JPH08304403A - 抗クラミジア・ニューモニエ抗体の検出・測定方法及びその試薬、並びにクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬 - Google Patents
抗クラミジア・ニューモニエ抗体の検出・測定方法及びその試薬、並びにクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬Info
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- JPH08304403A JPH08304403A JP7106012A JP10601295A JPH08304403A JP H08304403 A JPH08304403 A JP H08304403A JP 7106012 A JP7106012 A JP 7106012A JP 10601295 A JP10601295 A JP 10601295A JP H08304403 A JPH08304403 A JP H08304403A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 クラミジア属細菌を検出するための抗原ポリ
ペプチドを大量に合成する技術を提供し、これにより、
抗クラミジア・ニューモニエ抗体の検出・測定方法及び
その試薬、並びにクラミジア・ニューモニエ感染の診断
薬を提供する。 【構成】 配列番号１のポリペプチドに、直接に又は介
在アミノ酸配列を介して、配列番号２のポリペプチドの
中の連続した少なくとも５個のアミノ酸配列を含むポリ
ペプチドＢが結合した、ジヒドロ葉酸還元酵素−クラミ
ジア・ニューモニエの抗原ポリペプチド融合タンパク質
を抗原として用いることを特徴とする、クラミジア・ニ
ューモニエ感染の診断薬。
ペプチドを大量に合成する技術を提供し、これにより、
抗クラミジア・ニューモニエ抗体の検出・測定方法及び
その試薬、並びにクラミジア・ニューモニエ感染の診断
薬を提供する。 【構成】 配列番号１のポリペプチドに、直接に又は介
在アミノ酸配列を介して、配列番号２のポリペプチドの
中の連続した少なくとも５個のアミノ酸配列を含むポリ
ペプチドＢが結合した、ジヒドロ葉酸還元酵素−クラミ
ジア・ニューモニエの抗原ポリペプチド融合タンパク質
を抗原として用いることを特徴とする、クラミジア・ニ
ューモニエ感染の診断薬。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、抗クラミジア・ニュー
モニエ抗体の検出・測定方法及びその試薬、並びにクラ
ミジア・ニューモニエ感染の診断薬に関する。本発明は
医薬品工業、特にクラミジア・ニューモニエ感染症の診
断薬の製造において有効に利用される。
モニエ抗体の検出・測定方法及びその試薬、並びにクラ
ミジア・ニューモニエ感染の診断薬に関する。本発明は
医薬品工業、特にクラミジア・ニューモニエ感染症の診
断薬の製造において有効に利用される。
【０００２】
【従来の技術】クラミジア属の細菌は、クラミジア・ト
ラコマチス、クラミジア・シッタシ、クラミジア・ニュ
ーモニエ等の種（Species）が知られている。クラミジ
ア・トラコマチスは、トラコーマ、性病性リンパ肉芽
腫、泌尿生殖器感染症、封入体結膜炎、新生児肺炎等を
引き起こす原因菌であり、クラミジア・シッタシは、オ
ウム病等の原因菌であり、またクラミジア・ニューモニ
エは、呼吸器感染症、異形肺炎等の原因菌である。
ラコマチス、クラミジア・シッタシ、クラミジア・ニュ
ーモニエ等の種（Species）が知られている。クラミジ
ア・トラコマチスは、トラコーマ、性病性リンパ肉芽
腫、泌尿生殖器感染症、封入体結膜炎、新生児肺炎等を
引き起こす原因菌であり、クラミジア・シッタシは、オ
ウム病等の原因菌であり、またクラミジア・ニューモニ
エは、呼吸器感染症、異形肺炎等の原因菌である。
【０００３】クラミジア・ニューモニエの引き起こす呼
吸器感染症の症状は、マイコプラズマ・ニューモニエや
インフルエンザウイルスが原因で起こる感染症の症状と
類似しているので、しばしば誤診されやすい。そのた
め、クラミジア・ニューモニエの簡便な診断方法の開発
が望まれていた。
吸器感染症の症状は、マイコプラズマ・ニューモニエや
インフルエンザウイルスが原因で起こる感染症の症状と
類似しているので、しばしば誤診されやすい。そのた
め、クラミジア・ニューモニエの簡便な診断方法の開発
が望まれていた。
【０００４】感染症の診断は、通常、感染部位等におけ
る原因菌の存在の検出か、血清・その他の体液中におけ
る（原因菌に対する）抗体の存在の検出により確定的に
なされる。前者は抗原検査、後者は抗体検査と呼ばれ、
いずれも臨床で重要な意義があり、クラミジア・ニュー
モニエの抗体検査としては、クラミジア・ニューモニエ
の基本小体を用いて抗体の存在を検出する方法が知られ
ている。
る原因菌の存在の検出か、血清・その他の体液中におけ
る（原因菌に対する）抗体の存在の検出により確定的に
なされる。前者は抗原検査、後者は抗体検査と呼ばれ、
いずれも臨床で重要な意義があり、クラミジア・ニュー
モニエの抗体検査としては、クラミジア・ニューモニエ
の基本小体を用いて抗体の存在を検出する方法が知られ
ている。
【０００５】一方、大腸菌においてタンパク質を大量に
発現させることのできるプラスミドとして、ｐＢＢＫ１
０ＭＭが知られている（特開平４−１１７２８４号公
報）。このプラスミドは、ジヒドロ葉酸還元酵素（以
下、ＤＨＦＲと略す。）と抗アレルギー性ペプチドとの
融合タンパク質を発現させることができる。ここで得ら
れる融合タンパク質にはＤＨＦＲの酵素活性も保持され
ているので、融合タンパク質の精製はＤＨＦＲの特性と
活性を利用して容易に行うことがてきる。
発現させることのできるプラスミドとして、ｐＢＢＫ１
０ＭＭが知られている（特開平４−１１７２８４号公
報）。このプラスミドは、ジヒドロ葉酸還元酵素（以
下、ＤＨＦＲと略す。）と抗アレルギー性ペプチドとの
融合タンパク質を発現させることができる。ここで得ら
れる融合タンパク質にはＤＨＦＲの酵素活性も保持され
ているので、融合タンパク質の精製はＤＨＦＲの特性と
活性を利用して容易に行うことがてきる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】しかし、クラミジア属
細菌は培養が困難であり、基本小体を取得するのが容易
ではない。本発明は、クラミジア属細菌を検出するため
の抗原ポリペプチドを大量に合成する技術を提供し、こ
れにより、抗クラミジア・ニューモニエ抗体の検出・測
定方法及びその試薬、並びにクラミジア・ニューモニエ
感染の診断薬を提供することを目的とする。
細菌は培養が困難であり、基本小体を取得するのが容易
ではない。本発明は、クラミジア属細菌を検出するため
の抗原ポリペプチドを大量に合成する技術を提供し、こ
れにより、抗クラミジア・ニューモニエ抗体の検出・測
定方法及びその試薬、並びにクラミジア・ニューモニエ
感染の診断薬を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、まず、ク
ラミジア・ニューモニエからゲノムＤＮＡを抽出し、制
限酵素で部分分解してこれをファージベクターλgt１１
ＤＮＡに挿入してゲノムＤＮＡライブラリーを作成し、
これを大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株に感染させ、クラミジア
・ニューモニエ特異的モノクローナル抗体を用いてクラ
ミジア・ニューモニエの抗原ポリペプチドを発現する感
染大腸菌のコロニーをスクリーニングし、陽性の感染大
腸菌からλファージを抽出し、この操作を繰り返してλ
ファージを精製し、そのＤＮＡを取得した。そして、遺
伝子組換え技術を利用してこのλファージのＤＮＡと上
述のプラスミドｐＢＢＫ１０ＭＭから組換えプラスミド
ベクターｐＣＰＮ６０２３を構築し、本発明を完成し
た。
ラミジア・ニューモニエからゲノムＤＮＡを抽出し、制
限酵素で部分分解してこれをファージベクターλgt１１
ＤＮＡに挿入してゲノムＤＮＡライブラリーを作成し、
これを大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株に感染させ、クラミジア
・ニューモニエ特異的モノクローナル抗体を用いてクラ
ミジア・ニューモニエの抗原ポリペプチドを発現する感
染大腸菌のコロニーをスクリーニングし、陽性の感染大
腸菌からλファージを抽出し、この操作を繰り返してλ
ファージを精製し、そのＤＮＡを取得した。そして、遺
伝子組換え技術を利用してこのλファージのＤＮＡと上
述のプラスミドｐＢＢＫ１０ＭＭから組換えプラスミド
ベクターｐＣＰＮ６０２３を構築し、本発明を完成し
た。
【０００８】すなわち、本発明は、下記（１）〜（１
５）に関するものである。 （１）配列番号１のポリペプチドに、直接に又は介在ア
ミノ酸配列を介して、配列番号２のポリペプチドの中の
連続した少なくとも５個のアミノ酸配列を含むポリペプ
チドＢが結合した、ジヒドロ葉酸還元酵素−クラミジア
・ニューモニエの抗原ポリペプチド融合タンパク質を抗
原として用いることを特徴とする、抗クラミジア・ニュ
ーモニエ抗体の検出・測定方法。 （２）ポリペプチドＢが、配列番号２のポリペプチドか
らアミノ酸１〜３２０個が欠落しているポリペプチドで
ある、上記（１）記載の検出・測定方法。 （３）ポリペプチドＢが、配列番号２のポリペプチドの
中のアミノ酸１〜１００個が他のアミノ酸で置換されて
いるポリペプチドである、上記（１）記載の検出・測定
方法。 （４）融合タンパク質が配列番号３のアミノ酸配列から
なるポリペプチドである、上記（１）記載の検出・測定
方法。 （５）融合タンパク質が配列番号４のアミノ酸配列から
なるポリペプチドである、上記（１）記載の検出・測定
方法。 （６）配列番号１のポリペプチドに、直接に又は介在ア
ミノ酸配列を介して、配列番号２のポリペプチドの中の
連続した少なくとも５個のアミノ酸配列を含むポリペプ
チドＢが結合した、ジヒドロ葉酸還元酵素−クラミジア
・ニューモニエの抗原ポリペプチド融合タンパク質を抗
原として含有してなる、抗クラミジア・ニューモニエ抗
体の検出・測定用試薬。 （７）ポリペプチドＢが、配列番号２のポリペプチドか
らアミノ酸１〜３２０個が欠落しているポリペプチドで
ある、上記（６）記載の検出・測定用試薬。 （８）ポリペプチドＢが、配列番号２のポリペプチドの
中のアミノ酸１〜１００個が他のアミノ酸で置換されて
いるポリペプチドである、上記（６）記載の検出・測定
用試薬。 （９）融合タンパク質が配列番号３のアミノ酸配列から
なるポリペプチドである、上記（６）記載の検出・測定
用試薬。 （１０）融合タンパク質が配列番号４のアミノ酸配列か
らなるポリペプチドである、上記（６）記載の検出・測
定用試薬。 （１１）配列番号１のポリペプチドに、直接に又は介在
アミノ酸配列を介して、配列番号２のポリペプチドの中
の連続した少なくとも５個のアミノ酸配列を含むポリペ
プチドＢが結合した、ジヒドロ葉酸還元酵素−クラミジ
ア・ニューモニエの抗原ポリペプチド融合タンパク質を
有効成分とする、クラミジア・ニューモニエ感染の診断
薬。 （１２）ポリペプチドＢが、配列番号２のポリペプチド
からアミノ酸１〜３２０個が欠落しているポリペプチド
である、上記（１１）記載の診断薬。 （１３）ポリペプチドＢが、配列番号２のポリペプチド
の中のアミノ酸１〜１００個が他のアミノ酸で置換され
ているポリペプチドである、上記（１１）記載の診断
薬。 （１４）融合タンパク質が配列番号３のアミノ酸配列か
らなるポリペプチドである、上記（１１）記載の診断
薬。 （１５）融合タンパク質が配列番号４のアミノ酸配列か
らなるポリペプチドである、上記（１１）記載の診断
薬。
５）に関するものである。 （１）配列番号１のポリペプチドに、直接に又は介在ア
ミノ酸配列を介して、配列番号２のポリペプチドの中の
連続した少なくとも５個のアミノ酸配列を含むポリペプ
チドＢが結合した、ジヒドロ葉酸還元酵素−クラミジア
・ニューモニエの抗原ポリペプチド融合タンパク質を抗
原として用いることを特徴とする、抗クラミジア・ニュ
ーモニエ抗体の検出・測定方法。 （２）ポリペプチドＢが、配列番号２のポリペプチドか
らアミノ酸１〜３２０個が欠落しているポリペプチドで
ある、上記（１）記載の検出・測定方法。 （３）ポリペプチドＢが、配列番号２のポリペプチドの
中のアミノ酸１〜１００個が他のアミノ酸で置換されて
いるポリペプチドである、上記（１）記載の検出・測定
方法。 （４）融合タンパク質が配列番号３のアミノ酸配列から
なるポリペプチドである、上記（１）記載の検出・測定
方法。 （５）融合タンパク質が配列番号４のアミノ酸配列から
なるポリペプチドである、上記（１）記載の検出・測定
方法。 （６）配列番号１のポリペプチドに、直接に又は介在ア
ミノ酸配列を介して、配列番号２のポリペプチドの中の
連続した少なくとも５個のアミノ酸配列を含むポリペプ
チドＢが結合した、ジヒドロ葉酸還元酵素−クラミジア
・ニューモニエの抗原ポリペプチド融合タンパク質を抗
原として含有してなる、抗クラミジア・ニューモニエ抗
体の検出・測定用試薬。 （７）ポリペプチドＢが、配列番号２のポリペプチドか
らアミノ酸１〜３２０個が欠落しているポリペプチドで
ある、上記（６）記載の検出・測定用試薬。 （８）ポリペプチドＢが、配列番号２のポリペプチドの
中のアミノ酸１〜１００個が他のアミノ酸で置換されて
いるポリペプチドである、上記（６）記載の検出・測定
用試薬。 （９）融合タンパク質が配列番号３のアミノ酸配列から
なるポリペプチドである、上記（６）記載の検出・測定
用試薬。 （１０）融合タンパク質が配列番号４のアミノ酸配列か
らなるポリペプチドである、上記（６）記載の検出・測
定用試薬。 （１１）配列番号１のポリペプチドに、直接に又は介在
アミノ酸配列を介して、配列番号２のポリペプチドの中
の連続した少なくとも５個のアミノ酸配列を含むポリペ
プチドＢが結合した、ジヒドロ葉酸還元酵素−クラミジ
ア・ニューモニエの抗原ポリペプチド融合タンパク質を
有効成分とする、クラミジア・ニューモニエ感染の診断
薬。 （１２）ポリペプチドＢが、配列番号２のポリペプチド
からアミノ酸１〜３２０個が欠落しているポリペプチド
である、上記（１１）記載の診断薬。 （１３）ポリペプチドＢが、配列番号２のポリペプチド
の中のアミノ酸１〜１００個が他のアミノ酸で置換され
ているポリペプチドである、上記（１１）記載の診断
薬。 （１４）融合タンパク質が配列番号３のアミノ酸配列か
らなるポリペプチドである、上記（１１）記載の診断
薬。 （１５）融合タンパク質が配列番号４のアミノ酸配列か
らなるポリペプチドである、上記（１１）記載の診断
薬。
【０００９】以下、本発明の詳細を、１．形質転換体の
作製、２．融合タンパク質の製造方法、３．得られた融
合タンパク質、４．融合タンパク質をコードするＤＮ
Ａ、５．融合タンパク質を抗原として用いる抗クラミジ
ア・ニューモニエ抗体の検出・測定方法及び試薬、並び
に融合タンパク質を有効成分とするクラミジア・ニュー
モニエ感染の診断薬、の順に説明する。
作製、２．融合タンパク質の製造方法、３．得られた融
合タンパク質、４．融合タンパク質をコードするＤＮ
Ａ、５．融合タンパク質を抗原として用いる抗クラミジ
ア・ニューモニエ抗体の検出・測定方法及び試薬、並び
に融合タンパク質を有効成分とするクラミジア・ニュー
モニエ感染の診断薬、の順に説明する。
【００１０】１．形質転換体の作製 １．１ クラミジア・ニューモニエの培養 培養したＨＬ細胞から細胞浮遊液を調製し、培養上清を
除去した後にクラミジア・ニューモニエの浮遊液を添加
してこれを培養し、遠心分離してクラミジア・ニューモ
ニエ感染ＨＬ細胞を取得する。クラミジア・ニューモニ
エとしては、例えばクラミジア・ニューモニエＹＫ４１
株(金本ら：ミクロバイオロジカル・イムノロジー、37
巻、495-498頁、1993年(Y.Kanamoto et al., Microbio
l. Immunol., Vol.37, p.495-498, 1993))が使用でき
る。 １．２ クラミジア・ニューモニエの基本小体の精製 クラミジア・ニューモニエ感染ＨＬ細胞を破砕し、遠心
分離し、上清を回収する。ウログラフィン（シェーリン
グ社製）を用いた連続密度勾配液にこの上清を添加して
遠心分離し、クラミジア・ニューモニエの基本小体に相
当するバンドを回収する。
除去した後にクラミジア・ニューモニエの浮遊液を添加
してこれを培養し、遠心分離してクラミジア・ニューモ
ニエ感染ＨＬ細胞を取得する。クラミジア・ニューモニ
エとしては、例えばクラミジア・ニューモニエＹＫ４１
株(金本ら：ミクロバイオロジカル・イムノロジー、37
巻、495-498頁、1993年(Y.Kanamoto et al., Microbio
l. Immunol., Vol.37, p.495-498, 1993))が使用でき
る。 １．２ クラミジア・ニューモニエの基本小体の精製 クラミジア・ニューモニエ感染ＨＬ細胞を破砕し、遠心
分離し、上清を回収する。ウログラフィン（シェーリン
グ社製）を用いた連続密度勾配液にこの上清を添加して
遠心分離し、クラミジア・ニューモニエの基本小体に相
当するバンドを回収する。
【００１１】１．３ クラミジア・ニューモニエのゲノ
ムＤＮＡの調製 クラミジア・ニューモニエの基本小体を、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）
（以下、ＴＥ緩衝液という）に懸濁し、１％ドデシル硫
酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液及び１mg/mlプロテイナ
ーゼＫ水溶液を加えて保温し、基本小体を溶解させる。
０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）飽和フェノー
ルを加えて撹拌し、遠心分離し、水層を回収する。さら
にＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ）処理をし、フェノール
／クロロホルム／イソアミルアルコール処理とエタノー
ル沈殿処理をし、クラミジア・ニューモニエのゲノムＤ
ＮＡを取得する。
ムＤＮＡの調製 クラミジア・ニューモニエの基本小体を、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）
（以下、ＴＥ緩衝液という）に懸濁し、１％ドデシル硫
酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液及び１mg/mlプロテイナ
ーゼＫ水溶液を加えて保温し、基本小体を溶解させる。
０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）飽和フェノー
ルを加えて撹拌し、遠心分離し、水層を回収する。さら
にＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ）処理をし、フェノール
／クロロホルム／イソアミルアルコール処理とエタノー
ル沈殿処理をし、クラミジア・ニューモニエのゲノムＤ
ＮＡを取得する。
【００１２】１．４ ゲノムＤＮＡ発現ライブラリーの
作製 ゲノムＤＮＡを制限酵素ＡｃｃＩ、ＨａｅIII及びＡｌ
ｕＩで消化し、フェノール／クロロホルム／イソアミル
アルコール処理とエタノール沈殿処理をし、部分消化Ｄ
ＮＡを取得する。この部分消化ＤＮＡにリンカー、アデ
ノシン−５′−三リン酸（adenosine 5′-triphosphat
e、以下、ＡＴＰと略す）及びＴ４リガーゼを添加し
て、部分消化ＤＮＡにリンカーを付加させる。これを、
０．１Ｍ ＮａＣｌ及び１ｍＭ ＥＤＴＡ含有１０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液を移動相とするクロマ・スピン６０
００（Chroma spin 6000）カラムにかけ、溶出液を分取
し、１ｋｂｐから７ｋｂｐのＤＮＡ断片を含む分画を回
収する。得られた分画にＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼを加えて反応させ、ＤＮＡ断片の５′端をリ
ン酸化する。反応液をフェノール／クロロホルム／イソ
アミルアルコール処理及びエタノール沈殿処理し、５′
端がリン酸化されたＤＮＡ断片を取得する。このＤＮＡ
断片に、予め制限酵素ＥｃｏＲＩで切断しておいたλgt
１１ＤＮＡ、ＡＴＰ及びＴ４リガーゼを加えて反応さ
せ、市販のパッケージングキットを用い、得られた組換
えλgt１１ＤＮＡをパッケージングし、ゲノムＤＮＡ発
現ライブラリーを作製する。
作製 ゲノムＤＮＡを制限酵素ＡｃｃＩ、ＨａｅIII及びＡｌ
ｕＩで消化し、フェノール／クロロホルム／イソアミル
アルコール処理とエタノール沈殿処理をし、部分消化Ｄ
ＮＡを取得する。この部分消化ＤＮＡにリンカー、アデ
ノシン−５′−三リン酸（adenosine 5′-triphosphat
e、以下、ＡＴＰと略す）及びＴ４リガーゼを添加し
て、部分消化ＤＮＡにリンカーを付加させる。これを、
０．１Ｍ ＮａＣｌ及び１ｍＭ ＥＤＴＡ含有１０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液を移動相とするクロマ・スピン６０
００（Chroma spin 6000）カラムにかけ、溶出液を分取
し、１ｋｂｐから７ｋｂｐのＤＮＡ断片を含む分画を回
収する。得られた分画にＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼを加えて反応させ、ＤＮＡ断片の５′端をリ
ン酸化する。反応液をフェノール／クロロホルム／イソ
アミルアルコール処理及びエタノール沈殿処理し、５′
端がリン酸化されたＤＮＡ断片を取得する。このＤＮＡ
断片に、予め制限酵素ＥｃｏＲＩで切断しておいたλgt
１１ＤＮＡ、ＡＴＰ及びＴ４リガーゼを加えて反応さ
せ、市販のパッケージングキットを用い、得られた組換
えλgt１１ＤＮＡをパッケージングし、ゲノムＤＮＡ発
現ライブラリーを作製する。
【００１３】１．５ 抗原ポリペプチドをコードするＤ
ＮＡのクローニング 大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株の培養液に上記ゲノムＤＮＡ発
現ライブラリーを感染させ、寒天培地上で培養し、イソ
プロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）水溶
液に浸漬したニトロセルロースフィルターを利用して、
挿入ＤＮＡの発現により菌体内に産生されたタンパク質
をニトロセルロースフィルターに付着させる。このフィ
ルターを牛血清アルブミンを用いてブロッキング反応さ
せ、洗浄し、次いでフィルターを抗クラミジア・ニュー
モニエモノクローナル抗体と反応させる。抗クラミジア
・ニューモニエモノクローナル抗体としては、例えば、
ハイブリドーマ６０Ａ２３が生産するモノクローナル抗
体がある。反応後、フィルターを洗浄し、パーオキシダ
ーゼ等の酵素で標識された抗マウスＩｇＧ抗体を反応さ
せる。反応後、フィルターを洗浄し、発色基質液を添加
して反応させる。発色基質液としては、例えば、過酸化
水素水溶液及び４−クロロ−１−ナフトールのメタノー
ル溶液を含む液を利用することができる。反応後、フィ
ルターを洗浄し、風乾させる。
ＮＡのクローニング 大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株の培養液に上記ゲノムＤＮＡ発
現ライブラリーを感染させ、寒天培地上で培養し、イソ
プロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）水溶
液に浸漬したニトロセルロースフィルターを利用して、
挿入ＤＮＡの発現により菌体内に産生されたタンパク質
をニトロセルロースフィルターに付着させる。このフィ
ルターを牛血清アルブミンを用いてブロッキング反応さ
せ、洗浄し、次いでフィルターを抗クラミジア・ニュー
モニエモノクローナル抗体と反応させる。抗クラミジア
・ニューモニエモノクローナル抗体としては、例えば、
ハイブリドーマ６０Ａ２３が生産するモノクローナル抗
体がある。反応後、フィルターを洗浄し、パーオキシダ
ーゼ等の酵素で標識された抗マウスＩｇＧ抗体を反応さ
せる。反応後、フィルターを洗浄し、発色基質液を添加
して反応させる。発色基質液としては、例えば、過酸化
水素水溶液及び４−クロロ−１−ナフトールのメタノー
ル溶液を含む液を利用することができる。反応後、フィ
ルターを洗浄し、風乾させる。
【００１４】フィルターの発色スポットに対応する寒天
培地上のプラークを同定し、プラークに含まれるλファ
ージを取得する。プラークが全て上記モノクローナル抗
体と反応するようになるまで前記操作を繰り返し、抗原
ポリペプチドをコードするＤＮＡをクローン化し、抗ク
ラミジア・ニューモニエモノクローナル抗体反応性のク
ラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドを発現するλ
ファージを取得する。
培地上のプラークを同定し、プラークに含まれるλファ
ージを取得する。プラークが全て上記モノクローナル抗
体と反応するようになるまで前記操作を繰り返し、抗原
ポリペプチドをコードするＤＮＡをクローン化し、抗ク
ラミジア・ニューモニエモノクローナル抗体反応性のク
ラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドを発現するλ
ファージを取得する。
【００１５】１．６ クラミジア・ニューモニエ抗原ポ
リペプチドをコードするＤＮＡの取得 取得したλファージを大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株に感染さ
せ、培養し、λファージを大量に生産する。市販のキッ
トを用いてλファージからＤＮＡを取得・精製する。こ
のＤＮＡにプライマー、タックポリメラーゼ（Taq Poly
merase）及びデオキシヌクレオチド類を添加し、加熱、
冷却、保温の工程を繰り返し、λgt１１に挿入されたＤ
ＮＡを増幅させる。プライマーとしては、例えば、λgt
１１・フォワード・プライマー（λgt１１ forward pri
mer）及びλgt１１・リバース・プライマー（λgt１１
reverse primer）（いずれも宝酒造株式会社製）があ
り、タックポリメラーゼとしては、例えば、アンプリタ
ック・ＤＮＡ・ポリメラーゼ（AmpliTaq DNA Polymeras
e）がある。このＤＮＡ増幅方法の一般的手法はＰＣＲ
法として知られており、詳細は「サムブロック他編集、
モレキュラー・クローニング 第２版（コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリー）(1989年)」（J.Samb
look et al., Molecular Cloning 2nd ed., Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press （1989）、以下、本文献を
文献″モレキュラー・クローニング″という）に記載さ
れている。
リペプチドをコードするＤＮＡの取得 取得したλファージを大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株に感染さ
せ、培養し、λファージを大量に生産する。市販のキッ
トを用いてλファージからＤＮＡを取得・精製する。こ
のＤＮＡにプライマー、タックポリメラーゼ（Taq Poly
merase）及びデオキシヌクレオチド類を添加し、加熱、
冷却、保温の工程を繰り返し、λgt１１に挿入されたＤ
ＮＡを増幅させる。プライマーとしては、例えば、λgt
１１・フォワード・プライマー（λgt１１ forward pri
mer）及びλgt１１・リバース・プライマー（λgt１１
reverse primer）（いずれも宝酒造株式会社製）があ
り、タックポリメラーゼとしては、例えば、アンプリタ
ック・ＤＮＡ・ポリメラーゼ（AmpliTaq DNA Polymeras
e）がある。このＤＮＡ増幅方法の一般的手法はＰＣＲ
法として知られており、詳細は「サムブロック他編集、
モレキュラー・クローニング 第２版（コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリー）(1989年)」（J.Samb
look et al., Molecular Cloning 2nd ed., Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press （1989）、以下、本文献を
文献″モレキュラー・クローニング″という）に記載さ
れている。
【００１６】増幅されたＤＮＡを取得し、塩基配列を決
定・解析する。ＤＮＡの取得には市販のキットを使用す
ることができ、例えばウイザード・ＰＣＲ・プレップキ
ット(Wizard PCR Prep kit)(プロメガ(Promega)社製品)
を使用することができる。また、塩基配列を決定はタッ
クポリメラーゼを用いた蛍光標識ターミネータサイクル
シークエンス法で行うことができ、この方法を用いるに
は、パーキン・エルマー・ジャパン社から販売されてい
るキットを使用することができる。また、分析にあって
は市販の機械、例えば３７３Ａ型ＤＮＡシークエンサ
（アプライドバイオシステムズ社）を利用することがで
きる。
定・解析する。ＤＮＡの取得には市販のキットを使用す
ることができ、例えばウイザード・ＰＣＲ・プレップキ
ット(Wizard PCR Prep kit)(プロメガ(Promega)社製品)
を使用することができる。また、塩基配列を決定はタッ
クポリメラーゼを用いた蛍光標識ターミネータサイクル
シークエンス法で行うことができ、この方法を用いるに
は、パーキン・エルマー・ジャパン社から販売されてい
るキットを使用することができる。また、分析にあって
は市販の機械、例えば３７３Ａ型ＤＮＡシークエンサ
（アプライドバイオシステムズ社）を利用することがで
きる。
【００１７】塩基配列の決定後、得られたＤＮＡ塩基配
列を遺伝子配列分析ソフトで解析し、編集、連結、アミ
ノ酸翻訳領域の推定を行なう。遺伝子配列分析ソフトと
しては、「ＤＮＡＳＩＳ」（日立ソフトウェアエンジニ
アリング社）を用いることができる。解析の結果、完全
長の遺伝子が取得できていない場合は、既に取得されて
いるＤＮＡの前後のＤＮＡをゲノムウォーキングによっ
て取得する。ゲノムウォーキングを行うには、宝酒造
(株)から販売されているキットを使用することができ
る。
列を遺伝子配列分析ソフトで解析し、編集、連結、アミ
ノ酸翻訳領域の推定を行なう。遺伝子配列分析ソフトと
しては、「ＤＮＡＳＩＳ」（日立ソフトウェアエンジニ
アリング社）を用いることができる。解析の結果、完全
長の遺伝子が取得できていない場合は、既に取得されて
いるＤＮＡの前後のＤＮＡをゲノムウォーキングによっ
て取得する。ゲノムウォーキングを行うには、宝酒造
(株)から販売されているキットを使用することができ
る。
【００１８】１．７ ＤＨＦＲをコードするＤＮＡの調
製 ＤＨＦＲをコードするＤＮＡは、そのＤＮＡを含むプラ
スミドベクターから制限酵素を用いてそのＤＮＡを切り
出すか、あるいはそのＤＮＡを有するプラスミドＤＮＡ
やゲノムＤＮＡを鋳型とし、適切なプライマーを用いて
ＰＣＲ法を行ってそのＤＮＡを増幅することによって取
得する。前者の方法では、ＤＨＦＲをコードするＤＮＡ
を含むプラスミドベクターとして、例えばプラスミドベ
クターｐＢＢＫ１０ＭＭや本発明の組換えベクターでも
あるｐＣＰＮ６０２３を利用することができる。ｐＢＢ
Ｋ１０ＭＭを含む大腸菌は受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−２
３９４として、また、ｐＣＰＮ６０２３を含む大腸菌は
受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４９０８として、いずれも工
業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。こ
れらの大腸菌(プラスミド保持菌)からプラスミドを取得
するには、通常のプラスミドＤＮＡ取得方法に従えば良
く、この方法は文献″モレキュラー・クローニング″に
記載されている。プラスミドｐＢＢＫ１０ＭＭを用いる
場合は制限酵素としてＢａｍＨＩ及びとＸｈｏＩを使用
し、約４．６ＫｂｐのＤＮＡ断片を切り出せばよい。
製 ＤＨＦＲをコードするＤＮＡは、そのＤＮＡを含むプラ
スミドベクターから制限酵素を用いてそのＤＮＡを切り
出すか、あるいはそのＤＮＡを有するプラスミドＤＮＡ
やゲノムＤＮＡを鋳型とし、適切なプライマーを用いて
ＰＣＲ法を行ってそのＤＮＡを増幅することによって取
得する。前者の方法では、ＤＨＦＲをコードするＤＮＡ
を含むプラスミドベクターとして、例えばプラスミドベ
クターｐＢＢＫ１０ＭＭや本発明の組換えベクターでも
あるｐＣＰＮ６０２３を利用することができる。ｐＢＢ
Ｋ１０ＭＭを含む大腸菌は受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−２
３９４として、また、ｐＣＰＮ６０２３を含む大腸菌は
受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４９０８として、いずれも工
業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。こ
れらの大腸菌(プラスミド保持菌)からプラスミドを取得
するには、通常のプラスミドＤＮＡ取得方法に従えば良
く、この方法は文献″モレキュラー・クローニング″に
記載されている。プラスミドｐＢＢＫ１０ＭＭを用いる
場合は制限酵素としてＢａｍＨＩ及びとＸｈｏＩを使用
し、約４．６ＫｂｐのＤＮＡ断片を切り出せばよい。
【００１９】後者の方法では、プラスミドＤＮＡとして
例えば前述のｐＢＢＫ１０ＭＭやｐＣＰＮ６０２３をそ
のまま利用することができ、ゲノムＤＮＡとしては例え
ば枯草菌のゲノムＤＮＡを使用することができる。ゲノ
ムＤＮＡを取得するには通常のゲノムＤＮＡ取得方法に
従えば良く、この方法は文献″モレキュラー・クローニ
ング″に記載されている。後者の方法に使用するプライ
マーは、ＤＨＦＲをコードするＤＮＡの５′末端と３′
末端にある塩基配列を考慮して設計・合成することがで
きる。例えば配列番号５の塩基配列の１番目から２０番
目の配列を有するオリゴヌクレオチドと４６１番目から
４８０番目の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレ
オチドを使用することができる。これらのオリゴヌクレ
オチドは市販のＤＮＡ合成機を用いて化学合成すること
ができる。
例えば前述のｐＢＢＫ１０ＭＭやｐＣＰＮ６０２３をそ
のまま利用することができ、ゲノムＤＮＡとしては例え
ば枯草菌のゲノムＤＮＡを使用することができる。ゲノ
ムＤＮＡを取得するには通常のゲノムＤＮＡ取得方法に
従えば良く、この方法は文献″モレキュラー・クローニ
ング″に記載されている。後者の方法に使用するプライ
マーは、ＤＨＦＲをコードするＤＮＡの５′末端と３′
末端にある塩基配列を考慮して設計・合成することがで
きる。例えば配列番号５の塩基配列の１番目から２０番
目の配列を有するオリゴヌクレオチドと４６１番目から
４８０番目の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレ
オチドを使用することができる。これらのオリゴヌクレ
オチドは市販のＤＮＡ合成機を用いて化学合成すること
ができる。
【００２０】１．８ ＤＨＦＲ−クラミジア・ニューモ
ニエの抗原ポリペプチド融合タンパク質をコードするＤ
ＮＡを含む組換えベクターの作製、及びそれを含む形質
転換体の作製 上記１．６で取得したクラミジア・ニューモニエ抗原ポ
リペプチドをコードするＤＮＡと、上記１．７で取得し
たＤＨＦＲをコードするＤＮＡを、市販のキットを使用
して連結する。その際、必要に応じ、リンカーを使用す
る。市販のキットとしては例えば、ＤＮＡライゲーショ
ンキット(宝酒造)を用いることができる。連結によって
得られたＤＮＡが複製起点をもたず、プラスミドとして
は機能しない場合はこのＤＮＡを新たなプラスミドベク
ターに挿入する。この新たなプラスミドベクターとして
は、例えばｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８等を使用すること
ができる。
ニエの抗原ポリペプチド融合タンパク質をコードするＤ
ＮＡを含む組換えベクターの作製、及びそれを含む形質
転換体の作製 上記１．６で取得したクラミジア・ニューモニエ抗原ポ
リペプチドをコードするＤＮＡと、上記１．７で取得し
たＤＨＦＲをコードするＤＮＡを、市販のキットを使用
して連結する。その際、必要に応じ、リンカーを使用す
る。市販のキットとしては例えば、ＤＮＡライゲーショ
ンキット(宝酒造)を用いることができる。連結によって
得られたＤＮＡが複製起点をもたず、プラスミドとして
は機能しない場合はこのＤＮＡを新たなプラスミドベク
ターに挿入する。この新たなプラスミドベクターとして
は、例えばｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８等を使用すること
ができる。
【００２１】上記連結の反応物を宿主に入れ、形質転換
体を作製する。大腸菌由来のプラスミドを使用する場合
は宿主としては大腸菌を使用することができ、例えば大
腸菌ＨＢ１０１株を使用することができる。この宿主を
コンピテントセルとなるように処理をする。大腸菌ＨＢ
１０１株を処理して得たコンピテントセルは宝酒造から
販売されている。上記連結の反応物を宿主に入れ、形質
転換体を作製する方法は文献″モレキュラー・クローニ
ング″に記載されている。得られた形質転換体を培養し
てコロニーを形成させ、各コロニーからプラスミドＤＮ
Ａを取得し、適切な制限酵素で切断し、アガロースゲル
電気泳動で分析し、所望の組換えプラスミドをもつ形質
転換体を選択する。このようにして作製されたプラスミ
ドベクターとしては、例えばｐＣＰＮ６０２３プラスミ
ドがある。このようにして作製された形質転換体をとし
ては、前述の組換えベクターｐＣＰＮ６０２３が入った
大腸菌ＨＢ１０１株がある。
体を作製する。大腸菌由来のプラスミドを使用する場合
は宿主としては大腸菌を使用することができ、例えば大
腸菌ＨＢ１０１株を使用することができる。この宿主を
コンピテントセルとなるように処理をする。大腸菌ＨＢ
１０１株を処理して得たコンピテントセルは宝酒造から
販売されている。上記連結の反応物を宿主に入れ、形質
転換体を作製する方法は文献″モレキュラー・クローニ
ング″に記載されている。得られた形質転換体を培養し
てコロニーを形成させ、各コロニーからプラスミドＤＮ
Ａを取得し、適切な制限酵素で切断し、アガロースゲル
電気泳動で分析し、所望の組換えプラスミドをもつ形質
転換体を選択する。このようにして作製されたプラスミ
ドベクターとしては、例えばｐＣＰＮ６０２３プラスミ
ドがある。このようにして作製された形質転換体をとし
ては、前述の組換えベクターｐＣＰＮ６０２３が入った
大腸菌ＨＢ１０１株がある。
【００２２】２．融合タンパク質の製造方法 本発明の融合タンパク質を製造する場合は、形質転換体
の培養、形質転換体の破砕、ストレプトマイシン処理、
硫安沈殿、及びメソトリキセート(以下、ＭＴＸと略
す。)結合アフィニティークロマトグラフィー、の各工
程を行う。形質転換体の培養は、その形質転換体が成長
しうる培地でこの融合タンパク質が形質転換体内に十分
蓄積されるまで適温で培養器を振とうする。形質転換体
として前述の組換えベクターｐＣＰＮ６０２３が入った
大腸菌ＨＢ１０１株を使用する場合は、アンピシリンを
含むＬＢ培地で３７℃で一晩振とう培養し、その後、こ
の培養液をアンピシリン及びトリメトプリムを含むＴＢ
培地等に接種してさらに３７℃で一晩振とう培養する。
ＴＢ培地の調製方法は、文献″モレキュラー・クローニ
ング″に記載されている。培養した形質転換体を破砕す
るには、遠心分離で形質転換体を集め、緩衝液に懸濁
し、これに超音波を照射する。形質転換体が大腸菌の場
合は、上記懸濁液にリゾチームを加え、ＳＤＳを含む緩
衝液を加えることよって菌体を溶菌させてもよい。形質
転換体の破砕後、遠心分離して細胞残渣を除去し、上清
を取得する。この上清にストレプトマイシン硫酸塩を添
加し、しばらく撹拌し、遠心分離することによって、核
酸を沈殿物として除去し、上清を取得する。この上清を
ＭＴＸ−アガロースカラムに流し、融合タンパク質をカ
ラムに吸着させ、その後葉酸を含む溶出液を利用して融
合タンパク質を溶出する。
の培養、形質転換体の破砕、ストレプトマイシン処理、
硫安沈殿、及びメソトリキセート(以下、ＭＴＸと略
す。)結合アフィニティークロマトグラフィー、の各工
程を行う。形質転換体の培養は、その形質転換体が成長
しうる培地でこの融合タンパク質が形質転換体内に十分
蓄積されるまで適温で培養器を振とうする。形質転換体
として前述の組換えベクターｐＣＰＮ６０２３が入った
大腸菌ＨＢ１０１株を使用する場合は、アンピシリンを
含むＬＢ培地で３７℃で一晩振とう培養し、その後、こ
の培養液をアンピシリン及びトリメトプリムを含むＴＢ
培地等に接種してさらに３７℃で一晩振とう培養する。
ＴＢ培地の調製方法は、文献″モレキュラー・クローニ
ング″に記載されている。培養した形質転換体を破砕す
るには、遠心分離で形質転換体を集め、緩衝液に懸濁
し、これに超音波を照射する。形質転換体が大腸菌の場
合は、上記懸濁液にリゾチームを加え、ＳＤＳを含む緩
衝液を加えることよって菌体を溶菌させてもよい。形質
転換体の破砕後、遠心分離して細胞残渣を除去し、上清
を取得する。この上清にストレプトマイシン硫酸塩を添
加し、しばらく撹拌し、遠心分離することによって、核
酸を沈殿物として除去し、上清を取得する。この上清を
ＭＴＸ−アガロースカラムに流し、融合タンパク質をカ
ラムに吸着させ、その後葉酸を含む溶出液を利用して融
合タンパク質を溶出する。
【００２３】３．得られた融合タンパク質 本発明の融合タンパク質は、配列番号１のポリペプチド
に、直接に又は介在アミノ酸配列を介して、配列番号２
のポリペプチドの中の連続した少なくとも５個のアミノ
酸配列を含むポリペプチドＢが結合したものである。配
列番号１のポリペプチドは融合タンパク質のうち、ＤＨ
ＦＲ部分である。配列番号２のポリペプチドの中の連続
した少なくとも５個のアミノ酸配列を含むポリペプチド
Ｂは、望ましくは２０個以上、より望ましくは１００個
以上、さらに望ましくは２００個以上のアミノ酸からな
るものがよい。ポリペプチドＢとしては、例えば配列番
号２のポリペプチドを使用することができるし、配列番
号２のポリペプチドからアミノ酸１〜３２０個が欠落し
ているポリペプチドや配列番号２のポリペプチドの中の
アミノ酸１〜１００個が他のアミノ酸で置換されている
ポリペプチドを使用することもできる。配列番号２のポ
リペプチドからアミノ酸１〜３２０個が欠落しているポ
リペプチドとしては、例えば、配列番号２のポリペプチ
ドの２０３〜４３９番目のアミノ酸配列からなるものが
ある。
に、直接に又は介在アミノ酸配列を介して、配列番号２
のポリペプチドの中の連続した少なくとも５個のアミノ
酸配列を含むポリペプチドＢが結合したものである。配
列番号１のポリペプチドは融合タンパク質のうち、ＤＨ
ＦＲ部分である。配列番号２のポリペプチドの中の連続
した少なくとも５個のアミノ酸配列を含むポリペプチド
Ｂは、望ましくは２０個以上、より望ましくは１００個
以上、さらに望ましくは２００個以上のアミノ酸からな
るものがよい。ポリペプチドＢとしては、例えば配列番
号２のポリペプチドを使用することができるし、配列番
号２のポリペプチドからアミノ酸１〜３２０個が欠落し
ているポリペプチドや配列番号２のポリペプチドの中の
アミノ酸１〜１００個が他のアミノ酸で置換されている
ポリペプチドを使用することもできる。配列番号２のポ
リペプチドからアミノ酸１〜３２０個が欠落しているポ
リペプチドとしては、例えば、配列番号２のポリペプチ
ドの２０３〜４３９番目のアミノ酸配列からなるものが
ある。
【００２４】配列番号２のポリペプチドの中のアミノ酸
１〜１００個が他のアミノ酸で置換されているポリペプ
チドとしては、配列番号２のポリペプチドの中の任意の
箇所のアミノ酸を類似の性質をもつ他のアミノ酸に置換
したポリペプチドがあり、例えば、配列番号２のポリペ
プチドの５４４番目のアミノ酸であるチロシンがフェニ
ルアラニンに置換されたポリペプチドがある。
１〜１００個が他のアミノ酸で置換されているポリペプ
チドとしては、配列番号２のポリペプチドの中の任意の
箇所のアミノ酸を類似の性質をもつ他のアミノ酸に置換
したポリペプチドがあり、例えば、配列番号２のポリペ
プチドの５４４番目のアミノ酸であるチロシンがフェニ
ルアラニンに置換されたポリペプチドがある。
【００２５】ポリペプチドＢとしては、例えば、配列番
号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドが使用でき
る。また、ポリペプチドＢとしては、配列番号２のポリ
ペプチドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸配列
を含むポリペプチドに、１〜２０個のアミノ酸が結合し
たものも含まれる。このようなポリペプチドＢとして
は、例えば、配列番号２のポリペプチドの２０３〜４３
９番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドのＣ末端
に、リジン−グリシン−フェニルアラニン−グルタミン
酸−ロイシン−プロリン−トリプトファン−グリシン−
プロリン−ロイシン−イソロイシン−アスパラギンから
なるポリペプチドが付加したポリペプチドがある。介在
アミノ酸配列は特に限定されないが、例えば、ロイシ
ン、ロイシン−メチオニンからなるアミノ酸配列、グル
タミン−フェニルアラニン−グルタミン酸−プロリン−
ロイシン−アルギニン−グルタミン酸−グリシン−バリ
ン−アルギニンからなるアミノ酸配列等がある。
号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドが使用でき
る。また、ポリペプチドＢとしては、配列番号２のポリ
ペプチドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸配列
を含むポリペプチドに、１〜２０個のアミノ酸が結合し
たものも含まれる。このようなポリペプチドＢとして
は、例えば、配列番号２のポリペプチドの２０３〜４３
９番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドのＣ末端
に、リジン−グリシン−フェニルアラニン−グルタミン
酸−ロイシン−プロリン−トリプトファン−グリシン−
プロリン−ロイシン−イソロイシン−アスパラギンから
なるポリペプチドが付加したポリペプチドがある。介在
アミノ酸配列は特に限定されないが、例えば、ロイシ
ン、ロイシン−メチオニンからなるアミノ酸配列、グル
タミン−フェニルアラニン−グルタミン酸−プロリン−
ロイシン−アルギニン−グルタミン酸−グリシン−バリ
ン−アルギニンからなるアミノ酸配列等がある。
【００２６】本発明の融合タンパク質の具体例として
は、配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチドや
配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチドがあ
る。上記融合タンパク質の中では、配列番号３のアミノ
酸配列からなるポリペプチドが望ましい。
は、配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチドや
配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチドがあ
る。上記融合タンパク質の中では、配列番号３のアミノ
酸配列からなるポリペプチドが望ましい。
【００２７】４．融合タンパク質をコードするＤＮＡ 融合タンパク質をコードするＤＮＡは、融合タンパク質
のアミノ酸配列に対応する遺伝暗号から構成される種々
のものが利用できる。
のアミノ酸配列に対応する遺伝暗号から構成される種々
のものが利用できる。
【００２８】５．融合タンパク質を抗原として用いる抗
クラミジア・ニューモニエ抗体の検出・測定方法及び試
薬、並びに融合タンパク質を有効成分とするクラミジア
・ニューモニエ感染の診断薬 抗クラミジア・ニューモニエ抗体を検出・測定するに
は、例えば、上記融合タンパク質を担体に固定化し、検
体を添加し、洗浄し、標識化された二次抗体を添加し、
洗浄し、この標識を直接的又は間接的に検出・測定す
る。担体としては、例えば、ラテックスの粒子やセルロ
ースの糸、その他プラスチック製のアッセイプレートや
粒子等を利用することができる。上記融合タンパク質を
担体に固定化するには、例えば共有結合や物理吸着を利
用する。検体としては、例えばヒトの血清等を使用す
る。なお、検体中の他の抗体等が担体に非特異的に結合
するのを防止するため、検体の添加前に牛血清アルブミ
ン等で担体の表面をブロッキングしておくことが望まし
い。洗浄は界面活性剤を含むリン酸緩衝液等を利用して
行う。
クラミジア・ニューモニエ抗体の検出・測定方法及び試
薬、並びに融合タンパク質を有効成分とするクラミジア
・ニューモニエ感染の診断薬 抗クラミジア・ニューモニエ抗体を検出・測定するに
は、例えば、上記融合タンパク質を担体に固定化し、検
体を添加し、洗浄し、標識化された二次抗体を添加し、
洗浄し、この標識を直接的又は間接的に検出・測定す
る。担体としては、例えば、ラテックスの粒子やセルロ
ースの糸、その他プラスチック製のアッセイプレートや
粒子等を利用することができる。上記融合タンパク質を
担体に固定化するには、例えば共有結合や物理吸着を利
用する。検体としては、例えばヒトの血清等を使用す
る。なお、検体中の他の抗体等が担体に非特異的に結合
するのを防止するため、検体の添加前に牛血清アルブミ
ン等で担体の表面をブロッキングしておくことが望まし
い。洗浄は界面活性剤を含むリン酸緩衝液等を利用して
行う。
【００２９】標識化された二次抗体としては、例えば標
識化された抗ヒトモノクローナル抗体がある。標識とし
ては種々のものが利用でき、例えばアルカリフォスファ
ターゼ（Alkaline phosphatase）、ルシフェラーゼ（Lu
ciferase）、ペルオキシダーゼ（Peroxidase）、β−ガ
ラクトシダーゼ（β-galactosidase）等の酵素、フルオ
レセイン（Fluorescine）等の蛍光物質を利用すること
ができる。また、抗体と標識物の間にビオチン（Bioti
n）、アビジン（Avidin）、ストレプトアビジン（Strep
toavidin）、ディゴキシゲニン（Digoxigenin）等の化
学物質を介在させてもよい。標識を直接的又は間接的に
検出・測定するには、例えば、その標識が酵素である場
合は基質を添加し、酵素の触媒作用により発生する光や
発色を検出・測定するか吸光度の変化を測定する。ま
た、標識が蛍光物質である場合は反応系に紫外線を照射
し、発生する蛍光を検出・測定する。必要に応じ、増感
剤を使用する。
識化された抗ヒトモノクローナル抗体がある。標識とし
ては種々のものが利用でき、例えばアルカリフォスファ
ターゼ（Alkaline phosphatase）、ルシフェラーゼ（Lu
ciferase）、ペルオキシダーゼ（Peroxidase）、β−ガ
ラクトシダーゼ（β-galactosidase）等の酵素、フルオ
レセイン（Fluorescine）等の蛍光物質を利用すること
ができる。また、抗体と標識物の間にビオチン（Bioti
n）、アビジン（Avidin）、ストレプトアビジン（Strep
toavidin）、ディゴキシゲニン（Digoxigenin）等の化
学物質を介在させてもよい。標識を直接的又は間接的に
検出・測定するには、例えば、その標識が酵素である場
合は基質を添加し、酵素の触媒作用により発生する光や
発色を検出・測定するか吸光度の変化を測定する。ま
た、標識が蛍光物質である場合は反応系に紫外線を照射
し、発生する蛍光を検出・測定する。必要に応じ、増感
剤を使用する。
【００３０】上記融合タンパク質を抗原として用いる抗
クラミジア・ニューモニエ抗体の検出・測定用試薬とし
ては、例えば上記融合タンパク質を担体に固定化したも
のやさらに上記標識化された二次抗体や基質等が必要量
同封されたものがある。上記融合タンパク質を有効成分
とするクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬として
は、例えば上記試薬をそのまま利用することができる。
クラミジア・ニューモニエ抗体の検出・測定用試薬とし
ては、例えば上記融合タンパク質を担体に固定化したも
のやさらに上記標識化された二次抗体や基質等が必要量
同封されたものがある。上記融合タンパク質を有効成分
とするクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬として
は、例えば上記試薬をそのまま利用することができる。
【００３１】
【実施例】以下、実施例により本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれにより何ら制限されるものではない。
が、本発明はこれにより何ら制限されるものではない。
【００３２】実施例１ クラミジア・ニューモニエ６０
Ｋ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡの作製 （Ａ）宿主細胞（ＨＬ細胞）の培養 予め、プラスチック製培養フラスコ（７５cm2）の底面
いっぱいに増殖させたＨＬ細胞をリン酸緩衝化生理食塩
液（以下、ＰＢＳという）マグネシウム不含（−）液５
mlで洗浄し、０．１％（ｗ／ｖ）トリプシンを含むＰＢ
Ｓを５ml加えて細胞表面全体に行き渡らせ、その液を捨
てた後、３７℃で１０分間保温し、１０％（ｖ／ｖ）牛
胎児血清を含むダルベッコＭＥＭ培地５mlを加え、ピペ
ッテイングによりＨＬ細胞を剥離して、細胞浮遊液を調
製した。
Ｋ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡの作製 （Ａ）宿主細胞（ＨＬ細胞）の培養 予め、プラスチック製培養フラスコ（７５cm2）の底面
いっぱいに増殖させたＨＬ細胞をリン酸緩衝化生理食塩
液（以下、ＰＢＳという）マグネシウム不含（−）液５
mlで洗浄し、０．１％（ｗ／ｖ）トリプシンを含むＰＢ
Ｓを５ml加えて細胞表面全体に行き渡らせ、その液を捨
てた後、３７℃で１０分間保温し、１０％（ｖ／ｖ）牛
胎児血清を含むダルベッコＭＥＭ培地５mlを加え、ピペ
ッテイングによりＨＬ細胞を剥離して、細胞浮遊液を調
製した。
【００３３】７５cm2のプラスチック製培養フラスコで
培養するときは、培養フラスコに上記細胞浮遊液１ml及
び１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清含有ダルベッコＭＥＭ培
地１５〜２０mlを加え、また、６ウェルプラスチック製
培養容器で培養するときは、上記細胞浮遊液８mlと１０
％牛胎児血清含有ダルベッコＭＥＭ培地２９２mlとの混
合液４mlずつを各ウェルに加え、５％（ｖ／ｖ）炭酸ガ
ス雰囲気下で培養した。
培養するときは、培養フラスコに上記細胞浮遊液１ml及
び１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清含有ダルベッコＭＥＭ培
地１５〜２０mlを加え、また、６ウェルプラスチック製
培養容器で培養するときは、上記細胞浮遊液８mlと１０
％牛胎児血清含有ダルベッコＭＥＭ培地２９２mlとの混
合液４mlずつを各ウェルに加え、５％（ｖ／ｖ）炭酸ガ
ス雰囲気下で培養した。
【００３４】（Ｂ）クラミジア・ニューモニエ ＹＫ４
１の培養 ６ウェルプラスチック製培養容器（底面上）に増殖した
ＨＬ細胞の培養上清をピペットで取り除き、これに前述
のクラミジア・ニューモニエＹＫ４１株の浮遊液〔クラ
ミジア・ニューモニエＹＫ４１保存液を、１リットルあ
たり庶糖７５ｇ、リン酸一カリウム０．５２ｇ、リン酸
二カリウム１．２２ｇ及びグルタミン酸０．７２ｇを含
む水溶液（以下、ＳＰＧという）で１２ないし２４倍に
希釈し、超音波で１分間処理し、２，０００rpmで３分
間遠心分離した上清〕を１ウェルあたり２ml加えて、
２，０００rpmで１時間遠心吸着を行った。遠心吸着
後、クラミジア・ニューモニエ浮遊液を除き、１μg/ml
シクロヘキシミド及び１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含
むダルベッコＭＥＭ培地をウェルあたり４ml加え、５％
（ｖ／ｖ）炭酸ガス雰囲気下、３６℃で３日間培養し
た。培養後、滅菌したシリコン片で細胞を剥離し、細胞
を回収した。これを８，０００rpmで３０分間遠心分離
して、沈殿をＳＰＧに再懸濁し、−７０℃で保存した
（以下、これをクラミジア・ニューモニエＹＫ４１保存
液という）。
１の培養 ６ウェルプラスチック製培養容器（底面上）に増殖した
ＨＬ細胞の培養上清をピペットで取り除き、これに前述
のクラミジア・ニューモニエＹＫ４１株の浮遊液〔クラ
ミジア・ニューモニエＹＫ４１保存液を、１リットルあ
たり庶糖７５ｇ、リン酸一カリウム０．５２ｇ、リン酸
二カリウム１．２２ｇ及びグルタミン酸０．７２ｇを含
む水溶液（以下、ＳＰＧという）で１２ないし２４倍に
希釈し、超音波で１分間処理し、２，０００rpmで３分
間遠心分離した上清〕を１ウェルあたり２ml加えて、
２，０００rpmで１時間遠心吸着を行った。遠心吸着
後、クラミジア・ニューモニエ浮遊液を除き、１μg/ml
シクロヘキシミド及び１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含
むダルベッコＭＥＭ培地をウェルあたり４ml加え、５％
（ｖ／ｖ）炭酸ガス雰囲気下、３６℃で３日間培養し
た。培養後、滅菌したシリコン片で細胞を剥離し、細胞
を回収した。これを８，０００rpmで３０分間遠心分離
して、沈殿をＳＰＧに再懸濁し、−７０℃で保存した
（以下、これをクラミジア・ニューモニエＹＫ４１保存
液という）。
【００３５】（Ｃ）クラミジア・ニューモニエＹＫ４１
の基本小体の精製 −７０℃に保存しておいたクラミジア・ニューモニエＹ
Ｋ４１感染凍結ＨＬ細胞浮遊液を融解し、テフロンホモ
ジナイザーでホモジナイズした。２，５００rpmで１０
分間遠心分離し、上清を回収した。沈殿は再びＳＰＧに
懸濁し、同様の操作を行い、上清を回収した。同様の操
作を更に２回行い、得られた上清は集めて合わせた。
の基本小体の精製 −７０℃に保存しておいたクラミジア・ニューモニエＹ
Ｋ４１感染凍結ＨＬ細胞浮遊液を融解し、テフロンホモ
ジナイザーでホモジナイズした。２，５００rpmで１０
分間遠心分離し、上清を回収した。沈殿は再びＳＰＧに
懸濁し、同様の操作を行い、上清を回収した。同様の操
作を更に２回行い、得られた上清は集めて合わせた。
【００３６】別途、遠心管に５０％（ｗ／ｖ）庶糖を含
む０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）、次い
で、ウログラフィン７６％（シェーリング社製）３容量
と０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）７容量と
の混合液を重層し、この上に先に回収した上清を注意深
く重層し、８，０００rpmで１時間遠心分離した。５０
％（ｗ／ｖ）庶糖を含む０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液
（pH７．４）層及び沈殿を回収し、この回収液に同容量
のＳＰＧを加え、１０，０００rpmで３０分間遠心分離
した。上清を捨て、沈殿をＳＰＧに懸濁した。遠心分離
管に、ウログラフィン７６％（シェーリング社製）と
０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）の３５％か
ら５０％（総量に対する前者の容量比）までの連続密度
勾配液を作製し、この上に懸濁液を重層し、８０００rp
mで１時間遠心分離した。クラミジア・ニューモニエ Ｙ
Ｋ４１の基本小体に相当するバンドを回収し、これをＳ
ＰＧで２倍に希釈し、１００００rpmで３０分間遠心分
離した。得られた沈殿をＳＰＧに懸濁し、タンパク質濃
度を測定（バイオラッド社のタンパク測定キットを用
い、牛血清アルブミンを標準とした）後、−７０℃で保
存した。
む０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）、次い
で、ウログラフィン７６％（シェーリング社製）３容量
と０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）７容量と
の混合液を重層し、この上に先に回収した上清を注意深
く重層し、８，０００rpmで１時間遠心分離した。５０
％（ｗ／ｖ）庶糖を含む０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液
（pH７．４）層及び沈殿を回収し、この回収液に同容量
のＳＰＧを加え、１０，０００rpmで３０分間遠心分離
した。上清を捨て、沈殿をＳＰＧに懸濁した。遠心分離
管に、ウログラフィン７６％（シェーリング社製）と
０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）の３５％か
ら５０％（総量に対する前者の容量比）までの連続密度
勾配液を作製し、この上に懸濁液を重層し、８０００rp
mで１時間遠心分離した。クラミジア・ニューモニエ Ｙ
Ｋ４１の基本小体に相当するバンドを回収し、これをＳ
ＰＧで２倍に希釈し、１００００rpmで３０分間遠心分
離した。得られた沈殿をＳＰＧに懸濁し、タンパク質濃
度を測定（バイオラッド社のタンパク測定キットを用
い、牛血清アルブミンを標準とした）後、−７０℃で保
存した。
【００３７】（Ｄ）クラミジア・ニューモニエＹＫ−４
１株のゲノムＤＮＡの調製 上記精製クラミジア・ニューモニエＹＫ−４１株の基本
小体の懸濁液３００μｌ（タンパク質濃度：１．３７mg
/ml）を４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分離した。
沈殿に１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩
衝液pH８．０（以下、ＴＥ緩衝液という）５００μｌを
加えて懸濁した。同様の遠心分離を再度行い、沈殿を３
００μｌのＴＥ緩衝液に懸濁した。１％ＳＤＳ水溶液３
０μｌ及び１mg/mlプロテイナーゼＫ水溶液３０μｌを
加え、５６℃で３０分間インキュベートし、基本小体を
溶解させた。０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）
飽和フェノール３５０μｌを加え、ボルテックスミキサ
ーでよく混合後、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心
分離し、水層を回収した（ＤＮＡの抽出）。この抽出操
作はもう一度繰り返した。１０mg/mlのＲＮａｓｅ溶液
を２μｌ加え、３７℃で２時間インキュベートし、ＲＮ
Ａを分解した。０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH８．
０）飽和フェノール、クロロホルム及びイソアミルアル
コールの２５：２４：１（容量比）の混合液（以下、Ｐ
ＣＩという）３００μｌを加え、ボルテックスミキサー
でよく混合し、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分
離し、水層を回収した。この操作を合計５回繰り返し
た。
１株のゲノムＤＮＡの調製 上記精製クラミジア・ニューモニエＹＫ−４１株の基本
小体の懸濁液３００μｌ（タンパク質濃度：１．３７mg
/ml）を４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分離した。
沈殿に１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩
衝液pH８．０（以下、ＴＥ緩衝液という）５００μｌを
加えて懸濁した。同様の遠心分離を再度行い、沈殿を３
００μｌのＴＥ緩衝液に懸濁した。１％ＳＤＳ水溶液３
０μｌ及び１mg/mlプロテイナーゼＫ水溶液３０μｌを
加え、５６℃で３０分間インキュベートし、基本小体を
溶解させた。０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）
飽和フェノール３５０μｌを加え、ボルテックスミキサ
ーでよく混合後、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心
分離し、水層を回収した（ＤＮＡの抽出）。この抽出操
作はもう一度繰り返した。１０mg/mlのＲＮａｓｅ溶液
を２μｌ加え、３７℃で２時間インキュベートし、ＲＮ
Ａを分解した。０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH８．
０）飽和フェノール、クロロホルム及びイソアミルアル
コールの２５：２４：１（容量比）の混合液（以下、Ｐ
ＣＩという）３００μｌを加え、ボルテックスミキサー
でよく混合し、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分
離し、水層を回収した。この操作を合計５回繰り返し
た。
【００３８】得られた液にその１／１０容の１０Ｍ酢酸
アンモニウム水溶液及び２容のエタノールを加え、５分
間放置し、ＤＮＡを析出させたのち、４℃、１２，００
０rpmで５分間遠心分離した。沈殿は７０％エタノール
水溶液６００μｌを加え、混合し、４℃、１２，０００
rpmで５分間遠心分離する洗浄を２回繰り返した。遠沈
管のふたを開けたまま１５分間放置して沈殿を乾燥さ
せ、これにＴＥ２００μｌを加えて溶かし、−２０℃に
保存した。
アンモニウム水溶液及び２容のエタノールを加え、５分
間放置し、ＤＮＡを析出させたのち、４℃、１２，００
０rpmで５分間遠心分離した。沈殿は７０％エタノール
水溶液６００μｌを加え、混合し、４℃、１２，０００
rpmで５分間遠心分離する洗浄を２回繰り返した。遠沈
管のふたを開けたまま１５分間放置して沈殿を乾燥さ
せ、これにＴＥ２００μｌを加えて溶かし、−２０℃に
保存した。
【００３９】（Ｅ）ゲノムＤＮＡ発現ライブラリーの作
製 ゲノムＤＮＡ溶液１００μｌに、制限酵素用M-buffer１
０μｌ、制限酵素混合液（ＡｃｃＩ、ＨａｅIII及び１
／５０希釈のＡｌｕＩ各０．４μｌとＴＥ２０μｌを混
合）１０μｌを加え、３７℃で２０分間反応させた。な
お、上記２０分の反応時間は、ＤＮＡが１ｋｂｐ〜７ｋ
ｂｐの大きさの部分消化ＤＮＡに分解される時間で、予
め少量のゲノムＤＮＡを用いて試験した。上記反応液に
ＰＣＩを１００μｌ加え、ボルテックスミキサーでよく
混ぜ、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分離し、水
層を回収した。これに３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液１０μ
ｌ及びエタノール２２０μｌを加え、−８０℃に１５分
間静置し、部分消化ＤＮＡを析出させた。４℃、１２，
０００rpmで５分間遠心分離し、上清液を捨てたのち、
沈殿に７０％エタノール水溶液５００μｌを加えて混
ぜ、再び、１２，０００rpmで５分間遠心分離した。上
清液を捨て、沈殿を減圧下に乾燥した。
製 ゲノムＤＮＡ溶液１００μｌに、制限酵素用M-buffer１
０μｌ、制限酵素混合液（ＡｃｃＩ、ＨａｅIII及び１
／５０希釈のＡｌｕＩ各０．４μｌとＴＥ２０μｌを混
合）１０μｌを加え、３７℃で２０分間反応させた。な
お、上記２０分の反応時間は、ＤＮＡが１ｋｂｐ〜７ｋ
ｂｐの大きさの部分消化ＤＮＡに分解される時間で、予
め少量のゲノムＤＮＡを用いて試験した。上記反応液に
ＰＣＩを１００μｌ加え、ボルテックスミキサーでよく
混ぜ、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分離し、水
層を回収した。これに３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液１０μ
ｌ及びエタノール２２０μｌを加え、−８０℃に１５分
間静置し、部分消化ＤＮＡを析出させた。４℃、１２，
０００rpmで５分間遠心分離し、上清液を捨てたのち、
沈殿に７０％エタノール水溶液５００μｌを加えて混
ぜ、再び、１２，０００rpmで５分間遠心分離した。上
清液を捨て、沈殿を減圧下に乾燥した。
【００４０】得られた部分消化ＤＮＡを精製水２０μｌ
に溶かし、その１９μｌをとり、これに下記化１で示す
リンカー（２０pmole/μl）１４μｌ、１０ｍＭ ＡＴ
Ｐ４．５μｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ2、５０ｍＭジチオ
スレイトール及び５００μg/ml牛血清アルブミン含有
０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．６、以下、１０倍
濃度ライゲーション用緩衝液という）４．５μｌ、精製
水２μｌ及びＴ４リガーゼ１μｌを加え、１６℃で４時
間反応させ、リンカーを付加させた。
に溶かし、その１９μｌをとり、これに下記化１で示す
リンカー（２０pmole/μl）１４μｌ、１０ｍＭ ＡＴ
Ｐ４．５μｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ2、５０ｍＭジチオ
スレイトール及び５００μg/ml牛血清アルブミン含有
０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．６、以下、１０倍
濃度ライゲーション用緩衝液という）４．５μｌ、精製
水２μｌ及びＴ４リガーゼ１μｌを加え、１６℃で４時
間反応させ、リンカーを付加させた。
【化１】
【００４１】リンカーを付加させた部分消化ＤＮＡを、
０．１Ｍ ＮａＣｌ及び１ｍＭ ＥＤＴＡ含有１０ｍＭト
リス−塩酸緩衝液を移動相とするChroma spin 6000カラ
ムにかけた。溶出液２滴ずつを分取し、各分画の一部を
０．８％アガロースゲル電気泳動で分析して、１ｋｂｐ
から７ｋｂｐのＤＮＡ断片を含む分画を回収した。得ら
れた分画１４４μｌに、精製水１３μｌ、１０ｍＭ Ａ
ＴＰ ２０μｌ、０．１Ｍ ＭｇＣｌ2、５０ｍＭジチオ
スレイトール、１ｍＭスペルミジン塩酸塩及び１ｍＭ
ＥＤＴＡ含有０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．６、
以下、１０倍濃度リン酸化反応用緩衝液という）２０μ
ｌ、及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ３μｌを加え、
３７℃で３０分間反応させ、ＤＮＡ断片の５′端をリン
酸化した。ＰＣＩ ２００μｌを加えてよく振り混ぜた
後、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分離し、水層
を回収した。２０mg/mlグリコーゲン水溶液１μｌ、３
Ｍ酢酸ナトリウム水溶液２０μｌ及びエタノール４００
μｌを加えてヌクレオチドを析出させた。４℃、１２，
０００rpmで１０分間遠心分離し、上清を捨て、沈殿に
７０％エタノール２００μｌを加え混ぜ、再び遠心分離
し、上清を捨て、沈殿を風乾し、精製水１μｌを加え溶
かした。
０．１Ｍ ＮａＣｌ及び１ｍＭ ＥＤＴＡ含有１０ｍＭト
リス−塩酸緩衝液を移動相とするChroma spin 6000カラ
ムにかけた。溶出液２滴ずつを分取し、各分画の一部を
０．８％アガロースゲル電気泳動で分析して、１ｋｂｐ
から７ｋｂｐのＤＮＡ断片を含む分画を回収した。得ら
れた分画１４４μｌに、精製水１３μｌ、１０ｍＭ Ａ
ＴＰ ２０μｌ、０．１Ｍ ＭｇＣｌ2、５０ｍＭジチオ
スレイトール、１ｍＭスペルミジン塩酸塩及び１ｍＭ
ＥＤＴＡ含有０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．６、
以下、１０倍濃度リン酸化反応用緩衝液という）２０μ
ｌ、及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ３μｌを加え、
３７℃で３０分間反応させ、ＤＮＡ断片の５′端をリン
酸化した。ＰＣＩ ２００μｌを加えてよく振り混ぜた
後、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分離し、水層
を回収した。２０mg/mlグリコーゲン水溶液１μｌ、３
Ｍ酢酸ナトリウム水溶液２０μｌ及びエタノール４００
μｌを加えてヌクレオチドを析出させた。４℃、１２，
０００rpmで１０分間遠心分離し、上清を捨て、沈殿に
７０％エタノール２００μｌを加え混ぜ、再び遠心分離
し、上清を捨て、沈殿を風乾し、精製水１μｌを加え溶
かした。
【００４２】この液０．６μｌに、予め制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで切断したλgt１１ ＤＮＡ（１μg/μl、ストラタ
ジーン（Stratagene）社）１μｌ、１０倍濃度ライゲー
ション用緩衝液０．５μl、１０ｍＭ ＡＴＰ０．５μ
ｌ、Ｔ４リガーゼ０．４μｌ及び精製水２μｌを加え、
４℃で一晩反応させた。次いで、ギガパック（Gigapac
k）II Goldパッケージングキット（ストラタジーン社）
を用い、得られた組換えλgt１１ＤＮＡをパッケージン
グした。
ＲＩで切断したλgt１１ ＤＮＡ（１μg/μl、ストラタ
ジーン（Stratagene）社）１μｌ、１０倍濃度ライゲー
ション用緩衝液０．５μl、１０ｍＭ ＡＴＰ０．５μ
ｌ、Ｔ４リガーゼ０．４μｌ及び精製水２μｌを加え、
４℃で一晩反応させた。次いで、ギガパック（Gigapac
k）II Goldパッケージングキット（ストラタジーン社）
を用い、得られた組換えλgt１１ＤＮＡをパッケージン
グした。
【００４３】（Ｆ）抗原ポリペプチドをコードするＤＮ
Ａのクローニング 大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株の一白金耳を１０ｍＭ ＭｇＳ
Ｏ4３ml、０．２％マルトース及び５０μg/mlアンピシ
リン含有のＬＢ（水１Ｌ中にＮａＣｌ ５ｇ、ポリペプ
トン１０ｇ及び酵母エキス５ｇを含む）培地に接種し、
３７℃で一晩振とう培養したのち、これを２，０００rp
mで１０分間遠心分離した。沈殿（大腸菌）に１０ｍＭ
ＭｇＳＯ4水溶液９mlを加えて混ぜ、この大腸菌懸濁液
の０．３５mlを採り、これにλgt１１（ＤＮＡライブラ
リー）懸濁液を０．１〜１０μｌ加え、３７℃で２０分
間インキューベートし、大腸菌にλgt１１を感染させ
た。予め４７℃に保温した液状ＬＢ寒天培地２．５ml
に、上記λgt１１感染大腸菌を加え、これを直ちにＬＢ
寒天培地上に撒いた。上層寒天培地が固化した後、４２
℃で３〜４時間培養し、プラークが観察された時点で１
０ｍＭ ＩＰＴＧ水溶液に浸漬したニトロセルロースフ
ィルター（φ８２mm）を上層寒天培地に乗せ、３７℃で
１２時間培養した。黒インクをつけた注射針で非対称に
３ヵ所突き刺してフィルターに目印をつけた後、フィル
ターを寒天培地からとり出し、１５０ｍＭＮａＣｌ及び
０．１％ツィーン２０含有２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（pH７．５）（以下、ＴＴＢＳ緩衝液という）で３回洗
浄した。寒天培地は冷蔵庫中に保存した。
Ａのクローニング 大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株の一白金耳を１０ｍＭ ＭｇＳ
Ｏ4３ml、０．２％マルトース及び５０μg/mlアンピシ
リン含有のＬＢ（水１Ｌ中にＮａＣｌ ５ｇ、ポリペプ
トン１０ｇ及び酵母エキス５ｇを含む）培地に接種し、
３７℃で一晩振とう培養したのち、これを２，０００rp
mで１０分間遠心分離した。沈殿（大腸菌）に１０ｍＭ
ＭｇＳＯ4水溶液９mlを加えて混ぜ、この大腸菌懸濁液
の０．３５mlを採り、これにλgt１１（ＤＮＡライブラ
リー）懸濁液を０．１〜１０μｌ加え、３７℃で２０分
間インキューベートし、大腸菌にλgt１１を感染させ
た。予め４７℃に保温した液状ＬＢ寒天培地２．５ml
に、上記λgt１１感染大腸菌を加え、これを直ちにＬＢ
寒天培地上に撒いた。上層寒天培地が固化した後、４２
℃で３〜４時間培養し、プラークが観察された時点で１
０ｍＭ ＩＰＴＧ水溶液に浸漬したニトロセルロースフ
ィルター（φ８２mm）を上層寒天培地に乗せ、３７℃で
１２時間培養した。黒インクをつけた注射針で非対称に
３ヵ所突き刺してフィルターに目印をつけた後、フィル
ターを寒天培地からとり出し、１５０ｍＭＮａＣｌ及び
０．１％ツィーン２０含有２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（pH７．５）（以下、ＴＴＢＳ緩衝液という）で３回洗
浄した。寒天培地は冷蔵庫中に保存した。
【００４４】フィルターを１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有２
０ｍＭトリス−塩酸緩衝液(pH７．５）（以下、ＴＢＳ
緩衝液という）の０．１％牛血清アルブミン含有液に浸
し、３７℃で１時間振とうし、ブロッキング反応を行っ
た。次いで、フィルターをＴＴＢＳ緩衝液で２回洗浄し
たのち、５〜１０μg/mlの抗クラミジア・ニューモニエ
モノクローナル抗体（６０Ａ２３）のＴＴＢＳ溶液に浸
し、３７℃、１時間振とうした。フィルターをＴＴＢＳ
緩衝液で３回洗浄した後、パーオキシダーゼ標識の（５
０ng/ml）抗マウスＩｇＧ抗体溶液（ＴＴＢＳ緩衝液）
中、３７℃で１時間振とうした。フィルターをＴＴＢＳ
緩衝液で３回、及びＴＢＳ緩衝液で３回洗浄した後、発
色基質液（ＴＢＳ緩衝液１００mlに３０％過酸化水素水
溶液６０μｌと０．３％ ４−クロロ−１−ナフトール
のメタノール溶液２０mlを加えて調製）に浸漬し、室温
で約３０分間放置した。十分発色した時点でフィルター
をとり出し、精製水で洗浄し、風乾した。
０ｍＭトリス−塩酸緩衝液(pH７．５）（以下、ＴＢＳ
緩衝液という）の０．１％牛血清アルブミン含有液に浸
し、３７℃で１時間振とうし、ブロッキング反応を行っ
た。次いで、フィルターをＴＴＢＳ緩衝液で２回洗浄し
たのち、５〜１０μg/mlの抗クラミジア・ニューモニエ
モノクローナル抗体（６０Ａ２３）のＴＴＢＳ溶液に浸
し、３７℃、１時間振とうした。フィルターをＴＴＢＳ
緩衝液で３回洗浄した後、パーオキシダーゼ標識の（５
０ng/ml）抗マウスＩｇＧ抗体溶液（ＴＴＢＳ緩衝液）
中、３７℃で１時間振とうした。フィルターをＴＴＢＳ
緩衝液で３回、及びＴＢＳ緩衝液で３回洗浄した後、発
色基質液（ＴＢＳ緩衝液１００mlに３０％過酸化水素水
溶液６０μｌと０．３％ ４−クロロ−１−ナフトール
のメタノール溶液２０mlを加えて調製）に浸漬し、室温
で約３０分間放置した。十分発色した時点でフィルター
をとり出し、精製水で洗浄し、風乾した。
【００４５】フィルターの発色スポットに対応する寒天
培地上のプラークを捜して同定し、この部分の寒天をパ
スツールピペットでつき刺し、プラークを回収した。回
収したプラークはクロロホルム１滴を加えた０．１Ｍ
ＮａＣｌ、８ｍＭ硫酸マグネシウム及び０．０１％ゼラ
チン含有５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）（以
下、ＳＭ緩衝液という）中に採り、４℃で一晩放置しプ
ラーク中のλファージを抽出した。プラークが全て上記
モノクローナル抗体と反応するようになるまで、前記操
作を繰り返し、抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡを
クローン化した。このようにして、抗クラミジア・ニュ
ーモニエモノクローナル抗体反応性のクラミジア・ニュ
ーモニエ抗原ポリペプチドを発現するλファージが得ら
れ、これを６０−２Ｓλファージと命名した。
培地上のプラークを捜して同定し、この部分の寒天をパ
スツールピペットでつき刺し、プラークを回収した。回
収したプラークはクロロホルム１滴を加えた０．１Ｍ
ＮａＣｌ、８ｍＭ硫酸マグネシウム及び０．０１％ゼラ
チン含有５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）（以
下、ＳＭ緩衝液という）中に採り、４℃で一晩放置しプ
ラーク中のλファージを抽出した。プラークが全て上記
モノクローナル抗体と反応するようになるまで、前記操
作を繰り返し、抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡを
クローン化した。このようにして、抗クラミジア・ニュ
ーモニエモノクローナル抗体反応性のクラミジア・ニュ
ーモニエ抗原ポリペプチドを発現するλファージが得ら
れ、これを６０−２Ｓλファージと命名した。
【００４６】（Ｇ）６０−２Ｓλファージの培養とＤＮ
Ａ精製 前記（Ｆ）で述べた方法と同様にしてプラークを形成さ
せ、一つのプラークを回収し、１００μｌのＳＭ緩衝液
に入れ、４℃で一晩放置しλファージを抽出した。ＬＢ
培養液で一晩培養した大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株２５０μ
ｌに、λファージ液５〜１０μｌを加え、３７℃で２０
分間放置し、大腸菌にλファージを感染させた。予め３
７℃に温めておいた１０ｍＭ硫酸マグネシウムを含むＬ
Ｂ培地５０ｍｌに接種し、λファージによる大腸菌の溶
菌が起こるまで３７℃で５〜７時間振とう培養した。２
５０μｌのクロロホルムを加え、３，０００rpmで１０
分間遠心分離し大腸菌細胞残渣を除き、λファージ懸濁
液を得た。λファージＤＮＡは、Wizard λ preps キッ
ト（プロメガ社）を用いて精製した。
Ａ精製 前記（Ｆ）で述べた方法と同様にしてプラークを形成さ
せ、一つのプラークを回収し、１００μｌのＳＭ緩衝液
に入れ、４℃で一晩放置しλファージを抽出した。ＬＢ
培養液で一晩培養した大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株２５０μ
ｌに、λファージ液５〜１０μｌを加え、３７℃で２０
分間放置し、大腸菌にλファージを感染させた。予め３
７℃に温めておいた１０ｍＭ硫酸マグネシウムを含むＬ
Ｂ培地５０ｍｌに接種し、λファージによる大腸菌の溶
菌が起こるまで３７℃で５〜７時間振とう培養した。２
５０μｌのクロロホルムを加え、３，０００rpmで１０
分間遠心分離し大腸菌細胞残渣を除き、λファージ懸濁
液を得た。λファージＤＮＡは、Wizard λ preps キッ
ト（プロメガ社）を用いて精製した。
【００４７】（Ｈ）クラミジア・ニューモニエ抗原ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡの増幅 ６００μｌ用のマイクロチューブに、精製水６１．５μ
ｌ、１０倍濃度 反応用緩衝液（５００ｍＭ ＫＣｌ、
１５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．０１％ゼラチンを含むトリ
ス−塩酸緩衝液ｐＨ８．３）１０μｌ、２０ｍＭ ｄＮ
ＴＰ １μｌ、５３−３ＳλファージＤＮＡ溶液０．１
μｌ、２０ｎＭ λgt１１ forward primer（宝酒造株
式会社）１μｌ、２０ｎＭ λgt１１ reverse primer
（宝酒造株式会社）１μｌ、AmpliTaq DNA Polymerase
０．５μｌを入れ、ミネラルオイルを２〜３滴重層し
た。９４℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７３℃ ２分の
サイクルのインキュベーションを３０回繰返し、ＤＮＡ
を増幅した。反応後、１．２％低温融解アガロースゲル
電気泳動を行い、増幅されたＤＮＡを切り出して Wizar
d PCR Prep キット（プロメガ社）で精製した。
ペプチドをコードするＤＮＡの増幅 ６００μｌ用のマイクロチューブに、精製水６１．５μ
ｌ、１０倍濃度 反応用緩衝液（５００ｍＭ ＫＣｌ、
１５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．０１％ゼラチンを含むトリ
ス−塩酸緩衝液ｐＨ８．３）１０μｌ、２０ｍＭ ｄＮ
ＴＰ １μｌ、５３−３ＳλファージＤＮＡ溶液０．１
μｌ、２０ｎＭ λgt１１ forward primer（宝酒造株
式会社）１μｌ、２０ｎＭ λgt１１ reverse primer
（宝酒造株式会社）１μｌ、AmpliTaq DNA Polymerase
０．５μｌを入れ、ミネラルオイルを２〜３滴重層し
た。９４℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７３℃ ２分の
サイクルのインキュベーションを３０回繰返し、ＤＮＡ
を増幅した。反応後、１．２％低温融解アガロースゲル
電気泳動を行い、増幅されたＤＮＡを切り出して Wizar
d PCR Prep キット（プロメガ社）で精製した。
【００４８】（Ｉ）ＤＮＡ塩基配列分析 ＤＮＡ塩基配列分析は、ＰＣＲで増幅したＤＮＡを鋳型
として、Taq DNA ポリメラーゼを用いた蛍光標識ターミ
ネータサイクルシークエンス法でシークエンス反応を行
い、３７３Ａ型ＤＮＡシークエンサ（アプライドバイオ
システムズ社）で分析を行った。得られたＤＮＡ塩基配
列を遺伝子配列分析ソフト「ＤＮＡＳＩＳ」（日立ソフ
トウェアエンジニアリング社）を用いて、編集、連結、
アミノ酸翻訳領域の推定を行なった。
として、Taq DNA ポリメラーゼを用いた蛍光標識ターミ
ネータサイクルシークエンス法でシークエンス反応を行
い、３７３Ａ型ＤＮＡシークエンサ（アプライドバイオ
システムズ社）で分析を行った。得られたＤＮＡ塩基配
列を遺伝子配列分析ソフト「ＤＮＡＳＩＳ」（日立ソフ
トウェアエンジニアリング社）を用いて、編集、連結、
アミノ酸翻訳領域の推定を行なった。
【００４９】実施例２ ＤＨＦＲとクラミジア・ニュー
モニエの抗原ポリペプチドの一部を含むポリペプチドの
融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む組換えベクタ
ーの作製、及びそれを含む形質転換体の作製 プラスミドｐＢＢＫ１０ＭＭを制限酵素ＢａｍＨＩとＸ
ｈｏＩで切断し、１．２％低温融解アガロースゲル電気
泳動を行い、約４．６ＫｂｐのＤＮＡ断片を切り出して
精製した。これに、配列番号６及び配列番号７のＤＮＡ
断片を添加し、プラスミドｐＡＤＡ４３１を構築した。
一方、６０−２ＳλファージＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉで切断し、これに、プラスミドｐＡＤＡ４３１の制限
酵素ＭｕｎＩ消化物を添加し、ライゲーションして、組
換えプラスミドベクターをｐＣＰＮ６０２３を構築し
た。このプラスミドベクターは、ＤＨＦＲのＣ末端に介
在配列を介してクラミジア・ニューモニエの６０ＫＤａ
抗原ポリペプチド（熱ショックタンパク質）の一部を含
むポリペプチドを連結した融合タンパク質を発現させる
ものである。この融合タンパク質の推定アミノ酸配列は
を配列番号４のようになっていた。
モニエの抗原ポリペプチドの一部を含むポリペプチドの
融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む組換えベクタ
ーの作製、及びそれを含む形質転換体の作製 プラスミドｐＢＢＫ１０ＭＭを制限酵素ＢａｍＨＩとＸ
ｈｏＩで切断し、１．２％低温融解アガロースゲル電気
泳動を行い、約４．６ＫｂｐのＤＮＡ断片を切り出して
精製した。これに、配列番号６及び配列番号７のＤＮＡ
断片を添加し、プラスミドｐＡＤＡ４３１を構築した。
一方、６０−２ＳλファージＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉで切断し、これに、プラスミドｐＡＤＡ４３１の制限
酵素ＭｕｎＩ消化物を添加し、ライゲーションして、組
換えプラスミドベクターをｐＣＰＮ６０２３を構築し
た。このプラスミドベクターは、ＤＨＦＲのＣ末端に介
在配列を介してクラミジア・ニューモニエの６０ＫＤａ
抗原ポリペプチド（熱ショックタンパク質）の一部を含
むポリペプチドを連結した融合タンパク質を発現させる
ものである。この融合タンパク質の推定アミノ酸配列は
を配列番号４のようになっていた。
【００５０】実施例３ ＤＨＦＲとクラミジア・ニュー
モニエの５３ＫＤａ抗原ポリペプチドの一部を含むポリ
ペプチドの融合タンパク質の確認 プラスミドｐＣＰＮ６０２３を保持する大腸菌ＨＢ１０
１株１白金耳を５０mg/lのアンピシリンを含むＬＢ培地
３mlに接種し、３７℃で一晩振とう培養した。この大腸
菌を含む培地１０μｌに１０μｌのローディング緩衝液
（０．０１％ブロモフェノールブルー、１０％メルカプ
トエタノール、２０％グリセロール、５％ＳＤＳを含む
０．１５６Ｍトリス塩酸緩衝液、pH６．８）を加え、８
０℃で５分間加熱した後、反応液を５−２０％ポリアク
リルアミドグラジエントゲル電気泳動にかけた。セミド
ライブロッティング装置の陽極板上に、１０％メタノー
ル、０．０５％ドデシル硫酸ナトリウムを含む０．３Ｍ
トリス水溶液で湿らせたろ紙１枚、１０％メタノール、
０．０５％ドデシル硫酸ナトリウムを含む２５ｍＭトリ
ス水溶液で湿らせたろ紙１枚、１０％メタノール、０．
０５％ドデシル硫酸ナトリウム、４０ｍＭアミノカプロ
ン酸を含む２５ｍＭトリス水溶液で湿らせたニトロセル
ロース膜１枚、上記電気泳動の終了したポリアクリルア
ミドゲル、４０ｍＭアミノカプロン酸を含む２５ｍＭト
リス水溶液で湿らせたろ紙２枚をこの順序で重ね、陰極
板をセットして２．５mA/cm2の電流密度で1時間電流を
流し、ポリアクリルアミドゲル中のタンパク質をニトロ
セルロース膜に転写した。このニトロセルロース膜を
０．１％牛血清アルブミンを含むＴＢＳ緩衝液に入れ、
室温で１時間以上放置し、ブロッキングした。ニトロセ
ルロース膜をＴＴＢＳ緩衝液で２回洗浄した後、ハイブ
リドーマ６０Ａ２３が生産するモノクローナル抗体溶液
（５〜１０μg/ml ＴＴＢＳ緩衝液中）中で３７℃、１
時間振とうした。ニトロセルロース膜をＴＴＢＳ緩衝液
で３回洗浄した後、パーオキシダーゼ標識した抗マウス
ＩｇＧ抗体溶液（５０ng/ml ＴＴＢＳ緩衝液中）中で
３７℃１時間振とうした。ニトロセルロース膜をＴＴＢ
Ｓ緩衝液で３回洗浄した後、発色基質液（１００mlのTB
S緩衝液に６０μｌの３０％過酸化水素水溶液と２０ｍ
ｌの４−クロロ−１−ナフトール メタノール溶液を混
合する）に入れ、室温で３０分間反応させた。ニトロセ
ルロース膜を取り出し、精製水で洗浄した後風乾した。
この結果、融合タンパク質の大きさに相当する位置に発
色したバンドが観察され、プラスミドｐＣＰＮ６０２３
をもつ大腸菌が、クラミジア・ニューモニエに反応する
モノクローナル抗体と反応することのできる６０ＫＤａ
抗原を発現していることが示された。
モニエの５３ＫＤａ抗原ポリペプチドの一部を含むポリ
ペプチドの融合タンパク質の確認 プラスミドｐＣＰＮ６０２３を保持する大腸菌ＨＢ１０
１株１白金耳を５０mg/lのアンピシリンを含むＬＢ培地
３mlに接種し、３７℃で一晩振とう培養した。この大腸
菌を含む培地１０μｌに１０μｌのローディング緩衝液
（０．０１％ブロモフェノールブルー、１０％メルカプ
トエタノール、２０％グリセロール、５％ＳＤＳを含む
０．１５６Ｍトリス塩酸緩衝液、pH６．８）を加え、８
０℃で５分間加熱した後、反応液を５−２０％ポリアク
リルアミドグラジエントゲル電気泳動にかけた。セミド
ライブロッティング装置の陽極板上に、１０％メタノー
ル、０．０５％ドデシル硫酸ナトリウムを含む０．３Ｍ
トリス水溶液で湿らせたろ紙１枚、１０％メタノール、
０．０５％ドデシル硫酸ナトリウムを含む２５ｍＭトリ
ス水溶液で湿らせたろ紙１枚、１０％メタノール、０．
０５％ドデシル硫酸ナトリウム、４０ｍＭアミノカプロ
ン酸を含む２５ｍＭトリス水溶液で湿らせたニトロセル
ロース膜１枚、上記電気泳動の終了したポリアクリルア
ミドゲル、４０ｍＭアミノカプロン酸を含む２５ｍＭト
リス水溶液で湿らせたろ紙２枚をこの順序で重ね、陰極
板をセットして２．５mA/cm2の電流密度で1時間電流を
流し、ポリアクリルアミドゲル中のタンパク質をニトロ
セルロース膜に転写した。このニトロセルロース膜を
０．１％牛血清アルブミンを含むＴＢＳ緩衝液に入れ、
室温で１時間以上放置し、ブロッキングした。ニトロセ
ルロース膜をＴＴＢＳ緩衝液で２回洗浄した後、ハイブ
リドーマ６０Ａ２３が生産するモノクローナル抗体溶液
（５〜１０μg/ml ＴＴＢＳ緩衝液中）中で３７℃、１
時間振とうした。ニトロセルロース膜をＴＴＢＳ緩衝液
で３回洗浄した後、パーオキシダーゼ標識した抗マウス
ＩｇＧ抗体溶液（５０ng/ml ＴＴＢＳ緩衝液中）中で
３７℃１時間振とうした。ニトロセルロース膜をＴＴＢ
Ｓ緩衝液で３回洗浄した後、発色基質液（１００mlのTB
S緩衝液に６０μｌの３０％過酸化水素水溶液と２０ｍ
ｌの４−クロロ−１−ナフトール メタノール溶液を混
合する）に入れ、室温で３０分間反応させた。ニトロセ
ルロース膜を取り出し、精製水で洗浄した後風乾した。
この結果、融合タンパク質の大きさに相当する位置に発
色したバンドが観察され、プラスミドｐＣＰＮ６０２３
をもつ大腸菌が、クラミジア・ニューモニエに反応する
モノクローナル抗体と反応することのできる６０ＫＤａ
抗原を発現していることが示された。
【００５１】実施例４ クラミジア・ニューモニエの６
０ＫＤａ抗原ポリペプチド全体をコードするＤＮＡの取
得 プラスミドｐＣＰＮ６０２３と前述のλgt１１のＤＮＡ
ライブラリーを用いてゲノムウォーキングを行い、クラ
ミジア・ニューモニエの６０ＫＤａ抗原ポリペプチド全
体をコードするＤＮＡを取得する。このＤＮＡにコード
されているアミノ酸配列は配列刃番号２のようになって
いる。
０ＫＤａ抗原ポリペプチド全体をコードするＤＮＡの取
得 プラスミドｐＣＰＮ６０２３と前述のλgt１１のＤＮＡ
ライブラリーを用いてゲノムウォーキングを行い、クラ
ミジア・ニューモニエの６０ＫＤａ抗原ポリペプチド全
体をコードするＤＮＡを取得する。このＤＮＡにコード
されているアミノ酸配列は配列刃番号２のようになって
いる。
【００５２】実施例５ ＤＨＦＲとクラミジア・ニュー
モニエの６０ＫＤａ抗原ポリペプチド全体の融合タンパ
ク質をコードするＤＮＡを含む組換えベクターの作製、
及びそれを含む形質転換体の作製 プラスミドｐＢＢＫ１０ＭＭと前記クラミジア・ニュー
モニエの６０ＫＤａ抗原ポリペプチド全体をコードする
ＤＮＡを用い、実施例２と同様にしてＤＨＦＲとクラミ
ジア・ニューモニエの６０ＫＤａ抗原ポリペプチド全体
の融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む組換えベク
ターとそれを含む形質転換体を作製する。この融合タン
パク質のアミノ酸配列はを配列番号３のようになってい
る。
モニエの６０ＫＤａ抗原ポリペプチド全体の融合タンパ
ク質をコードするＤＮＡを含む組換えベクターの作製、
及びそれを含む形質転換体の作製 プラスミドｐＢＢＫ１０ＭＭと前記クラミジア・ニュー
モニエの６０ＫＤａ抗原ポリペプチド全体をコードする
ＤＮＡを用い、実施例２と同様にしてＤＨＦＲとクラミ
ジア・ニューモニエの６０ＫＤａ抗原ポリペプチド全体
の融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む組換えベク
ターとそれを含む形質転換体を作製する。この融合タン
パク質のアミノ酸配列はを配列番号３のようになってい
る。
【００５３】実施例６ 融合タンパク質を抗原として用
いる抗クラミジア・ニューモニエ抗体の検出・測定 融合タンパク質として、配列番号３のアミノ酸配列から
なるポリペプチドを用い、これをマイクロタイタープレ
ートに固定し、牛血清アルブミンを含むＰＢＳを加え、
４℃で一晩以上放置し、ブロッキングを行なう。牛血清
アルブミンを含むＰＢＳを除いた後、０．０２％（ｗ／
ｖ）ツィーン２０を含むＰＢＳで同様に２回洗浄後、ウ
ェルに患者の血清を加え、室温で２時間放置する。０．
０２％（ｗ／ｖ）ツィーン２０を含むＰＢＳで同様に３
回洗浄後、ウェルにパーオキシダーゼ標識化マウス抗ヒ
トＩｇＧ抗体を加え、室温で２時間放置する。０．０２
％（ｗ／ｖ）ツィーン２０を含むＰＢＳで同様に３回洗
浄後、ウェルにＡＢＴＳ溶液（ＫＰＬ社製）を加え、室
温で１５分〜１時間放置して発色反応させ、９６ウエル
ＥＩＡプレート用光度計で４０５nmの吸光度を測定す
る。
いる抗クラミジア・ニューモニエ抗体の検出・測定 融合タンパク質として、配列番号３のアミノ酸配列から
なるポリペプチドを用い、これをマイクロタイタープレ
ートに固定し、牛血清アルブミンを含むＰＢＳを加え、
４℃で一晩以上放置し、ブロッキングを行なう。牛血清
アルブミンを含むＰＢＳを除いた後、０．０２％（ｗ／
ｖ）ツィーン２０を含むＰＢＳで同様に２回洗浄後、ウ
ェルに患者の血清を加え、室温で２時間放置する。０．
０２％（ｗ／ｖ）ツィーン２０を含むＰＢＳで同様に３
回洗浄後、ウェルにパーオキシダーゼ標識化マウス抗ヒ
トＩｇＧ抗体を加え、室温で２時間放置する。０．０２
％（ｗ／ｖ）ツィーン２０を含むＰＢＳで同様に３回洗
浄後、ウェルにＡＢＴＳ溶液（ＫＰＬ社製）を加え、室
温で１５分〜１時間放置して発色反応させ、９６ウエル
ＥＩＡプレート用光度計で４０５nmの吸光度を測定す
る。
【００５４】
【発明の効果】請求項１記載の検出・測定方法は、クラ
ミジア・ニューモニエの抗体検査やクラミジア・ニュー
モニエ感染の診断に好適である。請求項２記載の検出・
測定方法は、請求項１記載の検出・測定方法の効果を奏
し、さらに、抗原として用いられる融合タンパク質のア
ミノ酸配列の長さが短いため、担体等に固定化できる抗
原ホリペプチドの数を多くすることができ、高感度であ
る。請求項３記載の検出・測定方法は、請求項１記載の
検出・測定方法の効果を奏し、さらに、抗原として用い
られる融合タンパク質がタンパク質分解酵素による分解
を受けにくい構造をつくることができるので安定性に優
れており、検出・測定結果の信頼性が高い。請求項４記
載の検出・測定方法は、請求項１記載の検出・測定方法
の効果を奏し、さらに、抗原として用いられる融合タン
パク質が抗原ポリペプチド全体を有するので、クラミジ
ア・ニューモニエの抗体検査やクラミジア・ニューモニ
エの感染の正確な診断に極めて適切である。請求項５記
載の検出・測定方法は、請求項１記載の検出・測定方法
の効果を奏し、さらに、抗原として用いられる融合タン
パク質が抗原ポリペプチドの抗原部分を有するので、ク
ラミジア・ニューモニエの抗体検査やクラミジア・ニュ
ーモニエの感染の正確な診断に極めて適切である。請求
項６記載の検出・測定用試薬は、クラミジア・ニューモ
ニエの抗体検査やクラミジア・ニューモニエ感染の診断
に好適である。請求項７記載の検出・測定用試薬は、請
求項６記載の検出・測定用試薬の効果を奏し、さらに、
抗原として用いられる融合タンパク質のアミノ酸配列の
長さが短いため、担体等に固定化できる抗原ポリペプチ
ドの数を多くすることができ、高感度である。請求項８
記載の検出・測定用試薬は、請求項６記載の検出・測定
用試薬の効果を奏し、さらに、抗原として用いられる融
合タンパク質がタンパク質分解酵素による分解を受けに
くい構造を作ることができるので安定性に優れており、
検出・測定結果の信頼性が高い。請求項９記載の検出・
測定用試薬は、請求項６記載の検出・測定用試薬の効果
を奏し、さらに、抗原として用いられる融合タンパク質
が抗原ポリペプチド全体を有するので、クラミジア・ニ
ューモニエの抗体検査やクラミジア・ニューモニエの感
染の正確な診断に極めて適切である。請求項１０記載の
検出・測定用試薬は、請求項６記載の検出・測定用試薬
の効果を奏し、さらに、抗原として用いられる融合タン
パク質が抗原ポリペプチドの抗原部分を有するので、ク
ラミジア・ニューモニエの抗体検査やクラミジア・ニュ
ーモニエの感染の正確な診断に極めて適切である。請求
項１１記載の診断薬は、クラミジア・ニューモニエ感染
の診断に好適である。請求項１２記載の診断薬は、請求
項１１記載の診断薬の効果を奏し、さらに、抗原として
用いられる融合タンパク質のアミノ酸配列の長さが短い
ため、担体等に固定化できる抗原ポリペプチドの数を多
くすることができ、高感度である。請求項１３記載の診
断薬は、請求項１１記載の診断薬の効果を奏し、さら
に、抗原として用いられる融合タンパク質がタンパク質
分解酵素による分解を受けにくい構造を作ることができ
るので安定性に優れており、検出・測定結果の信頼性が
高い。請求項１４記載の診断薬は、請求項１１記載の診
断薬の効果を奏し、さらに、抗原として用いられる融合
タンパク質が抗原ポリペプチド全体を有するので、クラ
ミジア・ニューモニエの抗体検査やクラミジア・ニュー
モニエの感染の正確な診断に極めて適切である。請求項
１５記載の診断薬は、請求項１１記載の診断薬の効果を
奏し、さらに、抗原として用いられる融合タンパク質が
抗原ポリペプチドの抗原部分を有するので、クラミジア
・ニューモニエの抗体検査やクラミジア・ニューモニエ
の感染の正確な診断に極めて適切である。
ミジア・ニューモニエの抗体検査やクラミジア・ニュー
モニエ感染の診断に好適である。請求項２記載の検出・
測定方法は、請求項１記載の検出・測定方法の効果を奏
し、さらに、抗原として用いられる融合タンパク質のア
ミノ酸配列の長さが短いため、担体等に固定化できる抗
原ホリペプチドの数を多くすることができ、高感度であ
る。請求項３記載の検出・測定方法は、請求項１記載の
検出・測定方法の効果を奏し、さらに、抗原として用い
られる融合タンパク質がタンパク質分解酵素による分解
を受けにくい構造をつくることができるので安定性に優
れており、検出・測定結果の信頼性が高い。請求項４記
載の検出・測定方法は、請求項１記載の検出・測定方法
の効果を奏し、さらに、抗原として用いられる融合タン
パク質が抗原ポリペプチド全体を有するので、クラミジ
ア・ニューモニエの抗体検査やクラミジア・ニューモニ
エの感染の正確な診断に極めて適切である。請求項５記
載の検出・測定方法は、請求項１記載の検出・測定方法
の効果を奏し、さらに、抗原として用いられる融合タン
パク質が抗原ポリペプチドの抗原部分を有するので、ク
ラミジア・ニューモニエの抗体検査やクラミジア・ニュ
ーモニエの感染の正確な診断に極めて適切である。請求
項６記載の検出・測定用試薬は、クラミジア・ニューモ
ニエの抗体検査やクラミジア・ニューモニエ感染の診断
に好適である。請求項７記載の検出・測定用試薬は、請
求項６記載の検出・測定用試薬の効果を奏し、さらに、
抗原として用いられる融合タンパク質のアミノ酸配列の
長さが短いため、担体等に固定化できる抗原ポリペプチ
ドの数を多くすることができ、高感度である。請求項８
記載の検出・測定用試薬は、請求項６記載の検出・測定
用試薬の効果を奏し、さらに、抗原として用いられる融
合タンパク質がタンパク質分解酵素による分解を受けに
くい構造を作ることができるので安定性に優れており、
検出・測定結果の信頼性が高い。請求項９記載の検出・
測定用試薬は、請求項６記載の検出・測定用試薬の効果
を奏し、さらに、抗原として用いられる融合タンパク質
が抗原ポリペプチド全体を有するので、クラミジア・ニ
ューモニエの抗体検査やクラミジア・ニューモニエの感
染の正確な診断に極めて適切である。請求項１０記載の
検出・測定用試薬は、請求項６記載の検出・測定用試薬
の効果を奏し、さらに、抗原として用いられる融合タン
パク質が抗原ポリペプチドの抗原部分を有するので、ク
ラミジア・ニューモニエの抗体検査やクラミジア・ニュ
ーモニエの感染の正確な診断に極めて適切である。請求
項１１記載の診断薬は、クラミジア・ニューモニエ感染
の診断に好適である。請求項１２記載の診断薬は、請求
項１１記載の診断薬の効果を奏し、さらに、抗原として
用いられる融合タンパク質のアミノ酸配列の長さが短い
ため、担体等に固定化できる抗原ポリペプチドの数を多
くすることができ、高感度である。請求項１３記載の診
断薬は、請求項１１記載の診断薬の効果を奏し、さら
に、抗原として用いられる融合タンパク質がタンパク質
分解酵素による分解を受けにくい構造を作ることができ
るので安定性に優れており、検出・測定結果の信頼性が
高い。請求項１４記載の診断薬は、請求項１１記載の診
断薬の効果を奏し、さらに、抗原として用いられる融合
タンパク質が抗原ポリペプチド全体を有するので、クラ
ミジア・ニューモニエの抗体検査やクラミジア・ニュー
モニエの感染の正確な診断に極めて適切である。請求項
１５記載の診断薬は、請求項１１記載の診断薬の効果を
奏し、さらに、抗原として用いられる融合タンパク質が
抗原ポリペプチドの抗原部分を有するので、クラミジア
・ニューモニエの抗体検査やクラミジア・ニューモニエ
の感染の正確な診断に極めて適切である。
【００５５】
配列番号：1 配列の長さ：160 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 Met Ile Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ala Val Asp Arg Val Ile Gly Met 1 5 10 15 Glu Asn Ala Met Pro Trp Asn Leu Pro Ala Asp Leu Ala Trp Phe Lys 20 25 30 Arg Asn Thr Leu Asn Lys Pro Val Ile Met Gly Arg His Thr Trp Glu 35 40 45 Ser Ile Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn Ile Ile Leu Ser Ser 50 55 60 Gln Pro Gly Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys Ser Val Asp Glu 65 70 75 80 Ala Ile Ala Ala Cys Gly Asp Val Pro Glu Ile Met Val Ile Gly Gly 85 90 95 Gly Arg Val Tyr Glu Gln Phe Leu Pro Lys Ala Gln Lys Leu Tyr Leu 100 105 110 Thr His Ile Asp Ala Glu Val Glu Gly Asp Thr His Phe Pro Asp Tyr 115 120 125 Glu Pro Asp Asp Trp Glu Ser Val Phe Ser Glu Phe His Asp Ala Asp 130 135 140 Ala Gln Asn Ser His Ser Tyr Glu Phe Glu Ile Leu Glu Arg Arg Ile 145 150 155 160
【００５６】配列番号：2 配列の長さ：544 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 Met Ala Ala Lys Asn Ile Lys Tyr Asn Glu Glu Ala Arg Lys Lys Ile 1 5 10 15 His Lys Gly Val Lys Thr Leu Ala Gle Ala Val Lys Val Thr Leu Gly 20 25 30 Pro Lys Gly Arg His Val Val Ile Asp Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gln 35 40 45 Val Thr Lys Asp Gly Val Thr Val Ala Lys Glu Ile Glu Leu Glu Asp 50 55 60 Lys His Glu Asn Met Gly Ala Gln Met Val Lys Glu Val Ala Ser Lys 65 70 75 80 Thr Ala Asp Lys Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala 85 90 95 Glu Ala Ile Tyr Ser Glu Gly Leu Arg Asn Val Thr Ala Gly Ala Asn 100 105 110 Pro Met Asp Leu Lys Arg Gly Ile Asp Lys Ala Val Lys Val Val Val 115 120 125 Asp Glu Leu Lys Lys Ile Ser Lys Pro Val Gln His His Lys Glu Ile 130 135 140 Ala Gln Val Ala Thr Ile Ser Ala Asn Asn Asp Ser Glu Ile Gly Asn 145 150 155 160 Leu Ile Ala Glu Ala Met Glu Lys Val Gly Lys Asn Gly Ser Ile Thr 165 170 175 Val Glu Glu Ala Lys Gly Phe Glu Thr Val Leu Asp Val Val Glu Gly 180 185 190 Met Asn Phe Asn Arg Gly Tyr Leu Ser Ser Tyr Phe Ser Thr Asn Pro 195 200 205 Glu Thr Gln Glu Cys Val Leu Glu Asp Ala Leu Ile Leu Ile Tyr Asp 210 215 220 Lys Lys Ile Ser Gly Ile Lys Asp Phe Leu Pro Val Leu Gln Gln Val 225 230 235 240 Ala Glu Ser Gly Arg Pro Leu Leu Ile Ile Ala Glu Glu Ile Glu Gly 245 250 255 Glu Ala Leu Ala Thr Leu Val Val Asn Arg Leu Arg Ala Gly Phe Arg 260 265 270 Val Cys Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg Lys Ala Met 275 280 285 Leu Glu Asp Ile Ala Ile Leu Thr Gly Gly Gln Leu Val Ser Glu Glu 290 295 300 Leu Gly Met Lys Leu Glu Asn Thr Thr Leu Ala Met Leu Gly Lys Ala 305 310 315 320 Lys Lys Val Ile Val Thr Lys Glu Asp Thr Thr Ile Val Glu Gly Leu 325 330 335 Gly Asn Lys Pro Asp Ile Gln Ala Arg Cys Asp Asn Ile Lys Lys Gln 340 345 350 Ile Glu Asp Ser Thr Ser Asp Tyr Asp Lys Glu Lys Leu Gln Glu Arg 355 360 365 Leu Ala Lys Leu Ser Gly Gly Val Ala Val Ile Arg Val Gly Ala Ala 370 375 380 Thr Glu Ile Glu Met Lys Glu Lys Lys Asp Arg val Asp Asp Ala Gln 385 390 395 400 His Ala Thr Ile Ala Ala Val Glu Glu Gly Ile Leu Pro Gly Gly Gly 405 410 415 Thr Ala Leu Val Arg Cys Ile Pro Thr Leu Glu Ala Phe Leu Pro Met 420 425 430 Leu Ala Asn Glu Asp Glu Ala Ile Gly Thr Arg Ile Ile Leu Lys Ala 435 440 445 Leu Thr Ala Pro Leu Lys Gln Ile Ala Ser Asn Ala Gly Lys Glu Gly 450 455 460 Ala Ile Ile Cys Gln Gln Val leu Ala Arg Ser Ala Asn Glu Gly Tyr 465 470 475 480 Asp Ala Leu Arg Asp Ala Tyr Thr Asp Met Ile Asp Ala Gly Ile Leu 485 490 495 Asp Pro Thr Lys Val Thr Arg Ser Ala Leu Glu Ser Ala Arg Ser Ile 500 505 510 Ala Gly Leu Leu Leu Thr Thr Glu Ala Leu Ile Ala Asp Ile Pro Glu 515 520 525 Glu Lys Ser Ser Ser Ala Pro Ala Met Pro Ser Ala Gly Met Asp Tyr 530 535 540 544
【００５７】配列番号：3 配列の長さ：704 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 Met Ile Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ala Val Asp Arg Val Ile Gly Met 1 5 10 15 Glu Asn Ala Met Pro Trp Asn Leu Pro Ala Asp Leu Ala Trp Phe Lys 20 25 30 Arg Asn Thr Leu Asn Lys Pro Val Ile Met Gly Arg His Thr Trp Glu 35 40 45 Ser Ile Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn Ile Ile Leu Ser Ser 50 55 60 Gln Pro Gly Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys Ser Val Asp Glu 65 70 75 80 Ala Ile Ala Ala Cys Gly Asp Val Pro Glu Ile Met Val Ile Gly Gly 85 90 95 Gly Arg Val Tyr Glu Gln Phe Leu Pro Lys Ala Gln Lys Leu Tyr Leu 100 105 110 Thr His Ile Asp Ala Glu Val Glu Gly Asp Thr His Phe Pro Asp Tyr 115 120 125 Glu Pro Asp Asp Trp Glu Ser Val Phe Ser Glu Phe His Asp Ala Asp 130 135 140 Ala Gln Asn Ser His Ser Tyr Glu Phe Glu Ile Leu Glu Arg Arg Ile 145 150 155 160 Met Ala Ala Lys Asn Ile Lys Tyr Asn Glu Glu Ala Arg Lys Lys Ile 165 170 175 His Lys Gly Val Lys Thr Leu Ala Gle Ala Val Lys Val Thr Leu Gly 180 185 190 Pro Lys Gly Arg His Val Val Ile Asp Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gln 195 200 205 Val Thr Lys Asp Gly Val Thr Val Ala Lys Glu Ile Glu Leu Glu Asp 210 215 220 Lys His Glu Asn Met Gly Ala Gln Met Val Lys Glu Val Ala Ser Lys 225 230 235 240 Thr Ala Asp Lys Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala 245 250 255 Glu Ala Ile Tyr Ser Glu Gly Leu Arg Asn Val Thr Ala Gly Ala Asn 260 265 270 Pro Met Asp Leu Lys Arg Gly Ile Asp Lys Ala Val Lys Val Val Val 275 280 285 Asp Glu Leu Lys Lys Ile Ser Lys Pro Val Gln His His Lys Glu Ile 290 295 300 Ala Gln Val Ala Thr Ile Ser Ala Asn Asn Asp Ser Glu Ile Gly Asn 305 310 315 320 Leu Ile Ala Glu Ala Met Glu Lys Val Gly Lys Asn Gly Ser Ile Thr 325 330 335 Val Glu Glu Ala Lys Gly Phe Glu Thr Val Leu Asp Val Val Glu Gly 340 345 350 Met Asn Phe Asn Arg Gly Tyr Leu Ser Ser Tyr Phe Ser Thr Asn Pro 355 360 365 Glu Thr Gln Glu Cys Val Leu Glu Asp Ala Leu Ile Leu Ile Tyr Asp 370 375 380 Lys Lys Ile Ser Gly Ile Lys Asp Phe Leu Pro Val Leu Gln Gln Val 385 390 395 400 Ala Glu Ser Gly Arg Pro Leu Leu Ile Ile Ala Glu Glu Ile Glu Gly 405 410 415 Glu Ala Leu Ala Thr Leu Val Val Asn Arg Leu Arg Ala Gly Phe Arg 420 425 430 Val Cys Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg Lys Ala Met 435 440 445 Leu Glu Asp Ile Ala Ile Leu Thr Gly Gly Gln Leu Val Ser Glu Glu 450 455 460 Leu Gly Met Lys Leu Glu Asn Thr Thr Leu Ala Met Leu Gly Lys Ala 465 470 475 480 Lys Lys Val Ile Val Thr Lys Glu Asp Thr Thr Ile Val Glu Gly Leu 485 490 495 Gly Asn Lys Pro Asp Ile Gln Ala Arg Cys Asp Asn Ile Lys Lys Gln 500 505 510 Ile Glu Asp Ser Thr Ser Asp Tyr Asp Lys Glu Lys Leu Gln Glu Arg 515 520 525 Leu Ala Lys Leu Ser Gly Gly Val Ala Val Ile Arg Val Gly Ala Ala 530 535 540 Thr Glu Ile Glu Met Lys Glu Lys Lys Asp Arg Val Asp Asp Ala Gln 545 550 555 560 His Ala Thr Ile Ala Ala Val Glu Glu Gly Ile Leu Pro Gly Gly Gly 565 570 575 Thr Ala Leu Val Arg Cys Ile Pro Thr Leu Glu Ala Phe Leu Pro Met 580 585 590 Leu Ala Asn Glu Asp Glu Ala Ile Gly Thr Arg Ile Ile Leu Lys Ala 595 600 605 Leu Thr Ala Pro Leu Lys Gln Ile Ala Ser Asn Ala Gly Lys Glu Gly 610 615 620 Ala Ile Ile Cys Gln Gln Val leu Ala Arg Ser Ala Asn Glu Gly Tyr 625 630 635 640 Asp Ala Leu Arg Asp Ala Tyr Thr Asp Met Ile Asp Ala Gly Ile Leu 645 650 655 Asp Pro Thr Lys Val Thr Arg Ser Ala Leu Glu Ser Ala Arg Ser Ile 660 665 670 Ala Gly Leu Leu Leu Thr Thr Glu Ala Leu Ile Ala Asp Ile Pro Glu 675 680 685 Glu Lys Ser Ser Ser Ala Pro Ala Met Pro Ser Ala Gly Met Asp Tyr 690 695 700 704
【００５８】配列番号：4 配列の長さ：419 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 Met Ile Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ala Val Asp Arg Val Ile Gly Met 1 5 10 15 Glu Asn Ala Met Pro Trp Asn Leu Pro Ala Asp Leu Ala Trp Phe Lys 20 25 30 Arg Asn Thr Leu Asn Lys Pro Val Ile Met Gly Arg His Thr Trp Glu 35 40 45 Ser Ile Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn Ile Ile Leu Ser Ser 50 55 60 Gln Pro Gly Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys Ser Val Asp Glu 65 70 75 80 Ala Ile Ala Ala Cys Gly Asp Val Pro Glu Ile Met Val Ile Gly Gly 85 90 95 Gly Arg Val Tyr Glu Gln Phe Leu Pro Lys Ala Gln Lys Leu Tyr Leu 100 105 110 Thr His Ile Asp Ala Glu Val Glu Gly Asp Thr His Phe Pro Asp Tyr 115 120 125 Glu Pro Asp Asp Trp Glu Ser Val Phe Ser Glu Phe His Asp Ala Asp 130 135 140 Ala Gln Asn Ser His Ser Tyr Glu Phe Glu Ile Leu Glu Arg Arg Ile 145 150 155 160 Gln Phe Glu Pro leu Arg Glu Gly Val Arg Tyr Phe Ser Thr Asn Pro 165 170 175 Glu Thr Gln Glu Cys Val Leu Glu Asp Ala Leu Ile Leu Ile Tyr Asp 180 185 190 Lys Lys Ile Ser Gly Ile Lys Asp Phe Leu Pro Val Leu Gln Gln Val 195 200 205 Ala Glu Ser Gly Arg Pro Leu Leu Ile Ile Ala Glu Glu Ile Glu Gly 210 215 220 Glu Ala Leu Ala Thr Leu Val Val Asn Arg Leu Arg Ala Gly Phe Arg 225 230 235 240 Val Cys Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg Lys Ala Met 245 250 255 Leu Glu Asp Ile Ala Ile Leu Thr Gly Gly Gln Leu Val Ser Glu Glu 260 265 270 Leu Gly Met Lys Leu Glu Asn Thr Thr Leu Ala Met Leu Gly Lys Ala 275 280 285 Lys Lys Val Ile Val Thr Lys Glu Asp Thr Thr Ile Val Glu Gly Leu 290 295 300 Gly Asn Lys Pro Asp Ile Gln Ala Arg Cys Asp Asn Ile Lys Lys Gln 305 310 315 320 Ile Glu Asp Ser Thr Ser Asp Tyr Asp Lys Glu Lys Leu Gln Glu Arg 325 330 335 Leu Ala Lys Leu Ser Gly Gly Val Ala Val Ile Arg Val Gly Ala Ala 340 345 350 Thr Glu Ile Glu Met Lys Glu Lys Lys Asp Arg val Asp Asp Ala Gln 355 360 365 His Ala Thr Ile Ala Ala Val Glu Glu Gly Ile Leu Pro Gly Gly Gly 370 375 380 Thr Ala Leu Val Arg Cys Ile Pro Thr Leu Glu Ala Phe Leu Pro Met 385 390 395 400 Leu Ala Asn Glu Asp Glu Ala Lys Gly Phe Glu Leu Pro Trp Gly Pro 405 410 415 Leu Ile Asn 419
【００５９】配列番号：5 配列の長さ：480 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 配列の種類：他の核酸 Genomic DNA 配列 ATG ATC AGT CTG ATT GCG GCG TTA GCG GTA GAT CGC GTT ATC GGC ATG 48 Met Ile Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ala Val Asp Arg Val Ile Gly Met 1 5 10 15 GAA AAC GCC ATG CCG TGG AAC CTG CCT GCC GAT CTC GCC TGG TTT AAA 96 Glu Asn Ala Met Pro Trp Asn Leu Pro Ala Asp Leu Ala Trp Phe Lys 20 25 30 CGC AAC ACC TTA AAT AAA CCC GTG ATT ATG GGC CGC CAT ACC TGG GAA 144 Arg Asn Thr Leu Asn Lys Pro Val Ile Met Gly Arg His Thr Trp Glu 35 40 45 TCA ATC GGT CGT CCG TTG CCA GGA CGC AAA AAT ATT ATC CTC AGC AGT 192 Ser Ile Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn Ile Ile Leu Ser Ser 50 55 60 CAA CCG GGT ACG GAC GAT CGC GTA ACG TGG GTG AAG TCG GTG GAT GAA 240 Gln Pro Gly Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys Ser Val Asp Glu 65 70 75 80 GCC ATC GCG GCG TGT GGT GAC GTA CCA GAA ATC ATG GTG ATT GGC GGC 288 Ala Ile Ala Ala Cys Gly Asp Val Pro Glu Ile Met Val Ile Gly Gly 85 90 95 GGT CGC GTT TAT GAA CAG TTC TTG CCA AAA GCG CAA AAA CTG TAT CTG 336 Gly Arg Val Tyr Glu Gln Phe Leu Pro Lys Ala Gln Lys Leu Tyr Leu 100 105 110 ACG CAT ATC GAC GCA GAA GTG GAA GGC GAC ACC CAT TTC CCG GAT TAC 384 Thr His Ile Asp Ala Glu Val Glu Gly Asp Thr His Phe Pro Asp Tyr 115 120 125 GAG CCG GAT GAC TGG GAA TCG GTA TTC AGC GAA TTC CAC GAT GCT GAT 432 Glu Pro Asp Asp Trp Glu Ser Val Phe Ser Glu Phe His Asp Ala Asp 130 135 140 GCG CAG AAC TCT CAC AGC TAT GAG TTC GAA ATT CTG GAG CGG CGG ATC 480 Ala Gln Asn Ser His Ser Tyr Glu Phe Glu Ile Leu Glu Arg Arg Ile 145 150 155 160
【００６０】配列番号：6 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GATCCAATTG CCATGGGGGC CCTTAATTAA TTAAC 35
【００６１】配列番号：7 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TCGAGTTAAT TAATTAAGGG CCCCCATGGC AATTG ３
５
５
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 14/295 8517−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 19/00 19/00 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (15)
- 【請求項１】 配列番号１のポリペプチドに、直接に又
は介在アミノ酸配列を介して、配列番号２のポリペプチ
ドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸配列を含む
ポリペプチドＢが結合した、ジヒドロ葉酸還元酵素−ク
ラミジア・ニューモニエの抗原ポリペプチド融合タンパ
ク質を抗原として用いることを特徴とする、抗クラミジ
ア・ニューモニエ抗体の検出・測定方法。 - 【請求項２】 ポリペプチドＢが、配列番号２のポリペ
プチドからアミノ酸１〜３２０個が欠落しているポリペ
プチドである、請求項１記載の検出・測定方法。 - 【請求項３】 ポリペプチドＢが、配列番号２のポリペ
プチドの中のアミノ酸１〜１００個が他のアミノ酸で置
換されているポリペプチドである、請求項１記載の検出
・測定方法。 - 【請求項４】 融合タンパク質が配列番号３のアミノ酸
配列からなるポリペプチドである、請求項１記載の検出
・測定方法。 - 【請求項５】 融合タンパク質が配列番号４のアミノ酸
配列からなるポリペプチドである、請求項１記載の検出
・測定方法。 - 【請求項６】 配列番号１のポリペプチドに、直接に又
は介在アミノ酸配列を介して、配列番号２のポリペプチ
ドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸配列を含む
ポリペプチドＢが結合した、ジヒドロ葉酸還元酵素−ク
ラミジア・ニューモニエの抗原ポリペプチド融合タンパ
ク質を抗原として含有してなる、抗クラミジア・ニュー
モニエ抗体の検出・測定用試薬。 - 【請求項７】 ポリペプチドＢが、配列番号２のポリペ
プチドからアミノ酸１〜３２０個が欠落しているポリペ
プチドである、請求項６記載の検出・測定用試薬。 - 【請求項８】 ポリペプチドＢが、配列番号２のポリペ
プチドの中のアミノ酸１〜１００個が他のアミノ酸で置
換されているポリペプチドである、請求項６記載の検出
・測定用試薬。 - 【請求項９】 融合タンパク質が配列番号３のアミノ酸
配列からなるポリペプチドである、請求項６記載の検出
・測定用試薬。 - 【請求項１０】 融合タンパク質が配列番号４のアミノ
酸配列からなるポリペプチドである、請求項６記載の検
出・測定用試薬。 - 【請求項１１】 配列番号１のポリペプチドに、直接に
又は介在アミノ酸配列を介して、配列番号２のポリペプ
チドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸配列を含
むポリペプチドＢが結合した、ジヒドロ葉酸還元酵素−
クラミジア・ニューモニエの抗原ポリペプチド融合タン
パク質を有効成分とする、クラミジア・ニューモニエ感
染の診断薬。 - 【請求項１２】 ポリペプチドＢが、配列番号２のポリ
ペプチドからアミノ酸１〜３２０個が欠落しているポリ
ペプチドである、請求項１１記載の診断薬。 - 【請求項１３】 ポリペプチドＢが、配列番号２のポリ
ペプチドの中のアミノ酸１〜１００個が他のアミノ酸で
置換されているポリペプチドである、請求項１１記載の
診断薬。 - 【請求項１４】 融合タンパク質が配列番号３のアミノ
酸配列からなるポリペプチドである、請求項１１記載の
診断薬。 - 【請求項１５】 融合タンパク質が配列番号４のアミノ
酸配列からなるポリペプチドである、請求項１１記載の
診断薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7106012A JPH08304403A (ja) | 1995-04-28 | 1995-04-28 | 抗クラミジア・ニューモニエ抗体の検出・測定方法及びその試薬、並びにクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7106012A JPH08304403A (ja) | 1995-04-28 | 1995-04-28 | 抗クラミジア・ニューモニエ抗体の検出・測定方法及びその試薬、並びにクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08304403A true JPH08304403A (ja) | 1996-11-22 |
Family
ID=14422760
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7106012A Pending JPH08304403A (ja) | 1995-04-28 | 1995-04-28 | 抗クラミジア・ニューモニエ抗体の検出・測定方法及びその試薬、並びにクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08304403A (ja) |
-
1995
- 1995-04-28 JP JP7106012A patent/JPH08304403A/ja active Pending
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