｌ
を採り、Ｐ３８８細胞由来のＲＮＲ粗精製画分０．７５
ｍｇ／５０μｌと混合して４℃で１〜２時間反応させ
た。これにトリチウムラベルしたＣＤＰを含む基質溶液
〔５ｍＭ ＡＴＰ，５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，５０ｍＭ Ｈ
ｅｐｅｓ（ｐＨ７．４），５ｍＭ ＤＴＴ，１０ｍＭ
ＮａＦ，０．５ｍＭ ＣＤＰ，3 Ｈ−ＣＤＰ １．２５
μＣｉ〕２５μｌを加え、３７℃で３０分間反応させた
後、９５℃で２分間煮沸して反応を停止させた。さらに
２０ｍｇ／ｍｌのCrotalus adamanteus 由来ヘビ毒２５
μｌを加えて３７℃で２時間インキュベートしてヌクレ
オチドをヌクレオシドに変換した後、９５℃で２分間煮
沸して反応を停止させた。遠心分離（５０００ｒｐｍ，
２分間）して得た上清１０μｌをポリエチレンイミン−
ボレート−セルロース〔polyethyleneimine(PEI)-borat
e-cellulose 〕シート上にスポットし、展開バッファー
（２０ｍＭギ酸アンモニウム：エタノール＝６：４）中
で展開し、乾燥後、ヌクレオシドとデオキシヌクレオシ
ドに相当する部分を切り出し、液体シンチレーションカ
ウンターで放射活性を測定した。その結果、図４に示す
ように、モノクローナル抗体ＫＭ１０５４及びＫＭ１０
５６はいずれも濃度依存的に、ＲＮＲ活性を阻害した。
【００４０】実施例２ （１）モノクローナル抗体の癌細胞との反応性の検討 実施例１で得られたモノクローナル抗体ＫＭ１０５４及
びＫＭ１０５６の種々の癌細胞との反応性を以下のよう
にして調べた。癌細胞としては、ヒト胃癌細胞株ＮＵＧ
Ｃ−４, ヒト甲状腺癌細胞株ＴＰＣ−１，ヒト肺癌Ｃａ
ｌｕ−１（ＡＴＣＣ ＨＴＢ５４）及びヒト白血病細胞
株Ｕ９３７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５９３）を用いた。浮
遊細胞はそのまま、付着細胞についてはトリプシンＥＤ
ＴＡで細胞をはがした後、１×１０6 個ずつ分注してＰ
ＢＳで洗浄後、用時調製した４％パラホルムアルデヒド
を５００μｌずつ分注し、室温で３０分間放置して固定
した。ＰＢＳで洗浄後、細胞膜の抗体透過性を上げるた
め、メタノールを５００μｌずつ分注し、−２０℃で２
分間処理した。ＰＢＳで洗浄後、１０％正常ヒト血清を
５００μｌずつ分注して室温で３０分間ブロッキングし
た後、モノクローナル抗体ＫＭ１０５４、ＫＭ１０５６
又はＫＭ１０２４（１０μｇ／ｍｌ）を２００μｌずつ
加えて室温で３０分間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、Ｆ
ＩＴＣ標識抗ラットイムノグロブリン抗体（ダコ社製）
を２００μｌずつ分注し、４℃で３０分間遮光して反応
させた。反応後、よくＰＢＳで洗浄した後、セルソータ
ー〔エピックス・エリート（コールター社製）〕を用い
て解析した。その結果、図５に示すように、モノクロー
ナル抗体ＫＭ１０５４とＫＭ１０５６はいずれも全ての
癌細胞株に反応し、癌細胞に幅広く存在するＲＮＲの検
出に利用できることが示された。
びＫＭ１０５６の種々の癌細胞との反応性を以下のよう
にして調べた。癌細胞としては、ヒト胃癌細胞株ＮＵＧ
Ｃ−４, ヒト甲状腺癌細胞株ＴＰＣ−１，ヒト肺癌Ｃａ
ｌｕ−１（ＡＴＣＣ ＨＴＢ５４）及びヒト白血病細胞
株Ｕ９３７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５９３）を用いた。浮
遊細胞はそのまま、付着細胞についてはトリプシンＥＤ
ＴＡで細胞をはがした後、１×１０6 個ずつ分注してＰ
ＢＳで洗浄後、用時調製した４％パラホルムアルデヒド
を５００μｌずつ分注し、室温で３０分間放置して固定
した。ＰＢＳで洗浄後、細胞膜の抗体透過性を上げるた
め、メタノールを５００μｌずつ分注し、−２０℃で２
分間処理した。ＰＢＳで洗浄後、１０％正常ヒト血清を
５００μｌずつ分注して室温で３０分間ブロッキングし
た後、モノクローナル抗体ＫＭ１０５４、ＫＭ１０５６
又はＫＭ１０２４（１０μｇ／ｍｌ）を２００μｌずつ
加えて室温で３０分間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、Ｆ
ＩＴＣ標識抗ラットイムノグロブリン抗体（ダコ社製）
を２００μｌずつ分注し、４℃で３０分間遮光して反応
させた。反応後、よくＰＢＳで洗浄した後、セルソータ
ー〔エピックス・エリート（コールター社製）〕を用い
て解析した。その結果、図５に示すように、モノクロー
ナル抗体ＫＭ１０５４とＫＭ１０５６はいずれも全ての
癌細胞株に反応し、癌細胞に幅広く存在するＲＮＲの検
出に利用できることが示された。
【００４１】（２）モノクローナル抗体の反応性とセル
サイクルの検討 モノクローナル抗体ＫＭ１０５４及びＫＭ１０５６の反
応性とセルサイクルとの関係を調べる目的で抗体染色と
ＤＮＡ染色の二重染色を以下のようにして行った。染色
は、（Ａ）ヒトＴ細胞リンパ腫細胞株ＣＣＲＦ−ＣＥＭ
（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１１９）、（Ｂ）ヒト末梢血よりPo
lymorphprep （第一化学社製）を用いた遠心法で採取し
たリンパ球及びそれをＯＫＴ−３〔ハイブリドーマＯＫ
Ｔ−３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ８００１）の培養上清をプロ
テインＡカラムを用いて精製したもの〕とＩＬ−２（シ
オノギ製薬社製）とで刺激して得られたリンパ球ブラス
トを用いて行った。
サイクルの検討 モノクローナル抗体ＫＭ１０５４及びＫＭ１０５６の反
応性とセルサイクルとの関係を調べる目的で抗体染色と
ＤＮＡ染色の二重染色を以下のようにして行った。染色
は、（Ａ）ヒトＴ細胞リンパ腫細胞株ＣＣＲＦ−ＣＥＭ
（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１１９）、（Ｂ）ヒト末梢血よりPo
lymorphprep （第一化学社製）を用いた遠心法で採取し
たリンパ球及びそれをＯＫＴ−３〔ハイブリドーマＯＫ
Ｔ−３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ８００１）の培養上清をプロ
テインＡカラムを用いて精製したもの〕とＩＬ−２（シ
オノギ製薬社製）とで刺激して得られたリンパ球ブラス
トを用いて行った。
【００４２】モノクローナル抗体ＫＭ１０５４及びＫＭ
１０２４を用いて抗体染色を（１）と同様に行った後、
０．２５ｍｇ／ｍｌＲＮａｓｅ（シグマ社製）及び０．
１％ＮＰ４０を含むＰＢＳを１×１０6 細胞あたり０．
９ｍｌ加え、３７℃で３０分間反応させた。さらに５０
０μｇ／ｍｌのプロピウムイオダイト（ＰＩ）及び１．
０％ＮＰ４０を含むＰＢＳを１×１０6 細胞当たり０．
１ｍｌ加えて混合し、氷冷中で２０分間以上反応させ、
セルソーター〔エピックス・エリート（コールター社
製）〕を用いて解析した。その結果を図６及び図７に示
す。図６に示したように、ヒトＴ細胞リンパ腫ＣＣＲＦ
−ＣＥＭでは、モノクローナル抗体ＫＭ１０５４はＧ１
期の一部の細胞からＳ期、Ｇ２期及びＭ期の細胞に陽性
となった。また、図７に示したように、Ｇ０期の細胞集
団である未刺激の末梢血リンパ球にはモノクローナル抗
体ＫＭ１０５４は対照抗体であるＫＭ１０２４と同様全
く反応しなかった。リンパ球をＯＫＴ−３とＩＬ−２と
を用いて同調的に増殖を開始させたリンパ球ブラストで
は、Ｇ０／Ｇ１期のポピュレーションに加えてＳ期、Ｇ
２期及びＭ期のポピュレーションの出現が認められる
が、対照抗体であるＫＭ１０２４はいずれのポピュレー
ションにも反応しなかったが、モノクローナル抗体ＫＭ
１０５４はＤＮＡレベルの高いＳ期、Ｇ２期及びＭ期の
ポピュレーションに選択的に反応した。
１０２４を用いて抗体染色を（１）と同様に行った後、
０．２５ｍｇ／ｍｌＲＮａｓｅ（シグマ社製）及び０．
１％ＮＰ４０を含むＰＢＳを１×１０6 細胞あたり０．
９ｍｌ加え、３７℃で３０分間反応させた。さらに５０
０μｇ／ｍｌのプロピウムイオダイト（ＰＩ）及び１．
０％ＮＰ４０を含むＰＢＳを１×１０6 細胞当たり０．
１ｍｌ加えて混合し、氷冷中で２０分間以上反応させ、
セルソーター〔エピックス・エリート（コールター社
製）〕を用いて解析した。その結果を図６及び図７に示
す。図６に示したように、ヒトＴ細胞リンパ腫ＣＣＲＦ
−ＣＥＭでは、モノクローナル抗体ＫＭ１０５４はＧ１
期の一部の細胞からＳ期、Ｇ２期及びＭ期の細胞に陽性
となった。また、図７に示したように、Ｇ０期の細胞集
団である未刺激の末梢血リンパ球にはモノクローナル抗
体ＫＭ１０５４は対照抗体であるＫＭ１０２４と同様全
く反応しなかった。リンパ球をＯＫＴ−３とＩＬ−２と
を用いて同調的に増殖を開始させたリンパ球ブラストで
は、Ｇ０／Ｇ１期のポピュレーションに加えてＳ期、Ｇ
２期及びＭ期のポピュレーションの出現が認められる
が、対照抗体であるＫＭ１０２４はいずれのポピュレー
ションにも反応しなかったが、モノクローナル抗体ＫＭ
１０５４はＤＮＡレベルの高いＳ期、Ｇ２期及びＭ期の
ポピュレーションに選択的に反応した。
【００４３】以上のように、モノクローナル抗体ＫＭ１
０５４の反応性は、Ｇ０／Ｇ１期に低く、Ｓ期からＧ
２、Ｍ期に高いＲＮＲ・Ｒ２サブユニットのセルサイク
ル依存的な発現と一致し、モノクローナル抗体ＫＭ１０
５４がセルサイクルマーカーや増殖マーカーとして有用
なＲＮＲの検出に利用することができることが示唆され
た。
０５４の反応性は、Ｇ０／Ｇ１期に低く、Ｓ期からＧ
２、Ｍ期に高いＲＮＲ・Ｒ２サブユニットのセルサイク
ル依存的な発現と一致し、モノクローナル抗体ＫＭ１０
５４がセルサイクルマーカーや増殖マーカーとして有用
なＲＮＲの検出に利用することができることが示唆され
た。
【００４４】（３）モノクローナル抗体を用いた細胞診
の検討 抗ＲＮＲ・Ｒ２サブユニットモノクローナル抗体の細胞
診への応用を検討する目的で、癌性奬膜炎症例３例より
腹水細胞または胸水細胞を５ｍｌずつ採取し、９５％ア
ルコールを用いて固定した。固定後、パラホルムアルデ
ヒドの代わりにアルコールを用いる以外は（１）と同様
にしてモノクローナル抗体ＫＭ１０５４による免疫細胞
染色を行った。その結果、第２表に示すように全ての検
体が陽性であった。また（１）の癌細胞株を用いた免疫
細胞染色における結果と同様に、各種細胞の反応性の強
弱については、それぞれ異なっていた。
の検討 抗ＲＮＲ・Ｒ２サブユニットモノクローナル抗体の細胞
診への応用を検討する目的で、癌性奬膜炎症例３例より
腹水細胞または胸水細胞を５ｍｌずつ採取し、９５％ア
ルコールを用いて固定した。固定後、パラホルムアルデ
ヒドの代わりにアルコールを用いる以外は（１）と同様
にしてモノクローナル抗体ＫＭ１０５４による免疫細胞
染色を行った。その結果、第２表に示すように全ての検
体が陽性であった。また（１）の癌細胞株を用いた免疫
細胞染色における結果と同様に、各種細胞の反応性の強
弱については、それぞれ異なっていた。
【００４５】
【表２】
【００４６】（４）モノクローナル抗体を用いた免疫組
織染色 ヒト各種組織のホリマリン固定パラフィン包埋組織を１
〜５ミクロンの厚さに薄切し、卵白アルブミンをコート
したスライドガラス上に固定した。キシレンで脱パラフ
ィン後、アルコール−水で段階的に親水化した。凍結切
片の場合には冷アセトン中で２０分間固定した。その
後、０. ３％過酸化水素を含むメタノール中で３０分間
処理し、内因性ペルオキシダーゼをブロックした。切片
をＰＢＳで洗浄後、希釈したウマ正常血清中で２０分間
ブロッキングし、抗ＲＮＲ・Ｒ２サブユニットモノクロ
ーナル抗体ＫＭ１０５４の精製抗体１０μｇ／ｍｌを４
℃で１２時間反応させた。ＰＢＳでよく洗浄した後、第
二抗体として１μｇ／ｍｌのビオチン標識抗ラットイム
ノグロブリン抗体（Jackson Immunoresearch Lab社製）
を１００μｌ加えて室温で３０分間反応させ、ＰＢＳで
洗浄した後、アビジン標識ペルオキシダーゼ（ニチレイ
社製）を加えて室温で３０分間反応させ、水中で１０分
間洗浄した後、０．０１％過酸化水素を含む０．０５％
ジアミノベンチジンと１分間反応させた。冷水中で反応
を停止させた後、ヘマトキシレンを用いて核染色し、ホ
ルマリン固定パラフィン包埋組織の場合にはアルコール
−水およびキシレンで脱水後カナダバルサムで固定し、
顕鏡した。凍結切片の場合にはグリセリン−ＰＢＳで包
埋し、顕鏡した。その結果、第３表に示すように、モノ
クローナル抗体ＫＭ１０５４は乳癌８例中全ての検体に
おける癌細胞と反応した。しかし、周囲の正常部分およ
び良性疾患４例には反応しなかった。
織染色 ヒト各種組織のホリマリン固定パラフィン包埋組織を１
〜５ミクロンの厚さに薄切し、卵白アルブミンをコート
したスライドガラス上に固定した。キシレンで脱パラフ
ィン後、アルコール−水で段階的に親水化した。凍結切
片の場合には冷アセトン中で２０分間固定した。その
後、０. ３％過酸化水素を含むメタノール中で３０分間
処理し、内因性ペルオキシダーゼをブロックした。切片
をＰＢＳで洗浄後、希釈したウマ正常血清中で２０分間
ブロッキングし、抗ＲＮＲ・Ｒ２サブユニットモノクロ
ーナル抗体ＫＭ１０５４の精製抗体１０μｇ／ｍｌを４
℃で１２時間反応させた。ＰＢＳでよく洗浄した後、第
二抗体として１μｇ／ｍｌのビオチン標識抗ラットイム
ノグロブリン抗体（Jackson Immunoresearch Lab社製）
を１００μｌ加えて室温で３０分間反応させ、ＰＢＳで
洗浄した後、アビジン標識ペルオキシダーゼ（ニチレイ
社製）を加えて室温で３０分間反応させ、水中で１０分
間洗浄した後、０．０１％過酸化水素を含む０．０５％
ジアミノベンチジンと１分間反応させた。冷水中で反応
を停止させた後、ヘマトキシレンを用いて核染色し、ホ
ルマリン固定パラフィン包埋組織の場合にはアルコール
−水およびキシレンで脱水後カナダバルサムで固定し、
顕鏡した。凍結切片の場合にはグリセリン−ＰＢＳで包
埋し、顕鏡した。その結果、第３表に示すように、モノ
クローナル抗体ＫＭ１０５４は乳癌８例中全ての検体に
おける癌細胞と反応した。しかし、周囲の正常部分およ
び良性疾患４例には反応しなかった。
【００４７】
【表３】
【００４８】
【発明の効果】本発明により、セルサイクルマーカーや
増殖マーカーとして有用なＲＮＲと特異的に反応し、且
つＲＮＲ活性を阻害する作用を有するモノクローナル抗
体を提供される。本発明のモノクローナル抗体は組織診
断や細胞診におけるＲＮＲの免疫学的検出、さらに生物
学的機能の解析等に有用である。
増殖マーカーとして有用なＲＮＲと特異的に反応し、且
つＲＮＲ活性を阻害する作用を有するモノクローナル抗
体を提供される。本発明のモノクローナル抗体は組織診
断や細胞診におけるＲＮＲの免疫学的検出、さらに生物
学的機能の解析等に有用である。
【００４９】
配列番号：１ 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列：CysAsnSerPheThrLeuAspAlaAspPhe
【００５０】配列番号：２ 配列の長さ：16 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列：CysLeuSerProGlyGlnLysGlnLysGluGluProLysGluVa
lLys
lLys
【図１】 抗ＲＮＲ・Ｒ２サブユニットモノクローナル
抗体ＫＭ１０５４，ＫＭ１０５６及びＫＭ１０６０の酵
素免疫測定法におけるＲ２サブユニットのＣ末ペプチド
に対する結合反応性を示す。
抗体ＫＭ１０５４，ＫＭ１０５６及びＫＭ１０６０の酵
素免疫測定法におけるＲ２サブユニットのＣ末ペプチド
に対する結合反応性を示す。
【図２】 抗ＲＮＲ・Ｒ２サブユニットモノクローナル
抗体ＫＭ１０５４，ＫＭ１０５６及びＫＭ１０６０のウ
エスタンブロッティングにおけるＨｅｌａＳ3 細胞由来
のＲＮＲ粗精製画分との反応性を示す。図中、＋は、予
めＲＮＲ・Ｒ２サブユニットのＣ末ペプチドと反応させ
た後、抗体を加えた場合の反応性を、−は、そのまま抗
体を加えた場合の反応性をそれぞれ示す。
抗体ＫＭ１０５４，ＫＭ１０５６及びＫＭ１０６０のウ
エスタンブロッティングにおけるＨｅｌａＳ3 細胞由来
のＲＮＲ粗精製画分との反応性を示す。図中、＋は、予
めＲＮＲ・Ｒ２サブユニットのＣ末ペプチドと反応させ
た後、抗体を加えた場合の反応性を、−は、そのまま抗
体を加えた場合の反応性をそれぞれ示す。
【図３】 抗ＲＮＲ・Ｒ２サブユニットモノクローナル
抗体ＫＭ１０５４，ＫＭ１０５６及びＫＭ１０６０の免
疫沈降反応におけるＨｅｌａＳ3 細胞由来のＲＮＲ粗精
製画分との反応性を示す。図中、＋は、予めＲＮＲ・Ｒ
２サブユニットのＣ末ペプチドと反応させた後、抗体を
加えた場合の反応性を、−は、そのまま抗体を加えた場
合の反応性をそれぞれ示す。
抗体ＫＭ１０５４，ＫＭ１０５６及びＫＭ１０６０の免
疫沈降反応におけるＨｅｌａＳ3 細胞由来のＲＮＲ粗精
製画分との反応性を示す。図中、＋は、予めＲＮＲ・Ｒ
２サブユニットのＣ末ペプチドと反応させた後、抗体を
加えた場合の反応性を、−は、そのまま抗体を加えた場
合の反応性をそれぞれ示す。
【図４】 抗ＲＮＲ・Ｒ２サブユニットモノクローナル
抗体ＫＭ１０５４，ＫＭ１０５６のＲＮＲ阻害活性を示
す。
抗体ＫＭ１０５４，ＫＭ１０５６のＲＮＲ阻害活性を示
す。
【図５】 抗ＲＮＲ・Ｒ２サブユニットモノクローナル
抗体ＫＭ１０５４，ＫＭ１０５６の免疫細胞染色による
種々の癌細胞株との反応性をセルソーターで解析した結
果を示す。
抗体ＫＭ１０５４，ＫＭ１０５６の免疫細胞染色による
種々の癌細胞株との反応性をセルソーターで解析した結
果を示す。
【図６】 ヒトＴ細胞リンパ腫細胞株ＣＣＲＦ−ＣＥＭ
を用いて、抗ＲＮＲ・Ｒ２サブユニットモノクローナル
抗体ＫＭ１０５４の反応性とセルサイクルの関係をセル
ソーターで解析した結果を示す。
を用いて、抗ＲＮＲ・Ｒ２サブユニットモノクローナル
抗体ＫＭ１０５４の反応性とセルサイクルの関係をセル
ソーターで解析した結果を示す。
【図７】 ヒト末梢血リンパ球及びヒト末梢血リンパ球
ブラストを用いて、抗ＲＮＲ・Ｒ２サブユニットモノク
ローナル抗体ＫＭ１０５４の反応性とセルサイクルの関
係をセルソーターで解析した結果を示す。
ブラストを用いて、抗ＲＮＲ・Ｒ２サブユニットモノク
ローナル抗体ＫＭ１０５４の反応性とセルサイクルの関
係をセルソーターで解析した結果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/577 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ａ６１Ｋ 39/395 9162−4Ｂ 15/00 ＺＮＡＣ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 岡部 正実 静岡県三島市加茂30−５ (72)発明者 山▲崎▼ 基生 東京都町田市中町３−９−13
Claims (8)
- 【請求項１】 リボヌクレオチドレダクターゼＲ２サブ
ユニットに特異的に反応し、且つリボヌクレオチドレダ
クターゼの活性を阻害する作用を有するモノクローナル
抗体。 - 【請求項２】 ＩｇＧ２ａサブクラスに属するラットモ
ノクローナル抗体である請求項１記載のモノクローナル
抗体ＫＭ１０５４。 - 【請求項３】 請求項１記載のモノクローナル抗体を生
産するハイブリドーマ。 - 【請求項４】 請求項２記載のモノクローナル抗体を生
産するハイブリドーマＫＭ１０５４（ＦＥＲＭ ＢＰ−
４８７５）。 - 【請求項５】 請求項１記載のモノクローナル抗体を用
いてリボヌクレオチドレダクターゼＲ２サブユニットを
免疫学的に検出する方法。 - 【請求項６】 請求項１記載のモノクローナル抗体を用
いた免疫細胞染色によるリボヌクレオチドレダクターゼ
Ｒ２サブユニットの検出法。 - 【請求項７】 請求項１記載のモノクローナル抗体を用
いた免疫組織染色によるリボヌクレオチドレダクターゼ
Ｒ２サブユニットの検出法。 - 【請求項８】 請求項１記載のモノクローナル抗体を用
いたヒト各種組織の癌の診断法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8019676A JPH08277300A (ja) | 1995-02-07 | 1996-02-06 | 抗リボヌクレオチドレダクターゼｒ２サブユニットモノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1887995 | 1995-02-07 | ||
| JP7-18879 | 1995-02-07 | ||
| JP8019676A JPH08277300A (ja) | 1995-02-07 | 1996-02-06 | 抗リボヌクレオチドレダクターゼｒ２サブユニットモノクローナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08277300A true JPH08277300A (ja) | 1996-10-22 |
Family
ID=26355620
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8019676A Withdrawn JPH08277300A (ja) | 1995-02-07 | 1996-02-06 | 抗リボヌクレオチドレダクターゼｒ２サブユニットモノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08277300A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001269184A (ja) * | 1999-06-28 | 2001-10-02 | Takeda Chem Ind Ltd | 新規タンパク質およびそのｄｎａ |
-
1996
- 1996-02-06 JP JP8019676A patent/JPH08277300A/ja not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001269184A (ja) * | 1999-06-28 | 2001-10-02 | Takeda Chem Ind Ltd | 新規タンパク質およびそのｄｎａ |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20030506 |