JPH08284A - セファロスポラン酸誘導体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 一般式（２） （式中、Ａは水素原子またはフェニルアセチル基、Ｒは
水素原子、水酸基、アセトキシ基またはハロゲン原子を
示す）で表される３−置換メチル−３−セフェム−４−
カルボン酸とクロロ酢酸低級アルキルエステルを水性媒
体中前記一般式（２）で表される３−置換メチル−３−
セフェム−４−カルボン酸とクロロ酢酸低級アルキルエ
ステルとから７−クロロアセトアミド−３−置換メチル
−３−セフェム−４−カルボン酸に変換する能力を有す
るアシラーゼまたはその含有物の存在下反応させること
を特徴とする７−クロロアセトアミド−３−置換メチル
−３−セフェム−４−カルボン酸の製造法。 【効果】 本酵素的製造法によりセファロスポリン系抗
生物質の製造中間体である７−クロロアセトアミド−３
−置換メチル−３−セフェム−４−カルボン酸を公知の
化学法より簡便、容易且つ高収率で得られ、しかも、公
害防止上の問題となる廃液を発生しない方法を提供する
ことができる。 【化１】

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、医薬品として優れた抗
菌活性を有する種々のセファロスポリン系抗生物質の製
造における有用な中間体の酵素的製造法に関する。さら
に詳しくは、本発明は、７−アミノまたはフェニルアセ
チルアミノ−セファロスポラン酸誘導体から７−クロロ
アセチルアミノ−セファロスポラン酸誘導体の酵素的製
造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】現在、医薬品として使用されているセフ
ァロスポリン系抗生物質は、セフェム環の３位に種々の
置換基を導入することにより優れた抗菌活性を有するセ
ファロスポリン化合物が次々登場している。

【０００３】３位の置換基の多様化に伴い、７位のアミ
ノ基に保護基をもち、３位の反応性を高めた原料中間体
が種々報告されている（特開昭５８−７４６８９号公報
等参照）。

【０００４】上記の原料中間体の１つとして、７−クロ
ロアセチルアミノ−セファロスポラン酸誘導体を使用す
る方法が種々報告されている（特開昭４９−３０３８６
号、特開昭５０−５２０８６号、特開昭５１−４３７８
４号、特開昭５３−１１９８８５号公報等参照）。

【０００５】７位のアミノ基の保護基として、クロロア
セチル基を使用した場合、その脱保護化に際し、簡便且
つ容易に脱離することができるので、リン化合物等の公
害防止上の問題となる廃液を発生しない点で非常に優れ
ている。

【０００６】従来、７−アミノセファロスポラン酸誘導
体を出発原料にし、その７位のアミノ基の保護基として
クロロアセチル基を導入する方法としては、化学的方法
が行われており、通常のアミノ基へのアシル基導入法に
従って７−アミノセファロスポラン酸誘導体にクロロ酢
酸クロライドまたはクロロ酢酸無水物を反応させる方法
が周知である。また、７−フェニルアセチルアミノまた
はフェノキシアセチルアミノ−セファロスポラン酸エス
テル誘導体にクロロアセチルクロライドを反応させるこ
とによりアシル交換反応による方法も報告されている
（特開昭４８−１５８９４号公報）。

【０００７】他方、７−アミノ−セフェム化合物にＤ−
フェニルグリシル基、２−チエニルアセチル基等のアシ
ル基を酵素的に導入する方法種々知られている（特公昭
５０−６５５１号、特公昭５２−２０５５２号、特公昭
５２−３１４３６号、特公昭５５−２９５８号、特開昭
４９−２０３９５号、特公昭５２−３１０３５号、特開
昭４９−４７５９４号、特公昭５４−３７２３７号、特
公昭５５−４８７９９号、特公昭５７−５９７６０号、
特公昭５４−３１０８０号、特公昭５７−２２５５９
号、特公昭５８−６４７６号、特公昭５７−３５９６０
号、特開昭５３−１１８５９１号公報等参照）。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】７位のアミノ基にクロ
ロアセチル基を化学的に導入する場合、大量の有機溶媒
と非常に反応性が高く人体に有害なクロロ酢酸ハライド
を使用し、環境上問題となる。また、４位のカルボン酸
をアシル化してカルボキシル保護基で保護する必要があ
り、製造工程が煩雑となる。

【０００９】さらにまた、７−アミノセファロスポラン
酸（７−ＡＣＡ）を原料として７位のアミノ基にアシル
基を導入後、３位のアセトキシメチル基の加水分解して
ヒドロキシメチル基に変換する場合、この加水分解を工
業的に有利な酵素法で行おうとするとき、一旦、有機溶
媒を分離し、単離、乾燥する工程が必要となり、工業的
に不利である。また、ペニシリンＧを原料として合成さ
れる７−フェニルアセトアミド−３−メチル−３−セフ
ェム化合物より目的のセファロスポラン酸誘導体を合成
する場合には、一旦フェニルアセチル基を脱離する必要
があるが、この脱離を化学的に行う場合、上記と同様に
大量の有機溶媒、反応性が高く人体に有害な試薬を使用
し、環境上の問題がある。さらに、４位のカルボン酸を
アシル化してカルボキシル保護基で保護する必要があ
り、製造工程が煩雑となる。

【００１０】一方、７位のアミノ基に酵素的にアシル基
を導入する公知の方法は、いずれも生成した目的物と反
応に使用する活性な前駆体とが酵素的に加水分解され、
且つ生成した目的物の加水分解反応は合成反応速度と比
較し同等程度であるため合成収率が８０％以下である。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の種
々の問題を解決するに当り、７位のアミノ基の保護基と
して導入する置換基として、その脱保護に際し、簡便且
つ容易でリン化合物等の公害防止上の問題となる廃液を
発生しないクロロアセチル基を選択し、この置換基をセ
ファロスポラン酸誘導体に導入すべく鋭意研究を続けた
結果、意外なことに、特定のアシラーゼによるクロロア
セチル基の７位のアミノ基への導入反応においては、生
成された目的物が実質的にアシラーゼによる加水分解を
受けないため、従来の報告で例を見ない高収率で得られ
ることを見出し、本発明を完成させるに至ったものであ
る。

【００１２】すなわち、本発明は、一般式（２）

【化３】 （式中、Ａは水素原子またはフェニルアセチル基、Ｒは
水素原子、水酸基、アセトキシ基またはハロゲン原子を
示す）で表されるセファロスポラン酸誘導体とクロロ酢
酸低級アルキルエステルを水性媒体中前記一般式（２）
で表されるセファロスポラン酸誘導体〔以下、単に「化
合物（２）」と称する〕 とクロロ酢酸低級アルキルエ
ステルとから一般式（１）

【００１３】

【化４】 （式中、Ｒは前記と同じ意味を有する）で表される７−
クロロアセチルアミノ−セファロスポラン酸誘導体に変
換する能力を有するアシラーゼ〔以下、単に「本アシラ
ーゼ」と称する〕またはその含有物の存在下反応させる
ことを特徴とする前記一般式（１）で表される７−クロ
ロアセチルアミノ−セファロスポラン酸誘導体〔以下、
単に「目的化合物（１）」と称する〕の製造法を提供す
るものである。

【００１４】本発明で使用される本アシラーゼは、バチ
ルス・メガテリウムまたはエッシェリヒア・コリ由来の
アシラーゼが有利である。工業的に製造する場合には、
バチルス・メガテリウムＢ−４００（ＦＥＲＭ Ｐ−７
４８）、バチルス・メガテリウムＡＴＣＣ１４９４５、
エッシェリヒア・コリＡＴＣＣ１１１０５等の微生物を
培養し、得られた培養物から本アシラーゼを分離、精製
すればよい。

【００１５】バチルス・メガテリウムＢ−４００の菌学
的性質については特公昭５０−６５５１号公報に記載さ
れており、エッシェリヒア・コリＡＴＣＣ１１１０５の
使用については特公昭３９−２５１２５号、特公昭３８
−９９３６号、特公昭４０−７８９６号、特公昭４２−
２２３７７号公報等に記載されている。

【００１６】上記微生物の培養は、公知の方法に従って
行うことができる。使用する培地は、一般細菌の栄養源
として公知のものが利用でき、例えばグルコース、フラ
クトース、マルトース、シュクロース、廃糖蜜、澱粉、
澱粉加水分解物、ポテト、酢酸、オレイン酸エチル、エ
タノール等の炭素源、硝酸、硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、アンモニア等の無機窒素源、酵母エキス、
麦芽エキス、ペプトン、肉エキス、コーン・スチープ・
リカー、ディスティラーズ・ソルブル、フィッシュミー
ル、大豆浸出液、大豆蛋白分解物等の有機窒素源、Ｌ−
バリン、Ｌ−グルタミン酸等のアミノ酸、リン酸、マグ
ネシウム、カリウム、鉄、コバルト、マンガン等の無機
栄養源を適宜組み合わせて使用できる。培地のｐＨは５
〜９の範囲で選べばよく、好ましくは６〜８の間であ
る。培養温度は１５〜４５℃、好ましくは２５〜４０℃
の間である。培養日数は１〜１０日の範囲で、酵素活性
が最大になるまで培養すればよい。

【００１７】得られた培養物から本アシラーゼを分離、
精製するには、本酵素は生産菌によりその存在状態が異
なり、菌体内酵素あるいは菌体外酵素として存在する。
菌体内酵素である場合は、菌体を磨砕、超短波等の処理
による菌体破壊物、セチルピリジウムクロライド等の処
理による菌体溶解液を塩析、分画沈澱、透析、吸着クロ
マトグラフィー、ゲル濾過等の公知の酵素分離・精製手
段により分離、精製することができる。また、菌体外酵
素である場合には、培養物から菌体を分離した培養濾液
を前記の公知の酵素分離・精製手段により分離、精製す
ることができる。

【００１８】本発明において、本アシラーゼ含有物と
は、本アシラーゼ活性を保持している限り如何なる形態
でも存在していてもよいことを意味する。例えば、本ア
シラーゼが菌体内酵素である場合、本アシラーゼ生産菌
の培養物、培養物から集菌して得た生菌体、物理的ある
いは化学的方法による菌体処理物、すなわち、アセト
ン、メタノール、エタノール等の処理による乾燥菌体、
磨砕、超短波等の処理による菌体破壊物、セチルピリジ
ウムクロライド等の処理による菌体溶解液、塩析、分画
沈澱、透析、吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過等の公
知の酵素分離・精製手段により部分的に分離、精製した
酵素製剤が挙げられる。

【００１９】また、本アシラーゼが菌体外酵素である場
合、本アシラーゼ生産菌の培養物、培養物から徐菌して
得た培養濾液、培養濾液から塩析、分画沈澱、透析、吸
着クロマトグラフィー、ゲル濾過等の公知の酵素分離・
精製手段により部分的に分離、精製した酵素製剤が挙げ
られる。

【００２０】さらにまた、本アシラーゼ、部分的に分離
・精製された段階で存在する本酵素含有液または生菌
体、乾燥菌体、菌体破壊物等の固体状態で存在する本酵
素含有物を固定化酵素あるいは固定化菌体を調製する公
知の方法に従って、公知の固体化用担体に固定化して得
た固定化酵素あるいは固定化菌体も本アシラーゼ含有物
に包含される。

【００２１】上記の固定化方法としては、共有結合法、
物理的吸着法、イオン結合法、生化学的特異結合法等の
担体結合法、格子型、マイクロカプセル型、リポソーム
型、膜型等の包括固定化法が好ましい。使用する担体と
しては、イオン交換樹脂、吸着樹脂等の有機化合物、活
性炭等の無機化合物、キチン等の天然物質、セラミック
等の人工基質が挙げられる。

【００２２】前記のバチルス・メガテリウムおよびエッ
シェリヒア・コリＡＴＣＣ１１１０５由来のアシラーゼ
は古くから知られており〔Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌ．，４３，７０５−７２１（１９７５）、Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．９，５３７−５５
４（１９８４）、Ｐｒｏｓｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ，２７，１３１−１４３（１９９２）等参照〕、
固定化ペニシリンアシラーゼ（旭化成工業社製、特公昭
６２−４７５１６号公報参照）、ペニシリンアミダーゼ
（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ａｍｉｄａｓｅ ｉｍｍｏｂ
ｉｌｉｚｅｄ ｏｎ ＥｕｐｅｒｇｉｔＣ ｆｒｏｍ
Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｆｌｕｋａ社製）等の固定化酵素の形態
で市販されている。

【００２３】本発明において使用される化合物（２）は
公知物質であるが、Ａが水素原子である物質としては、
７−ＡＣＡ、７−アミノ−３−メチル−３−セフェム−
４−カルボン酸（デアセトキシ−７−ＡＣＡ）、７−ア
ミノ−３−ヒドロキシメチル−３−セフェム−４−カル
ボン酸（デアセチル−７−ＡＣＡ）、７−アミノ−３−
クロロメチル−３−３−セフェム−４−カルボン酸、７
−アミノ−３−ブロモメチル−３−セフェム−４−カル
ボン酸等が例示され、Ａがフェニルアセチル基である物
質としては、７−フェニルアセトアミド−３−メチル−
３−セフェム−４−カルボン酸、７−フェニルアセトア
ミド−３−ヒドロキシメチル−３−セフェム−４−カル
ボン酸、７−フェニルアセトアミド−３−クロロメチル
−３−セフェム−４−カルボン酸、７−フェニルアセト
アミド−３−ブロモメチル−３−セフェム−４−カルボ
ン酸等が例示される。

【００２４】本発明に使用されるクロロ酢酸低級アルキ
ルエステルとしては、クロロ酢酸の炭素数１〜４個のア
ルキルエステルが挙げることができるが、工業的にはク
ロロ酢酸メチルエステルまたはクロロ酢酸エチルエステ
ルが好ましい。

【００２５】本発明においては、水性媒体中、本アシラ
ーゼまたはその含有物の存在下化合物（１）とクロロ酢
酸低級アルキルエステルを酵素的に反応させるのである
が、使用する水性媒体としては、水、各種塩類を含む緩
衝液、例えばリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、水または緩
衝液と親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール
等のアルコール溶媒、アセトン等のケトン溶媒、ジオキ
サン等のエーテル溶媒との混合溶媒が挙げられる。さら
には、該水性媒体と非親水性有機溶媒とからなる二相系
溶媒を使用してもよい。

【００２６】上記の反応温度は、原料の種類、溶媒の種
類、本アシラーゼまたはその含有物の存在形態等、種々
の条件により必ずしも一定ではないが、通常は０〜８０
℃、好ましくは１０〜５０℃の間で適宜選択される。化
合物（２）の濃度は０．００１から７０重量％、好まし
くは０．１〜４０重量％の間で適宜選択される。

【００２７】クロロ酢酸低級アルキルエステルの使用量
は化合物（２）の１〜１０倍の範囲で適宜選択される。
これらの基質は連続的あるいは間欠的に補充し、反応中
の濃度が上記の範囲に維持されるように添加してもよ
い。

【００２８】上記酵素反応はｐＨ約５〜９の範囲、好ま
しくは７〜９の範囲に維持されるのがよい。反応中、上
記ｐＨを保持するため、アンモニア水、水酸化ナトリウ
ム水溶液等が適宜添加されてもよい。反応経過を薄層ク
ロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高速液体クロマトグラフ
ィー（ＨＰＬＣ）等により追跡できるので、化合物
（２）が消失するか、または目的化合物（１）が最大に
生成されるのを待って適宜反応を終了させればよい。通
常の反応時間は０．５〜１００時間である。

【００２９】反応液から目的化合物（１）を採取するに
は、公知のセファロスポリン化合物を分離・精製する公
知の方法に従って行うことができる。例えば、抽出、結
晶化、クロマトグラフィー等の適宜組み合わせにより行
われる。

【００３０】

【発明の効果】アシラーゼによるクロロアセチル基のセ
フェム骨格の７位のアミノ基への導入反応においては、
生成された目的物が実質的にアシラーゼによる加水分解
を受けないため、合成反応収率が公知の他の酵素的合成
反応に比較し、極めて高い方法を提供することができ、
また、公知の化学法より簡便、容易且つ高収率で得ら
れ、公害防止上の問題となる廃液を発生しない方法を提
供することができる。

【００３１】

【実施例】次に、参考例、実施例および比較例を挙げて
本発明をさらに詳細に説明する。

【００３２】

【参考例】ポリペプトン１％、肉エキス１％、食塩０．
５％、フェニル酢酸０．２％を含む液体培地（ｐＨ７．
０）５０ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに分注し、蒸
気滅菌した後、斜面培養しておいたバチルス・メガテリ
ウムＢ−４００を接種し、３０℃で３０時間振盪培養し
た。培養後、培養物を合わせて遠心分離により菌体を除
去し、得られた培養液上清のｐＨを７．５に調整後、セ
ライト（ＪｏｈｎｓＭａｎｖｉｌｌｅ Ｓａｌｅｓ社製
Ｎｏ．５６０）２０ｇ／Ｌを添加し、２時間攪拌してペ
ニシリンＧアシラーゼを吸着させた。次いで、濾過して
セライトを回収し、水洗後、２４％硫安水溶液でペニシ
リンＧアシラーゼを溶出し、リン酸カリウム緩衝液に対
して透析を行い、酵素精製液（６０Ｕ／ｍｌ）を得た。

【００３３】本アシラーゼ活性の活性測定法は次の方法
により求めた。上記酵素溶液を７−フェニルアセチルア
ミノ−デアセチル−セファロスポラン酸２０ｍモル濃度
を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中で２５℃で２０分
間反応させ、ＨＰＬＣにより生成するデアセチル−７−
ＡＣＡを定量し、加水分解活性を求めた（活性１単位
（Ｕ）は１分間に１μモルのデセアセチル７−ＡＣＡを
加水分解する能力を示す）。

【００３４】上記のＨＰＬＣ分析は次の条件により行っ
た。 カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍ
ｅ ４．６ｍｍ×１５０ｍｍ（Ｎａｃａｒａｉ社製） 溶媒；０．５％酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリ
ル（１９：１０） 流速：１．０ｍｌ／分 波長：２５４ｎｍ 保持時間：７−フェニルアセチルアミノ−デアセチル−
セファロスポラン酸；６．７分、デアセチル−７−ＡＣ
Ａ；２分

【００３５】

【実施例１】７−ＡＣＡ２０ｍモルとクロロ酢酸メチル
６０ｍモルを蒸留水１００ｍｌに入れ、アンモニア水で
ｐＨを７．５に調整した後、参考例で得たペニシリンＧ
アシラーゼ溶液５ｍｌを添加し、反応中ｐＨが７．５に
保持するようアンモニア水を添加しながら、２５℃で１
８０分間反応させた。反応終了液をＨＰＬＣで定量した
ところ、１８．８ｍモルの７−クロロアセチルアミノセ
ファロスポラン酸が生成した。

【００３６】反応終了液に酢酸エチル２００ｍｌを添加
し、水溶液のｐＨを濃塩酸で２．０に調整した後、目的
物を溶媒抽出した。抽出液を飽和食塩水１００ｍｌで洗
浄した後、減圧濃縮した。得られた粉末を乾燥して７−
クロロアセチルアミノセファロスポラン酸３．０ｇを得
た。化合物の同定は、標品のクロマトグラフィーデータ
およびＮＭＲ、ＩＲおよびＵＶ等のスペクトルデータと
比較して行った。

【００３７】上記のＨＰＬＣ分析は次の条件により行っ
た。 カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍ
ｅ ４．６ｍｍ×１５０ｍｍ（Ｎａｃａｒａｉ社製） 溶媒；０．５％酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリ
ル（９６：９） 流速：１．０ｍｌ／分 波長：２５４ｎｍ 保持時間：７−クロロアセチルアミノ−デアセチル−セ
ファロスポラン酸；５．０分、デアセチル−７−ＡＣ
Ａ；１．８分

【００３８】

【実施例２】７−ＡＣＡ２０ｍモルとクロロ酢酸メチル
６０ｍモルを蒸留水１００ｍｌに入れ、アンモニア水で
ｐＨを７．５に調整した後、市販のペニシリンアミダー
ゼ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ａｍｉｄａｓｅ ｉｍｍｏ
ｂｉｌｉｚｅｄ ｏｎ Ｅｕｐｅｒｇｉｔ Ｃ ｆｒｏ
ｍ Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｆｌｕｋａ社製）１２ｇを添加し、
反応中ｐＨが７．５に保持するようアンモニア水を添加
しながら、２５℃で１８０分間反応させた。反応終了液
をＨＰＬＣで定量したところ、１８．８ｍモルの７−ク
ロロアセチルアミノセファロスポラン酸が生成した。

【００３９】反応終了液に酢酸エチル２００ｍｌを添加
し、水溶液のｐＨを濃塩酸で２．０に調整した後、目的
物を溶媒抽出した。抽出液を飽和食塩水１００ｍｌで洗
浄した後、減圧濃縮した。得られた粉末を乾燥して７−
クロロアセチルアミノセファロスポラン酸３．０ｇを得
た。化合物の同定は、標品のクロマトグラフィーデータ
およびＮＭＲ、ＩＲおよびＵＶ等のスペクトルデータと
比較して行った。

【００４０】

【実施例３】デアセチル７−ＡＣＡ２０ｍモルとクロロ
酢酸メチル６０ｍモルを蒸留水１００ｍｌに入れ、アン
モニア水でｐＨを７．５に調整した後、参考例で得たペ
ニシリンＧアシラーゼ溶液５ｍｌを添加し、反応中ｐＨ
が７．５に保持するようアンモニア水を添加しながら、
２５℃で１８０分間反応させた。反応終了液をＨＰＬＣ
で定量したところ、１８．８ｍモルの７−クロロアセチ
ルアミノ−デアセチル−セファロスポラン酸が生成し
た。上記のＨＰＬＣ分析条件は実施例１に記載の条件と
同一の条件で行った。

【００４１】

【実施例４】参考例で得たペニシリンＧアシラーゼ溶液
をデアセチル−７−ＡＣＡ２０ｍモル濃度とクロロ酢酸
メチル６０ｍモル濃度を含むｐＨ６．０〜８．５のリン
酸緩衝液中で２０分間反応させ、合成活性を求めた。
（活性１単位（Ｕ）は１分間に１μモルの７−クロロア
セチルアミノ−デアセチル−セファロスポラン酸を生成
する能力を示す）

【００４２】一方、同酵素液を７−クロロアセチルアミ
ノ−デアセチル−セファロスポラン酸２０ｍモル濃度を
含むｐＨ６．０〜８．５のリン酸緩衝液中で２５℃で２
０分間反応させ、加水分解活性を求めた。（活性１単位
（Ｕ）は１分間に１μモルのデアセチル７−ＡＣＡを生
成する能力を示す）

【００４３】この結果を表１に示す。

【表１】

【００４４】上記の結果から、参考例で得たペニシリン
Ｇアシラーゼ溶液によるデアセチル−７−ＡＣＡから７
−クロロアセチルアミノ−デアセチル−セファロスポラ
ン酸への合成活性は分解活性に比べ２０倍以上と高く、
実質的に分解されないことが分かる。

【００４５】

【比較例】参考例で得た酵素液および市販のペニシリン
アミダーゼをデアセチル−７−ＡＣＡ２０ｍモル濃度お
よびクロロ酢酸メチル、フェニル酢酸メチルまたはＤ−
フェニルグリシンメチルエステル６０ｍモル濃度を含む
ｐＨ６．５または７．５のリン酸緩衝液中で２５℃で２
０分間反応させ、合成活性を求めた。（活性１単位
（Ｕ）は１分間に１μモルの７−クロロアセチルアミノ
−デアセチル−セファロスポラン酸、７−フェニルアセ
チルアミノ−デアセチル−セファロスポラン酸または７
−Ｄ−フェニルグリシルアミノ−デアセチル−セファロ
スポラン酸を生成する能力を有する）

【００４６】一方、同酵素液を７−クロロアセチルアミ
ノ−デアセチル−セファロスポラン酸、７−フェニルア
セチルアミノ−デアセチル−セファロスポラン酸または
７−Ｄ−フェニルグリシルアミノ−デアセチル−セファ
ロスポラン酸２０ｍモル濃度を含むｐＨ６．５または
７．５のリン酸緩衝液中で２５℃で２０分間反応させ、
加水分解活性を求めた。（活性１単位（Ｕ）は１分間に
１μモルの各基質を加水分解する能力を示す）

【００４７】この結果を表２に示す。

【表２】

【００４８】上記の結果から、７位のアミノ基にフェニ
ルアセチルまたはＤ−フェニルグリシルの置換基が導入
されたデアセチル−セファロスポラン酸は、ペニシリン
Ｇアシラーゼによる合成活性と分解活性が同等であるの
に対し、本発明のクロロアセチル基が導入された置換基
に対しては、分解活性が非常に低く、非常に効率よくク
ロロアセチル基は導入されていることが分かる。

【００４９】

【実施例５】デアセチル７−ＡＣＡ３５ｍモルとクロロ
酢酸メチル１００ｍモルを蒸留水１００ｍｌに入れ、ア
ンモニア水を添加してｐＨを６．５または７．５に調整
した後、参考例で得たペニシリンＧアシラーゼ溶液８．
１ｍｌを添加し、反応中ｐＨが６．５または７．５に保
持するようアンモニア水を添加しながら、２５℃でｐＨ
が６．５または７．５に保持するようにアンモニア水を
添加しながら、１８０分間反応させた。反応終了液をＨ
ＰＬＣにて定量した結果、ｐＨ６．５では３２．３ｍモ
ル、ｐＨ７．５では３３．３ｍモルの７−クロロアセチ
ルアミノ−デアセチル−セファロスポラン酸が生成し
た。従って、上記の酵素反応条件が弱酸性、弱アルカリ
性のいずれの場合も良好な収率で得られることが分か
る。

【００５０】

【比較例】デアセチル７−ＡＣＡ３５ｍモルとフェニル
酢酸メチル１００ｍモルを蒸留水１００ｍｌ中に入れ、
アンモニア水を添加して、ｐＨを６．５または７．５に
調整し、参考例で得たペニシリンＧアシラーゼ溶液８．
１ｍｌを添加し、２５℃でｐＨが６．５または７．５に
保持するようにアンモニア水を添加しながら１８０分間
反応を行った。反応終了液をＨＰＬＣにて定量した結
果、ｐＨ６．５では２６．３ｍモル、ｐＨ７．５では１
９．３ｍモルの７−フェニルアセチルアミノ−デアセチ
ル−セファロスポラン酸が生成した。従って、デアセチ
ル−７−ＡＣＡにフェニルアセチル基を導入する場合、
弱アルカリ性では収率が低下することが分かる。

【００５１】

【実施例６】７−フェニルアセチルアミノ−デアセトキ
シ−セファロスポラン酸５ｍモルとクロロ酢酸メチル１
５ｍモルを蒸留水１００ｍｌに入れ、アンモニア水を添
加してｐＨを７．５に調整し、参考例で得たペニシリン
Ｇアシラーゼ溶液１．２５ｍｌを添加し、２５℃でｐＨ
が７．５に保持するようにアンモニア水を添加しなが
ら、１８０分間反応させた。反応終了液をＨＰＬＣで定
量したところ、４．４８ｍモルの７−クロロアセチルア
ミノ−デアセトキシ−セファロスポラン酸が生成した。
上記のＨＰＬＣ分析条件は実施例１に記載の条件と同一
の条件で行った。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一般式（２） 【化１】 （式中、Ａは水素原子またはフェニルアセチル基、Ｒは
   水素原子、水酸基、アセトキシ基またはハロゲン原子を
   示す）で表されるセファロスポラン酸誘導体とクロロ酢
   酸低級アルキルエステルを水性媒体中前記一般式（２）
   で表されるセファロスポラン酸誘導体とクロロ酢酸低級
   アルキルエステルとから一般式（１） 【化２】 （式中、Ｒは前記と同じ意味を有する）で表される７−
   クロロアセチルアミノ−セファロスポラン酸誘導体に変
   換する能力を有するアシラーゼまたはその含有物の存在
   下反応させることを特徴とする前記一般式（１）で表さ
   れる７−クロロアセチルアミノ−セファロスポラン酸誘
   導体の製造法。
2. 【請求項２】 アシラーゼまたはその含有物がバチルス
   属またはエッシェリヒア属に属する該アシラーゼ生産菌
   由来のアシラーゼまたはその含有物である請求項１記載
   の製造法