CH636450A5 - Metodo diagnostico per la determinazione del contenuto di triiodotironina. - Google Patents

Description

La presente invenzione si riferisce ad un metodo diagnostico per la determinazione della triiodotironina ed alla composizione adatta al metodo diagnostico stesso.

È noto che esistono diversi metodi per l'anilisi della triiodotironina, più semplicemente T3, e del suo anticorpo, particolarmente per la loro determinazione quantitativa nel siero; fra gli altri ricordiamo:

1) misura della concentrazione del T3 totale:

a) dosaggio mediante analisi di saturazione, che prevede la separazione del T3 dalla tiroxina (T4), separazione che è in effetti molto complessa e costituisce un serio ostacolo ad una applicazione di routine;

b) dosaggio radioimmunologico: costituisce attualmente il metodo più idoneo alla valutazione della triiodotironina. Esso prevede l'uso di un anticorpo specifico e del T3 marcato con 125I : il T3 del siero in esame compete con il T3 mercato per l'anticorpo, la quantità del complesso ml - T3-anticorpo è inversamente proporzionale alla concentrazione del T, del campione in esame. Bisogna sottolineare, a proposito di questo metodo, che i composti occorrenti (p. es. 125I) hanno una vita media relativamente breve e il test richiede un'apparecchiatura costosa, e inoltre l'uso di radioisotopi è sottoposto ad un severa legislazione sanitaria.

2) Misura dell'interazione tra ormone e TBP (thiroxine-

binding protein):

a) stima della frazione ormonica libera mediante dialisi all'equilibrio, ultrafiltrazione;

b) stima della saturazione relativa dei siti tiroxino-legan-ti: fissazione su resina del Ts marcato (BT3U, Resin T3 Uptake);

c) valutazione quantitativa delle proteine tiroxino-legan-ti: concentrazione della TBG (Thyroxine-binding globulin)

e della TBPA (thyroxine-binding prealbumin).

Si tratta di metodi indaginosi, basati sulla capacità di legame della TBP all'ormone, che forniscono una misura indiretta del T3 circolante. Il metodo che misura la fissazione del T, marcato alla resina è comunque il più maneggevole dei tre, pur presentando gli inconvenienti già descritti in lb.

Dalle misure della concentrazione del Ts totale e dell'interazione tra ormone e TBP si può calcolare la concentrazione del T3 libero.

Ora noi abbiamo trovato, ciò che costituisce l'oggetto della presente invenzione, un metodo per la determinazione della triiodotironina che ne permette il dosaggio fino a quantità piccolissime, dell'ordine del nanogrammo ed inferiore, senza gli inconvenienti prima menzionati, metodo che consiste nell'uso di un anticorpo insolubilizzato specifico per il T3 e di una composizione, a sua volta secondo oggetto della presente invenzione, fornita da un particolare enzima legato in modo covalente al T3 stesso (enzima sensibilizzato E-T3). L'insolubilizzazione, come noto, consente di ottenere anticorpi immuno-assorbenti che possiedono un'alta specificità ed affinità immunologica; l'impiego della composizione di cui sopra esalta queste qualità e soprattutto conferisce al sistema una particolare stabilità si da arrivare a risultati del tutto insospettati alla luce dell'arte nota: dosaggio di triiodotironina anche se presente in ridottissima quantità ed elevata riproducibilità; la cosa è tanto più notevole in quanto è largamente noto che la triiodotironina è un inibitore dell'attività enzimatica di alcun enzimi, lisozima, ad esempio, con cui forma anche un complesso insolubile. La scelta dell'enzima per il saggio immunoenzimatico deve essere effettuata in base ai seguenti criteri:

a) deve possedere un'alta attività specifica ad un pH tale da non indebolire il legame antigene-anticorpo;

b) deve essere misurabile semplicemente;

c) deve essere facilmente ottenibile in forma altamente purificata, solubile e stabile;

d) deve possedere gruppi reattivi a cui possono legarsi altre molecole senza perdita di attività biologica;

e) non deve essere inibito da sostanze presenti nel siero.

La determinazione, secondo il metodo dell'invenzione,

viene eseguita estraendo il T3 del campione in esame per «affinity-chromatography» su Ab (anticorpo) anti - T3 insolubilizzato in colonna o provetta. Con questo passaggio si ottiene una concentrazione della sostanza in esame e si allontanano componenti presenti nel siero che potrebbero interferire. Successivamente si tratta la colonna con la soluzione di ET3 e si determina poi sull'effluente l'attività enzimatica residua. Se il campione non contiene sostanza da dosare (T3), l'anticorpo blocca l'enzima sensibilizzato (E-T3) inibendone l'attività. Se, al contrario, la sostanza è presente, questa competerà per l'anticorpo con l'enzima, permettendo almeno a una parte della molecola di quest'ultimo di rimanere attive. Da quanto esposto risulta che il nostro metodo immunoenzimatico per la determinazione della triiodotironina è valido in quanto è una misura diretta dell'ormone circolante, anche se presente in concentrazioni molto basse, non subisce interferenze da sostanze presenti nel siero ed è di semplice esecuzione.

È ovvio che un procedimento suddetto può essere impiegato per la determinazione degli anticorpi anti-T3, essendo sufficiente insolubilizzare il T3, e quindi porre a contatto con il T3 insolubilizzato prima il campione e poi un enzima legato in modo covalente con l'anti-T3; si determina infine l'attività enzimatica residua: se il campione non contiene gli anticorpi si avrà un complesso E-Ab . T3 e non sarà possibile determinare l'attività enzimatica. Se al contrario nel campione sono presenti anticorpi questi formeranno un complesso T3. Ab e sarà possibile determinare l'attività del coniugato E-Ab.

Materiali

La carbonico anidrasi e la sieroalbumina bovina erano prodotti Boheringer-Mannheim Co. La l-etil-3-(3-dimetil-amminopropil)carbodiimmide era prodotto Sigma. La 3-5-3' triiodotironina e la glutaraldeide sono stati forniti dalla Fluka.

I reagenti per elettroforesi erano della Canalco. Il Bio Gel era fornito dalla ditta Bio-RAD. Tutti gli altri prodotti C. Erba o Merck.

Risultati

A) Preparazione di anticorpi anti-T3

Sono stati scolti in 25 mi di acqua e addizionati con 150 mg di l-etil-3 (3-dimetilamminopropil) carbodiimmide, 50 mg di BSA (siero albumina bovina).

Quindi sono stati aggiunti, goccia a goccia, 100 mg di T3 sciolti in 5 mi di N,N-dimetilformammide.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

3

636450

Dopo circa 5 min sono stati aggiunti 50 mg di l-etil-3--(3-dimetiIammino propiI)carbodiimmide.

La reazione è stata lasciata procedere per 18 ore a temperatura ambiente, al buio e sotto agitazione. Al termine il campione è stato centrifugato e dializzato contro frequenti cambi di acqua distillata per 72 ore.

II numero di residui di T3 incorporati in ciascuna molecola di albumina era determinato spettrofotometricamente usando un coefficiente di 6100 rrr1 cm"1 a 320 nm.

I risultati indicano che circa 5 residui di Ts erano coniugati a ciascuna molecola di BSA.

Gli spettri ultravioletti del BSA e del coniugato T3-BSA sono riportati in fig. 1 (curva 1 e 2).

L'anticorpo è stato ottenuto per immunizzazione successive di conigli con il complesso T3-BSA. Per la titolazione degli anticorpi è stato usato il metodo dell'agglutinazione passiva: si tratta di un metodo classico di serologia e consiste nel «coating» di emazie, trattate con acido tannico, con l'antigene in esame e quindi nell'esecuzione di un saggio di agglutinazione.

L'anticorpo ottenuto aveva un titolo di 1 : 8000.

La purificazione dell'anticorpo è effettuata centrifugando il siero, il sovranatante è stato diluito con un volume di acqua e un volume di solfato d'ammonio saturo, per una concentrazione finale del 33%. Dopo 15' è stato centrifugato a 4000 r.p.m. per 20' ed il precipitato risospeso in soluzione salina e riprecipitato con solfato d'ammonio fino a completa decolorazione della soluzione. II precipitato ripreso in soluzione salina è stato dializzato contro 2-3 cambi di soluzione salina a 4°C fino a scomparsa del solfato d'ammonio.

B) Preparazione di anticorpi immunoassorbenti su poli-

acrilammide

II Bio Gel P-300 era lasciato idratare per 24 ore in acqua ed era lavato molte volte con lo stesso mezzo.

A 100 mi del gel idratato erano aggiunti 500 mi di una soluzione al 6% di glutaraldeide in tampone fosfato 0,1M pH 7,0. La soluzione era incubata per una notte a 37°C.

Il gel era quindi lavato 10-20 volte con acqua, usando 500 mi per ciascun lavaggio.

10 mi di gel attivato erano mescolati con 12 mi di siero. La soluzione era agitata lentamente a temperatura ambiente per 14 h, centrifugata (3000 g, 10 min, 4°C) ed il super-natante era rimosso per stimare la quantità di anticorpo non assorbito.

Le particelle di gel erano quindi lavate con tampone fisiologico finché la densità del supernatante era meno di 0,02 a 280 nm. La quantità di anticorpo accoppiato era di 23 mg per mi di gel.

C) Preparazione del coniugato T3-carbonica anidrasi

(T3-BCA)

50 mg di carbonico anidrasi sono stati sciolti in 25 mi di acqua e mescolati con 30 mg di l-etil-3-(3-dimetilam-minopropil)-carbodi-immide. 20 mg di T3 sciolti in 5 mi di N,N-dimetilformammide sono stati aggiunti goccia a goccia, mantenendo il pH tra 5,5 e 6,0. La soluzione era tenuta con agitazione costante a temperatura ambiente, al buio per 18 ore circa. Al termine il campione era centrifugato e dializzato contro frequenti cambi di acqua a 4°C per 48 ore circa. Dall'analisi spettrofotometrica risultava che un residuo di T3 era coniugato a una molecola di carbonio anidrasi;

l'attività enzimatica residua del coniugato corrispondeva a circa il 50% di quella dell'enzima nativo. II coniugato T3-BCA era omogeneo e diverso dall'enzima nativo come verificato in elettroforesi.

D) Determinazione del T3

Si procede anzitutto alla determinazione di una curva di taratura nel modo seguente: 1 mi di anticorpo insolubilizzato su Bio Gel P 300 viene posto su una colonna (0,5 X 5 cm) termostatata a 25°C; attraverso la colonna viene fatto fluire 1 mi di soluzione contenente il coniugato T3-BCA ed una concentrazione 0,5 M. La colonna viene lasciata riposare per 1 ora, quindi lavata con 1 mi di tampone fisiologico e sull'effluente viene determinata l'attività biologica residua del coniugato. L'attività biologica di TS-BCA viene determinata spettrofotometricamente a 25°C misurando l'aumento dell'assorbimento a 348 nm dovuto all'idrolisi per p-nitro-fenilacetato: 1 mi di effluente viene mescolato con 1 mi di p-nitrofenilacetato 3mM, 0,3 mi di tampone fosfato 20 mM pH 7,4 e 0,7 mi di acqua; nella cella di riferimento viene posto un bianco contenente i reattivi meno l'enzima.

Per la determinazione della triiodotironina, quantità scalari di ormone libero (da 3 a 70 ngr per mi) vengono poste in varie colonne contenenti 1 mi di anticorpo insolubilizzato e lasciato a riposo per 1 ora.

La resina viene lavata con 5 mi di tampone fisiologico eluita nuovamente con 1 mi di T3-BCA 0,5 (iM e lasciata per 1 ora. La resina viene ancora lavata con 1 mi di tampone fisiologico e sull'effluente viene determinata l'attività specifica del coniugato T3-BCA.

In fig. 2 è riportato l'andamento dell'attività specifica di T3-BCA in funzione della concentrazione di Ts libero (in ascissa). La quantità minima dosabile è di 1-2 nanogrammi.

E) Determinazione del T3 in sieri umani standard

Con la tecnica sopra riportata sono stati analizzati tre sieri standard di soggetto ipo-, eu- e ipertiroidei, ottenendo rispettivamente i seguenti valori:

110 ng/100 mi, 236 ng/100 mi, 500 ng/100 mi. Tali valori sono in buon accordo con quelli misurati utilizzando tecniche radioimmunologiche.

La specificità dell'anticorpo da noi ottenuto è stata valutata misurando la capacità del T4 nel competere con il T3 per l'antisiero. Per ottenere una variazione dell'attività specifica del ciniugato BCA-T3 equivalente a quella determinata da 2 ng di T3 sono necessari 500 ng di T4.

Considerando che la normale concentrazione di T4 nel siero umano è di circa 80 ng/ml, la sua interferenza nel sistema di dosaggio è trascurabile.

Didascalia delle figure

Fig. 1 Spettro ultravioletto della siero albumina bovina e del coniugato T3-siero albumina bovina in soluzione acquosa. (1) Siero albumina bovina; (2) coniugato siero albumina bovina-T3; (3) spettro differenziale del coniugato meno la siero albumina bovina.

Fig. 2 Variazione percentuale dell'attività del coniugato T3-carbonico anidrasi in funzione della concentrazione di T3 libero [curva (d) da 0 a 7 ng/ml; curva (b) da 0 a 70 ng/ mi]. L'attività era determinata nelle condizioni descritte nel testo.

5

io

15

20

25

J0

35

40

45

50

55

60

V

1 foglio disegni

Claims (3)

636450

1. Metodo diagnostico per la determinazione del contenuto di triiodotironina in un campione, nel quale si estrae la triiodotironina del campione in esame per mezzo di un anticorpo anti-T, insolubilizzato, caratterizzato dal trattare quanto ottenuto con una composizione di un enzima sensibilizzato, formato dall'unione covalente dell'enzima con triiodotironina stessa.

2. Composizione adatta alla determinazione della triiodotironina secondo la rivendicazione 1, costituita dalla stessa triiodotironina e da un enzima legato ad essa in modo covalente.

2

RIVENDICAZIONI

3. Composizione secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che l'enzima è la carbonico anidrasi.