JPS60227675A - Ｏ−トランスカルバモイラ−ゼおよびその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は酵素の改善および半合成抗生物質製造における
それらの使用に関する。更に詳しくは、本発明は０−ト
ランスカルパモイラーゼおよび３−カルバモイルオキシ
メチルセファロスポリン抗生物質製造におけるその使用
に関する。

かなりの関心を呼んでいる半合成セファロスポリン抗生
物質の一部は、セファロスポリン核の３位にカルバモイ
ルオキシメチルすなわち−ＣＩ（２０ＣＯＮ）１２基を
有する化合物を包含しており、そ［７て種々のβ−アシ
ルアミド°基を有する多数のこのｌイブの抗生物質が提
案されている。３−カルバモイルオキシメチルセファロ
スポリン全産生させることのできる当障法は存在してい
るけれども、そのような方法は混合物が得られるという
不利点を有している。そのような混合物の個々の化合物
は一般に、分＃Ｉ饅更に化学的変性を必要としそしてそ
のような化学的変性は多くの場合５Ｊ＃ｉ困難なもので
ある。

しかしながら６−ヒドロキシメチルセファロスポリン化
合物からの３−カルバモイルオキシメチルセファロスポ
リンの製造は、魅力ある命題である。伺故ならば３−ヒ
ドロキシメチルセファロスポリン化合物は例えばベルギ
ー特許第８１４．９５７号明細嘗の方法によって良好な
収率で製造することができるからでめる。とれら３−ヒ
ドロキシメチルセファロスポリン化合物を化学試薬例え
ばイソシアネートと反応させて、３−カルバモイルオキ
シメチルセファロスポリン化合物を生成させることがで
きる。しかし現在までに提案されている試薬は、それら
の製造に必要な出発物質の不安定性および危険性ｔ−含
めて種々の不利点を有している。

ここに本発明者らは、０−トランスカルパモイラーゼの
存在を発見した。これはカルバモイルＪｌｉ　（ＮＨ２
ＣＯ−）ｆ　、　３−ヒドロキシメチルセファロスボυ
νに転移させて３−カルバモイルオキシメチルセフフロ
哀ボリンを生成させつる酵素である。この酵素は微生物
源によって産生される。

　６− すなわち、本発明の一態様によれば、本発明は微生−起
源のＯ−’）ランスカルパモイラーゼを提供するもので
あり、これはカルバモイル基を５−ヒドロキシメチルセ
フγロスボリンニ転移させて、３−カルバモイルオキシ
メチルセファロスポリンを生成させつるものでろ抄、且
つ悪影響のめる酵素を一部または児全に含有しない吃の
である。

Ｎ−）ランスカルバモイラーゼはすでに記載されている
が、０−トランスカルバモイラーゼの記載はまたなされ
ていない。

０−トランスカルバモイラーゼを産生ずる微生物は菌株
保存機関で公的に入手可能な菌株から選ぶことができる
し、またはこれは適尚な天然源、例えば土壌、下水、海
水、花、果物、空気または他の源から通常の手段で単離
することができる。有用な微生物の選択は容易に実施す
６− ることかで疼そして例えば次の操作を使用することがで
きる。

微生物は適当な条件下に生長させることができる。例え
ば次表を参照されたい。

肉エキス　１．８％ 細　菌　ペプトン　１．０％　２８．５７ＣＮａＣ１Ｏ
，５％　１〜２日 水道水 ｐＨをオートクレーブに かける前にＺ２±０．１に 調整する。

麦芽エキス　２．４％ カビまたは　酵母エキス　０．５％　２５５２８Ｃアク
チノマイ　水道水　２〜５日 セーテスまた　ｐＨヲオートクレープにけ酵母　かける
前に７．８に脚整 する 通常の手段例えば遠心分離によって醗酵の間の種々の時
間に細胞を収穫し、これを水酸化ナトリウムで、Ｈ６、
ＯＫｖ！４整された１０ｍＭピペラジン−Ｎ、Ｎ’−ビ
ス（？−エタンスルホンｍ　５−　ハイブーで洗う。充
填（パンク）された細胞（１？）を同一のパンファー（
４，５ｄ）に再懸濁させ、そして適当な方法例えばガラ
スピーズと共に激しく攪拌するかまたは超音波処理によ
り破壊させる。

破壊された細胞の懸濁液（４０μｍ）または細胞王宮の
上演み液（４０μｔ）’ｔ、カルバモイルホスフェート
（Ｏ，Ｓμモル）、放射性３−ヒドロキシメチルセファ
ロスポリン（１００ｎＣｉ’　（約２ｃｉ／Ｓ　１７％
ル）　）例ｉｒｘ〔３Ｉｑ〕−７ｉ−ｃ５−７ミノー５
−カルポキシベンタンア２ド）−５＝ヒドロキシメチル
セフ−６−エム−４−カルボン酸、および好ましくは塩
化マンガン（１００ナノモル）、塩化マグネシウム（１
００ナノモル）およびＡＴＰ　（０，３ミリモル）に、
最終容積０、１　ｍ水中で加える。この反応混合物を６
０分間２８°で培養する。

次いで塩酸（ＩＭ、０．１　ｍ　）を加えて未変化基質
をラクトン化させる。５０分間２８°においた後、１０
ｍＭの酢酸（４，Ｏｄ　）そして次いでＤｏｖｅｒ　−
１アセテート（ｘ８．２００〜４００メツシユ）（０，
５ａｄパック体積）を富有する水（０，７５ｗ１）’に
加える。混合後、このＤＯＷ６Ｘ　−１アセテートを沈
降させ、そして２＃Ｉ／の上澄液中の放射能を液体シン
チレーションスペクトロメーター（例えばハシカード・
トリカーブ５５２０）中で１５ｔＪのジオキサンベース
シンチレーション流体（例えばニュークリア書エンター
ブライゼスＮｍ２５０）？ｉ＝使用して測定する。

０−）ランスカルバモイフーゼの活性の・存在物および
それが存在することが見出された場合　９− のその程度は、記載の培養混合物から得られた放射能と
、放射性３−ヒドロキシメチルセファロスポリン添加５
ｋｔｉｔちに塩酸を加えた培養混合物から得られる放射
能との間の差（７５％）から測定することができる。３
−カルバモイルオキシメチルセファロスポリンの形成は
好ましくｕ未’Ｒ化３−ヒドロキシメチ刀・セファ−゛
スポリンのラクトン化後の反応混合物の適当なりロマト
グラフイー分析例えげ高圧液体クロマトグラフィー（Ｈ
ｐｒ、ｃ）によってｒ４認される。

クロマトグラフィーによつ′″ｒ：１１Ｅ明されるよう
に、セファロスポリン基質または生成物が分解して−る
場合にけ、・第二の・それに代る方法を使用することが
できる。前記の破壊細胞懸濁液（５０μｔ）を、最終容
積０．１−の水になるように（６Ｂ、７ＰＬ）−５−し
ドロキシメチル−７−（２−メトキシイオノ−２−（フ
ルー２−イル）ア１０− セトアミド〕セフー３−エムー４−カルボン酸（シン異
性体）（０，１Ｍモル）、塩化マグネシウム（０，１Ｍ
モル）、ｉ酸マンガン（０，１Ｍモル）、ＡＴＰ　（０
，１Ｍモル）、ピペラジン−Ｎ、Ｎ’−ビス（２−エタ
ン−スルホンｆｆ）（６μモル、ＫＯＨｆ、Ｉ（６，７
５１Ｃｖ４ｍ）お！び〔１４Ｃ〕カルバモイル−ホスフ
ェート（５０口Ｏｆ、０．１Ｍモル）に加える。反応物
は２８°で１０分子ｌ！ｌ培養される。

次いで［酸（０，１Ｍ、　ｏ、９ｍｔ）に酢酸エチル（
１ｄ）を加える。激１〜く攪拌した債、このエマルジョ
ンを遠心分離する（５００ｒ、１分間）。その有機相の
一部（０，５１Ｒ１）を４０°で減圧下に乾燥させ、そ
してその残渣を水（０，５ｍ　）と混合する。水中の放
射能を前記のようＫして測定する。

０−トランス力ルパモイラーゼ活性の存在およびそれが
存在することが見出された場合のそのａｌｌｉｌ、３−
ヒドロキシメチルセファロスポリンを除外した培養混合
物からの放射能に比べた場合の前記培養混合物から得ら
れる放射能の増加から測定することができる。６−カル
バモイルオキシメチルセファロスポリンの形成ハ、適当
なりロマトグラフイー分析例えば好ましくハ未変化３−
ヒドロキシメチルセファロスポリンのラクトン化後の反
応混合物のＨＰＬＣによって確鯖されなくてはならない
。

０−トランスカルバモイラーゼはアクナノ５セタレス目
の種、特にストレプトマイセス属の　〜種から導くこと
ができる。ＰＪＴｊＩの〇−トランスカルバモイラーゼ
活性を提供するために使用できる特に適当な種としては
、ストレプトマイセス・クラバリゲルス例えば英国特許
第１，３１５，１７７号明細書記載のＮＲＲＬ３５８５
株、ストレプトマイセス・ワダヤメンシス例えばオラン
ダ特許出願第７３０８９４８号明細書記載のＡＴＣ０２
１９８４株、ストレプトマイセス・アルボグリセオルス
例工ば米国特許第５，９１４，１５８号明細書記載のＮ
ＵＲＬ５７３５株、ストレプトマイセス嗜うクタムドク
ランス例えば英国特許第１，３２１，４１２号明細書記
載のＮＲＲＬ３８０２株、ストレプトマイセス・ジュモ
ンジ不ソシス例えば英国特許第１，３８７．９ｔ５５号
明細書記載のＮＲｆｌＬ　５７４１株、およびストレプ
トマイセスｐラクタムゲネス例えば特開昭５０−６９２
９４号明細書記載の株（微工研菌寄託Ａ２２Ｓｉ）があ
けられる。前記株の選択株および変異種もまた使用する
ことができる。

特に好ましい株はストレプトマイセス・クラバゲルスＮ
ｆＬＲＬ　３５８５株またはその選択株またはその異性
体である。

本明細書に使用されている場合、「変異株」なる用語は
自然発生的にか塘たは意図的に適用またはそれ以外のも
のでありうる外的薬剤の作−’１Ｂ− ［Ｒａｄｉａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｒａｄｉｏｉｓｏｔｏ
ｐｅｓ　ｆｏｒ　ＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＭｉｏｒｏｏｒ
ｇａｎｉｓｍｓ　Ｊ　（Ｐｒｏｏｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　
ｔｈｅ８ｙｍｐｏｓｉｕｍ。

Ｖｉｅｎｎａ　（１９７５）第２４１頁（Ｉｎｔ、ｅｒ
ｎａｔｌｏｎａＩＡｔｏｍｌｏ　Ｅｎｅｒｇｙ　Ａｕｔ
ｈｏｒｉｔｙ発行）〕　中のＨｏＩ、アドラー氏による
「Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅＤｅｖｅｘｏ
−ｎｔｏｆ　Ｍｌｏｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　Ｊに記載
されているものを包さする種々の方法により生成させる
ことができる。これらの方法とし°Ｃは次のものがめげ
られる。

１）イオン化放射。例えばＸ−およびｒ線、紫外光線、
光増感性試薬例えば８−メトキシプソラレン、亜酸化ｉ
ａ素、ヒドロキシルアミン、ビＩＪ　Ｚジン塩基同族体
例えは５−ブロモウラシル、アクリジン、アルキル化剤
例えばエチルメタンスルホネート首たはマスタードガス
、逸散化水素、フェノール、ホルムアルデヒド、熱の存
在１４− 下における紫外線、および、 ＩＩ）　遺伝学的技術例えば組換え、人工的抗原変換、
変形、溶原化、溶原変換および自然発生的変異株に対す
る選別技術。

本明細４１に使用されている場合、「選択様」なる用語
は、親株の性質から光性的または定量的に異った一つま
たはそれ以上の性質例えば醗酵の間に産生される物質に
対する抵抗性を有する株を与えるような様式で培養され
た親株から選ばれたコロニーから導かれた微生物株を意
味する。そのような選択様は、勿論親倣生物の自然発生
的変異株でありうるがしかしある場合にはそうではない
であろう。

０−トランスカルパモイラーゼは、それに対する栄養媒
体中で＃素を産生する微生物を培養することにより製造
することができる。栄養培地は、窒素、炭素および伐跡
元累澱を富有しているべきである。昔素源は、例えば通
常の肉エキスまたは酵母エキス、ペプトンまたは例えば
トリプトース、カゼイン氷解物、ホエー粉末またはコー
ンスチープリカーのような調製品でありうる。炭素源は
、レリえは炭水化物源例えば殿粉または任意のその分解
生成物または他の糖、有榛酸またはパラフィンでありう
る。培地の至適、Ｈおよび至適培ｑ＃温度は使用される
微生物の性質に依存する。望ましいｐＩ（は通常４〜９
の範Ｈに見出され、そしてその温度は通常１０°〜４０
Ｃの範囲にある。微生物のｔ＠９Ｎｉｉ通常攪拌または
振盪および通気を使用して行なわれる。必要な酵素活性
が最大値に達する時間は微生物によって変動する。従っ
て使用される各棟に対して至適培養時間ケ決定するのが
望ましい。

酵素が菌体外のものである微生物に対しては、液体培養
培地または全細胞を除去した後の戸液會酵素源として使
用することができる。ｒｌＩ禦が細胞結合型の場合には
、通常の方法例えば適当なバッファー中に細胞全懸濁さ
せた後の超音波処理、ガラスピーズによる粉砕またはホ
モジネート化によって、使用のため忙それを遊離させる
ことができる。細胞破片を除去したかまたは除去を行な
っていない調製品のいずれも酵素源として使用すること
ができる。しかし、通常の方法によってこの酵素を更に
精製することが好ましい。イオン交換セルロースまたは
親和力（アフィニティー）吸着剤または他の吸着剤例、
！ｅ−Ｈヒドロキシルアパタイトによるパッチ処理また
けカラムクロマドグ〉フィーを使用することができる。

更に、この酵素を分子ふるい技術例えば超濾過または虐
析によって嬢縮しまたは更に精製することができる。一
般に、精製処理の間、そのｐＨ′ｆｒ：５〜１１の範囲
内に保持すると１７− とが望ましい。そのような操作は、存在するかも知れず
且つ酵素反応または基質を阻害しうる他の有害々酵素例
えばβ−ラクタマーゼ、アミドヒドロキシラーゼ、カル
バモイルホスフェートキナーゼおよびホスファターゼを
一部または完全に除去する。種々の薬剤、例えば基質、
コファクター、金属イオン、還元剤または塩例えばホス
フェートを使用して酵素の安定性を改善するのが望まし
い。

この酵素は例えば適当なマトリックスの上またはその中
に不溶化または補葬するととＫよってその不動形で使用
すｂことができる。すなわち、酵素抽出物をさもなけれ
ば不活性の無機または有機重合体に共有結合または架橋
形成させるか、繊維上または繊維中にまたは膜ま九は重
合体゛νＵえばボリアクリルアきドゲル上またはその中
に補集させるか、イオン交換樹脂に吸着さ−ユ８− せるか、試薬例えはグルタルアルテヒドと交叉結合させ
るか、または封入体レロえはビーズ中に吸蔵させること
ができる。これらのタイプの不１１１化０−）ランスカ
ルバモイラーゼは有利にはその鏝で＃累會再使用できる
バッチ法および基質を不動化酵素を含有するカラムを通
して通過させる連続流水法で使用することができる。

本発明の別の態様においては、本発明は３−ヒドロキシ
メチルセファロスボリンをカルバモイル化合物またはそ
れのｍｌＩ駆体に微生物源から導かれた所望の０−トラ
ンス力ルバモイラーゼ活性を示す＃素の存在下に接触さ
せることよりなる３−カルバモイルオキシメチルセファ
ロスポリンの灸造法金提供するものである。

好ましいカルバモイル化合物は、カルバモイルホスフェ
ート（ＮＨ２Ｃｏ、０ＰＯ５Ｈ２）であるがしかし他の
カルバモイル化合物ガえばカルバモイルアスパルテート
またはカルバモイルオキザメートおよび前駆体例えばシ
トルリン（ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ　）またはＡＴＰ　、
重炭Ｍ１およびアンモニアまたはグルタミンとの混合物
をも使用することができる。カルバモイルホスフェート
は無機前駆体から例えばアルカリ金属燐ｍ塩ガえは燐酸
カリウムおよびアルカリ金属イソシアンｆｌｌ塩例えは
イソシアン酸カリウムの組合せによって生成させること
ができる。

セファロスポリン基質とは、式 〔式中Ｒ１はアミノまたはブロック（閉塞〕されたアミ
ノ基ｖ／ｌｌえばＣ１〜２０カルボキシルアシルγｉド
基であり、Ｒ２は水素原子または低級アルキル基（クリ
えばメチル、エチルおよびプロピル）、低級アルコキシ
基（例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシ〕、低級ア
ルキルチオ基（ＶｔＵえはメチルチオ、エチルチオ）、
または低級アルカノイル基（Ｎえばアセチル）（使用さ
れている「低級」なる表現は８個以下好ましくは６個以
下の炭素原子を含有する基音意味している）であり、Ｙ
はンＳまたはンＳ→○基を轡わし、そして２位、３位お
よび４位にかけての点線はこの化合物がセフ−２−エム
またはセフ−３−エム化合物でありうることを示してい
る〕を有しつる化合物およびその塩またはエステルであ
る。適当なカルボキシルアシルアミド基は、セファロス
ボリン抗生物質中に一般に見出される基例えばセファロ
スポリン化合物関係の文献中に見出されるアミド形成性
アシル皐から導かれるものである。

存在しうる特定のγシルアミド基としては、２１− Ｒ，（ＣＨ２）ｋ、Ｃ０ＮＨ，− 〔式中Ｒはカルボキシルまたけ複禦猿状アリール基（例
えばフェニル、１個またはそれ以上のハロ、ヒドロキシ
、低級アルキル、ニトロ、アミノ、低級アルカノイル、
低級アルコキシまたは低級アルキルチオで置換されてい
るフェニル、チェニルまたはフリル）またはアリールオ
キシ、アリールチオ、アリール低級アルコキシまたはア
リール低級アルキルチオ基（例エバフェノキシ、フェニ
ルチオ、５−メチル−１，３，４−チアジアゾール−２
−イルチオまたはベンジルチオ）であり、そしてｋけ１
〜４の整数である〕の基、式 ％式％ 〔式中Ｒａはアリール基（例えば単環性または二２２− 環性炭素項状または複！ｌ’項状アリール基ψＵえばフ
ェニル、ナフチルまたは１個またはそれ以上のハロ、ヒ
ドロキシ、低級アルキル、ニトロ、アミノ、低級アルカ
ノイル、低級アルコキシマたは低級アルキルチオで置換
されたフェニル）であり、そしてＸはアミノ、保睦され
たアミノ（例えばＤ−５−アミノ−５−カルボヤシベン
タンアミド基に関して以下に論じられている任意のＮ−
保欣基例えば第３級ブトキシカルボニｋ　Ｍ　’Ｆｔ　
官有する、カルボキシ、カルブアルコキシまたはヒドロ
キシである〕の基および式〔式中Ｒ″は前記定義の意味
（ｉｙＵえばＨ＆はフェニル、置換フェニル、ナフチル
、チェニル、フリルまたはピリジルである）を有しそし
てＲｂは水素、アシル（列えけ低級アルカノイル〕、低
級アルキル（例えばメチル、エチル、プロピルまたはブ
チル）、シクロアルキル（例えば５〜７個の炭素原子合
有のもの例えばシクロペンチルまたはシクロヘキシル）
、アリール（例えば炭素環状アリール例えばフェニル）
、アリール低級アルキル（例えばベンジルまたはフェネ
チル）である〕の基、または式 〔式中Ｒ′はチェニルまたはフリル基を表わし、そして
ＲｏおよびＲｄは同一または異ってそれぞれ水素、自〜
４γルキル（例えはメチル、エチル、ロープロピル、イ
ソプロピルまたはブチル）、０２〜４アルケニル（例え
はビニルまたはアリル）、０３〜７シクロアル中ル（例
えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロ烏ンチルま
たはシクロヘキシル）、フェニル、ナフチル、チェニル
、フリル、カルボキシ、０２〜５アルコキシカルボニル
（例えばエトキシカルボニル）およびシアノから選にれ
、めるいＦｉＲＱおよびＣ６はそれらの結合している炭
素原子と共に０３〜７シクロアルキリデンまたはシクロ
ヘキシリデン基（例えばシクロブチリデン、シクロペン
チリデンまたはシクロヘキシリデン基）を形成するもの
であ抄、そしてｍおよびｎはそれぞれ０またけ１であっ
てｍとｎとの和け０ま九は１である〕の基、または式 〔式中Ｒａハフェニル、チェニルまたはフリル基を表わ
し、セしてＲｏ、Ｒ（１、ｍおよびｎは前記定義のとお
りであり、そしてＲｏおよび〆は更にア２５− ミノカルボニルまたはＮ−置換７２ノカルボニＡ［（？
ｌばＮ　−（ｃ１〜４アルキル）アミノカルボニル例え
ばＮ−メチルアミノカルボニル）を表わしていても工く
、そしてＲｏは水ｌｅｉたはＣ１〜４アルキル基（飼え
ばメチル、エチル、プロピル、イソプロピルまたは第３
級ブチル）である〕の基があげられる。

弐１の化合物中に存在せしめつる前記一般式内に入るＲ
１基の例としては、フェニルアセドア之ド、チェニルア
セトアミド、２−ヒドロキシ−２−フェニルア化ドアミ
ド、２−第３級ブトミドがめげられる。

式ＩＯ化合物中に存在せしめつるその他のアジルア２ド
基Ｒ１としては、天然物醗酵産生化合物例えばセファロ
スポリンＣ中に見出されるわ２６− −５−γＳノー５−カルポキシペンタンア２ドｆｉ、Ｄ
−５−７２ノー５−カルボキシペンタンアミド基のＮ−
保護誘導体（例えばそのアミノ基が英国特許第１，０４
１，９８５号、同第１，３０２，０１５号または同第１
，３１５，２０７芳容明細書のいずれかに記載のタイプ
の保護基により置換されているもの）、Ｄ−５−アミノ
−５−カルボキシペンタンアミド基の変形により得られ
るアシルアミド基（例えば、例えば英国特許第１．２７
２．７６９号明細書記載の例えは酵素的脱７２）化およ
び酸化によってそれから得られる４−カルボキシブトア
２ド基、およびホルムアミド基があげられる。

本発明の方法においては基５β全本発明の酵素ＩＩｌ＆
Ｉ製物と合し、そしてこれと共に望ましくは例えば０〜
６０Ｃ好ましくは２０〜４０Ｃ例えば約２ＢＣで好まし
くは４〜９例えは５〜８のｐＨ範囲のパンファー溶液中
で培養する。この反応は、好ましくは二価金属イオン例
えば１μｍ〜１０１１１Ｍ　（１６度のカルシウム、マ
ダイ、シウム、亜鉛、銅、鉄、マンガンおよびコバルト
イオン、例えば約１．０　ｍＭ第一マンガンイオンおよ
び約ｉ、　ｏ　ｍＭマグイ・ンウムイオンの存在下に、
そして所望によりコファクター例えば５０μＭ〜１５０
ｍＭの濃度の例えばＡ’ｒＰの存在下に行なわれる。反
応が完結した場合、すなわちセファロスボリン基質が反
応混合物のクロマトグラフィーから判断してもはや生成
物に変換されなくなったら、例えば酸性化および遠心を
行なって酵素調製物を除去した後に、適当な抽出および
精製法例えば容媒およびイオン交換クロマトグラフィー
の使用によって所望の３−カルバモイルオキシメチルセ
ファロスポリン紮回収する。

ヒドロキシメチルセファロスボリン基質は、その場で３
−低級アルカノイルオキシメチルセファロスボリン例え
は３−アセトキシメチルセファロスポリンから反応媒体
中でアルカノイルオ中ジメチルセファロスポリンをヒド
ロキシメチルセファロスポリンに変換させうるエステラ
ーゼによって生成させることができる。

２９− ここに不発明を次の調裂例および実施例において更に詐
しく記載するが、これらは本発明を駆足するものとして
理解ざｎるべきではない。

実施例全体にわたってすべての温度は℃でめる。

例　１ 〔３−メチル−！５Ｈ］　−７β−（Ｄ−５−アミノ−
５−カルボキシペンタンアミド）−３−メチル−セフ−
３−エム−４−カルボン酸 セファロスポリンＣカリウム（４８５ｍ９）、硅礫土上
の酸化パラジウム（６１６η）および水（７ｄ）を反応
、器中で混合した。この反応器を１０分間窒素ガスで置
換し、そして次いでトリチウムガスで充満した。トリエ
チルアミン（０，２ｄ）を加えそしてこの混合物を激し
く２０℃で１時間攪拌した。この時間の間に、約６０１
のトリチウムが摂取さｎ、た。このフラスコヲ窒素で置
換し、そしてその内容物を３ｃＩＲの焼結ガラス３０− 上に支持ざｎだ砂礫土床で濾過した。この床を水洗しそ
してｆＰ液を蒸発させて褐色油状スラッジを形成させた
〇 水（２５＃ＬＡ）中のこの調製物１００　ｍｏｉを希塩
酸でｐＨ２，８に調整しそして炭素（８８１１０，１５
０ダ）を加えた。この懸濁液を攪拌しく３０分間）、そ
して次いで珪藻土床上で濾過した。この床を水洗（１０
ａｄ）Ｌそして炭素から表記化合物をアセトン−水混合
物（１：２体積基準）で溶出させた。次いでこの溶出液
を０．５　＃Ｉ／のＩＲＡ−６８アセテートカラムに適
用し、そしてこのカラムを水洗した後、表記化合物を酢
酸カリウム溶液（１％ｙ／ｖ　、　５　Ｑ　ｍｌ　）で
カラムから溶出させた。この段階での収率は５　ｏ　ｍ
ｏｉであった。この溶液の２０　ｍｏｉを前記の炭素処
理を使用して脱塩した。炭素溶出液を減圧下に蒸発させ
、セしてそｎの含有する表記化合物をセルロース上での
プレパラテイブ薄層クロマトグラフィーによってプロパ
ン−１−オール／水／酢酸（５：２：１容！基準）を溶
媒として使用して精製した。紫外線（２５４ｎｍ）下に
急冷することによって可視化ざ１．た帯域を酢酸カリウ
ム溶液（０，１％ｗ／ｖ　）で溶出させそして約２．５
０１７　ミリモルの比活性を示す表記化合物（５，４ｍ
０１）を回収した。

例　２ 〔５−ヒドロキシメチル−５）１３−７β−（Ｄ＝５−
アミノ−５−カルボキシペンタンアミド）−３−ヒドロ
キシメチルセフ−３−エム−４−カルホン？２　（７’
スアセチルセンアロスボリン０）（ａ）　ジオキシゲナ
ーゼ酵素の調製 Ｗ、ガムスにより完全に記載されているアクレモニウム
・クリソゲヌム・ブロッ株０ＭＩ４９１＋７［Ｏｅｐｈ
ａｌｏｓｐｏｒｉｎ−ａｒｔｉｇｅ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌ
ｐｉｌｚｅ（Ｈｙｐｈｏｍｙｃｅｔｅｓ）（１９７１）
第１０９〜１１１頁〕を水１を当りに次のものを含有す
る寒天斜面上で生育させた。

マルトース　４０ｉｉ１ オクソイド麦芽エキス　２４９ オクソイドペブトン　１０９ 寒　天　２０９ この斜面を２８℃で７日間培養し、そして各斜面の半分
を収穫し、そして水１を当シ次のものを包含する培地４
０ｒｒｌ含有のフラスコ中にそれを接種した。

コーンスチープリカ−２５− 酢酸アンモニウム　５，５ｖ 蔗　糖　２５９ 炭酸カルシウム　５ｇ このフラスコを２８’Ｃで４８時間軌道振盪培養材上で
培養しそして次いでこの培養物の一部（１，２５５ｇ／
）を使用して水１を尚シ次のものを包含する培地２５ｍ
を含有するフラスコに接種し−３３− た。

大豆粉　３８ゾ 乳　糖　３８１７ 炭酸カルシウム　１［ｌｙ 倣酸アンモニウム　５ｙ 尿　素　ｏ、５ｐ Ｌ−メチオニン　１．９９ とうもろこし油　３．０ｐ このフラスコ′ｆＩ：２８℃で７２時間、軌道振盪培養
機上で培養しそしてその最終培養物（２ｔ）を４０００
ゾで２分曲４′Ｃで遠心することにょシ収得した。菌糸
体を炭酸カルシウム層から剥ぎ取シ、そして冷燐酸カリ
ウムバッファー（０，ｔ）ＩＭ、ｐＨ７，０）中で洗っ
た。洗った菌糸体（４０１Ｔｈα−オギソグルタレート
（２ｍＭ）およびアスコルビン酸（２ｍＭ）ｋＭ有する
同一バッファーで１８０ｄとし、そして１分間ガラスビ
ー３４− ズ（２５０ｒｎ！、１ｍｍｊ？Ｍ径）と共に、２０００
　ｒｐｍで操作ざ扛そして一５°に塩水で冷却されてい
るダイモミル中で１分間攪拌することにより破壊した。

破壊さ扛た細胞８ＪＶＡ製物を遠心（３０，０００ゾ、
３０分）しそしてその上澄液を超沖過することによｌ）
５ｍｌｊｆＣ＠縮して約１．５ナノモル／分／ゴのジオ
キシゲナーゼ活性を有する調製品を生成させた。

（ｂ）　ジオキシゲナーゼの精製 ジオキシゲナーゼを含有する＃浮上澄液（１００屑ｇ）
（活性０．９２ナノモル／分／　ｍｅ、比活性約０．０
フロナノモル／分／〜蛋白）を、７β−（Ｄ−５−アミ
ノ−５−カルボキシペンタンアずド）−３−メチルセフ
−３−エム−４−カルボン酸（１２ミリＭ）およびジテ
オスレイトール（０，１ミリＭ）を含有する燐酸バッフ
ァー（１０ｍＭ、　ｐＨ７，０）　Ｋ対して透析し、そ
してこｎ’＆透析バッフ７−で平衡化させたＤＥＡＦセ
ルロー、Ｘ（Ｄｇ２３，１００Ｆ湿時Ｎ　１ｆｔ）　（
Ｄ　力５　Ａに適用した。透析バッファー中の塩化ナト
リウムの直線状（ＩＭ、勾配（１，５ｔ、　０〜ＩＭ　
）　’ｔ’ジオキシゲナーゼを溶出させた。その分画を
１次のようにしてジオキシゲナーゼ活性に関して分析し
た。

両分の一部（４０μｔ）を、水酸化カリウムでｐＨ７Ｏ
に緩衝しそして７０μｔの最Ｐ８積とした［３−メチル
−５Ｈ］　−７β−（１３−５−アミノ−５−カルボキ
シペンタンアミド）−３−メチルセフ−３−エム−４−
カルボン酸（１４ナノモル、約２Ｃ１１モル）、２−オ
キシグルタレート（７０ナノモル）、アスコルベート（
７０ナノモル）オよびＰＩＰＥ８　（ピヘラジン−Ｎ、
Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）］（７μモ７μ金
含有する反応混合物に加えた。この反応混合物を２８℃
で６０分間培賃した。次いで等容積の１Ｍ塩酸を加え、
そしてその混合物を２ＢＣで３０分間培養した。各試料
の−５（２０μｔ）を次いでＤｏｗｅｘ　−１アセテー
トカラム（２５＋１＋１ｌｌＸ　４ｗｎ）に適用し、こ
のカラムを水（２Ｘ２．５ｄ）で洗いそして溶出液を６
ゴとした。こ九ら溶液のそ扛ツレの一部（１（（２ｍ／
）をジオキサンペースのシンチレーション液体（１５ｍ
）に期１え、そしてシンチレーションスペクトロメータ
ー上でその放射能を測定した。存在するジオキシゲナー
ゼ活性は、記載の培養混合物から得られる放射能と放射
性３−メチルセファロスポリン添加後直ちに塩酸を加え
た培養混合物から得られる放射能との差から測定ざｎた
。

約０．５Ｍ塩化ナトリウム濃度において溶出ざｎた厳も
活性な画分を合し、セして超濾過（グイアフロ−ＵＭｌ
、０膜、３０　ｐｓｉ　）により５．２ゴに濃縮しそし
てジチオスレイトール（０，１ｍＭ）３７− 會有燐酸バンン７−　（ＩＱｍＭ、　ｐＨ７，０）に対
して透析し友。６２ナノモル／分の活性を有するジオキ
シゲナーゼを回収した。その比活性は約５．３ナノモル
／分／ダ蛋白でめった。

（ｃ）［３−メチル−”Ｈ］　−７β−（Ｄ−５−アミ
ノ−５−カルボキシペンタンアミド）−３−メチルセフ
−３−エム−４−カルボン酸（１，２５μモル、ｊ　２
．Ｏｍ０１　）　ｆ　７時間３７＠テ前記（ｂ）　テ記
載のようにして精製されたジオキシゲナーゼ（２０ナノ
モル／分）、アスコルビン酸（１００μモル）、２−オ
キシグルタレー）（１００μモル）、第二鉄イオン（硫
酸第二鉄アンモニウムで飽和した水１−）およびＰＩＰ
Ｅ８バッファー（０，５膜リモル、ｐＨ７，０）と共に
最終容積１゜ゴで培養した。

次いで酢酸（２ｄ）を加えそしてその反応混合物を遠心
分離し友。上泄液を減圧下に乾燥で５８− せ、残渣を水（２０ｍ／）に溶解させ、そして燐酸カリ
ウムバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ７，０）で平衡化させ
たＤＥＡＥセルロース（２Ｏ２湿時重相°）のカラムに
適用した。このカラムを燐酸バッファー　（１０ｍＭ、
ｐＨ７０）中の塩化ナトリウムの直線状濃度勾配（２０
０ｍｌ、（１〜０２Ｍ）で溶出させた。約０．１Ｍ塩化
ナトリウムで溶出する表記化合物を含有する両分を合し
、減圧下に濃縮しそしてバイオゲルＰ２のカラム（１０
（］Ｏｍ＋ｎＸ２５鰭直径）上で一１分した。２６０　
ｎｍの吸収により検出されるセファロスポリンを集めそ
してｔｌｏおよびＨＰＬＯにより分析した。表記化合物
（２，２８ｍ０１）のみを生成物中に検出することがで
きた。

実施例　１ ０−トランス力ルバモイラ〜ゼ抽出物の製造ストレプト
マイセス・クラバリゲルスＮＲＲＬ６５８５の芽胞形成
斜面を滅菌水（１０１１！／）にＩＭｉ濁σせ、そして
その一部（２，５ゴ）を培地Ｉ〔蔗糖（２０１，大豆粉
（ビピー社製品＞（１５１％酵母エキス（オクンイド＞
　（５！ｉ’）、燐酸水素２カリウム（０，１７）、オ
クンイドトリプトン（５１、グリセリン（１０９）およ
び水道水（１００口ｄ）を含有する溶液］中に接種した
（２５０ｄのバックルつき振盪フラスコ中２５ゴ）。こ
の培地を４８時間２６６で軌道培養機中で培養しそして
次いでこの培養物の一部（０，２５ｍ／）’ｉ使用して
培地■〔クエン酸ナトリウム（２１ｉ’）、燐酸水素２
カリウム（１，４Ｐ）、燐酸２水素カリウム（０，６Ｖ
）、ＭｇＳＯ４−７Ｈ２０（０，５１ｉｔ　’）、Ｆｅ
ＳＯ４・７８２０（０，２５１、Ｌ−アスパラギン（０
，２ｆ）、可溶性澱粉（１，０１および蒸榴水（１００
０Ｐｎりを含有する溶液〕に接種した（２５０ｄの振盪
フラスコ中２５　ｍｌ　］。この培地を次いで２６＠で
４８時間培養しそして次いで遠心によシ細胞を集めた（
１ａ０００　ｒｐｍ、１５分、４Ｃ）。この＋ｌ（Ｉ＋
胞をＰＩＦｇＳ溶液（５ゴ、１０ｍＭ、ｐＨ，６，０）
に懸濁させ、そしてこ２１を４″でＭＳｇ、５６８超音
波破壊装置を使用して最大振幅で５分間破壊した。

例　２ ストレプトマイセス・クラバリゲルスからのＯ−トラン
スカルバモイラーゼの存在下における［１４０］カルバ
モイルホスフエートおよび７α−メトキシ−７β−（Ｄ
−５−アミノ−５−カルボキシペンタンアミド）−３−
ヒドロキシメチルセフ−５−エム−４−カルボンＨＣ７
α−メトキシデスアセトキシセファロスポリン０）から
の７α−メトキシ−７β−（Ｄ−５−アミノ−５−カル
ボキンペンタンアミド）−３−カルバモイルオキシメチ
ルセフ−３−エム−４−カルボン酸（セファマイシ、ン
０）の合成放射性（”　Ｏ］カルバモイルホスフェ−）
　（３１４１− ナノモル、０．２５μ０１　）および７α−メトキシデ
スアセチルセファロスポリンＯ（’１００μ９）ヲ笑施
例１の０−トランスカルバモイラーゼＩｆｌｌＪ品の１
刊〜（１ｄ）と共に３０分ｍ１２７″で培養した。

この反応混合物を氷上で冷却し、そしてラベル式ｎでい
ないセファマイ７ンＯ（５０μｔ、２０／ｎ９／−）を
すべての生成放射性士ファマイシン０に対するキャリア
ー、として刃口えた。これに続いて酢酸（０，２５ゴ、
５Ｍ、４°）を加えた。沈澱を遠心分離しそしてその上
澄液を減圧下に蒸発乾固させた。

乾燥した上澄液をバッファー（＠酸／酢酸（０，０６Ｍ
酢酸を蟻酸でｐＨ２，５に調整したもの）〕（３５μｔ
）に再懸濁させ、そして同一バッファー中で平衡化させ
た陰イオン交換ＨＰＬＯカラム（ジバックス８ＡＸ　、
２．５　Ｘ　１００ｍ、　１，０００　ｐｓｉで１−７
分の流速）に適用した（３０μｔ）。セファマイ４２− シン０を含有する主Ｅ２６６ビークを集め（５ｍ１）、
蒸発乾固させそして再び前記バッファー（３５μｔ）中
にとった。こｎｆ次いで［ｉリイオンＨＰＬＯカラム（
ジバックス８０Ｘ、２．５Ｘ１００叫、１０００ｐｓｉ
で１ｍｅ１分の流速）に適用しく３０μｔ）、そしてセ
ファロスポリン０のピークを包含する両分を集めた。合
した両分を蒸溜水で３ｍ１Ｋ調節し、そしてそのＥ２６
６および放射能を測定した。

セファマイシン０中に包含ざｊた放射能はキャリアーの
５％回収に対して補正した後０．７％と計算された。

例　３ ０−トランスカルバモイル化反応（細胞不含上澄液の使
用） 使用された方法は例２と同様であるが、ただしこの場合
細胞ホモジネートを、そｆＬを４０で１０分３０．００
０ｇで遠心して得られる細胞不含上澄液で置換した。

セファマイシン０中に包含ざｎていた放射能は中ヤリア
ーに対する補正後（約５％）　０．２６％であると計算
さｎ、た。

例　４ ストレプトマイセス・クラパリゲルスからのアセチルエ
ステラーゼおよび０−トランスカルバモイラーゼの存在
下における７β−（Ｄ−５−アミノ−５−カルボキシペ
ンタンアミド）−７α−メトキシ−３−アセトキンメチ
ルセフ−３−エム−４−カルボン酸（７α−メトキシセ
ファロスポリン０）からのセファマイシンＣの合成 （ａｌ　操作は例２と同様でめったがただし７α−メト
キシセファロスポリンＯ（１００μＶ）が使用された。

培養後の全反応混合物のクロマトグラフィー分析は７α
−メトキシセファロスポリン０の大部分が８．タラバリ
ゲルスの抽出物中に存在するということが仰らｊ、てい
るエステラーゼ［Ｏｈｅｍｏｔｈｅｒ、１．２３７（１
９７２）参照〕によって７α−メトキシデスアセチルセ
ファロスポリン０に変換されていることを示した。

セファマイシンＣ中に包含された放射能はキャリアー回
収に対して補正した後（約５％）に０．１２％でおると
計算さｎた。

（ｂ）　操作は前記（ａ）と同様であったがただしここ
では〔カルバモイル１４０〕シトルリン（８ナノモル、
０．５μＣ１）カカルバモイルホスフエートの代りに使
用ざｎた。

セファマイシンＣ中に包含さｎた放射能はキャリアー回
収に対して補止した後（約５％）にＱ、０７％でめると
計算された。

例　５ （６Ｒ，７Ｒ）−３−カルバモイルオキシメチル−４６
− ７−〔２−メトキシイミノ−２−（フルー２−イル）−
アセドアばド〕セフー３−エムー４−カルボン酸（シン
異性体） Ｓ、クラバリゲルスＮＲＲＬ　５５８５’にブロス（肉
汁）（１，２１）中で生育させそして例１に記載のよう
にして収得した。ａ胞をＨＯｔでｐＨ７：０に調整した
１０ｍＭのイミダゾールバッファーで洗った。

湿った細胞（４５１７）をイミダゾールバッファー（１
８０ゴ）に再懸濁させ、セしてこｊ、を１分間０、１　
＋ｎガラスピーズと共に２００　Ｏｒｐｍで操作さｒｔ
　Ｌかも塩水で一５℃に冷却されているダイノミル中で
攪拌した。破壊ざｎだ細胞のホモジネートを遠心分離（
３０，０ＯＯＰ、３０分）にかけ。

そしてその上澄液をイミダゾールバッファーで平衡化さ
せたＤＲＡＷセルロース（１００５’湿時重１）含有カ
ラムに適用した。０−トランスカールバモイラーゼを１
０ｍＭイミゝイミダゾールｐＨ０中の塩化４６− ナトリウム濃度勾配（０〜１Ｍ）で溶出した。約０．５
Ｍ塩化ナトリウムで溶出された〇−トランスカルバモイ
ラーゼを含有する両分（９０ｍ／）を超ｆＰ８によって
６ｍ１Ｋ濃縮した。

濃縮した酵素（０，５ｄ）を（６ａ、７Ｒ）−３−ヒド
ロキシメチル−７−（２−メトキンイミノ−２−（フル
ー２−イル）−アセトアミド〕−セフー３−エム−４−
カルボン酸（シン異性体）（０，１μモル）、カルバモ
イルホスフェート（３μモル）　、ＡＴＰ　（１μモル
）、塩化マグネシウム（１μモル）、［化マンガン（１
μモル）および水酸化カリウムでｐＨ６，ｏに調整した
ｐｒｐｇｓバッファー（５０μモル）を含有する最終容
積１．０ｄの水中で２８°で培養した。２時間後、酢酸
（２０μｔ）の添加によってその反応を停止させた。そ
のｐＨを次いで１Ｍ塩酸で２．０に調整しそして沈澱し
た蛋白質を遠心除去した。その上澄液を酢酸エチルで（
２，５ｍ／）抽出した。有機相を合しそして蒸発乾固さ
せた。次いでそｊ−の含有シテいるセファロスポリンを
ＨＰＬＯにより分離した（　１００簡Ｘ　５ｍｉ’ｆｆ
径のカラム、Ｐａｒｔｉｓｉｌ　５　。

１５００ｐｓｉで水胞オロのクロロホルム／メタノール
７９０％蟻酸（２５：　２　：　１　ｖ／ｖ）（溶出〕
。これは２７０ｎｍの七１らの吸収によって検出さｎた
。

それらの滞留時間を標準試料と比較したそれらの紫外吸
収ピークの大きさは、セファロスポリン出発物省の２０
％が表記化合物に変換さｎたことを示した。

例　６ ０−トランスカルバモイル化反応によるデスアセチルセ
ファロスポリンＣおよびカルバモイルホスフェートから
の７β−（Ｄ−５−アミノ−５−カルボキシペンタンア
ミド）−３−カルノ（モイルオキシメチル−セフ−３−
エム−４−カルボン酸（セファロスポリンＣカルバメー
ト）の合成 ａ）限定された濃度のＡＴＰＯ存在下においてカルバモ
イルホスフェ−）　（０，５μモル）、〔３−ヒドロキ
シメチル’Ｈ〕ｙ’スアセチルセファロスボリン０（２
５０ｎＯ１，０，０２５ナノモル）、ｆｆｌ化マンガン
（０，１ナノモル）、塩化マグネシウム（０，１μモル
）、クルクミン（０，１μモル）、重炭酸ナトリウム（
０，２μモル）およびＡＴＰ（０，１ナノモル）を０．
１ｄの最終容積で、例１に記載の超音波破壊細胞懸濁液
４０μｔと共に混合した。この混、合物を６０分間２８
″で培養した。

この反応を１Ｍ塩酸（０，１ｍ）で停止させた。

酸性とした反応混合物を２８″で３０分培養してデスア
セチルセファロスポリン０をラクトン化させた。その混
合物を次いで１０ｍＭ酢酸（４，Ｏｄ）で希釈し、そし
て１＃ｊを、Ｄｏｗｅｘ−１アセテ４９− −　）　（Ｘ８．２００〜４００メツシユ）のカラム（
２５ｗｍＸ　６ｍ）上でのクロマトグラフィーにかけた
。このカラムを１０ｍＭ酢酸（４ｄ）で洗いそして溶出
液中の放射能を測だした。

生成すれたセファロスポリン０カルバメートのＩ・は、
同様の培養混合物を放射性ラベルし九デスアセチルセフ
ァロスポリンＣ添刃口後直チに塩酸で処理した際の溶出
物に比較した場合のカラムから溶出ざｎた放射能の減少
から推定された。１２％のデスアセチルセファロスポリ
ン０がセファロスポリンＣカルバメートに変換された。

酸添７７１］後の反応混合物のクロマトグラフィー分析
（セルロースＴＬＯ１ｎ−グロハノール／酢［／Ｊ−５
：　１　：　２使用）は、セファロスポリンＣカルバメ
ートの合成を確証し友。セファロスポリン０カルバメー
トおよびデスアセチルセフ５０− アロスポリン０のラクトンを使用して行ったスポットの
放射能は１２％のデスアセチルセファロスポリンＯがセ
ファロスポリン０カルバメートに変換されたことを確証
した。

ｂ）　ＡＴＰの飽和濃縮物の存在下において操作は前記
ａ）と同様でるるかただしここでは１ナノモルの放射能
ラベルしたデスアセチルセファロスポリンＯと１０ナノ
モルのＡＴＰが使用ざｎた・ ５６％のデスアセチルセファロスポリンＯがセファロス
ポリンＣカルバメートに変換された。

例　７ ［３Ｈ］−７β−（Ｄ−５−アミノ−５−カルボキシペ
ンタンアミド）−３−カルバモイルオキシメチルセフ−
３−エム−４−カルボン酸の合成例３におけるようにし
てＳ、クラバリゲルスＮＲＲＬ３５８５の破壊細胞から
製造された上澄液（５０μｔ）？１Ｌ−２８°で３０分
間〔６−ヒドロキシメチル−３）（］　＋　７β−（Ｄ
−５−アばノー５−カルボキンペンタンアミド）−３−
ヒドロキシメチルセフ−３−エム−４−カルボン酸（１
ナノモル、０．２５　μｏｉ　）　、ＡＴＰ　（１００
ナノモル）、塩化マグネシウム（１００ナノモル）、塩
化マンガン（１００ナノモル）および表に示した化合物
をも官有する総容積０．１ゴの水中で培養した。

１Ｍ塩酸（０，１＃Ｉ／）を加えて反応を停止させ、そ
して未反応のセファロスポリン出発物質全ラクトン化さ
せた。２８Ｃで３Ｏ分抽゛いた後、Ｄｏｗｅｘ−１−ア
セテート（０，３３ｍのバック容積、ＡＧＩＸ８．２０
０〜４００メツシユ）を含有する水（４，０ｍ）を刀【
１えた。ラクトン化セファロスポリン出発物質による上
澄液の放射能をジオキサンベース液体ンンチレーターに
ュークリア・エンタープライゼスＮＥ−２５０）の存在
下に測定した。０−トランスカルパモイラーゼの活性は
、その上澄液を５０μｔの水でａ！換した１料、に比べ
た場合の放射能の低下から１１°算された。

外　し　０．０２ カルバモイルホスフエート（３００ナノモル）　’　０
．３４例　８ Ｓ、クラバリゲルスからの〇−トランスカルバモイラー
ゼの製造 活発に生育しているＳ、クラバリゲルスＮＲＲＬ３５８
５の培養液（６ｔ）全使用して水酸化カリウムでｐＨ１
ＯにＩ！ｌＡＩ整した次の培地（１５０ｔ）に接種した
。

　５３− Ｎ毒゛ＣＶｔ） グリセリン　６５ クエン酪　１．５ Ｌ−アスパラギン　６．７ Ｍｇ５Ｏ４・７ｌ−）２０　、　、　０．５に２ＨＰＯ
４α４２ ０ａＯ４２０，２ ＮａＯ４Ｏ，ｌ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２０α０５ ＦｅＢＯ４＠７Ｈ２０α０３ Ｍｎ８０４−４Ｈ２００ｊ ピペラジン−Ｎ、Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）
０．０２培養物は１０立方フィート／分の通気速度でそ
して撹拌は行わずに２８０で４５時間生育させた。次い
で２００１／時の流速で、連続流ｎ遠心分離機中で細胞
を採取し、そして塩酸でｐＨ６，８に調整した１０ｍＭ
イミダゾールバッファー５４− （２ｏｚ）に再Ｗ、濁させた。この調製物ｆ：５００−
のガラスピーズ（０，１震■径）と共に３．０［］Ｏｒ
ｐｍの０．６を連続流れヘッドを付したダイノミル中で
攪拌することによって１２０＃１１！／分の流速で破壊
した。

０−トランス力ルパモイラーゼをこの調製物から１）Ｅ
ＡＥセルロース［２Ｘ４ｋｙ、１０ｍＭイミダゾールバ
ッファー（ｐＨ６，８）中で平衡化させたもの］を使用
してｅ、着させた。このＤＥＡＥセルロース＊　＋＝ニ
ーバッファー２Ｘ８ｔ）そして次いで０．１Ｍ塩化ナト
１）ラム含有バッファー（２Ｘ８ｔ）で洗い、そして最
後に０．５Ｍ塩化ナトリウム含有バッファー（３Ｘ８ｔ
）でこの酵素を溶出させた。すべてのこｎらのおよび以
後の操作は４″で行われた。固体ＡＴＰおよびカルバモ
イルホスフェートを溶出物に加えて各々０．１ミリＭの
濃度とした。この調製品を２回ヒドロキシルアパタイト
のスラリー（２Ｌ、　１　：　１（ｖ／ｖ）固足床ヒド
ロキシルアパタイト、５ｍＭ燐酸カリ平衡化パンファー
ｐＨ６，８）で処理して、不賛の蛋白質を吸着せしめた
。酵Ｓ、をＩｋ酸アンモニウム（９，６ｋｙ）ｋ使用し
てステンレス・スチール攪拌話中でこの上澄液から沈澱
させ、これを次いで０．５Ｍ塩化ナトリウム含有イミダ
ゾールバッファー（５００ゴ）に再溶Ｉ’１１させた。

この酵素を最後に、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１
５：リモルカルバモイルホスフエートおよび０．１ミリ
ＭＡＴＰを含有する新しいイミダゾールバッファー（２
Ｘ１０ｔ）に対して透析して約３０国際単位を含有する
０−トランスカルバモイラーゼの透析桧厚溶液を生成さ
せた。

例　９ （６Ｒ，７Ｒ）−３−カルバモイルオキシメチル−７−
（２−（フルー２−イル）−２−メトキシイミノアセト
アミド〕セフ−３−エム−４−カルボン酸（シン異性体
） （１）　（６Ｅｌ　、　７　Ｒ）　−３−ヒドロキシメ
チル−７−［２−（フルー２−イル）−２−メトキシイ
ばノアセトアばド〕セフー６−ニムー４−カルホン酸（
シン異性体＞　（４０９）　、ＡＴＰ　（３（１０ｒｎ
９）。

カルバモイルホスフェート（１５０Ｌｎｑ）　、硫Ｗマ
グネシウム（２０〜）および塩化マンガン（２０Ｉｎ？
）を例８で製造さｎ、た０−トランスカルパモイラーゼ
溶液の一部（５０ｍ）にカロえ、そして最終容積１００
−で６．７５のｐＨとした。この混合物を２８°で３時
間培養し、そして次いで濃塩酸（２，５ｍ／）を添加し
て酸性とし、１０分間放置しそして酢酸エチルで抽出し
た。この酢酸エチル場ヲ０．１　Ｍ重炭酸ナトリウムで
逆抽出し、これｔ−次いで酸性としそして酢酸エチルで
再抽出した。この抽出物を減圧下に転線させそしてその
５１　一 固体をジエチルエーテルで磨砕すると表記化合物（１５
，３■）が乾燥粉末として得られた。Ｅ１′Ｘｃ３ｎ ４０５　（２７３ｎｍ）。ｎｍｒスペクトルは表記化合
物の標準試料のそｎと同様でめった。

（ＩＩ）　基質としてアンモニウム（６Ｒ，７Ｒ）−３
−アセトキシメチル−７−（２−（フルー２−イル）−
２−メトキシイミノアセトアミド〕−セフ−６−エムー
４−カルボキシレート（シン異性体）（４０■）を使用
しセして豚肝アセチルエステラーゼ（１単位）全添加し
てこの方法をくりかえした。ＴＬＯ［シリカおよびクロ
ロホルム／メタノール／９０％蟻酸（９０！６：４）使
用］による生成物の分析は表記化合物の標準試料と同−
Ｒｆ餉を有する新しい紫外吸収スポットの存在を示した
。

例　１０ 表１に示した７−アシルアミド基金有する３５８− −ヒドロキシメチルセフ−３−エム−４−カルボン酸基
質を使用して例９（１）の操作をくりかえして相当する
３−カルバモイルオキシメチルセフ−３−エム−４−カ
ルボン酸全生成させた。

表　１ 純黒遊離酸 チェニルアセトアミド　４）ｖ）於離酸　２２〜　２０
９（２５９ｎｍ）生成物のｎｍｒスペクトルは滴当な３
−カルノ（モイルオキシメテルセフー３−エム−４−カ
ルボン酸の標Ｍ！Ａ試料のそれと同様でめった。

例　１１ ７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチルセフ−３−
エム−４−カルボン酸 ７−アミノ−３−ヒドロキシメチルセフ−６−エム−４
−カルボン酸（４０μ９）、［：１４０］カルバモイル
ホスフエ〜）（１５［］μ９．７５μＣ１）。

硫酸マグネシウム（２０μｙ）、塩化マンガン（２０μ
９）およびＰＩＰＥＳパンファー（０，５μモル、ｐＨ
６，７５）ｖ例９　（１）Ｋ記載のＯ−）ランスカルバ
モイラーゼと共に培養した。培養後このｍ合物を氷酢酸
（１０μｔ）で酸性とし、遠心分離により透明化しそし
てその上澄液を回転蒸発器上での蒸発により乾１２１！
させた。この物質を酢酸／蟻酸バッファー〔氷酢酸（５
ゴ）、蟻酸（０，２ｍ／）、メタノール／水（４０：６
０ヅｖ）　１Ｌ中、ｐＨは４Ｎ７に酸化ナトリウムで５
．９に調整〕（６０μｔ）にとった。一部分（１０μｔ
）をＰａｒｔｉｓｉｌ　１０８ＡＸカラム（２５０＋＋
ｎＸ　４．６ｒｔｔｘ　）に適用し、そして同一バッフ
ァーで１０００ｐｓｉ　（１ｍｔ／分）で溶出させた。

溶出液の２６０ｎｍの紫外吸収および放射能を測定した
。新らしい紫外吸収ピークが１２分後に検出てれた。こ
れもまた放射能を含有していた。このピークは表記の基
準化合物を使用して得られたものに合致した。セファロ
スポリン出発物質の表記化合物への変換は１６％であっ
た。

特許出願人　グラクツ・ラボラドリース・リミテッド ６１− 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号０発　明
　者　ステイーブン・ジェイ　イギリス国ノ・ムズ・ブ
ルーワー　スメツドロー ゛ツキンガムシャー州ハイウイコウム、キングド５幡

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）カルバモイル基を６−ヒドロキシメチルセファロス
   ポリンに転移させて５−カルバモイルオキシメチルセフ
   ァロスポリンを生成させることができそして悪影響を及
   ばず酵素を一部または完全に除去した微生物源の０−）
   ランスカルパモイラーゼ。 ２）アクチノミセタレス目の種から導かれる、前記第１
   項記載のＯ−）ランスカルバモイラーゼ。 ！Ｊ）ストレプトマイセス属の種から導かれる、前記第
   ２項記載の０−トランスカルバモイラーゼ。 ４）ストレプトマイセス・クラパリゲルス、ストレプト
   マイセス・ワダヤメ／シス、ストレフトマイセス・ラク
   タムシュランス、ストレプトマイセス゛・アルボグリセ
   オルス、ストレフトマイセス・ジュモンジネンシスまタ
   ハストレプトマイセス・ラクタンゲネスまたはその選択
   味または変異株から導かれる、前記第３項記載のＯ−）
   ランスカルパモイラーゼ。 ５）　ストンブトマイセス・クラバリゲルスＮ　ＲＲＬ
   ３５８５株ｉたはその選択味または変異株から導かれる
   、前記第４項記載の０−）ランスカルパモイラーゼ。 ６）β−ラクタマーゼ、アミドヒドロラーゼ、カルバモ
   イルホスフェートキナーゼおよびホスファターゼを含有
   しない、前記第１〜５項のいずれかに記載の０−トラン
   スカルパモイラーゼ。 ７）不動形の前記第１〜６項のいずれかに記載の０−ト
   ランス力ルパモイラーゼ。 ８）適当な微生物種をそれに対する栄養培地中で培養し
   、そして悪影響のある酵素の一部または全部を除去する
   ことを包含する、カルバモイル基を５−ヒドロキシメチ
   ルセファロスポリ／に転移させてろ−カルパモイルオキ
   シメチルセファロスポリンを生成させうる〇−トランス
   力ルバモイラ二ゼ活性を有する調製品の製造法。 ９）微生物がアクチノミセタレス目のものである、前記
   第８項記載の方法。 １０）微生物が前記第６〜５項のいずれかに記載のもの
   の１種である、前記第９項記載の方法。 １１）調製品を基質、コファクター、金楓イオン、還元
   剤または塩で安定化させる、前記第８〜１０項のいずれ
   かに記載の方法。 １２）塩が燐酸塩である、前記第１１項記載の方法。