JPH0829098B2 - 細胞接着活性ポリペプチド - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、フイプロネクチン様の細胞接着活性タンパ
ク質に関し、更に詳しくは、ヒトフイプロネクチンの細
胞接着活性を有するポリペプチド及びその製造方法に関
する。

〔従来の技術〕

フイプロネクチンは、動物の種々の組織や体液中、ま
た、培養細胞表面などに広く分布する多機能糖タンパク
質であり、細胞の接着、伸展、移動、分化、増殖、貧食
作用などの生理作用を示し、組織修復、組織構築、生体
防御などに関与していることが知られている。

フイプロネクチンは、分子量約25万のポリペプチドが
Ｃ末端付近でＳ−Ｓ結合で２量体を形成している。分子
内アミノ酸配列は、繰返し構造を有し、Ｉ、II、III型
に分けられる。更に、種々の機能を有するドメイン構造
を有し、細胞接着、コラーゲン、ヘパリン及びフイブリ
ン等に対する結合活性を示す。これらのドメインのう
ち、細胞接着ドメインについては、その生物活性から産
業上の利用が考えられており、例えば、培養基質のコー
テイング剤として、細胞が付着する基質の調製に使用す
ることができる。また、細胞付着の促進剤として、点眼
液、ローシヨン、外傷治療薬等に使用することができ
る。

フイプロネクチンの細胞接着ドメインの基本構造につ
いては、その最小必要単位としてＲ−Ｇ−Ｄ−Ｓ配列が
明らかにされており〔ネーチヤー（Nature）第309巻、
第30〜33頁（1984）〕、この配列を含む108アミノ酸残
基からなる分子量1.15万のポリペプチドが、細胞接着活
性ペプチドとして特表昭59−501548号公報に記載されて
いる。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、この分子量1.15万のポリペプチドの細
胞接着活性は、天然のフイプロネクチンに比べて非常に
弱く、前記の用途として用いるには必ずしも実用的とは
いい難い。このことについては、例えばジヤーナル オ
ブ バイオロジカル ケミストリー（J.Biol.Chim.）第
260巻、第13256〜13260頁（1985）に記載されている。
また、本発明者らは、前記分子量1.15万のポリペプチド
を遺伝子工学的に製造し、そのNRK細胞（ラツト腎細
胞）に対する細胞接着活性を、天然のフイプロネクチン
と比較した。その結果、フイプロネクチンは0.1〜１μg
/ウエルで活性がみられたのに対し、分子量1.15万のポ
リペプチドでは40μg/ウエルでも活性は認められなかつ
た。

本発明の目的は、フイプロネクチンの細胞結合ドメイ
ンペプチドとして、実質的に細胞接着活性を有するアミ
ノ酸配列を明らかにし、その製造方法を提供することに
ある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は「ポリペ
プチドに関する発明であつて、下記式Ｉで示されるアミ
ノ酸配列で表されることを特徴とする。

また、本発明の第２の発明はDNAに関する発明であつ
て、上記第１の発明のポリペプチドをコードすることを
特徴とする。

更に、本発明の第３の発明はポリペプチドの製造方法
に関する発明であつて、上記第２の発明のDNA配列が組
込まれたベクターが導入された大腸菌を培養し、培養物
より前記第１の発明のポリペプチドを採取することを特
徴とする。

前記課題を解決する手段としては、フイプロネクチン
の細胞結合ドメインに相当する種々の鎖長のポリペプチ
ドをコードするDNA配列を発現ベクターに接続し、宿主
細胞に導入して、目的とするポリペプチドを生産させ、
それぞれを単離して、細胞接着活性を測定することによ
り解決される。実際、そのような手段により、分子量1.
15万のポリペプチドには、細胞接着活性がほとんどない
こと、しかし、そのＮ末側を延長した283アミノ酸残基
から成るポリペプチドには天然のフイプロネクチンとほ
ぼ同等の細胞接着活性があることなどが、本発明者らに
よつて見出された。本発明は、これらの知見に基づいて
達成された。

以下、順を追つて、本発明を具体的に説明する。

ヒトフイプロネクチンの全アミノ酸配列及びそのcDNA
配列は、ジ エムボ ジヤーナル（The EMBO Journal）
第４巻、第1755〜1759頁（1985）に記載されている。そ
の細胞接着ドメインのアミノ酸配列から、対応するcDMA
をクローニングする手段は公知であり、例えばヒト肝臓
からポリＡを含むRNA画分を調製し、岡山−バーグ法あ
るいは、ガブラー−ホフマン（Gubler−Hoffman）法等
によりcDNAライブラリーを作製することができる。一
方、その様なcDNAライブラリーは市販されており、例え
ばクローンテツク社より購入することができる。cDNAラ
イブラリーから目的のcDNAクローンを得る方法として
は、アミノ酸配列に対応したDNAをプロープとするコロ
ニーハイプリダイゼーシヨンあるいはプラークハイプリ
ダイゼーシヨンが用いられる。プロープとハイプリダイ
ズするクローンを選択し、培養菌体あるいはフアージ溶
菌液からDNAを抽出し、制限酵素で切断する。電気泳動
にかけてインサートの確認を行う。必要とあれば、サザ
ンブロツテイングにより、インサートが、プロープとハ
イプリダイズすることの確認を行う。最終的にはインサ
ートの塩基配列をダイデオキシ（dideoxy）法等の方法
で調べることにより、目的のクローンを同定することが
できる。

フイプロネクチンの細胞接着ドメインをコードするcD
NAを組込んだベクターは必要に応じて宿主内で増幅さ
れ、精製され、更に、制限酵素による切断によりcDNA部
分を切出し、電気泳動によりcDNA断片を精製することが
できる。このcDNA断片を、発現が可能なベクターに読取
りフレームが合うようにDNAリガーゼで接続し、宿主細
胞に導入することにより、cDNAの発現が可能となる。大
腸菌を宿主とする発現ベクターとしては、既存のすべて
のベクターが使用可能であるが、好ましくは、プロモー
ター活性が強く、誘導発現が可能な宿主−ベクター系を
用いる。そのようなベクターとしては、例えば、λPLプ
ロモーターを組込んだベクター、lacプロモーターを組
込んだベクター、trpプロモーターを組込んだベクタ
ー、pstSプロモーターを組込んだベクター、lacとtrpの
両プロモーターを組込んだベクター、lppプロモーター
を組込んだベクター、lppとlacの両プロモーターを組込
んだベクター等が知られている（榊 佳之著「ベクター
DNA」、講談社サイエンテイフイク、1986年）。

また、発現されたペプチドが分泌可能なように、シグ
ナルペプチド遺伝子の下流に外来遺伝子を挿入できるベ
クターを利用することもできる。

目的のポリペプチドの遺伝子をシグナルペプチド遺伝
子の下流に接続できるような発現ベクター、あるいは直
接発現ベクターを用いてペプチドを発現させる場合、ベ
クターとの接続において、目的ポリペプチドのＮ末にベ
クター由来の数個のアミノ酸配列が含まれる場合があ
る。これらの配列が付加することによつて、ポリペプチ
ドの細胞接着活性が本質的に変化することはなく、その
まま使用することができる。しかし、これらの配列を必
要に応じて遺伝子工学的に除去することもできる。これ
は、部位特異的変異導入と呼ばれ、確立された技術であ
る。

一般的には、異種のペプチドが大腸菌で発現した場
合、異種ペプチドが宿主の生育に有害となることが多い
ので、あらかじめ、プロモーターリプレツサーの存在下
に生育させたのち、リプレツサーを不活化するか、イン
デユーサーを添加することにより、異種ペプチドの発現
を誘導する方法がとられるが、異種ペプチドが宿主大腸
菌に有害でない場合は、この限りではない。本発明で発
現させるポリペプチドは、宿主大腸菌に有害とはいえな
いので、必ずしも誘導発現に限定する必要はない。

細胞接着ポリペプチドの遺伝子を組込んだベクターを
常法により大腸菌に導入し、形質転換大腸菌を、発現に
適した条件下に培養し、目的ポリペプチドを発現させる
ことができる。目的ポリペプチドの発現の確認には、イ
ムノプロツテイングの手法を用いることができ、例えば
培養菌体に、SDSを含むバツフアーを加えて加熱し、全
タンパク質を可溶化した後、ポリアクリルアミド電気泳
動にかける。泳動パターンをニトロセルロースやナイロ
ンのメンプランに移し取り、フイプロネクチンの細胞接
着ドメインに特異的なモノクローナル抗体を作用させ、
更に酵素標識第２抗体を結合させる。結合した第２抗体
の酵素活性を、発色基質で発色させることにより、目的
のポリペプチドのバンドを確認することができる。

大腸菌からの細胞接着ポリペプチドの精製は、例えば
次のようにする。集菌した菌体ペレツトをバツフアーに
懸濁し、超音波処理により可溶性画分と不溶性画分に分
け、後者は、更に7M尿素を含むバツフアーで可溶化す
る。可溶性画分を集めて、イムノプロツテイングで用い
た抗体を結合させたセフアロース4Bカラムにかけ、アフ
イニテイ精製を行う。溶出にはpH2付近のバツフアーを
用いる。イムノプロツテイングにより、目的ポリペプチ
ド画分を集めることにより、電気泳動的にほぼ単一のポ
リペプチドを得ることができる。必要とあれば、FPLC又
はHPLCで更に精製することができる。このようにして得
られたポリペプチドが細胞接着活性を有するか否かは例
えば次のようにして調べる。バツフアーに溶かしたサン
プルを、マイクロタイタープレートに吸着させた後、NR
K細胞（正常ラツト腎細胞）の懸濁液を添加し、37℃で
１時間培養後、細胞の形態変化により接着活性の有無を
観察する。接着活性を発現するウエル当りの最小量を天
然のフイプロネクチンと比較することにより、培養活性
の強さを表すことができる。

このようにして、フイプロネクチンの細胞接着ドメイ
ンに相当するいくつかのポリペプチドを遺伝子工学的に
製造し、その生物活性を調べることにより、接着活性発
現に必要かつ十分なポリペプチド配列が明らかとなつ
た。後記表１に得られたポリペプチドの細胞接着活性を
フイプロネクチンと比較して示した。この結果からAla
¹²³⁵−Met¹⁵¹⁷を含むポリペプチドは、実質的にフイプ
ロネクチンと同等の強い細胞接着活性を有することが明
らかとなつた。細胞接着活性を有するポリペプチドは、
そのまま、あるいは、二官能架橋剤を介して他のペプチ
ドと結合させて使用することができる。他のペプチドと
結合させる方法としては、例えば、ペプチドのＣ末端に
Cys残基を付加しておき、Cys残基を架橋剤、例えば３−
（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸−Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミドエステルを介して、他のペプチドのアミ
ノ基と結合させる方法がとられる。ペプチドのＣ末端に
Cys残基を付加することは遺伝子工学的に容易に達成す
ることができ、例えば、目的のポリペプチドをコードす
る遺伝子をクローニングする際に３′末端をCysに対応
するコドンを付加した合成DNAで置き換えればよい。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されない。

実施例１ フイプロネクチンのIle¹⁴¹⁰−Met¹⁵¹⁷（108アミノ酸
残基）をコードするcDNA断片のクローニング（第１図参
照） なお、第１図は、フイプロネクチンのIle¹⁴¹⁰−Me
¹⁵¹⁷を含むポリペプチドをコードするDNA配列を組込ん
だ発現プラスミドの構築の工程を示す図である。

（１−１）cDNA断片の調製 フイプロネクチンの細胞接着ドメインをコードするcD
NA配列を含む4.1kbのプラスミドpLF5〔バイオケミスト
リー（Biochemistry）第25巻、第4936〜4941頁（198
6）〕100μｇを、制限酵素Bal I用バツフアー及び100ユ
ニツトのBal Iを含む200μｌの反応液中、37℃、２時間
インキユベートした。反応液を、ニユクレオジエン（Nu
cleogen）社製HPLCカラムDEAE−4000（６×125mm）にか
け、5M尿素を含む30mMリン酸カリウムバツフアー（pH6.
5）中でKClの濃度勾配で溶出し、イソプロピルアルコー
ル沈殿により、0.75kbの断片7.5μｇを得た。次に、こ
の断片を30ユニツトのFok Iで37℃、１時間処理し、同
様の精製方法で92bpと203bpの断片をそれぞれ60ng及び1
40ng得た。

（１−２）合成DNAリンカーの調製 cDNA断片をベクターに接続するための５′側及び３′
側リンカーを、次の方法により化学合成した。塩基配列
は、第１図に示してある。５′側リンカーの上のストラ
ンド（鎖長11）を5U、下のストランド（鎖長７）を5L、
また３′側リンカーの上のストランド（鎖長30）を3U、
下のストランド（鎖長30）を3Lと名付けてそれぞれアプ
ライドバイオシステムズ社のDNA合成機を用いて合成し
た。脱保護の後、5U及び5Lはイオン交換HPLC（TSKゲルD
EAE−2000）で精製し、SepPak（ウオーターズ社）で脱
塩し、それぞれ60μg,40μｇを得た。3U及び3Lは7M尿素
を含む12％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、
ゲル片から抽出後、同様に脱塩して、それぞれ32μｇ、
26μｇを得た。塩基配列は、固相マキサム・ギルバート
法で確認した。各ストランドは次の方法により５′末端
をリン酸化した。すなわち、25μｇのDNAを10μｌの蒸
留水に溶かし、PNK（ポリヌクレオチドキナーゼ）用バ
ツフアー〔50mMトリス（Tris）HCl、pH7.6、10mM MgC
l₂、10mM DTT〕、1mM ATP及び５ユニツトのPNKを含む20
μｌの溶液中で37℃、１時間インキユベートし、65℃、
10分の処理で反応を停止した。リン酸化の後5Uと5L、3U
と3Lをそれぞれアニーリング操作により、２重鎖とし
た。すなわち、5Uと5Lを等量混ぜて、60℃に10分間保持
した後徐々に室温に戻し、更に15℃まで冷却した。3Uと
3Lについても同様に処理した。

（１−３）cDNA断片とリンカーの結合 （１−２）で調製した２種のリンカー及び（１−１）
で調製した２種のDNA断片（92bp及び203bp）を用いて、
ライゲーシヨン反応に供した。すなわちcDNA断片各0.5p
mole、リンカー各5pmoleを、ライゲーシヨンバツフアー
（66mMトリスHCl、pH7.6、6.6mM MgCl₂）、0.5mM ATP、
10mM DTT及び2.8ユニツトのT4 DNAリガーゼを含む20μ
ｌの溶液中で16℃、一夜インキユベートした。反応液を
65℃、10分処理した後２倍量の冷エタノールを加えて、
−70℃に30分保持した後遠心によりDNAを沈殿として回
収した。これを、EcoRIバツフアー、7.5ユニツトのEcoR
Iを含む20μｌの反応液中、37℃、30分インキユベート
した後、ポリアクリルアミド電気泳動にかけて336bpの
断片を切出し、ゲル溶出バツフアー（0.5M酢酸アンモニ
ウム、0.01M酢酸マグネシウム、1mM EDTA）で37℃、10
時間抽出しエタノール沈殿により、DNAを回収した。こ
れを20μｌのTE（10mMトリスHCl、1mM EDTA、pH8.0）に
溶かした。

（１−４）リンカーを結合したcDNA断片とベクターの結
合 １μｇの分泌型発現ベクターpIN III−ompA1〔ジ エ
ムボ ジヤーナル、第３巻、第2437〜2442頁（1984）〕
を制限酵素EcoRI用バツフアー中５ユニツトのEcoRIと共
に37℃、１時間インキユベートし、次いで0.5ユニツト
のアルカリホスフアターゼを加え、更に１時間インキユ
ベートした。反応液をフエノール処理（２回）した後、
エタノール沈殿により、0.5μｇのDNAを回収した。EcoR
Iで切断し、脱リン酸したpIN IIIompA1ベクター0.1μｇ
と（１−３）で得たDNA断片の10μｌをT4 DNAリガーゼ
用バツフアー、0.5mM ATP、10mM DTT及び2.8ユニツトの
T4 DNAリガーゼを含む30μｌの反応液中、16℃、一夜イ
ンキユベートした。この反応液15μｌを大腸菌の形質転
換に使用した。

（１−５）大腸菌の形質転換 大腸菌SB221〔ジ エムボ ジヤーナル、第３巻、第2
437〜2442頁（1984）〕を5mlのＬ−プロス（バクトトリ
プトン、10g/l、酵母エキス5g/l、NaCl 5g/l、pH7.2）
を含む20ml容試験管で37℃、一夜振とう培養した。その
0.05mlを5mlの新しいＬ−プロスに接種し、600nmの吸光
度が0.6になるまで振とう培養した。これを氷冷し、４
℃、5000rpmで５分間遠心し、上清を除去した。これに
あらかじめ氷冷した0.1M MgCl₂を2.5ml加え混合した
後、同様に遠心分離して上清を除去した。更に、氷冷し
た0.1M CaCl₂を1.25ml加え、穏やかに混合し氷水中に30
分間保持した。遠心分離により上清を除去した後、氷冷
した0.1M CaCl₂を0.1ml加え穏やかに懸濁した。これ
に、（１−４）で得た反応液10μｌを加え、氷水中に30
分間保持した。次に、42℃で２分間加熱処理を行つた。
更に、37℃に加温したＬ培地を1ml加え、37℃で30分間
インキユベートした。更に、37℃で１時間振とう培養し
た。培養液を、50μg/mlのアンピシリンを含むＬ寒天培
地に塗布し、37℃で一夜培養し生育するコロニーを分離
した。その結果、約200のコロニーが得られ、そのうち
の14コロニーにつき、プラスミドの分析を行つた。

（１−６）プラスミドの分析（ラピツド法） 14種の形質転換体を50μg/mlのアンピシリンを含む1.
5mlのＬ−プロスで一夜振とう培養した後、遠心分離に
より菌体ペレツトを回収した。菌体を100μｌの溶液Ａ
（50mMグルコース、10mM EDTA、25mMトリスHCl、pH8.
0、2mg/mlリゾチーム）で懸濁し、室温に５分保持した
後、200μｌの溶液Ｂ（0.2N NaOH、１％SDS）を加え、
容器を５回穏やかに転倒させ、０℃に10分保持した、15
0μｌの5M酢酸カリウム（pH5.0）を加えた後、２倍量の
冷エタノールを加え、−70℃で30分保持した後、遠心分
離によりDNAを回収した。これを80％エタノールで洗浄
し、真空ポンプでエタノール水を除去し、少量のTEに溶
かした。その一部（0.1μｇ）をEcoRI用バツフアーと５
ユニツトのEcoRIを含む10μｌの反応液中37℃で１時間
反応させた後、アガロース電気泳動で分離し、エチジウ
ムブロマイド染色で予想されるDNAのバンド（0.33kb）
の生成を調べた。その結果、９クローンに目的のバンド
が認められた。これら９クローンについて更にRvu IIと
Hind IIIの２重消化を行い、挿入断片の方向性を調べた
ところ、８クローンが正しい方向に挿入されていた。こ
れらのうちの５クローンについてプラスミドからXba I
とHind IIIの２重消化で挿入断片を含むDNAを切出し、
フアージM13mp18及びmp19に組込んで、ダイデオキシ法
による塩基配列分析を行つたところ、３クローンが目的
の配列を含むことを確認した。このようにして得られた
組換え体プラスミドをpTF101と命名した。

（１−７）プラスミドの精製 前記（１−６）で得られたpTF101を導入した大腸菌
（SB221/pTF101）を5mlのＬ−ブロスに接種し、37℃、
一夜振とう培養した。これを、500mlの同培地に移して
培養を続け、660nmの吸光度が0.6になつた時点で170μg
/mlのクロラムフエニコールを添加し、更に10〜12時間
培養した。5000rpm、10分間遠心し、菌体をSTE（10mMト
リスHCl、pH8、100mM NaCl、1mM EDTA）で洗浄し、同様
に遠心分離でペレツトを回収した。10mlの溶液Ａに懸濁
し、室温に５分保持し、更に20mlの溶液Ｂを加え穏やか
にかくはんし、０℃に５分間保持した。15mlの3M酢酸カ
リウムを加え穏やかにかくはんした後、０℃に10分保持
した。8000rpm、60分遠心して45mlの上清を得、これに2
7ml（0.6倍量）のイソプロピルアルコールを加えて室温
に15分保持した。遠心分離で沈殿を回収し、80％エタノ
ールで洗浄した。残存エタノール水を真空ポンプで除い
て乾燥した。これを、4mlのTEに溶かし、4.75gの塩化セ
シウムを加え、更に5mg/mlのエチジウムプロマイドを42
0μｌ加え０℃に30分保持した。8000rpm、10分間遠心
し、不溶物を除去した上清をペツクマン社クイツクシー
ルチユーブに入れ、55000回転で一夜超遠心分離を行つ
た。紫外線照射下にプラスミドのバンドを注射器で抜取
つた。等量のイソプロピルアルコールで７回抽出してエ
チジウムプロマイドを除去した後、エタノール沈殿を２
回、更に80％エタノールで洗浄して、真空乾燥後、適量
のTEに溶かした（収量760μｇ）。

実施例２ フイプロネクチンのAla¹²³⁵−Met¹⁵¹⁷（283アミノ酸残
基）をコードするcDNAのクローニング（第２図参照） なお、第２図は、フイプロネクチンのAla¹²³⁵−Met
¹⁵¹⁷を含むポリペプチドをコードするDNA配列を組込ん
だ発現プラスミドの構築の工程を示す図である。

50μｇのプラスミドpLF5をEcoRIメチラーゼバツフア
ー（100mMトリスHCl、pH8.0、2mM DTT、10mM EDTA、80
μM S−アデノシルメチオニン）及び200ユニツトのEcoR
Iメチラーゼを含む反応液200μｌ中で、37℃、60分イン
キユベートしEcoRIサイトを保護した。65℃、20分の処
理で反応を停止した後、Pvu IIバツフアー及び96ユニツ
トのPvu IIを加え、反応液300μｌとして37℃、60分間
インキユベートした。これを、アガロース電気泳動にか
け、0.60kbの断片を切出した。これを溶出バツフアー
（5mMトリス酢酸バツフアー、pH8.0、1mM EDTA）を含む
透析チユーブに入れ、同バツフアー中で電気泳動溶出を
行つてDNAを抽出した。抽出液に対し２回のフエノール
抽出を行つた後、1/10容量の3M酢酸ナトリウムを加え、
更に、２倍量のエタノールを加えて、エタノール沈殿を
２回行つた。80％エタノールで洗浄後乾燥し、少量のTE
に溶かした（収量1.2μｇ）。

一方、実施例１で得たプラスミドpTF101の140μｇ
を、144ユニツトのPvu IIを含む200μｌの反応液で37
℃、60分インキユベートした後、150ユニツトのEcoRIを
加えて、240μｌの反応液とし、37℃、60分インキユベ
ートした。ポリアクリルアミド電気泳動にかけ、0.25kb
の断片を切出した。ゲル片から前述の方法でDNAを抽出
し、エタノール沈殿によりDNAを回収した（収量0.4μ
ｇ）。先に得た0.6kbの断片1.25μｇと0.25kbの断片0.4
μｇを2.8ユニツトのT4 DNAリガーゼ、0.5mM ATP及び10
mM DTTを含む50μｌのリガーゼバツフアー中で、16℃、
30分インキユベートした。反応液に92pmoleのリン酸化
リンカー（pCCGAATTGG）及び1.4ユニツトのT4 DNAリガ
ーゼを加え、液量70μｌとして10℃で一夜インキユベー
トした。65℃、10分の処理で反応を止め、バツフアーを
EcoRI至適条件にし、30ユニツトのEcoRIを加えて、37
℃、60分間反応させた。反応液をアガロース電気泳動に
かけ、0.86kbのバンドを切出し、前述の方法でDNAを回
収した（約25ng）。0.86kb断片20ngと、EcoRIで切断
し、脱リン酸したベクターpIN−III−ompA1の0.1μｇを
2.8ユニツトのT4 DNAリガーゼ、0.5mMATP及び10mM DTT
を含む20μｌのリガーゼバツフアー中、16℃、10時間イ
ンキユベートした後、反応液の1/2を用いて、前述の方
法で大腸菌SB 221を形質転換させた。得られた形質転換
体のうちの48クローンについて前述の方法でプラスミド
分析を行い、６クローンに目的断片を含むプラスミドが
検出された。更に、これらのプラスミドをBam H1消化し
て、生成する断片を分析した結果、５クローンが正方向
に挿入された目的断片を含んでいた。更に、そのうちの
３クローンについて塩基配列を調べたところ、１つのク
ローンが正しい塩基配列を持つことを確認した。この組
換体プラスミドを、pTF301と命名し、このプラスミドを
保持する大腸菌SB 221を、エシエリヒア・コーリSB 221
/pTF301と命名した。次に、pTF301から、1.8kbのEcoRI
−Sal I断片を切出し、これをpUC 18のEcoRI−Sal Iサ
イトに接続して得られた組換え体プラスミドをpTF1409
と命名し、そのプラスミドを保持する大腸菌HB 101をEs
cherichia coli HB 101/pTF1409と命名して、表示し、
工業技術院微生物工業技術研究所に寄託した〔微工研条
寄第1939号（FERM BP−1939）〕。

実施例３ フイプロネクチンのGly¹⁰¹⁴−Met¹⁵¹⁷（504アミノ酸残
基）をコードするcDNAのクローニング（第３図参照） なお、第３図は、フイプロネクチンのGly¹⁰¹⁴−Met
¹⁵¹⁷を含むポリペプチドをコードするDNA配列を組込ん
だ発現プラスミドの構築の工程を示す図である。

（３−１）プライマー伸長法によるcDNA合成フイプロネ
クチンmRNAに相補的な配列を有する17塩基合成プライマ
ー（^5′pGTCTCCCACTGAAGTGC^3′）を前述の方法に従つて
調製した。この合成プライマーを用いてヒト肝臓由来ポ
リ(A)⁺RNA（クローンテツク社）から、cDNAを合成し
た。

cDNA合成には、アマシヤム社「cDNA合成システム」に
含まれる試薬を用いた。すなわち、５×フアーストスト
ランド合成バツフアー４μｌ、ピロリン酸ナトリウム溶
液１μｌ、リボヌクレアーゼインピヒター１μｌ（20ユ
ニツト）、デオキシ三リン酸混液（10mM）２μｌ、合成
DNAプライマー１μｌ（0.1μｇ）、〔α−³²P〕dCTP 5
μCi及びポリ(A)⁺RNA 1μｌ（１μｇ）を氷冷下エツペ
ンドルフチユーブに順次加え、静かに混和した。20ユニ
ツト（１μｇ）の逆転写酵素と蒸留水を加えて全量を20
μｌとし静かに混和した後、42℃で50分間インキユベー
トした。これを氷浴に戻し、セカンドストランド合成用
バツフアー37.5μｌ、〔α−³²P〕dCTP 50μCi（５μ
ｌ）、大腸菌リボヌクレアーゼH0.8ユニツト（１μ
ｌ）、大腸菌DNAポリメラーゼ１の23ユニツト（3.5μ
ｌ）及び水33μｌを順次加え静かに混和した。12℃、60
分、次いで22℃、60分、更に70℃、10分インキユベート
し、氷浴に戻し、2.0ユニツト（0.5μｌ）のT4 DNAポリ
メラーゼを加えた。静かに混和後、37℃、10分間インキ
ユベートした。10μｌの0.25M EDTA（pH8.0）及び10μ
ｌの10％SDSを加えて反応を停止させた。フエノール抽
出を２回行つた後、等量の4M酢酸アンモニウムを加え、
更に、２倍量の冷エタノールを加えてドライアイス中に
15分保持後、室温に戻して、10分間遠心し上清を除い
た。ペレツトを50μｌのTEに溶かし、もう一度エタノー
ル沈殿を行い、更に沈殿を200μｌの冷エタノールで洗
浄し、乾燥した後、少量のTEに溶かした。

（３−２）cDNAのλgt10フアージベクターへの接続と、
インビトロパツケージング 前項（３−１）で得られたcDNA、0.5μｇのEcoRIリン
カー（ｄ〔pGGAATTCC〕）リガーゼバツフアー及び2.8ユ
ニツトのT4 DANリガーゼを含む反応液16.6μｌを15℃一
夜インキユベートした後、70℃、10分の処理で反応を停
止させた。バツフアーをEcoRIの至適条件にした後、50
ユニツトのEcoRIを加え、液量を100μｌとして37℃、２
時間インキユベートした後、70℃、10分の処理で反応を
止めた。この全量をセフアデツクスＧ−50のカラム（1m
l）にかけてSTEバツフアー（100mM NaCl、10mM トリス
HCl、1mMEDTA、pH8.0）で溶出し、遊離のリンカーを除
去した後、cDNAフラクシヨンを、10mM トリスHCl（pH
8.0）、0.1mM EDTAに対して透析し、凍結乾燥した。こ
れに333mM NaCl、10mM MgCl₂を加えて4.5μｌとし、λg
t10/EcoRIアーム（アマシヤム社）0.5μｌ（0.25μｇ）
を加え、更に、５μｌのDNAライゲーシヨンキツト（宝
酒造）Ｂ液を加え、26℃、10分インキユベートし、70
℃、10分で反応を停止した。これを、インビトロパツケ
ージング反応に供した。すなわち、反応液４μｌを、２
種のパツケージングエキストラクト（ストラテジーン
社）と静かに混和し、22℃、２時間インキユベートして
フアージ粒子を形成させ、500μｌのSMバツフアー（100
mM NaCl、8mM MgSO₄、50mM トリスHCl、pH7.5、0.01％
ゼラチン）及び20μｌのクロロホルムを加え、４℃に保
存した。

（３−３）プラークハイプリダイゼーシヨン フアージ液の100μｌをあらかじめＬ−ブロス＋0.4％
マルトースの培地で一夜培養した大腸菌NM514の200μｌ
に加え、37℃、15分インキユベートし、42℃に加温した
4mlのＬ−軟寒天培地（Ｌ−ブロス＋0.8％寒天）に加
え、あらかじめ調製した20mlのＬ−寒天プレート上に重
層した。37℃で一夜インキユベートして得られたプレー
ト上にナイロンフイルター（アマシヤム社、ハイボンド
Ｎ）を30秒接触させた後、変性溶液（0.5M NaOH、1.5M
NaCl）で飽和した厚手の紙上に５分間置き、更に中和
溶液（0.5MトリスHCl、pH7.0、1.5M NaCl）で飽和した
紙上に５分間静置した。次に、２×SSC（0.3M NaCl、
30mMクエン酸ナトリウム、pH7.0）でフイルターを洗浄
し風乾した後、300nmのUV照射（５分間）により固定
し、レプリカフイルターとした。一方、ハイブリダイゼ
ーシヨンに用いるプローブを調製した。すなわち、プラ
スミドpLF5の４μｇを、12ユニツトのPvu II、次いで15
ユニツトのEcoRIで分解し、アガロース電気泳動で0.43k
bの断片100ngを回収した。これを、アマシヤム社「マル
チプライム DNAラベリングシステム」を用いて³²Pでラ
ベルした。方法は添付のプロトコールに従つた。得られ
た標識プローブは、60μｌで5.5×10⁷cpmであつた。前
述のレプリカフイルターを、６×SSC、５×デンハルト
（Denhardt）（BSA、ポリビニルピロリドン、フイコー
ル各0.1％）、0.5％SDS、80μg/mlサケ精子DNAを含む15
mlの溶液中で65℃、４時間インキユベートし、プレハイ
ブリダイゼーシヨンを行つた。次に熱変性処理した標識
プローブ（2.75×10⁷cpm）を加え、同条件で一夜ハイブ
リダイゼーシヨンを行つた。フイルターを２×SSC、0.1
％SDSの洗液で65℃、15分のインキユベートを２回、次
いで0.2×SSC、0.1％SDSの洗液で65℃、15分のインキユ
ベートを２回行つた後２×SSCで軽くリンスし、オート
ラジオグラフイーを行つた。その結果、４×10³のプラ
ーク中に250のポジテイブシグナルが認められた。

（３−４）フアージDNAの調製と挿入断片の分析 ポジテイブシグナルを与えたフアージクローンを1ml
のSMバツフアーに懸濁し、その250μｌを、あらかじめ
一夜培養した大腸菌NM514の0.5mlに加え、37℃、15分イ
ンキユベートして、フアージを吸着させ、10mM MgCl₂を
含むＬ−ブロス5mlを加え、37℃、4.5時間振とう培養し
た。50μｌのクロロホルムを加え、更に10分振とうした
後、遠心分離により上清（フアージ溶菌液）を得た。溶
菌液に20μｇのDNase i、10μｇのRNase Aを加え、37
℃、30分インキユベートした。更に0.29gのNaCl、0.55g
のPEG 6000を加えて、氷中で２時間インキユベートし
た。遠心でペレツトを回収し、400μｌのTEに懸濁し
た。フエノール抽出を２回、フエノール／クロロホルム
抽出を１回、クロロホルム抽出を１回行つた後、エタノ
ール沈殿により、フアージDNAを回収した。これを20μ
ｌのTEに溶かし、20ユニツトのEcoRIを含む30μｌの反
応液中で37℃、２時間インキユベートし、アガロース電
気泳動により、挿入断片の分析を行つた。その結果、24
クローン中、１クローンに1.1kbの挿入断片が認められ
た。この1.1kb断片をプラスミドpUC 118にサブクローニ
ングし、得られた組換え体プラスミドをpUFN 74と命名
した。これを用いて挿入断片の塩基配列をダイデオキシ
法で決定したところ、この断片はフイプロネクチンcDNA
〔ジ エムポ ジヤーナル、第４巻、第1755〜1759頁
（1985）〕の2990番目のＧから、4105番目のＡまでを含
むことが判明した。但し、3018番目のＣ、3063番目の
Ｃ、3216番目のＣはそれぞれＡ、Ａ、Ｔに置換していた
が、アミノ酸コードに変化はなかつた。

（３−５）pUFN 74のEcoO 109−BamH1断片の調製 40μｇのpUFN74に対し、200ユニツトのEcoO 109を加
え、400μｌの反応液中、37℃、２時間インキユベート
した。エタノール沈殿により、DNAを回収し、その1/2量
を7mM トリスHCl、pH7.5、1mM EDTA、20mM NaCl、7mM M
gCl₂、20μM dATP、dGTP、dCTP、dTTP及び２ユニツトの
クレノウ酵素を含む200μｌの反応液中、室温、20分イ
ンキユベートした。65℃、10分で反応を止め、反応液を
ライゲーシヨンバツフアーの組成とし、2.5nmoleのEcoR
Iリンカー（ｄ〔pCCGAATTCGG〕）及び2.8ユニツトのT4D
NAリガーゼを加え、13℃、一夜インキユベートした。加
熱により反応を止め、60ユニツトのBamH1、50ユニツト
のEcoRIを含む400μｌの反応液中、37℃、２時間インキ
ユベートした。アガロース電気泳動により1.0kbの断片
0.2μｇを得た。

（３−６）pTF301のBamH1−Hind III断片の調製 50μｇのpTF301に200ユニツトのEcoRIメチラーゼを加
え、200μｌの反応液とし、37℃、１時間インキユベー
トした。65℃、20分の処理後、60ユニツトのBamH1、60
ユニツトのHind IIIを含む400μｌの反応液とし、37
℃、２時間インキユベートした。アガロース電気泳動に
より0.5kbの断片0.1μｇを得た。

（３−７）Gly¹⁰¹⁴−Met¹⁵¹⁷（504アミノ酸残基）をコ
ードするcDNA断片の構築とクローニング （３−５）で得た1.0kb断片0.2μｇ、（３−６）で得
た0.5kb断片0.1μｇを100μｌのライゲーシヨンバツフ
アー中、2.8ユニツトのT4 DNAリガーゼを加え、16℃、
一夜インキユベートし、70℃、10分の処理で反応を止め
た。反応液をHind III用バツフアーとし、12ユニツトの
Hind IIIを含む100μｌの反応液を37℃、２時間インキ
ユベートした。更に、バツフアーをEcoRI用の組成と
し、10ユニツトのEcoRIを加えて、37℃、２時間インキ
ユベートし、加熱により反応を止めた。この反応液20μ
ｌをあらかじめEcoRI−Hind III処理して脱リン酸した
プラスミドpIN III−ompA1の0.16μｇを2.8ユニツトのT
4 DNAリガーゼを含む30μｌの反応液中、16℃、一夜イ
ンキユベートした。反応液の1/2量を用いて大腸菌HB 10
1を形質転換した。得られた形質転換体の12クローンに
つき挿入断片を調べたところ、５クローンに1.5kbの断
片が認められた。その塩基配列をダイデオキシ法で決定
し、フイプロネクチンのGly¹⁰¹⁴からMet¹⁵¹⁷をコードす
るcDNAを含むプラスミドを得た。このプラスミドをpTF
1101と命名した。

実施例４ 部位特異的変異による付加配列の除去（第４図参照） なお、第４−１図は、pTF 101における不要DNA配列及
びアミノ酸配列と、それを除去した後のDNA配列及びア
ミノ酸配列を示す図であり、第４−２図は、部位特異的
変異によるpTF 101からの不要DNA配列の除去の工程を示
す図である。

pTF 101やpTF 301に挿入されているcDNA断片を発現さ
せると、シグナルペプチド以外にＮ末にベクター由来の
３アミノ酸が付加したペプチドが生成される。シグナル
ペプチドは、宿主のシグナルペプチダーゼにより除去さ
れうるが、Ｎ末側に付加したアミノ酸はそのままでは除
去されない。そこで、この余分の３アミノ酸をコードす
る9bpの配列を部位特異的変異により除去することを試
みた。方法は井上らの方法〔プロシーデイングス オブ
ナシヨナル アカデミー オブ サイエンス オブ
ザ U.S.A.（Proceedings of National Academy of Sci
ence of the U.S.A.）第79巻、第3438〜3441頁（198
2）〕に準じて行つた（第４−１図、第４−２図）。

５μｇのpTF 101を、Pst Iで切断した後、クレノウ酵
素を作用させ、粘着末端を平滑末端とした。これをエタ
ノール沈殿により回収して40μｌのTEに溶かした（フラ
グメント１）。一方、５μｇのpTF 101をXba I−Hind I
IIで切断し、挿入断片を含む領域を除去した断片を５％
アクリルアミド電気泳動により回収し、40μｌのTEに溶
かした（フラグメント２）。更に、変異導入用オリゴヌ
クレオチドプライマー（dGTAGCGCAGGCCATTGGCCAACAA）
を合成し、20pmole/μｌのTE溶液とした。その25μｌ
を、５ユニツトのPNKと0.03mM ATPを含む50μｌのキナ
ーゼバツフアー中、37℃、60分インキユベートし５′末
端をリン酸化した。0.3μｇのフラグメント１、0.28μ
ｇのフラグメント２及び75pmoleのオリゴヌクレオチド
プライマーを、ポリメラーゼ−リガーゼバツフアー（10
0mM NaCl、6.5mM トリスHCl、pH7.5、8mM MgCl₂、1mM
メルカプトエタノール）を含む35μｌの反応液中で３
分間煮沸した後、30℃で30分インキユベートし、更に４
℃で30分インキユベートした。一部をアガロース電気泳
動にかけ、ヘテロ二重鎖が形成されたことを確認した。
次に反応液の10μｌを、各々0.5mMのdATP、dGTP、dCT
P、dTTP、1mM ATP、クレノウ酵素２ユニツト及び１ユニ
ツトのT4 DNAリガーゼを含む20μｌの溶液中で12℃、一
夜インキユベートした。反応液を用いて大腸菌HB 101を
形質転換した。得られた200コロニーのうち、100コロニ
ーにつき、ラピツド法でプラスミドを調製し、PstI−Ec
oRI断片の生成を調べ、２つのEcoRIサイトのうちの一方
のサイトを失つているクローンを選択した。その結果、
５クローンが目的のクローンであつた。そのうちの１ク
ローンについて、プラスミドをXbaI−Himd IIIで切断
し、M13mp18及びM13mp19に組込んでダイデオキシ法で塩
基配列分析を行い、ベクター由来の9bpが除去されてい
ることを確認した。このようにして得られたプラスミド
を、pTF201と命名した。pTF301についても全く同様にし
て、ベクター由来の9bpを除去し、得られたプラスミド
をpTF901と命名した。

実施例５ フイプロネクチンのIle¹⁴¹⁰−Met¹⁵¹⁵（108アミノ酸残
基ポリペプチド）の生産と精製 プラスミドpTF201を組込んだ大腸菌HB101/pTF201を50
μg/mlのアンピシリンを添加した5mlのＬ−プロスを含
む試験管２本に接種し、37℃、一夜振とう培養した。こ
れを、500mlの同培地を含む2lの三角フラスコにそれぞ
れ接種して、培養を続け、660nmの吸光度が0.3となつた
ところで2mMのIPTG（イソプロピルβ−チオガラクトシ
ド）を添加し、２時間後に集菌した。菌体の一部を用い
て、イムノプロツテイングを行つた。すなわち、全菌体
タンパク質を、SDS−PAGE（SDS−ポリアクリルアミド電
気泳動）で分離し、泳動パターンをニトロセルロースメ
ンプランに転写した後、フイプロネクチンの細胞接着ド
メインを特異的に認識する抗フイプロネクチンモノクロ
ーナル抗体FN−10（宝酒造）を作用させ、次いで、パー
オキシダーゼ標識第２抗体を作用させた。結合した標識
第２抗体を、過酸化水素とｏ−フエニレンジアミンの存
在下で発色させることにより、目的のポリペプチドが生
産されていることを確認した。次に、全菌体ペレツト
を、10mM トリスHCl（pH7.5）、5mM EDTA、5mMメルカ
プトエタノールを含む溶液に懸濁して、超音波処理を行
つて、12000rpm、30分遠心して、上清20mlを得た。これ
を、20mM トリスHCl（pH7.5）バツフアーに対して透析
し、抗フイプロネクチンモノクローナル抗体（FN−10）
を結合させたセフアロース4Bのカラム（8ml）に通し
た。カラムを洗浄バツフアーＡ（20mM トリスHCl、pH
8.0、0.15M KCl）で洗浄し、更に洗浄バツフアーＢ（20
mM トリスHCl、pH6.4、0.15M KCl）で洗浄した。最後
に溶出バツフアー（50mM グリシン・HCl、pH2.3、0.20
M KCl）で溶出した。溶出液のイムノブロツテイングを
行い、目的ポリペプチドの画分を集めた。更にモノ（Mo
no）S HR5/5（フアルマシア）カラムにかけて20mM酢酸
バツフアー（pH4.0）中のNaClの濃度勾配により溶出
し、電気泳動的にほぼ単一なポリペプチド4mgを得た。
得られたポリペプチドのＮ末端側の10アミノ酸残基の配
列を決定したところ、フイプロネクチンのIle¹⁴¹⁰からV
al¹⁴¹⁹の配列に一致した。また、アミノ酸組成の分析結
果も理論値に一致した。但し、SDS−PAGEでは、目的の
バンドは分子量約14kD付近に検出され、予想される分子
量11.5kDよりも高い値を示した。これは、ペプチド中の
プロリン（Pro）の含量が高い（108残基中９残基）ため
であると推定される。事実、タンパク質中のプロリンの
含量が多い場合には、SDS−PAGEでの分子量は予想より
も高い値を示すことが知られている〔モレキユラー ア
ンド セルラー バイオロジー（Molecular and Cellul
ar Biology）第４巻、第2486頁（1984）〕。

実施例６ フイプロネクチンのAla¹²³⁵−Met¹⁵¹⁷（283アミノ酸残
基ポリペプチド）を含むペプチドの生産と精製 プラスミドpTF901を導入した大腸菌HB101/pTF901を実
施例５と同様の方法で培養し、同様の方法で精製して2l
の培養液から、電気泳動的にほぼ単一なペプチドとして
約400μｇを得た。本ポリペプチドのＮ末側アミノ酸配
列を調べたところ、目的のポリペプチドのＮ末にベクタ
ー由来のシグナルペプチドの一部（Ala−Gly−Phe−Ala
−Val−Ala−Gln−Ala）が付加した構造を有することが
分つた。

次に、プラスミドpTF1409を導入した大腸菌HB101/pTF
1409も同様に培養、精製し、2lの培養液から、約600μ
ｇのポリペプチドを得た。本ポリペプチドのＮ末側のア
ミノ酸配列を調べたところ、目的ポリペプチドのＮ末に
ベクター由来のアミノ酸配列（Met−Thr−Met−Ile−Th
r−Asn−Ser）が付加した構造を有することが分つた。

実施例７ フイプロネクチンのGly¹⁰¹⁴−Met¹⁵¹⁷（504アミノ酸残
基ポリペプチド）を含むポリペプチドの生産と精製 プラスミドpTF1101を導入した大腸菌HB101/pTF1101を
用いて、実施例５と同様な方法で１の培養を行い、菌
体を超音波破砕した後、透析後、抗体を結合したセフア
ロース4Bのカラムにかけ、電気泳動的に単一なポリペプ
チドを600μｇ得た。本ポリペプチドのＮ末側アミノ酸
配列を調べたところ、目的ポリペプチドのＮ末にベクタ
ー由来のシグナルペプチド配列とAla−Asn−Ser配列が
付加した構造を有することがわかつた。

実施例８ 細胞接着活性の測定 前記実施例５〜７で得られた各ポリペプチドを用い
て、細胞接着活性を測定した。方法は、ルオスラーテイ
（Ruoslahti）らの方法〔メソツズ イン エンジモロ
ジー（Methods in Enzymology）第82巻、第803〜831頁
（1981）〕に準じて行つた。また、ポジテイプコントロ
ールとしては、ヒトのフイプロネクチンを用いた。すな
わち、試料を、0.1M NaHCO₃で段階的に希釈し、その50
μｌを96穴マイクロプレートに分注し、37℃、１時間イ
ンキユベートして、試料をプレートに付着させた。次に
PBS（リン酸緩衝化生理食塩水）でプレートを２回洗浄
し、１％BSAを100μｌ加え、37℃、１時間インキユベー
トして、プレートをブロツクした。プレートをPBSで２
回洗浄した後、あらかじめ、イーグルの最小培地（ME
M）に10⁶細胞/mlとなるように懸濁させたラツト腎細胞
（NRK−49F）を100μl/ウエルの割合で分注し、37℃で
２〜３時間インキユベートした。顕微鏡下で細胞の形態
変化を観察し、細胞接着活性を示す最少量を決定した。
その結果を下記表１に示す。

実施例９ Ｃ末にCys残基を付加したポリペプチドをコードするcDN
Aのクローニングと発現（第５図参照） なお、第５図は、Ｃ末にCys残基を付加したポリペプ
チドをコードするDNA配列を組込んだ発現プラスミドの
構築の工程を示す図である。

実施例４で得られたプラスミドpTF201からXbaI−Hind
III断片（0.44kb）を切出し、これをFokIで切断して、
XbaI−FokI断片（175bp）とFokI−FokI断片（203bp）を
得た。

一方、Ｃ末側のFokI−EcoRI断片のストツプコドンの
前にCysのコドン（TGC）を付加した合成DNAを調製し、
リン酸化後二重鎖とした。このようにして得られた、Xb
aI−FokI断片、ForI−FokI断片及びFokI−EcoRI断片
を、あらかじめpTF201からXbaI−EcoRI断片を除いたベ
クターとDNAリガーゼで接続し、大腸菌HB101を形質転換
した。得られた形質転換体から、プラスミドを精製し、
M13mp18にサブクローニングして、ダイデオキシ法で塩
基配列を調べ、３′末端にCysに対応するTGCの配列が付
加していることを確認した。このようにしてIle¹⁴¹⁰−M
et¹⁵¹⁷のＣ末にCys残基が付加したポリペプチドをコー
ドするcDNAを組込んだプラスミドを得、pTF1201と命名
した。

次に、pTF1201からPvuII−HindIII断片を、また、実
施例４で得られたpTF901からXbaI−PvuII断片をそれぞ
れ切出して、精製した。これらを、あらかじめ、pTF901
からXbaI−HindIII断片を除いたベクターと、DNAリガー
ゼで連結し、大腸菌HB101を形質転換した。得られた形
質転換体からプラスミドを抽出し、挿入断片をM13mp18
にサブクローニングして、ダイデオキシ法により、塩基
配列を調べ、３′末端にCysに対応するTGC配列が付加し
ていることを確認した。このようにしてAla¹²³⁵−Met
¹⁵¹⁷のＣ末にCys残基が付加したポリペプチドをコード
するcDNAを組込んだプラスミドを得、pTF1501と命名し
た。pTF1501を実施例５と同様の方法で培養、精製を行
つて、１の培養液から、500μｇの精製ポリペプチド
を得た。本ポリペプチドのアミノ酸組成分析を行つた結
果、分子中のCys残基の数は１と計算され、理論値と一
致した。

〔発明の効果〕

以上詳細に説明したように、本発明により、フイプロ
ネクチンと実質上同等の細胞接着活性を有するポリペプ
チド、及びその遺伝子工学的な製造方法が提供された。

【図面の簡単な説明】

第１図はフイプロネクチンのIle¹⁴¹⁰−Met¹⁵¹⁷を含むポ
リペプチドをコードするDNA配列を組込んだ発現プラス
ミドの構築の工程を示す図、第２図はフイプロネクチン
のAla¹²³⁵−Met¹⁵¹⁷を含むポリペプチドをコードするDN
A配列を組込んだ発現プラスミドの構築の工程を示す
図、第３図はフイプロネクチンのGly¹⁰¹⁴−Met¹⁵¹⁷を含
むポリペプチドをコードするDNA配列を組込んだ発現プ
ラスミドの構築の工程を示す図、第４−１図はpTF101に
おける不要DNA配列及びアミノ酸配列とそれを除去した
後のDNA配列及びアミノ酸配列を示す図、第４−２図は
部位特異的変異によるpTF101からの不用DNA配列の除去
の工程を示す図、第５図はＣ末にCys残基を付加したポ
リペプチドをコードするDNA配列を組込んだ発現プラス
ミドの構築の工程を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＢＬ ＡＤＡ ＡＤＴ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＡ ＡＤＴ (72)発明者 菅原 由起 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (56)参考文献 特開 昭62−89699（ＪＰ，Ａ)

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記式Ｉで示されるアミノ酸配列で表され
   ることを特徴とするポリペプチド。
2. 【請求項２】請求項１記載のポリペプチドをコードする
   ことを特徴とするDNA。
3. 【請求項３】請求項２記載のDNA配列が組込まれたベク
   ターが導入された大腸菌を培養し、培養物より請求項１
   記載のポリペプチドを採取することを特徴とするポリペ
   プチドの製造方法。