JPH08282A - ５−メチルウリジンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 核酸を原料とした微生物による５−メチルウ
リジンの製造法において特有の不純物を分離する方法を
開発し、高純度の５−メチルウリジン結晶を取得する。 【構成】 微生物を用い、酵素反応にて５−メチルウリ
ジンを製造する方法において、該微生物を培養した後、
該培地成分の一部または全部を除去し、該微生物により
酵素反応を行わせ、生成した５−メチルウリジンを晶析
し、得られた結晶を沈降速度差をで他の不純物結晶と分
離する。 【効果】 簡便な方法で高純度な５−メチルウリジンの
結晶を取得できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、医薬品原料として有用
な５−メチルウリジン（5ーmethyluridine）の製造方法
に関するものである。５−メチルウリジンは、エイズ薬
として市販されているアジドチミジン、また同じく臨床
試験中のｄ４Ｔ（2',3'ーdidehydroxy-2',3'-dideoxythy
midine）の合成中間体として有望視されている。

【０００２】

【従来の技術】５−メチルウリジンは従来、化学的合成
法で製造されており、そこでの精製は、主として、メタ
ノール、エタノール等の有機溶剤を用いた結晶化により
行われていた。（J.Am.Chem.Soc.,78,2117(1956)；特開
昭６３ー６３６６８；Helvetica Chimica Acta、2179(19
80)；Synthesis,259(1982)）

【０００３】これらの技術は、核酸を原料とし、微生物
を用いて変換する方法とは副生する不純物が異なるた
め、精製を含めた５−メチルウリジンの製造方法として
は参考にならない。

【０００４】微生物を利用する５−メチルウリジンの製
造方法としては、ヌクレオシド、またはリボースー１ー
リン酸に５ーメチルウラシルを微生物存在下に作用させ
る事により製造する方法が知られている。（特開平２ー
２３８８２）

【０００５】しかしながら、この特許には５−メチルウ
リジンの精製法に関する具体的な記述が無く、製品とし
ての５−メチルウリジンを製造するには不十分である。

【０００６】とりわけ、５−メチルウリジンの大きな結
晶を晶析により得る事は、結晶の分離性を良くして分離
に必要な装置の規模を小さくする事ができ、また、不純
物との分離も良くなり、高純度の製品を得るには必要不
可欠であるが、それに関するなんらの記述もされていな
い。

【０００７】通常、結晶成長には過飽和の大きさと不純
物が大きな影響を与え、とりわけ、不純物の組成は晶析
せんとする系によって全く事なり、この制御が晶析の可
不可を決める重要な鍵であり、与えられた系での特徴的
な制御が必要である場合が多い。

【０００８】よって、微生物を利用した５−メチルウリ
ジンの場合、生物化学的生産に必要な情報は公知である
が、反応液よりの精製については、独自に方法を開発す
る必要があった。

【０００９】反応液より、若干の前処理を経て濃縮によ
り５−メチルウリジンを晶析した所、２０から３０マイ
クロメーター（μｍ）の大きさの結晶しか得られず、こ
れでは分離速度が非常に遅く、分離装置が大きな物にな
る事が判明した。更に、この大きさでは、後述する結晶
の粒度の差を利用した不純物の分離には全く不適切であ
る事が判明した。

【００１０】５−メチルウリジンは微生物を用い、核酸
類を原料として、酵素反応により製造することができる
が、そのとき反応生成物中には、未反応物である核酸類
および副生物である核酸類が不純物として含まれてい
る。５−メチルウリジンを製造するのに５ーメチルウラ
シル（チミン）とグアノシンを原料として用いる場合、
反応液中の不純物としては、主としてチミン、グアニ
ン、グアノシン、および、2-Amino-7-β-D-ribofuranos
yl-7H-purine-6(1H)one（シュドグアノシン）が存在す
る。このうち、例えば、チミンは温度、ｐＨ等に対する
溶解度変化のパターンが５−メチルウリジンに類似して
いるため、結晶化によって除去する事は難しい。また、
イオン解離パターンも類似しているのでイオン交換樹脂
等の処理による除去も困難である。

【００１１】これら核酸系の不純物は、核酸を原料とし
た微生物による製造法に特有のものであり、公知の知識
を活用する事ができない。また、公知文献ではこれらを
分離する方法は記述されていない。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】５−メチルウリジンを
効率よく生産し、かつ、純度の高い物になるよう、微生
物を用いた反応液からの５−メチルウリジン結晶の粒度
を大きくして結晶と母液の分離効率を高め、さらには、
この結晶と他の不純物結晶との分離効率をよくする方法
を開発する。

【００１３】

【課題を解決するための手段】発明者は、微生物を培養
し、核酸類を原料として酵素反応にて５−メチルウリジ
ンを製造し、その晶析お呼び分離方法を検討した際、微
生物の培養液の処理方法により、後工程の５−メチルウ
リジンの晶析で得られる結晶の粒度に大きな差のある事
を見いだし、本発明を完成した。すなわち、本発明は、
リボース−１−燐酸若しくはその塩及び５−メチルウラ
シルから５−メチルウリジンを生成する能力を有する微
生物またはヌクレオシド、無期燐酸若しくはその塩及び
５−メチルウラシルから５−メチルウリジンを生成する
能力を有する微生物を用い、酵素反応にて５−メチルウ
リジンを製造する方法において、該微生物を培養した
後、（イ）該培地成分の一部、または全部を除去し、次
いで（ロ）該微生物にリボース−１−燐酸若しくはその
塩及び５−メチルウラシルまたはヌクレオシド、無期燐
酸若しくはその塩及び５−メチルウラシルを作用せし
め、５−メチルウリジンを生成させた後、次いで（ハ）
生成した５−メチルウリジンを晶析し、分離することを
特徴とする５−メチルウリジンの製造方法に関するもの
である。

【００１４】本発明に用いられる微生物は、リボース−
１−燐酸若しくはその塩及び５−メチルウラシルから５
−メチルウリジンを生成する能力を有する微生物または
ヌクレオシド、無期燐酸若しくはその塩及び５−メチル
ウラシルから５−メチルウリジンを生成する能力を有す
る微生物であれば、使用可能である。例えば、アクロモ
バクター属、アシネトバクター属、エアロモナス属等、
特許公報特開平２−２３８８２号に記載の微生物を挙げ
ることができる。特に好ましい微生物としては、アース
ロバクター属、セルロモナス属、フラボバクテリウム
属、クレブジェラ属、ミクロバクテリウム属、ミクロコ
ッカス属、サルシナ属に属する微生物を例示することが
できる。その具体例として、下記の微生物が挙げられ
る。アースロハ゛クター シンフ゜レックス(Arthrobacter simplex) FERM P-10
068セルロモナス フラヒ゛ケ゛ナ(Cellulomonas flavigena) ATCC 486フラホ゛ハ゛クテリウム レナナム(Flavobacterium rhenanum) FERM BP-
1862クレフ゛シ゛ェラ ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae) ATCC 8308ミクロハ゛クテリウム ラクチカム(Microbacterium lacticum) ATCC 818
0ミクロコッカス ルテウス(Micrococcus luteus) FERM P-7399サルシナ ルテア(Sarcina lutea) FERM P-7400

【００１５】上記微生物の培養は、炭素源、窒素源、
P、S、Fe、Mn等の無機イオン、さらに必要ならば、ビタ
ミン等の微量栄養素または蛋白分解物、酵母エキスのよ
うな有機窒素源を含有する通常の培地を用い、通常の培
養方法で行なえば良い。

【００１６】得られた微生物の培養液からの培地成分の
除去方法としては、培養液を自然沈降後の上澄み除去、
遠心分離ないしはろ過等の通常の方法を使用できる。こ
れらの方法により、菌体と母液とに容易にかつ任意の割
合に分ける事ができる。培地成分の除去量の割合は、培
養液の５０〜９９容量％が好ましく、特に好ましくは７
０〜９０容量％である。

【００１７】培養液から培地成分を一部ないしは大部分
を除去した後、微生物含有液に直接あるいは微生物含有
液を無機燐酸緩衝液、トリス緩衝液等の緩衝液で希釈し
たものに、反応基質である、リボース−１−燐酸若しく
はその塩及び５−メチルウラシル、または、ヌクレオシ
ド、無期燐酸若しくはその塩及び５−メチルウラシルを
添加し、酵素反応を行い、５−メチルウリジンを生成す
る。反応は、ｐＨ範囲は４〜１０、好ましくは６〜８、
温度範囲は、２０〜７０℃、好ましくは５０〜７０℃の
条件下、静地あるいは攪拌しながら、１０分〜１０日間
行われる。

【００１８】培養液の培地成分を除去する事無く、培養
液にそのまま核酸類の基質を添加した後反応させた場
合、得られる結晶の粒度は長径で２０から３０μｍであ
った。この粒径では、結晶の例えば遠心ろ過を行った場
合の分離速度が非常に遅く、大きな装置が必要である事
が判明した。

【００１９】これに対し、培養液の培地成分を一部、ま
たは大部分を除去した後に核酸類の基質を添加し、反応
を行った場合には、５０から５５０μｍの粒径の結晶の
得られる事を発見した。この粒径であれば、結晶の分離
速度が速くなり、かつ後述の他の不純物核酸との粒径を
利用した分離が可能になる。

【００２０】発明者は５−メチルウリジンの精製を検討
した際、上記の様に、培養液から培地成分を一部ないし
は大部分を除去した後基質を加えて反応させると、後工
程で得られる５−メチルウリジンの結晶が比較的大きく
成る事を発見し、この性質が５−メチルウリジンの精製
に活用できうるとの着想を得た。一般的に言って、工業
的に粒度の揃った結晶を得ようとする場合、被晶析流体
をその流体自体で下方より流動させ、大きな結晶を下部
に、細かい結晶を上部に分級させ、上部の細かい結晶を
系外で溶解、再循環させる方法が取られるが、本発明の
ように、製品結晶と不純物結晶を沈降速度で分ける方法
は数少ない。その理由は、そのような粒度分布を持った
系が無い事、製品結晶中に不純物結晶が取り込まれ、た
とえ分ける事ができたとしても純度が上がらない事、お
よび、たとえ分級する事が可能な粒系、結晶の質であっ
ても、発想がそこに至らない為と考えられる。

【００２１】５−メチルウルジンの場合、市販試薬の結
晶粒系は大きくとも５０μｍ程度であったが、発明者が
これを水より再晶析したところ、５００μｍ程の結晶が
得られた。

【００２２】一方、不純物を含む実液系から得られた５
−メチルウリジン結晶の粉末Ｘ線回折の結果、５−メチ
ルウリジンは他の不純物と”混晶”を作らず、混合した
結晶群の中から５−メチルウリジンの結晶のみを取り出
す事ができれば、高純度の製品の得られる事を見いだし
た。また、実液系での５−メチルウリジンの結晶粒系は
通常、３００から６００μｍ、特に小さい場合でも５０
から１００μｍの範囲にあり、この時、不純物側の結晶
粒系は５から５０μｍであった。さらに、撹判後静置し
た晶析スラリーの観察により、５−メチルウリジン結晶
がガラス容器の下部にあり、上部の液は短時間であれば
濁っている事を見いだし、沈降速度の差を使えば、他の
結晶を分離できる着想を得た。

【００２３】具体的に結晶同志を沈降速度で分離する方
法としては、一つにはデカンテーション法がある。結晶
スラリーをよく混合し、しかる後静置し、５−メチルウ
リジンが大方沈降し、他の結晶が浮遊してる間に５−メ
チルウリジン以外の層を容器を傾けて流し去る方法であ
る。流出液を結晶分離し、その母液を元の容器に戻し、
再度上記の操作を繰り返す操作を何回か繰り返す事によ
り、不純物結晶を含まない５−メチルウリジン結晶を取
得できる。また、大きな装置では、容器を傾けるのは難
しいので、機械力に頼らざるを得ない。たとえば、非沈
降層をポンプを用いて吸い出す、あるいは、適当な位置
にオーバーフロー口を設けておいて、沈降後、そこから
上部の液をオーバーフローさせる等の方法が考えられ
る。また、一般的な流動層型連続晶析槽を改良し、清澄
母液を槽の下部から流し、５−メチルウリジンの結晶は
流出させず、不純物結晶のみを流出させる方法、また
は、いわゆるスーパーデカンター、ハイドロサイクロン
等の結晶の分級分離が可能な遠心分離機で一気に、大き
な結晶と小さな結晶を分ける方法が考えられる。

【００２４】デカンテーションないしは上記遠心分離器
等を使用する機械的分離を繰り返すことにより、所定の
分離の効率と、所定の製品純度を得ることが可能であ
る。

【００２５】これらのいずれの方法も、分離された不純
物結晶を含む流体を遠心分離機、ろ過等で結晶分離し、
その母液を元の装置にもどす操作があれば不純物結晶分
離効率をより高める事が可能になる。

【００２６】分離した５−メチルウリジン側の結晶の層
を遠心分離、ろ過等で分離し、さらにこの時、結晶を水
で、可能ならば冷水で洗浄すれば、より純度の高い結晶
が得られる。

【００２７】５−メチルウリジンを製造するに当たり、
核酸を原料とし、微生物を用いて変換する方法の代表例
として、ヌクレオシド、無機リン酸および５ーメチルウ
ラシル（チミン）を微生物存在下で作用させる方法があ
る。ここで、ヌクレオシドとしては、アデノシン、グア
ノシン、イノシン、ウリジン、シチジンまたはキサント
シンが例示される（特開平２−２３８８２）。この反応
において、不純物としてそれぞれの残留ヌクレオシド、
５ーメチルウラシル（チミン）、使用したヌクレオシド
から副成した塩基およびリン酸が存在する。これらの不
純物を５−メチルウリジンとの溶解度の差で分離する事
は容易に考えられるが、核酸成分の温度、ｐＨに対する
溶解度変化のパターンはお互いに類似しており、これ以
上分ける事は容易ではない。

【００２８】この反応液中で、不純物核酸の除去を検討
する過程で、発明者は５−メチルウリジンの結晶が比較
的大きくなるのに対し、他のものが大きくならない事を
見いだした。さらに、５−メチルウリジンの流体中での
沈降速度が他の結晶に比べ、著しく大きい事を発見し
た。

【００２９】特開平２−２３８８２の条件に加え、培養
液から培地成分を一部ないしは大部分を除去した後基質
を加えて反応させた後、反応液を冷却、ろ過、活性炭脱
色、ろ過して得たろ液を濃縮し、３から１５℃の範囲に
冷却晶析して、何等他の溶媒を加える事無く析出してく
る結晶のうち、５−メチルウリジン結晶の平均的粒系が
５０から５５０μｍであるのに対し、不純物のそれは１
０から３０μｍ程度であった。

【００３０】そこで、流体中の５−メチルウリジン結晶
を５分から１０分で沈降させておいた後、５−メチルウ
リジン結晶層以外の部分を容器を傾けて流出させ（デカ
ンテーション）、さらに流出液中の結晶を分離後、その
母液を容器に戻し、撹判後、再びデカンテーションする
操作を繰り返したところ、他の結晶をあまり含まない高
純度の５−メチルウリジンが得られた。

【００３１】晶析装置の規模または結晶粒径により、５
−メチルウリジンの沈降に要する時間は変化するが、そ
の時の所用時間は、晶泥の一部を抜き取り、メスシリン
ダー等の中で実際に沈降させ、それに要した時間と沈降
距離を計り、これから実際の装置中での所用沈降速度を
計算する事により、容易に沈降時間を設定する事ができ
る。

【００３２】一方、不純物の結晶粒径は、常にほぼ一定
であるから、沈降時間は５−メチルウリジン側だけを考
えれば良い。あまり長い時間沈降時間を取ると、不純物
結晶も多少沈降してくる。メスシリンダーのような小さ
な装置では、３０分程度で微結晶の沈降層が形成され
た。この場合にも、不純物結晶が沈降してくる時間は、
装置の規模に基づいて容易に計算でき、沈降時間の限度
はこれにより決める事ができる。

【００３３】流動層型連続晶析槽を改良、あるいは流動
層分級型晶析缶を設計して用いる場合には、清澄母液を
槽の下部から流し、５−メチルウリジンの結晶は流出さ
せず、不純物結晶のみを流出させるに必要な流体の線速
度を測定する事により、容易に実装置での線速度を決定
する事ができる。

【００３４】また同様に、いわゆるスーパーデカンター
を用いる場合、小型機を用い、沈降面積あたりの流体フ
ィード流速と結晶の分離性を測定する事により、容易に
実機でのフィード流量を設定する事ができる。

【００３５】ここに、われわれは結晶の沈降速度の差を
利用する方法が、５−メチルウリジンと他の核酸成分と
を分離する有効な方法である事を見いだした。

【００３６】上記の方法は、５−メチルウリジンとの分
離が極めて難しいチミンの分離に特に大きな効力を発揮
した。チミンは溶解度の温度、ｐＨに対する変化のパタ
ーンが５−メチルウリジンに相似であり、分離が困難で
あり、また、イオン解離のパターンも似ており、イオン
交換樹脂等でも分離が困難であるため、本発明の方法法
は、非常に有効であった。

【００３７】また、共存する他の核酸であるグアノシ
ン、グアニン、シュドグアノシンについても非常に有効
な分離手段であった。

【００３８】微生物の培養液中の培地成分の一部ないし
は大部分を除去した場合にのみ、５−メチルウリジンの
大きな粒径の結晶が得られる理由は明確では無いが、酵
素反応中に培地成分中に含まれるアミノ酸と他の成分、
例えば糖が反応して、その生成物が５−メチルウリジン
の結晶の成長を阻害しているのではないかと考えられ
る。本微生物を用いた反応の温度は６０℃であり、一般
的な微生物を用いた生産に比べて温度が高く、この事が
前述の副生反応を促進していると考えられ、本特許の培
地成分の除去の必要性をもたらしているものと考えられ
る。

【００３９】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に説明する。

【００４０】実施例１ 特開平２−２３８８２号公報の実施例１に従い、フラボ
バクテリウム レナナム(Flavobacterium rhenanum) FE
RM BP-1862を培養し、菌体培養液を調製した。この菌体
培養液を遠心処理し、培地成分の５０％を除去した。こ
れにトリス緩衝液を加えて元の容量に戻し、基質の５−
メチルウラシルとグアノシンを添加し、温度を６０℃に
保って反応させた。反応液を冷却、ろ過、活性炭脱色、
ろ過、真空濃縮し、これを５℃迄冷却した。得られた晶
析スラリー中の結晶の大きさは約８０μｍであった。ま
た、５−メチルウリジンと他の不純物核酸結晶とは自然
沈降で良く二層に分離していた。

【００４１】実施例２ 特開平２−２３８８２号公報の実施例１に従い、フラボ
バクテリウム レナナム(Flavobacterium rhenanum) FE
RM BP-1862を培養し、菌体培養液を調製した。この菌体
培養液を遠心処理し、培地成分の９０％を除去した。こ
れにトリス緩衝液を加えて元の容量に戻し、基質の５−
メチルウラシルとグアノシンを添加し、本発明の実施例
１と同様に反応と後処理を行った。得られた晶析スラリ
ー中の結晶の大きさは約７０μｍであった。また、５−
メチルウリジンと他の不純物核酸結晶とは自然沈降で良
く二層に分離していた。

【００４２】実施例３ 特開平２−２３８８２号公報の実施例１に従い、フラボ
バクテリウム レナナム(Flavobacterium rhenanum) FE
RM BP-1862を培養し、菌体培養液を調製した。この菌体
培養液を遠心処理し、培地成分の９０％を除去した。こ
れに無機リン酸緩衝液を加えて元の容量に戻し、基質の
５−メチルウラシルとグアノシンを添加し、本発明の実
施例１と同様に反応と後処理を行った。得られた晶析ス
ラリー中の結晶の大きさは約１００μｍであった。ま
た、５−メチルウリジンと他の不純物核酸結晶とは自然
沈降で良く二層に分離していた。

【００４３】実施例４ 実施例１から３の上層を下層の５−メチルウリジン層と
上澄み分離し、この下層を遠心分離した所、いずれも速
い速度で分離できた。

【００４４】実施例５ 特開平２−２３８８２号公報の実施例２に従い、ミクロ
コッカス ルテウス(Micrococcus luteus) FERM P-7399
を培養し、菌体培養液を調製後、常法に従い洗浄菌体を
得た。これにトリス緩衝液を加えて、元の容量に戻し、
基質の５−メチルウラシルとグアノシンを添加し、本発
明の実施例１と同様に酵素反応を実施した。得られた酵
素反応液を冷却、ろ過、活性炭脱色、ろ過、真空濃縮し
て、５−メチルウリジン２５．５％、チミン１．９５
％、グアノシン０．５７％含む濃縮液３８４．９ｇを得
た。これをさらに５０ｒｐｍで撹判しながら徐徐に１０
℃まで冷却し、結晶を析出させた。これを１０分間静置
し、下部の５−メチルウリジン層以外の上部の微結晶懸
濁部分をデカンテーション分離して流出させ、流出液中
の結晶をろ過分離し、乾重量あたり５−メチルウリジン
を２２．６％、チミンを５０．７％、グアノシンを１
０．７％含む８．６２ｇの湿結晶を得た。この母液側を
５−メチルウリジン結晶層の残っている元の容器に戻
し、撹判し、再び１０℃に冷却した。これを再度、上記
と同様にデカンテーション分離し、再び流出液中の結晶
をろ過分離し、乾重量あたり５−メチルウリジンを４
１．４％、チミンを２６．１％、グアノシンを１４．４
％、グアニンを０．０５２％を含む乾燥状態で４．５７
ｇの結晶を得た。この母液側を５−メチルウリジン結晶
層の残っている元の容器に戻し、撹判しながら１０℃に
冷却後、バスケット型遠心ろ過機で流体全量を分離し
た。分離時に結晶層を５７．８ｇの冷水で結晶を洗浄し
た。分離結晶を乾燥し、７５．２１ｇの含水和物結晶を
得た。濃縮液からの５−メチルウリジンの収率は７１．
４％であった。この結晶の純度は９３．２４％であり、
不純物として、３．３３％のチミン、０．３４２％のグ
アノシンが含まれていた。５−メチルウリジンに対する
チミンの比率は、濃縮液で７．６％、製品で３．６％で
あり、晶析、デカンテーション工程で半減していた。更
に言えば、定性的であるが、シュドグアノシンも大幅に
減少していた。さらに、デカンテーションを繰り返す事
により、不純物核酸は更に減少させ得たであろう。な
お、この晶析での５−メチルウリジンの結晶平均粒径は
約３５０μｍ、微結晶の平均粒径は１０μｍであった。

【００４５】実施例６ 本発明の実施例５と同様にして、菌体培養液を調製後、
酵素反応を実施した。この酵素反応液を冷却、ろ過、活
性炭脱色、ろ過、真空濃縮して、５−メチルウリジン２
３．０％、チミン１．７１％、グアノシン０．４５％含
む濃縮液５８０Ｌを得た。これを晶析缶中で１００ｒｐ
ｍで撹判しながら徐徐に５℃まで冷却し、結晶を析出さ
せた。撹判を停止し、約１５分間、５−メチルウリジン
結晶を沈降させた後、微結晶を含んだ上部微結晶懸濁液
をポンプを用いて機械的に分離した。この分離液中の微
結晶をろ過分離し、この母液側を元の晶析缶に戻し、撹
判し、再び５℃に冷却した。上記の撹判、静置、上部微
結晶懸濁液分離、微結晶ろ過分離、再懸濁の一連の操作
を４度繰り返した後、バスケット型遠心ろ過機で懸濁液
全体を分離した。分離時に６０Ｌの水で結晶を洗浄し
た。分離結晶を乾燥し、９６Ｋｇの含水和物結晶を得
た。濃縮液からの５−メチルウリジンの収率は７２．０
％であった。この結晶の純度は９３．８％であり、不純
物として、１．８％のチミン、０．１６％のグアノシン
が含まれていた。５−メチルウリジンに対するチミンの
比率は、濃縮液で７．４％、製品で１．９％であり、晶
析、デカンテーション工程で４分の１に減少していた。
また、シュドグアノシンも大幅に減少していた。さら
に、デカンテーションを繰り返す事により、不純物核酸
は更に減少させ得たであろう。なお、この晶析での５−
メチルウリジンの結晶平均粒径は約５５０μｍ、微結晶
の平均粒径は１５μｍであった。

【００４６】比較例１ 本発明の実施例１と同様にして、フラボバクテリウム
レナナム(Flavobacterium rhenanum) FERM BP-1862の菌
体培養液を調製した。この菌体培養液の培地成分を除去
することなく、基質の５−メチルウラシルとグアノシン
を添加し、本発明の実施例１と同様に温度を６０℃に保
って反応させた。反応液を冷却、ろ過、活性炭脱色、ろ
過、真空濃縮し、これを５℃迄冷却した。得られた５−
メチルウリジンの結晶の大きさは２０から３０μｍであ
り、他の不純物核酸結晶との自然沈降による分離現象は
見られなかった。また、遠心分離に非常に長時間要し
た。

【００４７】比較例２ 本発明の実施例５と同様にして、ミクロコッカス ルテ
ウス(Micrococcus luteus) FERM P-7399の菌体培養液を
調製後、酵素反応を実施した。得られた酵素反応液を冷
却、ろ過、活性炭脱色、ろ過、真空濃縮して、５−メチ
ルウリジン２５．２％、チミン１．５５％、グアノシン
０．４２％含む濃縮液７．０５ｋｇを得た。これをさら
に撹判しながら徐徐に５℃まで冷却し、結晶を析出させ
た。この懸濁液を静置することなく、すぐにバスケット
型遠心ろ過機で全量分離し、５−メチルウリジンを４．
５％、チミンを０．２６％、グアノシンを０．１２％含
む５２２３ｇの母液を得た。更に結晶層を８１４ｇの冷
水で洗浄した。この洗浄時の母液は、５−メチルウリジ
ンを５．１８％、チミンを０．３１％、グアノシンを
０．１９％含み、１９２６ｇあった。分離結晶を乾燥
し、１．５２ｋｇの含水和物結晶を得た。濃縮液からの
５−メチルウリジンの収率は７６．３％であった。この
結晶の純度は８９．２８％であり、不純物として、５．
２１％のチミン、０．６９％のグアノシンが含まれてい
た。５−メチルウリジンに対するチミンの比率は、濃縮
液で６．２％、製品で５．８％であり、晶析工程での減
少は全くなかった。

【００４８】

【発明の効果】産業上有用な５−メチルウリジンを、有
機溶剤等特殊な溶媒を用いる事無く、かつ、簡便な方法
で高純度に精製できる。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 リボース−１−燐酸若しくはその塩及び
   ５−メチルウラシルから５−メチルウリジンを生成する
   能力を有する微生物またはヌクレオシド、無期燐酸若し
   くはその塩及び５−メチルウラシルから５−メチルウリ
   ジンを生成する能力を有する微生物を用い、酵素反応に
   て５−メチルウリジンを製造する方法において、該微生
   物を培養した後、（イ）該培地成分の一部、または全部
   を除去し、次いで（ロ）該微生物にリボース−１−燐酸
   若しくはその塩及び５−メチルウラシルまたはヌクレオ
   シド、無期燐酸若しくはその塩及び５−メチルウラシル
   を作用せしめ、５−メチルウリジンを生成させた後、次
   いで（ハ）生成した５−メチルウリジンを晶析し、分離
   することを特徴とする５−メチルウリジンの製造方法
2. 【請求項２】 培地成分の除去率が５０％から９９％で
   ある請求項１の方法。
3. 【請求項３】 ５−メチルウリジンを晶析し、分離する
   際に５−メチルウリジンの結晶を沈降速度差で他の不純
   物結晶と分離することを特徴とする、請求項１または請
   求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】 分離方法がデカンテーション法または機
   械的分離方法であることを特徴とする、請求項１乃至３
   のいずれか１請求項に記載の方法。