JPH02193071A - ハプトグロビン―ヘモグロビン複合体測定用試薬キット及びそれを用いるハプトグロビン―ヘモグロビン複合体の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は臨床検査領域等で用いられるハプトグロビン−
ヘモグロビン複合体測定用試薬キット及びそれを用いる
ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体の測定法に関する
。さらに詳細には抗ヒトハプトグロビン固相化抗体と酵
素標識抗ヒトヘモグロビン抗体又は抗ヒトヘモグロビン
固相化波体と酵素標識抗ヒトハプトグロビン抗体とから
なるハプトグロビン−ヘモグロビン複合体測定用試薬キ
ット及びそれを用いる酵素免疫測定法に関する。

［従来の技術］ 大量輸血、体外循環、血液透析及び臓器潅流などの処置
において、しばしば高度溶血を起こすため溶血性腎障害
をはじめ柾々の合併症が懸念される。その対処療法とし
て、ハプトグロビンを補充して過剰の遊離ヘモグロビン
を補充したハプトグロビンと結合させ、ハプトグロビン
−ヘモグロビン複合体に転化させて正常なヘモグロビン
代謝に乗せようとするハプトグロビン補充療法が行われ
ており、患者の血清、血漿、及び尿中の、ハプトグロビ
ン−ヘモグロビン複合体量を知ることは臨床上極めて重
要である。また、最近では大腸癌の早期診断方法として
、糞便中のハプトグロビン−ヘモグロビン複合体のＡｌ
１定が有用視されている。

このように、血漿、血清及び尿中のハプトグロビン−ヘ
モグロビン複合体の測定は臨床上重要な意義を有し、そ
の測定方法としては、セルロースアセテート膜電気泳動
法による方法や、簡易分別定量法による方法が従来から
知られている。また、最近では糞便中のハプトグロビン
−ヘモグロビン複合体の測定法としてＲＩＡ法を用いて
測定する方法も報告されている。

上記のセルロースアセテート膜電気泳動法によるハプト
グロビン−ヘモグロビン複合体の測定は、まずシアンメ
トヘモグロビン法で検体中の総ヘモグロビン量を定量す
る。次に同一検体につき、セルロースアセテート膜電気
泳動法で、遊離型ヘモグロビン、ハプトグロビン−ヘモ
グロビン複合体、メトヘモアルブミン画分に分離する。

分離後、ペルオキシダーゼ反応によりヘモグロビンを染
色し、各両分における染色度をデンシトメーターでスキ
ャンニングし、総ヘモグロビン量に対するハプトグロビ
ン−ヘモグロビン複合体中のヘモグロビン量の比率を求
める。求めた比率を予めシアンメトヘモグロビン法で定
量した総ヘモグロビン量に乗じて、ハプトグロビン−ヘ
モグロビン複合体中のヘモグロビン量が算出される。更
にハプトグロビン−ヘモグロビン複合体量を求めようと
する場合は、ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体中の
ヘモグロビン量にハプトグロビンとヘモグロビンの結合
比を乗じて、ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体中の
ハプトグロビン量を求め、ノーブトグロビン−ヘモグロ
ビン複合体中のヘモグロビン量に加算して、ハプトグロ
ビン−ヘモグロビン複合体量とする。

簡易測定法によるハプトグロビン−へモグロビン複合体
の、ＩＦ５定は、シアンメトヘモグロビン法による総ヘ
モグロビンの定量と一元免疫拡散法（Ｍａｎｃｉｎｉ法
）による総ハプトグロビンの定量を行い、ハプトグロビ
ンとヘモグロビンとの結合比を用いてハプトグロビン−
ヘモグロビン複合体量を算出するものである。なお、ハ
プトグロビンを一元免疫拡散法で正確に定量しようとす
る場合は、予め澱粉ゲル電気泳動法、免疫電気泳動法又
はアクリルアミドゲル電気泳動法でハプトグロビンの血
清型を識別しておき、標準曲線から求めた測定値にハプ
トグロビンの血清型別の係数を乗じて、定量値としなけ
ればならない。

また、ＲＩＡ法を用いる糞便中ヘモグロビンーハプトグ
ロビン複合体の測定方法（目黒高志、他、医学のあゆみ
：１４Ｂ巻３号参照）は、精製ヘモグロビンと精製ハプ
トグロビンを混合して調製したヘモグロビン−ハプトグ
ロビン複合体をＰｒｅｕｎｄ’ｓｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａ
ｄｊｕｖａｎｔと混合し、家兎に免疫して得られた抗血
清にマーカーとして　　Ｉを標識した１２５Ｉ標識抗体
を検体（糞便）抽出液に添加した後、検体抽出液中のヘ
モグロビンーノ＼ブトグロビン複合体と反応した　　Ｉ
標識抗体の放射活性から検体抽出液中のへモグロビンー
ノ１ブトグロビン複合体量を求めようとするものである
。但し、本誌で得られたヘモグロビン−ノーブトグロビ
ン複合体に対する抗血清は二次元免疫拡散法で、精製ヘ
モグロビン−ハプトグロビン複合体との間に２本の沈降
線を形成し、精製ヘモグロビン及びノ１ブトグロビンと
それぞれ反応したことを報告している。

［発明が解決しようとする課題］ 上記の従来技術において、セルロースアセテート膜電気
泳動法は総ヘモグロビン量に分画比を乗じて、間接的に
ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体量を求める方法で
あるため、測定操作が繁雑で長時間を要すると共に総ヘ
モグロビンの定量限界及びセルロースアセテート膜電気
泳動法の検出限界以下のヘモグロビンが結合したノーブ
トグロビン−ヘモグロビン複合体については測定できな
いという問題がある。

また、簡易分別定量法による測定方法では、総ヘモグロ
ビン量と総ハプトグロビン量から間接的にハプトグロビ
ン−ヘモグロビン複合体量を求める方法であるため、ヘ
モグロビンの定量限界以下のヘモグロビンが結合したハ
プトグロビン−ヘモグロビン複合体及びハプトグロビン
の定量限界以下のハプトグロビンと結合したハプトグロ
ビン−ヘモグロビン複合体については測定できない。

一方、ＲＩＡ法による測定方法では、放射性物質を使用
するので特定のＲＩ施設を必要とし、また１２５Ｉ標識
に用いたヘモグロビン−７１ブトグロビン複合体に対す
る抗血清がヘモグロビン及びノ１ブトグロビンと各々反
応するため、検体中にヘモグロビン−ハプトグロビン複
合体と遊離型のヘモグロビン或いは非結合型のハプトグ
ロビンが混在している場合は、ヘモグロビン−ハプトグ
ロビン複合体と共に遊離型のヘモグロビン或いは非結合
型のハプトグロビンをも測定することになり、検体中の
ヘモグロビン−ハプトグロビン複合体のみを特異的に測
定しているとは言えない。

本発明は、上記の従来技術の欠点を解消すべくなされた
もので、血清、血漿、尿、糞便等に存在するハプトグロ
ビン−ヘモグロビン複合体を特異的に、高感度で直接定
量できる該複合体測定用試薬キット及びそれを用いる測
定法を提供することを目的とする。

［課題を解決するための手段及び作用］本発明のハプト
グロビン−ヘモグロビン複合体測定用試薬キットは、抗
ヒトハプトグロビン抗体と抗ヒトヘモグロビン抗体のい
ずれか一方を固相に結合させた固相化抗体と、他方の抗
体に酵素を結合させた酵素標識抗体とからなることを特
徴とするものである。

また、本発明のハプトグロビン−ヘモグロビン複合体の
測定法は、抗ヒトハプトグロビン抗体と抗ヒトヘモグロ
ビン抗体のいずれか一方を固相に結合させた固相化抗体
に、ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体含有検体を接
触させると共に上記抗ヒトハプトグロビン抗体及び抗ヒ
トヘモグロビン抗体のうち固相上に固定化されていない
抗体に酵素を結合させた酵素標識抗体を作用させて、ノ
１ブトグロビンーヘモグロビン複合体を介して固相上に
該酵素標識抗体を固定化し、次いでその酵素活性を測定
することを特徴とするものである。

本発明は上記の構成よりなり、抗ヒトハプトグロビン抗
体と抗ヒトヘモグロビン抗体の内、一方の抗体を固相化
した固相化抗体と他方の抗体に酵素を結合させた酵素標
識抗体を用い、該固相上に検体中のハプトグロビン−ヘ
モグロビン複合体を介して該酵素標識抗体を結合させ（
所謂サンドイツチ法）、次いでその酵素標識抗体の酵素
活性を測定するもので、酵素活性は結合した酵素標識抗
体量によって定まり、その酵素標識抗体量は固相化抗体
に結合したハプトグロビン−ヘモグロビン複合体量によ
って定まる。また固相化抗体に結合するハプトグロビン
−ヘモグロビン複合体量は検体中のハプトグロビン−ヘ
モグロビン複合体Ｊｉｌによって定まる。従って、酵素
活性は検体中のハプトグロビン−ヘモグロビン複合体量
に相関するので、酵素活性を測定することにより検体中
のハプトグロビン−ヘモグロビン複合体量を求めること
ができる。

本発明で使用される抗ヒトハプトグロビン抗体としては
、ヒトハプトグロビンに対する抗体（モノクローナル抗
体及びポリクローナル抗体）であればいずれの抗体も使
用することができ、これらはヒトハプトグロビンで免疫
した動物の血清より慣用の方法で得ることができる。よ
り好ましくは精製ヒトハプトグロビン抗体が用いられ、
これはヒトハプトグロビン抗体（ポリクローナル抗体及
びモノクローナル抗体）から、正常人プール血漿より調
製した精製ヒトハプトグロビンを結合させたアフィニテ
ィクロマトグラフィーにより調製することができる。

また、抗ヒトヘモグロビン抗体としては、ヒトヘモグロ
ビンに対する抗体（モノクローナル抗体及びポリクロー
ナル抗体）であればいずれの抗体も使用することができ
、これらはヒトヘモグロビンで免疫した動物の血清より
慣用の方法で得ることができる。より好ましくは精製ヒ
トヘモグロビン抗体が用いられ、例えば、ジョージら（
ＧｅｏｒｇｅＨ，ｅｔ　　ａｔ、　　Ａｒａ、　　Ｊ、
　　Ｃｌ１ｎ、Ｐａｔｈｏｌ、　　Ｖｏｌ、８９．　３
４２　〜３４６、１９７１１１）の方法によって調製で
き、またヒトヘモグロビン抗体（ポリクローナル抗体及
びモノクローナル抗体）から、精製ヒトヘモグロビンを
結合させたアフィニティクロマトグラフィーにより調製
することも可能である。

本発明において、抗ヒトハプトグロビン抗体及び抗ヒト
ヘモグロビン抗体の内の一方は固相上に固定化され、固
相化抗体を形成する。これらの固相化抗ヒトハプトグロ
ビン抗体及び固相化抗ヒトヘモグロビン抗体は、上記の
抗ヒトハプトグロビン抗体及び抗ヒトヘモグロビン抗体
をそれぞれ用いて、ブロムシアン法などの既知の手段（
酵素免疫測定法、第３版：医学書院発行、第３９５頁参
照）で調製できる。抗体を固定化する固相材料としては
、酵素免疫測定法等で従来から使用されている固相材料
のいずれも用いることができ、例えば、アガロース、セ
ファロース等の多糖類、ガラス、セラミックス、プラス
チックなどが例示される。

これらの材料の形状は特に限定されないが、測定操作の
便宜性等からマイクロプレート、プラスチックチューブ
又はプラスチックボールがより好ましい。

一方、抗ヒトハプトグロビン抗体及び抗ヒトヘモグロビ
ン抗体の内、固相上に固定化されていない抗体は酵素で
標識され、酵素標識抗体を形成する。これらの酵素標識
抗ヒトヘモグロビン抗体及び酵素標識抗ヒトハプトグロ
ビン抗体は、上記の抗ヒトヘモグロビン抗体及び抗ヒト
ハプトグロビン抗体をそれぞれ用いて、グルタルアルデ
ヒド法、マレイミド法などの既知の手段（酵素免疫測定
法、第３版：医学書院発行、第１０９頁参照）で調製で
きる。ここで使用される酵素としては、酵素免疫測定法
で従来から使用されている酵素のいずれも使用すること
ができ、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスフ
ァターゼ、グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ
、グルコースオキシダーゼ等が例示される。

本発明の試薬キットは、抗ヒトハプトグロビン抗体と抗
ヒトヘモグロビン抗体のいずれか一方を固相に結合させ
た固相化抗体と、他方の抗体に酵素を結合させた酵素標
識抗体とで少なくとも構成され、さらに追加的に、酵素
活性を測定するための酵素基質試薬及び検量線作成に使
用するハプトグロビン−ヘモグロビン複合体標準品を含
んでいてもよい。上記の酵素基質試薬は、酵素標識抗体
に使用されている酵素の基質そのもの又はそれを適宜な
緩衝液に適当な濃度に溶解したものが使用される。また
ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体標準品は、例えば
、後記実施例３に記載の手段で調製できる。

次に、本発明の試薬キットを用いるハプトグロビン−ヘ
モグロビン複合体の測定法をより詳細に説明すると、例
えば、固相化抗体に抗ヒトハプトグロビン抗体を、標識
抗体として抗ヒトヘモグロビン抗体を用いた場合、まず
、必要に応じて適当な緩衝液で濃度調整されたハプトグ
ロビン−ヘモグロビン複合体含有検体（血清、血漿、尿
、糞便抽出液）を固相化抗体と反応させた後、上清を除
去することによって、固相化抗体と特異的に結合したハ
プトグロビン−ヘモグロビン複合体と非結合型のハプト
グロビンが固相上に残る。次に標識抗体を添加すること
によって、標識抗体はハプトグロビン−ヘモグロビン複
合体中のヘモグロビンに特異的に結合する。結合しなか
った過剰の標識抗体を除いた後、酵素活性を測定する。

一方、ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体標準品を３
〜５段階濃度に希釈した試料液につき上記と同様な操作
を行うことによって、ハプトグロビン−ヘモグロビン複
合体濃度と酵素活性との関係式（検量線）を作成し、上
記で得られた酵素活性と検量線とを対比することにより
、検体中のハプトグロビン−ヘモグロビン複合体量を求
めることができる。

上記方法において、酵素活性の測定方法としては、酵素
の種類により種々の方法が用いられるが、酵素標識抗体
の酵素の基質を添加し、該基質の変化量を測定する方法
が簡便で好ましい。特に基質の変化量を吸光度の測定で
行なう方法が操作性及び定量性に優れるので好ましく、
このような酵素とその基質の例としては、例えば、ペル
オキシダーゼと、過酸化水素と０−フェニレンジアミン
との組合せ等が例示される。

なお、上記の例においては、固相化抗体に抗ヒトハプト
グロビン抗体を、標識抗体として抗ヒトヘモグロビン抗
体を用いた場合をもって説明したが、固相化抗体に抗ヒ
トヘモグロビン抗体を、標識抗体として抗ヒトハプトグ
ロビン抗体を用いた場合においても実質的に同様な方法
にてハプトグロビン−ヘモグロビン複合体を測定するこ
とができる。

［発明の効果］ 本発明の試薬キット及びそれを用いるハプトグロビン−
ヘモグロビン複合体の測定法によれば、酵素免疫測定法
を用いているので、血清、血漿、尿、糞便等に含まれる
ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体を特異的に、高感
度且つ直接的に定量することができ、また測定操作も簡
便であると共に短時間に測定が終了し、しかも特定の施
設を要することなくΔ−ｊ定できるという効果を奏する
。

［実施例］ 以下、本発明を実施例及び実験例に基づいてより詳細に
説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものでは
ない。

実施例１ 固相化抗体の調製 ヘモグロビンを含まない正常人プール血漿より調製した
精製ヒトハプトグロビン（■ミドリ十字製）を結合させ
たアフィニティクロマトグラフイーにより精製した抗ヒ
トハプトグロビンヤギＩｇＧを０．０５Ｍ炭酸ナトリウ
ム塩緩衝液（ｐＨ９，６）！、：０Ｄ２８０が０．０２
１：なルヨウニ溶解し、その０．１ｍｌづつをＥＩＡ用
マイクロプレートのウェルに加え、４℃で１５時間静置
した。

ウェルの内容液を吸引除去後、０．０２％Ｔｖｅｅｎ−
２０を含有するリン酸塩緩衝化生理食塩液（ＰＢＳ）０
．３ｍｌを加え再び吸引除去した。　Ｔｖｅｅｎ−２０
含有ＰＢＳ添加及び吸引除去を計３回繰り返した後、０
．５％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ　（０，３
ｍ１）を添加し、室温で３時間放置後吸引除去した。以
上の処理により、抗ヒトハプトグロビン固定マイクロプ
レートを調製した。

実施例２ 酵素標識抗体の調製 ジョージら（Ｇｅｏｒｇｅ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ、　Ａｇｏ
、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ。

Ｐａｔｈｏｌ、　Ｖｏｌ、８９．３４２〜８４６．１９
７８）の方法によって調製した精製抗ヒトヘモグロビン
ヤギＩｇＧにマレイミド法（石川栄治、河合患、宮井潔
編集「酵素免疫ハｊ定法」第３版、医学書院発行、第１
０９頁）によりペルオキシダーゼを標識した。以上の処
理によりペルオキシダーゼ標識抗ヒトヘモグロビン抗体
液を調製した。

実施例３ ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体標準液の調製 ウィリアムスら（Ｉｆｉｌｌｌａａ＋ｓ　ｅｔ　ａｌ、
　Ａｎａｌ、　Ｂｌｏ−ｃｈｅｌｌ、、　Ｖｏｌ、５４
．１３７〜１４５．１９７３）の方法によって調製した
精製ヒトヘモグロビンと実施例１で用いた精製ヒトハプ
トグロビン（■ミドリ十字製）を重量比２：１で混和し
、３７℃で１時間反応させた後、抗ヒトハプトグロビン
抗体を結合させたアフィニティクロマトグラフィーによ
り吸着画分（ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体と非
結合型ハプトグロビン）を分取し、未吸着画分を除去し
た。次に精製ヒトヘモグロビンを結合させたアフィニテ
ィクロマトグラフィーにより、上記で得られた吸着画分
（ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体と非結合型ハプ
トグロビン）より、遊離ハプトグロビンを吸着除去した
後、５ｅｐｈａｃｒｙｌＳ−４００を用いたゲル濾過で
遊離ヘモグロビンを除去することによって、ハプトグロ
ビン−ヘモグロビン複合体液を得た。以上の処理により
得られたハプトグロビン−ヘモグロビン複合体液につき
、Ｌｏｖｒｙ法で蛋白量を測定し、ハプトグロビン−ヘ
モグロビン複合体標準液とした。

実験例 実施例で得た抗ヒトハプトグロビン固定マイクロプレー
ト、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトヘモグロビン抗体及び
ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体標準液を用いたハ
プトグロビン−へモグロビン複合体の測定を以下の通り
行った。

実験例１ 実施例３で得たハプトグロビン−ヘモグロビン複合体標
準液を１　ｍｌ中のハプトグロビン−ヘモグロビン複合
体量が３．０００ｎｇになるように０．５％ウシ血清ア
ルブミンを含有するＰＢＳで濃度調整を行った後、同Ｐ
ＢＳで段階的に倍々希釈して得た１倍〜１．０２４倍希
釈液を測定試料液とした。

次に、実施例１で得た抗ヒトハプトグロビン固定マイク
ロプレートのウェルに、上記ＰＢＳ及び１倍〜１　、０
２４倍希釈液を０．１ｍｌづつ添加し、３７℃で１時間
静置した。ウェルの内容液を吸引除去後、Ｔｗｅｅｎ−
２０含有ＰＢＳ　（０，３ｍ１）の添加及び吸引除去を
計３回繰り返し洗浄した。その後、実施例２で得たペル
オキシダーゼ標識抗ヒトヘモグロビン抗体液を０．１ｍ
ｌづつ各ウェルに添加し、３７℃で１時間静置した。再
びウェルの内容液を吸引除去し、Ｔｖｅｅｎ−２０含有
ＰＢＳ　（０，３ｍ１）の添加及び吸引除去を３回繰り
返し洗浄した。次いで０，１Ｍリン酸−クエン酸緩衝液
（ｐＨ５，０）ニ過酸化水素水（０，０１５％ｗ／Ｖ）
、Ｏ−７エニレンジアミン（１，５−ｇ／ｍｌ）を溶か
した基質溶液０．１ｍｌをウェルに加え、室温で３０分
間反応させ、その後２．５Ｍ硫酸（０，０５ｍ１）を添
加して反応を停止した。測定試料液に代えてＰＢＳを添
加したウェルを対照として測定試料を添加したウェルの
吸光度（４９２ｎｓ）をマイクロプレート用分光々度計
を用いて測定した。結果を第１図に示した。

実験例２ 人血清に対する添加回収試験 健常成人より採取した血清を均等に二分した。

その一方の血清には実施例３で得たハプトグロビン−ヘ
モグロビン複合体標準液を一定量添加した（添加後試料
と称する）。また他方の血清には、ハプトグロビン−ヘ
モグロビン複合体標準液に代えてＰＢＳを同量加えた（
添加前試料と称する）。

添加後試料及び添加前試料につき実験例１に示した方法
と同様な処理を行ない、４９２ｎｍにおける吸光度をＩ
ＩＩＪ定した。４９２ｎ団における吸光度を実験例１で
得た検量線と対比し、添加前及び添加後の試料中のハプ
トグロビン−ヘモグロビン複合体量を求めた。添加後試
料中のハプトグロビン−ヘモグロビン複合体量から添加
前試料中のハプトグロビン−ヘモグロビン複合体量を差
し引いた量を添加したハプトグロビン−ヘモグロビン複
合体量で除することによって、添加量に対する回収率を
求めた。

３名の健常人血清についての結果を第１表に示した。

実験例３ 人尿に対する添加回収試験 健常成人より採取した尿を均等に二分した。その一方の
人尿には実施例３で得たハプトグロビン−ヘモグロビン
複合体標準液を一定量添加した（添加後試料と称する）
。また他方の人尿には、ハプトグロビン−ヘモグロビン
複合体標準液に代えてＰＢＳを同量加えた（添加前試料
と称する）。

添加後試料及び添加前試料につき、実験例１に示した方
法と同様に処理して、４９２ｎｍにおける吸光度を測定
した。４９２ｎａにおける吸光度を実験例１で得た検量
線と対比し、添加後試料及び添加前試料中のハプトグロ
ビン−ヘモグロビン複合体量を求めた。添加後試料中の
ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体量から添加前試料
中のハプトグロビン−ヘモグロビン複合体量を差し引い
た量を添加したハプトグロビン−ヘモグロビン複合体量
で除することによって、添加量に対する回収率を求めた
。

３名の健常成人尿についての結果を第１表に示した。

実験例４ 人糞側における添加回収試験 健常成人より採取した糞便を概ね均等に二分した。その
一方の糞便に実施例３で得たハプトグロビン−ヘモグロ
ビン複合体標準液を一定量添加した後、双方の糞便に約
２倍量の生理食塩液を加え、１時間攪拌した。少量の生
理食塩液で液量を一定に調整した後、１．５００〜２．
０００　ｇで３０分間遠心分離し、その上清を更にメン
ブランフィルタ−（０，４５μｌ）で濾過した濾液を各
々添加後試料及び添加前試料とした。添加後試料及び添
加前試料につき、実験例１に示した方法で４９２ｎ−に
おける吸光度を測定した。４９２ｎｍにおける吸光度を
実験例１で得た検量線と対比し、添加後試料及び添加前
試料中のハプトグロビン−ヘモグロビン複合体量を求め
た。添加後試料中のハプトグロビン−ヘモグロビン複合
体量から添加前試料中のハプトグロビン−ヘモグロビン
複合体量を差し引いた量を添加したハプトグロビン−ヘ
モグロビン複合体量で除することによって、添加量に対
する回収率を求めた。

３名の健常成人糞便についての結果を第１表に示した。

（以下余白） 第１表に示されるように、本発明の測定方法は回収率が
高く、定量性に優れた方法であることが認められた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明によるハプトグロビン−ヘモグロビン
複合体の測定における検量線を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、抗ヒトハプトグロビン抗体と抗ヒトヘモグロビン抗
   体のいずれか一方を固相に結合させた固相化抗体と、他
   方の抗体に酵素を結合させた酵素標識抗体とからなるハ
   プトグロビン−ヘモグロビン複合体測定用試薬キット。 ２、固相化抗体の固相が、マイクロプレート、プラスチ
   ックチューブ又はプラスチックボールである請求項１記
   載のハプトグロビン−ヘモグロビン複合体測定用試薬キ
   ット。 ３、酵素標識抗体の酵素が、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ
   −ガラクトシダーゼ又はアルカリフォスファターゼであ
   る請求項１又は２に記載のハプトグロビン−ヘモグロビ
   ン複合体測定用試薬キット。 ４、追加的に、ヒトハプトグロビン−ヒトヘモグロビン
   複合体を一定量含有するハプトグロビン−ヘモグロビン
   複合体標準品及び酵素の基質試薬を含む請求項１ないし
   ３のいずれかに記載のハプトグロビン−ヘモグロビン複
   合体測定用試薬キット。 ５、抗ヒトハプトグロビン抗体と抗ヒトヘモグロビン抗
   体のいずれか一方を固相に結合させた固相化抗体に、ハ
   プトグロビン−ヘモグロビン複合体含有検体を接触させ
   ると共に上記抗ヒトハプトグロビン抗体及び抗ヒトヘモ
   グロビン抗体のうち固相上に固定化されていない抗体に
   酵素を結合させた酵素標識抗体を作用させ、ハプトグロ
   ビン−ヘモグロビン複合体を介して固相上に該酵素標識
   抗体を固定化し、次いでその酵素活性を測定することを
   特徴とするハプトグロビン−ヘモグロビン複合体の測定
   法。 ６、固相化抗体の固相が、マイクロプレート、プラスチ
   ックチューブ又はプラスチックボールである請求項５記
   載のハプトグロビン−ヘモグロビン複合体の測定法。