JPH08308596A - Ｈｌａの検出 - Google Patents
Ｈｌａの検出Info
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- JPH08308596A JPH08308596A JP8053480A JP5348096A JPH08308596A JP H08308596 A JPH08308596 A JP H08308596A JP 8053480 A JP8053480 A JP 8053480A JP 5348096 A JP5348096 A JP 5348096A JP H08308596 A JPH08308596 A JP H08308596A
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Landscapes
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- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 より簡便にかつ大量の検体を検査でき、現在
日本人での存在が知られているすべてのタイプのＨＬＡ
−ＤＲ抗原のタイピングが可能なプローブセットの提
供。 【解決手段】 下記の配列１〜１６で示されるオリゴヌ
クレオチドおよび／またはその相補鎖の一部または全部
からなるプローブセット。 【化１】
日本人での存在が知られているすべてのタイプのＨＬＡ
−ＤＲ抗原のタイピングが可能なプローブセットの提
供。 【解決手段】 下記の配列１〜１６で示されるオリゴヌ
クレオチドおよび／またはその相補鎖の一部または全部
からなるプローブセット。 【化１】
Description
【０００１】
【発明の背景】発明の分野 本発明は、ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）のタイピングに用
いられるプローブ群に関し、更に詳しくはＨＬＡのうち
ＤＲ抗原を遺伝子型にタイピングするのに用いられるプ
ローブ群に関する。
いられるプローブ群に関し、更に詳しくはＨＬＡのうち
ＤＲ抗原を遺伝子型にタイピングするのに用いられるプ
ローブ群に関する。
【０００２】背景技術 臓器移植を行う場合、臓器の提供者と患者の間でＨＬＡ
の型がどれだけ一致しているかが移植成功率に大きく影
響する。ＨＬＡが一致しない場合、拒絶反応のため臓器
が患者に生着しなかったり、逆に提供者由来の免疫細胞
のためにＧＶＨＤが発生し患者の生命が危険にさらされ
ることになる。また糖尿病など特定の病気の発症率とＨ
ＬＡの型の関連も指摘されている。ＨＬＡのタイピング
はこのような医療技術の高度化に従い重要性を増したと
いえる。
の型がどれだけ一致しているかが移植成功率に大きく影
響する。ＨＬＡが一致しない場合、拒絶反応のため臓器
が患者に生着しなかったり、逆に提供者由来の免疫細胞
のためにＧＶＨＤが発生し患者の生命が危険にさらされ
ることになる。また糖尿病など特定の病気の発症率とＨ
ＬＡの型の関連も指摘されている。ＨＬＡのタイピング
はこのような医療技術の高度化に従い重要性を増したと
いえる。
【０００３】従来ＨＬＡのタイピングは抗体を用いて行
われてきた。しかし抗体はその供給源を経済的にほぼ限
られている上、モノクローナル抗体を得ることが困難な
こともあり、優れた品質の抗体を安定して十分量得るこ
とは困難であるといえる。この問題はＨＬＡの中でも特
にクラスII抗原について顕著となってきている。
われてきた。しかし抗体はその供給源を経済的にほぼ限
られている上、モノクローナル抗体を得ることが困難な
こともあり、優れた品質の抗体を安定して十分量得るこ
とは困難であるといえる。この問題はＨＬＡの中でも特
にクラスII抗原について顕著となってきている。
【０００４】そのため、従来の抗体による検査法に代わ
り、特異性の面で安定した、しかも検査用の試薬の供給
に制限の無い遺伝子によるタイピング法が研究され、種
々の方法が提案されている。また日本骨髄バンク等世界
中で骨髄や腎臓を中心として臓器移植ネットワークが徐
々に規模を拡大してきている。そのためますます、試薬
による量的制限のない遺伝子タイピングで大量の検体を
低コストでタイピングできるものが求められてきてい
る。
り、特異性の面で安定した、しかも検査用の試薬の供給
に制限の無い遺伝子によるタイピング法が研究され、種
々の方法が提案されている。また日本骨髄バンク等世界
中で骨髄や腎臓を中心として臓器移植ネットワークが徐
々に規模を拡大してきている。そのためますます、試薬
による量的制限のない遺伝子タイピングで大量の検体を
低コストでタイピングできるものが求められてきてい
る。
【０００５】従来、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＳＳ
Ｏ法、ＰＣＲ−ＳＳＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法等が提案
されている（今日の移植ＶＯＬ．７ ＳＵＰＰＬ １９
９４）。また、国際ＨＬＡワークショップ（第１１回１
９９１年）ではＰＣＲ−ＳＳＯ法について、標準の反応
条件、プライマー、およびプローブを定めている。
Ｏ法、ＰＣＲ−ＳＳＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法等が提案
されている（今日の移植ＶＯＬ．７ ＳＵＰＰＬ １９
９４）。また、国際ＨＬＡワークショップ（第１１回１
９９１年）ではＰＣＲ−ＳＳＯ法について、標準の反応
条件、プライマー、およびプローブを定めている。
【０００６】上記種々の提案にもかかわらず、より簡便
な方法への希求が依然として存在している。骨髄バンク
事業等でのスクリーニングにおいて不可欠な条件として
は、（１）操作が簡易でかつ大量検体処理に適してい
る、（２）対象の集団に見られるほぼ全てのタイプを検
出できる、（３）分類のレベルが適当で、最終検査の実
施対象を実用上支障のない程度の数に絞り込むこと、そ
して（４）作業量、試薬のコスト等とのバランスが取れ
ていることなどが挙げられる。
な方法への希求が依然として存在している。骨髄バンク
事業等でのスクリーニングにおいて不可欠な条件として
は、（１）操作が簡易でかつ大量検体処理に適してい
る、（２）対象の集団に見られるほぼ全てのタイプを検
出できる、（３）分類のレベルが適当で、最終検査の実
施対象を実用上支障のない程度の数に絞り込むこと、そ
して（４）作業量、試薬のコスト等とのバランスが取れ
ていることなどが挙げられる。
【０００７】本発明者らは先に、第２３回日本免疫学会
において１２種類のプローブを用いたＨＬＡ−ＤＲ抗原
のタイピングを提案している。
において１２種類のプローブを用いたＨＬＡ−ＤＲ抗原
のタイピングを提案している。
【０００８】
【発明の概要】本発明者らは、今般、先に提案した上記
１２種類のプローブに加え、さらに４種類のプローブ、
またはこれらの相補鎖を組み合わせて用いることによ
り、より完全にＨＬＡ−ＤＲ抗原のタイピングが可能で
あるとの知見を得た。本発明はかかる知見に基づくもの
である。すなわち、本発明はより簡便にかつ大量の検体
を検査できるＨＬＡ−ＤＲ抗原のタイピングが可能なプ
ローブセットの提供をその目的としている。
１２種類のプローブに加え、さらに４種類のプローブ、
またはこれらの相補鎖を組み合わせて用いることによ
り、より完全にＨＬＡ−ＤＲ抗原のタイピングが可能で
あるとの知見を得た。本発明はかかる知見に基づくもの
である。すなわち、本発明はより簡便にかつ大量の検体
を検査できるＨＬＡ−ＤＲ抗原のタイピングが可能なプ
ローブセットの提供をその目的としている。
【０００９】また本発明は、現在日本人での存在が知ら
れているすべてのタイプの判定が可能なプローブセット
の提供をその目的としている。
れているすべてのタイプの判定が可能なプローブセット
の提供をその目的としている。
【００１０】本発明によるプローブセットは、下記の配
列１〜１６で示されるオリゴヌクレオチドおよび／また
はその相補鎖の一部または全部からなるもの、である。 配列１：ＣＧＧＴＴＧＣＴＧＧＡＡＡＧＡＴＧＣＡＴＣ 配列２：ＡＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＴＡＧＧＣＴＧ 配列３：ＧＧＣＣＧＧＧＴＧＧＡＣＡＡＣＴＡＣ 配列４：ＡＴＧＴＴＴＡＡＣＣＴＧＣＴＣＣＡＡ 配列５：ＣＣＴＧＡＴＧＡＧＧＡＧＴＡＣＴＧＧＡＡ 配列６：ＡＧＣＴＡＣＴＧＣＧＣＴＴＣＧＡＣ 配列７：ＣＧＴＡＧＡＧＴＡＣＴＣＣＡＡＧＡＡ 配列８：ＣＴＴＡＴＡＣＴＴＡＣＣＣＴＧＣＣＡ 配列９：ＡＧＡＣＡＧＧＣＧＧＧＣＣＣＴ 配列１０：ＴＣＡＡＡＣＴＴＡＴＣＣＴＧＣＴＴＣ 配列１１：ＡＡＡＣＴＴＡＡＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡ 配列１２：ＡＣＴＣＴＡＣＧＴＣＴＧＡＧＴＧＴＣ 配列１３：ＡＣＧＧＧＴＧＡＧＴＧＴＴＡＴＴＴＣ 配列１４：ＧＡＣＣＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡＣＡＧＧ 配列１５：ＡＣＡＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡＣＧＡＧＣ 配列１６：ＣＣＣＧＴＡＧＴＴＧＴＧＴＣＴＧＣＡ
列１〜１６で示されるオリゴヌクレオチドおよび／また
はその相補鎖の一部または全部からなるもの、である。 配列１：ＣＧＧＴＴＧＣＴＧＧＡＡＡＧＡＴＧＣＡＴＣ 配列２：ＡＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＴＡＧＧＣＴＧ 配列３：ＧＧＣＣＧＧＧＴＧＧＡＣＡＡＣＴＡＣ 配列４：ＡＴＧＴＴＴＡＡＣＣＴＧＣＴＣＣＡＡ 配列５：ＣＣＴＧＡＴＧＡＧＧＡＧＴＡＣＴＧＧＡＡ 配列６：ＡＧＣＴＡＣＴＧＣＧＣＴＴＣＧＡＣ 配列７：ＣＧＴＡＧＡＧＴＡＣＴＣＣＡＡＧＡＡ 配列８：ＣＴＴＡＴＡＣＴＴＡＣＣＣＴＧＣＣＡ 配列９：ＡＧＡＣＡＧＧＣＧＧＧＣＣＣＴ 配列１０：ＴＣＡＡＡＣＴＴＡＴＣＣＴＧＣＴＴＣ 配列１１：ＡＡＡＣＴＴＡＡＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡ 配列１２：ＡＣＴＣＴＡＣＧＴＣＴＧＡＧＴＧＴＣ 配列１３：ＡＣＧＧＧＴＧＡＧＴＧＴＴＡＴＴＴＣ 配列１４：ＧＡＣＣＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡＣＡＧＧ 配列１５：ＡＣＡＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡＣＧＡＧＣ 配列１６：ＣＣＣＧＴＡＧＴＴＧＴＧＴＣＴＧＣＡ
【００１１】上記の配列１〜１６で示されるオリゴヌク
レオチドの相補鎖は、具体的には、下記の配列１ａ〜１
６ａで示されるオリゴヌクレオチドである。 配列１ａ：ＧＡＴＧＣＡＴＣＴＴＴＣＣＡＧＣＡＡＣＣＧ 配列２ａ：ＣＡＧＣＣＴＡＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＴ 配列３ａ：ＧＴＡＧＴＴＧＴＣＣＡＣＣＣＧＧＣＣ 配列４ａ：ＴＴＧＧＡＧＣＡＧＧＴＴＡＡＡＣＡＴ 配列５ａ：ＴＴＣＣＡＧＴＡＣＴＣＣＴＣＡＴＣＡＧＧ 配列６ａ：ＧＴＣＧＡＡＧＣＧＣＡＧＴＡＧＣＴ 配列７ａ：ＴＴＣＴＴＧＧＡＧＴＡＣＴＣＴＡＣＧ 配列８ａ：ＴＧＧＣＡＧＧＧＴＡＡＧＴＡＴＡＡＧ 配列９ａ：ＡＧＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＴＣＴ 配列１０ａ：ＧＡＡＧＣＡＧＧＡＴＡＡＧＴＴＴＧＡ 配列１１ａ：ＴＴＧＧＡＧＧＡＧＧＴＴＡＡＧＴＴＴ 配列１２ａ：ＴＧＣＡＧＡＣＡＣＡＡＣＴＡＣＧＧＧ 配列１３ａ：ＧＡＣＡＣＴＣＡＧＡＣＧＴＡＧＡＧＴ 配列１４ａ：ＧＡＡＡＴＡＡＣＡＣＴＣＡＣＣＣＧＴ 配列１５ａ：ＣＣＴＧＴＣＴＴＣＣＡＧＧＡＧＧＴＣ 配列１６ａ：ＧＣＴＣＧＴＣＴＴＣＣＡＧＧＡＴＧＴ
レオチドの相補鎖は、具体的には、下記の配列１ａ〜１
６ａで示されるオリゴヌクレオチドである。 配列１ａ：ＧＡＴＧＣＡＴＣＴＴＴＣＣＡＧＣＡＡＣＣＧ 配列２ａ：ＣＡＧＣＣＴＡＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＴ 配列３ａ：ＧＴＡＧＴＴＧＴＣＣＡＣＣＣＧＧＣＣ 配列４ａ：ＴＴＧＧＡＧＣＡＧＧＴＴＡＡＡＣＡＴ 配列５ａ：ＴＴＣＣＡＧＴＡＣＴＣＣＴＣＡＴＣＡＧＧ 配列６ａ：ＧＴＣＧＡＡＧＣＧＣＡＧＴＡＧＣＴ 配列７ａ：ＴＴＣＴＴＧＧＡＧＴＡＣＴＣＴＡＣＧ 配列８ａ：ＴＧＧＣＡＧＧＧＴＡＡＧＴＡＴＡＡＧ 配列９ａ：ＡＧＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＴＣＴ 配列１０ａ：ＧＡＡＧＣＡＧＧＡＴＡＡＧＴＴＴＧＡ 配列１１ａ：ＴＴＧＧＡＧＧＡＧＧＴＴＡＡＧＴＴＴ 配列１２ａ：ＴＧＣＡＧＡＣＡＣＡＡＣＴＡＣＧＧＧ 配列１３ａ：ＧＡＣＡＣＴＣＡＧＡＣＧＴＡＧＡＧＴ 配列１４ａ：ＧＡＡＡＴＡＡＣＡＣＴＣＡＣＣＣＧＴ 配列１５ａ：ＣＣＴＧＴＣＴＴＣＣＡＧＧＡＧＧＴＣ 配列１６ａ：ＧＣＴＣＧＴＣＴＴＣＣＡＧＧＡＴＧＴ
【００１２】
【発明の具体的説明】本発明によるプローブセットに用
いられる配列は、上記配列１〜１６の一部または全部お
よび１ａ〜１６ａの一部または全部である。これらの配
列は、それぞれＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子にそのタイプ
に対応してハイブリダイズする。すなわち、被験者由来
のＤＮＡ、好ましくは白血球より抽出されたＤＮＡと、
上記配列のいずれがハイブリダイズするかにより、ＨＬ
Ａ−ＤＲ抗原のタイピングを行う。
いられる配列は、上記配列１〜１６の一部または全部お
よび１ａ〜１６ａの一部または全部である。これらの配
列は、それぞれＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子にそのタイプ
に対応してハイブリダイズする。すなわち、被験者由来
のＤＮＡ、好ましくは白血球より抽出されたＤＮＡと、
上記配列のいずれがハイブリダイズするかにより、ＨＬ
Ａ−ＤＲ抗原のタイピングを行う。
【００１３】それぞれの配列がハイブリダイズするＨＬ
Ａ−ＤＲ抗原のタイプは以下のとおりである。この表を
判定表としてＨＬＡ−ＤＲ抗原のタイプを判定すること
ができる。
Ａ−ＤＲ抗原のタイプは以下のとおりである。この表を
判定表としてＨＬＡ−ＤＲ抗原のタイプを判定すること
ができる。
【００１４】
【表１】
【００１５】また、本発明においては、上記配列１〜１
６またはその相補鎖の組み合わせと比較すると、ややそ
の反応性に劣るが、配列５は下記配列１９または２０
と、配列６は下記配列２１〜２４のいずれか一つと置換
してＨＬＡ−ＤＲ遺伝子のタイピングを行うことができ
る。但し、これらの配列を利用する場合には、判定時に
交差反応に注意するなどの配慮が必要である。
６またはその相補鎖の組み合わせと比較すると、ややそ
の反応性に劣るが、配列５は下記配列１９または２０
と、配列６は下記配列２１〜２４のいずれか一つと置換
してＨＬＡ−ＤＲ遺伝子のタイピングを行うことができ
る。但し、これらの配列を利用する場合には、判定時に
交差反応に注意するなどの配慮が必要である。
【００１６】 配列１９：ＣＣＴＧＡＴＧＡＧＧＡＧＴＡＣＴＧＧＡＡＣＡＧ 配列２０：ＴＧＡＴＧＡＧＧＡＧＴＡＣＴＧＧＡＡ 配列２１：ＡＧＴＧＴＣＴＣＴＣＣＡＧＴＡＡＣＣ 配列２２：ＡＧＣＣＣＣＴＧＣＧＣＴＴＣＧＡＣ 配列２３：ＡＧＣＴＣＡＴＧＣＧＣＴＴＣＧＡＣ 配列２４：ＡＧＣＴＣＣＡＧＣＧＣＴＴＣＧＡＣ これらの配列と試料ＤＮＡとのハイブリダイゼーション
の有無は、通常用いられる条件下で確認されてよい。
の有無は、通常用いられる条件下で確認されてよい。
【００１７】本発明の好ましい態様によれば、上記配列
は特開平５−１９２１９８号公報に記載の方法によっ
て、固相、好ましくはマイクロタイタープレートに一本
鎖核酸として固定化されてタイピングに利用されるのが
好ましい。まず、上記配列を１またはそれ以上繰り返し
（好ましくはタンデムに）含む配列を得て、それを例え
ばＭ１３ファージ、ファージとプラスミドの複合ベクタ
ー（例えばｐＵＣ１１８、ｐＢＳＭ１３＋、ＰＵＣｆ１
等）に組み込み、一本鎖核酸を得る。特に、上記配列を
５〜２００コピー導入したベクターから得られる一本鎖
核酸を用いるのが好ましい。次に、この一本鎖核酸を固
相に固定化する。
は特開平５−１９２１９８号公報に記載の方法によっ
て、固相、好ましくはマイクロタイタープレートに一本
鎖核酸として固定化されてタイピングに利用されるのが
好ましい。まず、上記配列を１またはそれ以上繰り返し
（好ましくはタンデムに）含む配列を得て、それを例え
ばＭ１３ファージ、ファージとプラスミドの複合ベクタ
ー（例えばｐＵＣ１１８、ｐＢＳＭ１３＋、ＰＵＣｆ１
等）に組み込み、一本鎖核酸を得る。特に、上記配列を
５〜２００コピー導入したベクターから得られる一本鎖
核酸を用いるのが好ましい。次に、この一本鎖核酸を固
相に固定化する。
【００１８】これらの一本鎖核酸を固定化する担体とし
ては、核酸が非特異的に吸着しうるもの、あるいは、官
能基が導入できその官能基と核酸との間で共有結合でき
るものであればいずれの材質のものも、また、いずれの
形状のものも利用可能である。その具体例としては、い
わゆるポリマー製のマイクロプレート、チューブ、ビー
ズ形状のものがあげられる。特にマイクロプレートを用
いるのが、その機械化の容易性から好ましい。
ては、核酸が非特異的に吸着しうるもの、あるいは、官
能基が導入できその官能基と核酸との間で共有結合でき
るものであればいずれの材質のものも、また、いずれの
形状のものも利用可能である。その具体例としては、い
わゆるポリマー製のマイクロプレート、チューブ、ビー
ズ形状のものがあげられる。特にマイクロプレートを用
いるのが、その機械化の容易性から好ましい。
【００１９】前記した一本鎖核酸をこれらの担体に固定
化する方法としは、まず化学結合法が挙げられる〔Nucl
eic Acids Res., 15, 5373-5390 (1987)〕。化学結合に
よって核酸を固定化する方法の具体例としては、アミノ
基を導入した担体と核酸をグルタルアルデヒドのような
架橋剤を用いて両者を結合させる方法が挙げられる。ま
た、核酸に官能基（例えばトランスアミネーション反応
により１級のアミノ基）を導入し、適当な架橋剤を用い
て担体上に導入された官能基と結合させることも有効で
ある。
化する方法としは、まず化学結合法が挙げられる〔Nucl
eic Acids Res., 15, 5373-5390 (1987)〕。化学結合に
よって核酸を固定化する方法の具体例としては、アミノ
基を導入した担体と核酸をグルタルアルデヒドのような
架橋剤を用いて両者を結合させる方法が挙げられる。ま
た、核酸に官能基（例えばトランスアミネーション反応
により１級のアミノ基）を導入し、適当な架橋剤を用い
て担体上に導入された官能基と結合させることも有効で
ある。
【００２０】また、吸着などの非特異的結合によって核
酸を直接担体に固定することもできる。特に担体がマイ
クロプレートである場合は、紫外線照射またはＭｇＣｌ
２の添加により吸着効率をあげることが可能である（特
開昭６１−２１９４００号公報）。さらに、核酸とタン
パク質を適当な方法によって化学結合あるいは非特異的
に吸着させ、そのタンパク質と担体との非特異的吸着を
利用して固定化する方法なども有効である。
酸を直接担体に固定することもできる。特に担体がマイ
クロプレートである場合は、紫外線照射またはＭｇＣｌ
２の添加により吸着効率をあげることが可能である（特
開昭６１−２１９４００号公報）。さらに、核酸とタン
パク質を適当な方法によって化学結合あるいは非特異的
に吸着させ、そのタンパク質と担体との非特異的吸着を
利用して固定化する方法なども有効である。
【００２１】本発明において、上記固相に固定化された
配列と試料ＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応の条
件は適宜選択、決定されてよい。例えば、本工程でのハ
イブリダイゼーション反応は、基本的には、従来の膜を
用いるハイブリダイゼーションと同様に行なうことがで
きる〔B. D. Hames and S. J. Higgins, Nucleic Acid
Hybridization, A Practical Approach, IRL Press (19
85) 〕。
配列と試料ＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応の条
件は適宜選択、決定されてよい。例えば、本工程でのハ
イブリダイゼーション反応は、基本的には、従来の膜を
用いるハイブリダイゼーションと同様に行なうことがで
きる〔B. D. Hames and S. J. Higgins, Nucleic Acid
Hybridization, A Practical Approach, IRL Press (19
85) 〕。
【００２２】試料ＤＮＡとしては、ヒト白血球由来のＤ
ＮＡであるのが好ましい。この試料の検出される目的配
列は、上記配列とのハイブリダイズを検出可能なように
標識されているのが好ましい。標識化の方法としては、
例えば、（１）目的核酸に標識物を直接導入する方法、
（２）標識化されたオリゴヌクレオチドプライマーを使
用して目的核酸に相当する核酸あるいは目的核酸と相補
的な核酸を合成する方法、（３）標識化された単位核酸
の存在下、オリゴヌクレオチドプライマーを使用して目
的核酸に相当する核酸あるいは目的核酸と相補的な核酸
を合成する方法などが具体例としてあげられる。
ＮＡであるのが好ましい。この試料の検出される目的配
列は、上記配列とのハイブリダイズを検出可能なように
標識されているのが好ましい。標識化の方法としては、
例えば、（１）目的核酸に標識物を直接導入する方法、
（２）標識化されたオリゴヌクレオチドプライマーを使
用して目的核酸に相当する核酸あるいは目的核酸と相補
的な核酸を合成する方法、（３）標識化された単位核酸
の存在下、オリゴヌクレオチドプライマーを使用して目
的核酸に相当する核酸あるいは目的核酸と相補的な核酸
を合成する方法などが具体例としてあげられる。
【００２３】（１）の目的核酸に標識物を直接導入する
方法としては、目的核酸に光反応でビオチン誘導体を導
入し酵素を結合したストレプトアビジンで検出する方法
〔Nucleic Acids Res., 13, 745 (1985)〕、目的核酸を
スルホン化し酵素標識抗スルホン化抗体を用いて検出す
る方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 3466-3470
(1984)〕などが、操作の簡便性、迅速性の点から好まし
い。
方法としては、目的核酸に光反応でビオチン誘導体を導
入し酵素を結合したストレプトアビジンで検出する方法
〔Nucleic Acids Res., 13, 745 (1985)〕、目的核酸を
スルホン化し酵素標識抗スルホン化抗体を用いて検出す
る方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 3466-3470
(1984)〕などが、操作の簡便性、迅速性の点から好まし
い。
【００２４】一方、前記（２）および（３）の方法とし
ては、特定の核酸配列を増幅する方法〔BIO/TECHNOLOG
Y, 8, 291 (1990) 〕を利用することができる。これら
の方法は目的核酸を増幅するという点で特に注目されて
いるが、それのみならず、比較的簡単に目的核酸に相当
する合成核酸あるいは目的核酸と相補的な合成核酸を標
識化できる点でも利用価値が高い。例えば、ＰＣＲ法
〔Science, 230, 1350-1354 (1985)〕にあっては、標識
したプライマーを利用するか、あるいは、標識したモノ
ヌクレオチドトリリン酸を利用することにより、標識さ
れた伸長生成物または増幅生成物を得ることができる。
また、Ｑβレプリカーゼを利用する増幅法〔BIO/TECHNO
LOGY, 6, 1197 (1988)〕にあっては、同様に標識したモ
ノヌクレオチドトリリン酸を利用することによって標識
された伸長生成物または増幅生成物を得ることができ
る。また、前述した以外の核酸増幅法においても、伸長
反応または増幅反応によって取り込まれるモノヌクレオ
チドトリリン酸やオリゴヌクレオチドを標識しておくこ
とによって伸長生成物または増幅生成物を標識すること
ができる。特に（２）の方法が本発明にあっては好まし
い。
ては、特定の核酸配列を増幅する方法〔BIO/TECHNOLOG
Y, 8, 291 (1990) 〕を利用することができる。これら
の方法は目的核酸を増幅するという点で特に注目されて
いるが、それのみならず、比較的簡単に目的核酸に相当
する合成核酸あるいは目的核酸と相補的な合成核酸を標
識化できる点でも利用価値が高い。例えば、ＰＣＲ法
〔Science, 230, 1350-1354 (1985)〕にあっては、標識
したプライマーを利用するか、あるいは、標識したモノ
ヌクレオチドトリリン酸を利用することにより、標識さ
れた伸長生成物または増幅生成物を得ることができる。
また、Ｑβレプリカーゼを利用する増幅法〔BIO/TECHNO
LOGY, 6, 1197 (1988)〕にあっては、同様に標識したモ
ノヌクレオチドトリリン酸を利用することによって標識
された伸長生成物または増幅生成物を得ることができ
る。また、前述した以外の核酸増幅法においても、伸長
反応または増幅反応によって取り込まれるモノヌクレオ
チドトリリン酸やオリゴヌクレオチドを標識しておくこ
とによって伸長生成物または増幅生成物を標識すること
ができる。特に（２）の方法が本発明にあっては好まし
い。
【００２５】ここで使用する標識物質とは、ハイブリダ
イゼーション操作後にこの物質を検出し得るものである
ならば、放射性、非放射性を問わない。取扱いの容易
性、保存性、廃棄処理等から、また本発明の効果を最も
よく享有するものとして、非放射性の標識物質が好まし
い。
イゼーション操作後にこの物質を検出し得るものである
ならば、放射性、非放射性を問わない。取扱いの容易
性、保存性、廃棄処理等から、また本発明の効果を最も
よく享有するものとして、非放射性の標識物質が好まし
い。
【００２６】非放射性の標識物質としては、例えばビオ
チン、２，４‐ジニトロフェニル基、ジゴキシゲニン等
のハプテン、フルオレセインおよびその誘導体〔例え
ば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）
等〕、ローダミンおよびその誘導体〔例えば、テトラメ
チルローダミンイソチオシネート（ＴＲＩＴＣ）、テキ
サスレッド等〕、４‐フルオロ‐７‐ニトロベンゾフラ
ン（ＮＢＤＦ）およびダンシルなどの蛍光物質あるいは
アクリジン等の化学発光物質が挙げられる。これらによ
りオリゴヌクレオチドを標識する場合は、いずれも公知
手段（特開昭５９−９３０９８号、特開昭５９−９３０
９９号各公報参照）により、標識化を行うことができ
る。また、ヌクレオチド三リン酸を標識する場合は公知
手段〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 4045 (1983)
、特開昭６３−１５２３６４公報〕に準じて行うか、
市販品を利用することができる。
チン、２，４‐ジニトロフェニル基、ジゴキシゲニン等
のハプテン、フルオレセインおよびその誘導体〔例え
ば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）
等〕、ローダミンおよびその誘導体〔例えば、テトラメ
チルローダミンイソチオシネート（ＴＲＩＴＣ）、テキ
サスレッド等〕、４‐フルオロ‐７‐ニトロベンゾフラ
ン（ＮＢＤＦ）およびダンシルなどの蛍光物質あるいは
アクリジン等の化学発光物質が挙げられる。これらによ
りオリゴヌクレオチドを標識する場合は、いずれも公知
手段（特開昭５９−９３０９８号、特開昭５９−９３０
９９号各公報参照）により、標識化を行うことができ
る。また、ヌクレオチド三リン酸を標識する場合は公知
手段〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 4045 (1983)
、特開昭６３−１５２３６４公報〕に準じて行うか、
市販品を利用することができる。
【００２７】本発明の好ましい態様によれば、この試料
ＤＮＡの標識は標識化されたオリゴヌクレオチドプライ
マーを使用し、ＰＣＲ法によって増幅と同時に行われる
のが好ましい。さらに本発明の最も好ましい態様によれ
ば、標識されたプライマーとして下記の配列１７および
１８を用いるのが好ましい。 配列１７：ＣＣＧＣＴＧＣＡＣＴＧＴＧＡＡＧＣＴＣＴ 配列１８：ＴＣＧＴＧＴＣＣＣＣＡＣＡＧＣＡＣＧＴ このプライマーの使用により、非特異的な反応が防止さ
れ、ＨＬＡ−ＤＲ抗原をコードする遺伝子のみを増幅す
ることができ、より明確なタイピングを行うことができ
る。
ＤＮＡの標識は標識化されたオリゴヌクレオチドプライ
マーを使用し、ＰＣＲ法によって増幅と同時に行われる
のが好ましい。さらに本発明の最も好ましい態様によれ
ば、標識されたプライマーとして下記の配列１７および
１８を用いるのが好ましい。 配列１７：ＣＣＧＣＴＧＣＡＣＴＧＴＧＡＡＧＣＴＣＴ 配列１８：ＴＣＧＴＧＴＣＣＣＣＡＣＡＧＣＡＣＧＴ このプライマーの使用により、非特異的な反応が防止さ
れ、ＨＬＡ−ＤＲ抗原をコードする遺伝子のみを増幅す
ることができ、より明確なタイピングを行うことができ
る。
【００２８】本発明において、上記配列と試料ＤＮＡと
のハイブリダイズの有無を検出する操作は、存在する標
識の種類に応じて適宜選択され、決定されてよい。
のハイブリダイズの有無を検出する操作は、存在する標
識の種類に応じて適宜選択され、決定されてよい。
【００２９】ここで、目的核酸に存在する標識が直接検
出可能なものである場合、すなわち標識が例えばラジオ
アイソトープ、蛍光物質、色素などである場合には、標
識核酸が固相に結合した状態で検出操作を行うかまたは
標識物を核酸と結合したまま、あるいは標識物を核酸か
ら切り放した状態で溶液中に遊離させた後、その標識に
応じた方法によって検出操作を行なう。また、標識が間
接的に検出可能なものである場合、すなわち標識が例え
ばビオチン，ハプテンなどの特異的結合反応のリガンド
である場合、一般的にそれらの検出に用いられているよ
うに、直接信号を発生する標識あるいは信号を発生する
反応を触媒する酵素を結合した受容体（たとえばアビジ
ンまたは抗体）を使用して検出操作を行う。
出可能なものである場合、すなわち標識が例えばラジオ
アイソトープ、蛍光物質、色素などである場合には、標
識核酸が固相に結合した状態で検出操作を行うかまたは
標識物を核酸と結合したまま、あるいは標識物を核酸か
ら切り放した状態で溶液中に遊離させた後、その標識に
応じた方法によって検出操作を行なう。また、標識が間
接的に検出可能なものである場合、すなわち標識が例え
ばビオチン，ハプテンなどの特異的結合反応のリガンド
である場合、一般的にそれらの検出に用いられているよ
うに、直接信号を発生する標識あるいは信号を発生する
反応を触媒する酵素を結合した受容体（たとえばアビジ
ンまたは抗体）を使用して検出操作を行う。
【００３０】
【実施例】実施例１ 特開平５−１９２１９８号公報に開示された方法に従
い、下記の第１表に示される１６種類の配列のそれぞれ
について、その配列が約５０回繰り返された配列を含む
一本鎖ＤＮＡを調製した。得られたそれぞれの一本鎖Ｄ
ＮＡをマイクロタイタープレートに次のように固定し
た。まず、０．７５Ｍ塩化ナトリウム、０．１５Ｍトリ
ス−塩酸、および０．１５Ｍ塩化マグネシウム（ｐＨ
８．０）溶液に前記一本鎖ＤＮＡを溶解し、４μｇ／ｍ
ｌ溶液を調製した。この一本鎖ＤＮＡ溶液をマイクロタ
イタープレートに１ウエル当たり１００μｌずつ加え
た。プレートにふたをして３７℃１６時間放置した後、
洗浄緩衝液（１Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍトリス−塩
酸、２ｍＭ塩化マグネシウム、０．１％ツイーン２０
（ｐＨ９．３））で３回洗浄した。
い、下記の第１表に示される１６種類の配列のそれぞれ
について、その配列が約５０回繰り返された配列を含む
一本鎖ＤＮＡを調製した。得られたそれぞれの一本鎖Ｄ
ＮＡをマイクロタイタープレートに次のように固定し
た。まず、０．７５Ｍ塩化ナトリウム、０．１５Ｍトリ
ス−塩酸、および０．１５Ｍ塩化マグネシウム（ｐＨ
８．０）溶液に前記一本鎖ＤＮＡを溶解し、４μｇ／ｍ
ｌ溶液を調製した。この一本鎖ＤＮＡ溶液をマイクロタ
イタープレートに１ウエル当たり１００μｌずつ加え
た。プレートにふたをして３７℃１６時間放置した後、
洗浄緩衝液（１Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍトリス−塩
酸、２ｍＭ塩化マグネシウム、０．１％ツイーン２０
（ｐＨ９．３））で３回洗浄した。
【００３１】ヒト白血球より抽出したＤＮＡをサンプル
とし、５′側にビオチン標識した配列１７および配列１
８をプライマーとして、ＰＣＲ法により３０サイクルの
増幅を行った。得られた増幅物を熱変性した後、その５
μｌを、ハイブリダイゼーション溶液１００μｌが入れ
られた上記の一本鎖ＤＮＡが固定されたウエルに添加
し、５８℃で１時間放置した。液を棄てた後、６５℃の
３Ｍ塩化テトラメチルアンモニウム溶液２００μｌを加
え、６５℃で５分間放置した。液を棄て再び６５℃の３
Ｍ塩化テトラメチルアンモニウム溶液２００μｌを加
え、６５℃で１０分間放置した。液を棄てた後、酵素希
釈液（０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍトリス塩酸、
２ｍＭ塩化マグネシウム、０．０５％ツイーン２０（ｐ
Ｈ７．５））３００μｌで３回洗浄した。液を除去した
後、酵素希釈液で５０００倍に希釈したペルオキシダー
ゼ標識アビジン（ベクター社製）１００μｌを加え、室
温に１５分間放置した。液を除去後、酵素希釈液３００
μｌで３回洗浄した。発色基質液（１．５ｍＭ ２，
２′‐アジノ‐ビス‐（３‐エチルベンゾチアゾリン‐
６‐スルホニックアシッド）ジアンモニウム、０．０１
５％ Ｈ２Ｏ２含有０．２Ｍ酒石酸緩衝液ｐＨ４．４）
を加え、１５分間室温で反応させた後、４１５ｎｍの吸
光度を測定した。
とし、５′側にビオチン標識した配列１７および配列１
８をプライマーとして、ＰＣＲ法により３０サイクルの
増幅を行った。得られた増幅物を熱変性した後、その５
μｌを、ハイブリダイゼーション溶液１００μｌが入れ
られた上記の一本鎖ＤＮＡが固定されたウエルに添加
し、５８℃で１時間放置した。液を棄てた後、６５℃の
３Ｍ塩化テトラメチルアンモニウム溶液２００μｌを加
え、６５℃で５分間放置した。液を棄て再び６５℃の３
Ｍ塩化テトラメチルアンモニウム溶液２００μｌを加
え、６５℃で１０分間放置した。液を棄てた後、酵素希
釈液（０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍトリス塩酸、
２ｍＭ塩化マグネシウム、０．０５％ツイーン２０（ｐ
Ｈ７．５））３００μｌで３回洗浄した。液を除去した
後、酵素希釈液で５０００倍に希釈したペルオキシダー
ゼ標識アビジン（ベクター社製）１００μｌを加え、室
温に１５分間放置した。液を除去後、酵素希釈液３００
μｌで３回洗浄した。発色基質液（１．５ｍＭ ２，
２′‐アジノ‐ビス‐（３‐エチルベンゾチアゾリン‐
６‐スルホニックアシッド）ジアンモニウム、０．０１
５％ Ｈ２Ｏ２含有０．２Ｍ酒石酸緩衝液ｐＨ４．４）
を加え、１５分間室温で反応させた後、４１５ｎｍの吸
光度を測定した。
【００３２】各配列の吸光度は下記の表に示される通り
であった。また、その結果より、各サンプルについてＤ
Ｒ遺伝子のタイプを判定した。その結果は下記の表に示
される通りであった。
であった。また、その結果より、各サンプルについてＤ
Ｒ遺伝子のタイプを判定した。その結果は下記の表に示
される通りであった。
【００３３】 第１表 サンプル ６２ Ｋ Ｗ 配列１ ０．１１ ０．１０ ０．１０ ２ ２．３２ ０．１５ ０．１３ ３ ０．１６ １．９９ ０．１７ ４ ０．１３ １．１０ ０．１２ ５ ０．１１ ０．１１ ０．１１ ２１ ０．１４ ０．４２ ０．４３ ７ ０．１１ ０．９７ １．４９ ８ ０．１５ ０．１５ ０．１５ ９ ０．１０ ０．１１ ０．１１ １０ １．３６ ０．１５ ０．１４ １１ ０．１２ ０．１２ ０．１２ １２ ０．１０ ０．３６ ０．６２ １３ ０．１６ ０．１９ ０．１５ １４ ０．１３ ０．１３ ０．１３ １５ ０．１１ ０．１２ １．５０ １６ １．１１ １．３１ １．７８ ＤＲタイプ （1501-1503/ （0301-0303,0401 (1301/1302/1304, 1601,0901) /0403-0411/1410) 1301-1307/1401/ 1402/1405/1409)
【００３４】実施例２ 上記実施例１を同様の実験を別のサンプルに対して行っ
た。その結果は次の表に示される通りであった。また、
その結果より、各サンプルについてＤＲ遺伝子タイプを
判定した。その結果は下記の表に示される通りであっ
た。
た。その結果は次の表に示される通りであった。また、
その結果より、各サンプルについてＤＲ遺伝子タイプを
判定した。その結果は下記の表に示される通りであっ
た。
【００３５】 第２表 サンプル ＯＫＢ１７ ＯＫＢ３５ Ｎ 配列１ ０．１１ ０．３３ ２．３７ ２ ０．１９ ３．００ ０．１５ ３ ０．２９ １．１５ ０．１９ ４ １．１３ ０．１７ ０．１４ ５ ０．１２ ０．１３ ０．１３ ２１ ０．１３ ０．１８ ０．１５ ７ ０．１１ ０．１１ ０．９５ ８ ２．０６ ０．１９ ０．１４ ９ ０．１２ ０．１２ １．２５ １０ ０．１５ ０．３９ ０．１６ １１ ０．１２ １．９５ ０．１２ １２ ０．１１ ０．１２ ０．１０ １３ ０．２４ ０．２０ １．３２ １４ ０．１１ ０．１３ ０．１２ １５ ０．１０ ０．１０ ０．１０ １６ ２．２２ ２．０７ １．９９ ＤＲタイプ （0401/0403- （1501-1503/ (0101/0102, 0411/1410,0701) 1601,1001) 0801/0804）
【００３６】実施例３ 特開平５−１９２１９８号公報に開示された方法に従
い、配列６、配列２１、配列２２、配列２３、および配
列２４のそれぞれについて、その配列が約５０回繰り返
された配列を含む一本鎖ＤＮＡを調製した。得られたそ
れぞれの一本鎖ＤＮＡをマイクロタイタープレートに次
のように固定した。まず、０．７５Ｍ塩化ナトリウム、
０．１５Ｍトリス‐塩酸、および０．１５Ｍ塩化マグネ
シウム（ｐＨ８．０）溶液に上記一本鎖ＤＮＡを溶解
し、４μｇ／ｍｌ溶液を調製した。この一本鎖ＤＮＡ溶
液をマイクロタイタープレートに１ウエル当たり１００
μｌずつ加えた。プレートにふたをして３７℃１６時間
放置した後、洗浄緩衝液（１Ｍ塩化ナトリウム、０．１
Ｍトリス‐塩酸、２ｍＭ塩化マグネシウム、０．１％ツ
イーン２０（ｐＨ９．３））で３回洗浄した。
い、配列６、配列２１、配列２２、配列２３、および配
列２４のそれぞれについて、その配列が約５０回繰り返
された配列を含む一本鎖ＤＮＡを調製した。得られたそ
れぞれの一本鎖ＤＮＡをマイクロタイタープレートに次
のように固定した。まず、０．７５Ｍ塩化ナトリウム、
０．１５Ｍトリス‐塩酸、および０．１５Ｍ塩化マグネ
シウム（ｐＨ８．０）溶液に上記一本鎖ＤＮＡを溶解
し、４μｇ／ｍｌ溶液を調製した。この一本鎖ＤＮＡ溶
液をマイクロタイタープレートに１ウエル当たり１００
μｌずつ加えた。プレートにふたをして３７℃１６時間
放置した後、洗浄緩衝液（１Ｍ塩化ナトリウム、０．１
Ｍトリス‐塩酸、２ｍＭ塩化マグネシウム、０．１％ツ
イーン２０（ｐＨ９．３））で３回洗浄した。
【００３７】ヒト白血球より抽出したＤＮＡをサンプル
とし、５′側にビオチン標識した配列１７および配列１
８をプライマーとしてＰＣＲ法により３５サイクルの増
幅を行った。得られた増幅物を熱変性した後、その５μ
ｌを、ハイブリダイゼーション溶液１００μｌが入れら
れた上記の一本鎖ＤＮＡが固定されたウエルに添加し、
５８℃で１時間放置した。液を棄てた後、６５℃の３Ｍ
塩化テトラメチルアンモニウム溶液２００μｌを加え、
６５℃で５分間放置した。液を棄てて再び６５℃の３Ｍ
塩化テトラメチルアンモニウム溶液２００μｌを加え、
６５℃で１０分間放置した。液を棄てた後、酵素希釈液
（０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍトリス‐塩酸、２
ｍＭ塩化マグネシウム、０．０５％ツイーン２０（ｐＨ
７．５）２００μｌで３回洗浄した。液を除去した後、
酵素希釈液で２０００倍に希釈したアルカリホスファタ
ーゼ標識アビジン（ＢＲＬ社製）１００μｌを加え、室
温に１５分間放置した。液を除去後、酵素希釈液２００
μｌで３回洗浄した。発色基質液（４ｍｇｐ‐ニトロフ
ェニルリン酸、１Ｍジエタノールアミン、０．５ｍＭ塩
化マグネシウムｐＨ９．８）を加え、６０分間室温で反
応させた後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。各配列の
吸光度は次の表に示される通りであった。
とし、５′側にビオチン標識した配列１７および配列１
８をプライマーとしてＰＣＲ法により３５サイクルの増
幅を行った。得られた増幅物を熱変性した後、その５μ
ｌを、ハイブリダイゼーション溶液１００μｌが入れら
れた上記の一本鎖ＤＮＡが固定されたウエルに添加し、
５８℃で１時間放置した。液を棄てた後、６５℃の３Ｍ
塩化テトラメチルアンモニウム溶液２００μｌを加え、
６５℃で５分間放置した。液を棄てて再び６５℃の３Ｍ
塩化テトラメチルアンモニウム溶液２００μｌを加え、
６５℃で１０分間放置した。液を棄てた後、酵素希釈液
（０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍトリス‐塩酸、２
ｍＭ塩化マグネシウム、０．０５％ツイーン２０（ｐＨ
７．５）２００μｌで３回洗浄した。液を除去した後、
酵素希釈液で２０００倍に希釈したアルカリホスファタ
ーゼ標識アビジン（ＢＲＬ社製）１００μｌを加え、室
温に１５分間放置した。液を除去後、酵素希釈液２００
μｌで３回洗浄した。発色基質液（４ｍｇｐ‐ニトロフ
ェニルリン酸、１Ｍジエタノールアミン、０．５ｍＭ塩
化マグネシウムｐＨ９．８）を加え、６０分間室温で反
応させた後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。各配列の
吸光度は次の表に示される通りであった。
【００３８】 第３表 配 列 サンプル DRB1タイプ ６ ２１ ２２ ２３ ２４ ２２ 1201, 0801 1.50 1.37 0.53 0.12 0.08 ６５ 0901, 1201 1.49 1.21 0.41 0.15 0.24 ６９ 0403, 1201 1.88 1.68 0.26 0.16 0.11 １０７ 0803, 1201 1.06 0.75 0.29 0.11 0.07 １０８ 0101, 0406 DRB4*0101 0.11 0.13 0.36 0.06 0.05 ６４ 1502, 1403 DRB3*0101 0.25 0.18 0.54 0.12 0.10 １２１ 0901, 1403 DRB3*0101 0.02 0.14 0.38 0.01 0.00 １１７ 0901, 1101 DRB3*0202 0.02 0.27 0.92 0.01 0.02
【００３９】実施例４ 配列６および２１のみについて、実施例３と一部共通す
るサンプルについて、実施例３と同様の実験を行った。
各配列の吸光度は次の表に示される通りであった。
るサンプルについて、実施例３と同様の実験を行った。
各配列の吸光度は次の表に示される通りであった。
【００４０】 第４表 配列 サンプル DRB1タイプ ６ ２１ ２２ 1201, 0801 0.62 0.46 ６９ 0403, 1201 0.45 0.40 １０７ 0803, 1201 1.00 0.96 ９２ 1502, 1101 0.14 0.20 ９３ 0405, 1101 0.10 0.23 １１７ 0901, 1101 DRB3*0202 0.11 0.18 １１８ 1101, 1405 0.14 0.22 ６４ 1502, 1403 DRB3*0101 0.14 0.10
【００４１】実施例５ 特開平５−１９２１９８号公報に開示された方法に従
い、配列５、配列５ａ、配列１９、配列１９ａ、および
配列２０のそれぞれについて、その配列が約５０回繰り
返された配列を含む一本鎖ＤＮＡを調製した。得られた
それぞれの一本鎖ＤＮＡをマイクロタイタープレートに
次のように固定した。まず、０．７５Ｍ塩化ナトリウ
ム、０．１５Ｍトリス‐塩酸、および０．１５Ｍ塩化マ
グネシウム（ｐＨ８．０）溶液に上記一本鎖ＤＮＡを溶
解し、４μｇ／ｍｌ溶液を調製した。この一本鎖ＤＮＡ
溶液をマイクロタイタープレートに１ウエル当たり１０
０μｌずつ加えた。プレートにふたをして３７℃１６時
間放置した後、洗浄緩衝液（１Ｍ塩化ナトリウム、０．
１Ｍトリス‐塩酸、２ｍＭ塩化マグネシウム、０．１％
ツイーン２０（ｐＨ９．３））で３回洗浄した。
い、配列５、配列５ａ、配列１９、配列１９ａ、および
配列２０のそれぞれについて、その配列が約５０回繰り
返された配列を含む一本鎖ＤＮＡを調製した。得られた
それぞれの一本鎖ＤＮＡをマイクロタイタープレートに
次のように固定した。まず、０．７５Ｍ塩化ナトリウ
ム、０．１５Ｍトリス‐塩酸、および０．１５Ｍ塩化マ
グネシウム（ｐＨ８．０）溶液に上記一本鎖ＤＮＡを溶
解し、４μｇ／ｍｌ溶液を調製した。この一本鎖ＤＮＡ
溶液をマイクロタイタープレートに１ウエル当たり１０
０μｌずつ加えた。プレートにふたをして３７℃１６時
間放置した後、洗浄緩衝液（１Ｍ塩化ナトリウム、０．
１Ｍトリス‐塩酸、２ｍＭ塩化マグネシウム、０．１％
ツイーン２０（ｐＨ９．３））で３回洗浄した。
【００４２】ヒト白血球より抽出したＤＮＡをサンプル
とし、５′側にビオチン標識した配列１７および配列１
８をプライマーとしてＰＣＲ法により３５サイクルの増
幅を行った。得られた増幅物を熱変性した後、その５μ
ｌを、ハイブリダイゼーション溶液１００μｌが入れら
れた上記の一本鎖ＤＮＡが固定されたウエルに添加し、
５８℃で１時間放置した。液を棄てた後、６５℃の３Ｍ
塩化テトラメチルアンモニウム溶液２００μｌを加え、
６５℃で５分間放置した。液を棄てて再び６５℃の３Ｍ
塩化テトラメチルアンモニウム溶液２００μｌを加え、
６５℃で１０分間放置した。液を棄てた後、酵素希釈液
（０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍトリス‐塩酸、２
ｍＭ塩化マグネシウム、０．０５％ツイーン２０（ｐＨ
７．５））２００μｌで３回洗浄した。液を除去した
後、酵素希釈液で２０００倍に希釈したアルカリホスフ
ァターゼ標識アビジン（ＢＲＬ社製）１００μｌを加
え、室温に１５分間放置した。液を除去後、酵素希釈液
２００μｌで３回洗浄した。発色基質液（４ｍｇｐ‐ニ
トロフェニルリン酸、１Ｍジエタノールアミン、０．５
ｍＭ塩化マグネシウムｐＨ９．８）を加え、６０分間室
温で反応させた後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。各
配列の吸光度は次の表に示される通りであった。
とし、５′側にビオチン標識した配列１７および配列１
８をプライマーとしてＰＣＲ法により３５サイクルの増
幅を行った。得られた増幅物を熱変性した後、その５μ
ｌを、ハイブリダイゼーション溶液１００μｌが入れら
れた上記の一本鎖ＤＮＡが固定されたウエルに添加し、
５８℃で１時間放置した。液を棄てた後、６５℃の３Ｍ
塩化テトラメチルアンモニウム溶液２００μｌを加え、
６５℃で５分間放置した。液を棄てて再び６５℃の３Ｍ
塩化テトラメチルアンモニウム溶液２００μｌを加え、
６５℃で１０分間放置した。液を棄てた後、酵素希釈液
（０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍトリス‐塩酸、２
ｍＭ塩化マグネシウム、０．０５％ツイーン２０（ｐＨ
７．５））２００μｌで３回洗浄した。液を除去した
後、酵素希釈液で２０００倍に希釈したアルカリホスフ
ァターゼ標識アビジン（ＢＲＬ社製）１００μｌを加
え、室温に１５分間放置した。液を除去後、酵素希釈液
２００μｌで３回洗浄した。発色基質液（４ｍｇｐ‐ニ
トロフェニルリン酸、１Ｍジエタノールアミン、０．５
ｍＭ塩化マグネシウムｐＨ９．８）を加え、６０分間室
温で反応させた後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。各
配列の吸光度は次の表に示される通りであった。
【００４３】 第５表 配 列 サンプル DRB1タイプ ５ ５ａ １９ １９ａ ２０ JRC30 0.855 0.413 0.588 0.485 0.321 69 0403, 1201 0.117 0.091 0.203 0.109 0.095 93 0405, 1101 0.552 0.254 0.398 0.283 0.209 118 1101, 1405 0.582 0.439 0.804 0.365 0.395
【００４４】実施例６ 配列５、配列１９、および配列２０のみについて、実施
例５と一部共通するサンプルについて、実施例５と同様
の実験を行った。各配列の吸光度は次の表に示される通
りであった。
例５と一部共通するサンプルについて、実施例５と同様
の実験を行った。各配列の吸光度は次の表に示される通
りであった。
【００４５】 第６表 配 列 サンプル DRB1タイプ ５ １９ ２０ ２３ 0901 0.022 0.057 0.075 ６３ 0403 0.026 0.171 0.041 ９２ 1502, 1101 0.461 0.392 0.194 ９３ 0405, 1101 0.515 0.513 0.266 １１７ 0901, 1101 0.538 0.470 0.375 １１８ 1101, 1405 0.421 0.393 0.310 Ｋ 0301, 0403 0.040 0.184 0.022
【００４６】実施例７ 特開平５−１９２１９８号公報に開示された方法に従
い、下記の第７表に示された１６種類の配列のそれぞれ
について、その配列が約５０回繰り返された配列を含む
一本鎖ＤＮＡを調製した。得られたそれぞれの一本鎖Ｄ
ＮＡをマイクロタイタープレートに以下のように固定し
た。まず、０．７５Ｍ塩化ナトリウム、０．１５Ｍトリ
ス−塩酸、および０．１５Ｍ塩化マグネシウム（ｐＨ
８．０）溶液に前記一本鎖ＤＮＡを溶解し、４μｇ／ｍ
ｌ溶液を調製した。この一本鎖ＤＮＡ溶液をマイクロタ
イタープレートに１ウエル当たり１００μｌずつ加え
た。プレートにふたをして３７℃１６時間放置した後洗
浄緩衝液（１Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍトリス−塩
酸、２ｍＭ塩化マグネシウム、０．１％ツイーン２０
（ｐＨ９．３））で３回洗浄した。
い、下記の第７表に示された１６種類の配列のそれぞれ
について、その配列が約５０回繰り返された配列を含む
一本鎖ＤＮＡを調製した。得られたそれぞれの一本鎖Ｄ
ＮＡをマイクロタイタープレートに以下のように固定し
た。まず、０．７５Ｍ塩化ナトリウム、０．１５Ｍトリ
ス−塩酸、および０．１５Ｍ塩化マグネシウム（ｐＨ
８．０）溶液に前記一本鎖ＤＮＡを溶解し、４μｇ／ｍ
ｌ溶液を調製した。この一本鎖ＤＮＡ溶液をマイクロタ
イタープレートに１ウエル当たり１００μｌずつ加え
た。プレートにふたをして３７℃１６時間放置した後洗
浄緩衝液（１Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍトリス−塩
酸、２ｍＭ塩化マグネシウム、０．１％ツイーン２０
（ｐＨ９．３））で３回洗浄した。
【００４７】ヒト白血球より抽出したＤＮＡをサンプル
とし、に５′側にビチオン標識した配列１７および配列
１８をブライマーとして、ＰＣＲ法により３０サイクル
の増幅を行った。得られた増幅物を熱変性した後、その
５μｌを、ハイブリダイゼーション溶液１００μｌが入
れられた上記の一本鎖ＤＮＡが固定されたウエルを添加
し、５８℃で１時間放置した。液を棄てた後、６５℃の
３Ｍ塩化テトラメチルアンモニウム溶液２００μｌを加
え、６５℃で５分間放置した。液を棄て再び６５℃の３
Ｍ塩化テトラメチルアンモニウム溶液２００μｌを加
え、６５℃で１０分間放置した。液を棄てた後、酵素希
釈液（０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍトリス−塩
酸、２ｍＭ塩化マグネシウム、０．０５％ツイーン２０
（ｐＨ７．５））、３００μｌで３回洗浄する。液を除
去した後、酵素希釈液で５０００倍に希釈したペルオキ
シダーゼ標識アビジン１００μｌを加え、室温に１５分
間放置した。液を除去後酵素希釈液３００μｌで３回洗
浄した。発色基質液（１．５ｍＭ２，２′‐アジノービ
ス‐（３‐エチルベンチアゾリン‐６‐スルホニックア
シッド）ジアンモニウム、０．０１５％ Ｈ２Ｏ２含有
０．２Ｍ酒石酸緩衝液ｐＨ４．４）を加え、１５分間室
温で反応させた後、４１５ｎｍの吸光度を測定した。
各配列の吸光度は下記の表に示される通りであった。ま
た、その結果より、各サンプルについてＤＲ遺伝子のタ
イプを判定した。その結果は下記の表に示される通りで
あった。
とし、に５′側にビチオン標識した配列１７および配列
１８をブライマーとして、ＰＣＲ法により３０サイクル
の増幅を行った。得られた増幅物を熱変性した後、その
５μｌを、ハイブリダイゼーション溶液１００μｌが入
れられた上記の一本鎖ＤＮＡが固定されたウエルを添加
し、５８℃で１時間放置した。液を棄てた後、６５℃の
３Ｍ塩化テトラメチルアンモニウム溶液２００μｌを加
え、６５℃で５分間放置した。液を棄て再び６５℃の３
Ｍ塩化テトラメチルアンモニウム溶液２００μｌを加
え、６５℃で１０分間放置した。液を棄てた後、酵素希
釈液（０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍトリス−塩
酸、２ｍＭ塩化マグネシウム、０．０５％ツイーン２０
（ｐＨ７．５））、３００μｌで３回洗浄する。液を除
去した後、酵素希釈液で５０００倍に希釈したペルオキ
シダーゼ標識アビジン１００μｌを加え、室温に１５分
間放置した。液を除去後酵素希釈液３００μｌで３回洗
浄した。発色基質液（１．５ｍＭ２，２′‐アジノービ
ス‐（３‐エチルベンチアゾリン‐６‐スルホニックア
シッド）ジアンモニウム、０．０１５％ Ｈ２Ｏ２含有
０．２Ｍ酒石酸緩衝液ｐＨ４．４）を加え、１５分間室
温で反応させた後、４１５ｎｍの吸光度を測定した。
各配列の吸光度は下記の表に示される通りであった。ま
た、その結果より、各サンプルについてＤＲ遺伝子のタ
イプを判定した。その結果は下記の表に示される通りで
あった。
【００４８】 第７表 サンプル Ｎ Ｏ 配列１ ３．５８ ０．０３ ２ ０．１３ ０．０５ ３ ０．１８ ０．１０ ４ ０．０９ ０．０３ ５ ０．０９ ０．０３ ６ ０．１２ ２．３６ ７ １．２０ １．１３ ８ ０．１１ ０．０４ ９ ２．１３ ０．０４ １０ ０．２０ ０．０５ １１ ０．０９ ０．０４ １２ ０．０３ ０．４３ １３ １．５７ １．７２ １４ ０．０４ ０．０６ １５ ０．０２ １．２４ １６ ２．７７ ３．２７ ＤＲタイプ(0101/0102,0801/0804） (1201/1202,1301/1302/1304)
Claims (4)
- 【請求項１】下記の配列１〜１６で示されるオリゴヌク
レオチドおよび／またはその相補鎖の一部または全部か
らなる、ＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子のタイピングに用い
られるプローブセット。 配列１：ＣＧＧＴＴＧＣＴＧＧＡＡＡＧＡＴＧＣＡＴＣ 配列２：ＡＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＴＡＧＧＣＴＧ 配列３：ＧＧＣＣＧＧＧＴＧＧＡＣＡＡＣＴＡＣ 配列４：ＡＴＧＴＴＴＡＡＣＣＴＧＣＴＣＣＡＡ 配列５：ＣＣＴＧＡＴＧＡＧＧＡＧＴＡＣＴＧＧＡＡ 配列６：ＡＧＣＴＡＣＴＧＣＧＣＴＴＣＧＡＣ 配列７：ＣＧＴＡＧＡＧＴＡＣＴＣＣＡＡＧＡＡ 配列８：ＣＴＴＡＴＡＣＴＴＡＣＣＣＴＧＣＣＡ 配列９：ＡＧＡＣＡＧＧＣＧＧＧＣＣＣＴ 配列１０：ＴＣＡＡＡＣＴＴＡＴＣＣＴＧＣＴＴＣ 配列１１：ＡＡＡＣＴＴＡＡＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡ 配列１２：ＡＣＴＣＴＡＣＧＴＣＴＧＡＧＴＧＴＣ 配列１３：ＡＣＧＧＧＴＧＡＧＴＧＴＴＡＴＴＴＣ 配列１４：ＧＡＣＣＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡＣＡＧＧ 配列１５：ＡＣＡＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡＣＧＡＧＣ 配列１６：ＣＣＣＧＴＡＧＴＴＧＴＧＴＣＴＧＣＡ - 【請求項２】核酸試料と、請求項１記載のオリゴヌクレ
オチドおよび／またはその相補鎖の一部または全部との
相補性の有無を検出することを含んでなる、ＨＬＡ−Ｄ
Ｒ抗原の遺伝子のタイピング法。 - 【請求項３】核酸試料が、下記の配列１７および１８： 配列１７：ＣＣＧＣＴＧＣＡＣＴＧＴＧＡＡＧＣＴＣＴ 配列１８：ＴＣＧＴＧＴＣＣＣＣＡＣＡＧＣＡＣＧＴ で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして増幅
されたものである、請求項２記載のＨＬＡ−ＤＲ抗原の
遺伝子のタイピング法。 - 【請求項４】ＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子タイピング用キ
ットであって、 固相担体と、標識プライマーとを含んでなり、前記固相
担体には、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドおよび
／またはその相補鎖の一部または全部を含む一本鎖核酸
が固定されてなり、該オリゴヌクレオチドおよびその相
補鎖のそれぞれは１またはそれ以上繰り返していてもよ
く、 前記標識プライマーが請求項３に記載の配列１７および
１８で表される配列を含んでなるプライマーであること
を特徴とする、キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8053480A JPH08308596A (ja) | 1995-03-10 | 1996-03-11 | Ｈｌａの検出 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5143795 | 1995-03-10 | ||
| JP7-51437 | 1995-03-10 | ||
| JP8053480A JPH08308596A (ja) | 1995-03-10 | 1996-03-11 | Ｈｌａの検出 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08308596A true JPH08308596A (ja) | 1996-11-26 |
Family
ID=26391973
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8053480A Pending JPH08308596A (ja) | 1995-03-10 | 1996-03-11 | Ｈｌａの検出 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08308596A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2793808A1 (fr) * | 1999-05-20 | 2000-11-24 | Biomerieux Sa | Procede d'analyse de la predisposition genetique d'un patient a au moins une maladie |
| FR2793809A1 (fr) * | 1999-05-20 | 2000-11-24 | Biomerieux Sa | Procede d'analyse de la predisposition genetique d'un patient a au moins une maladie et amplification adaptee a un tel procede |
| WO2000065088A3 (en) * | 1999-04-26 | 2001-08-09 | Amersham Pharm Biotech Ab | Primers for identifying typing or classifying nucleic acids |
| JP2005185171A (ja) * | 2003-12-25 | 2005-07-14 | Canon Inc | Ｈｌａ−ｄｒアレルを同定するためのプローブセット及び特定方法 |
| US8193331B2 (en) | 2003-12-25 | 2012-06-05 | Canon Kabushiki Kaisha | Probe set and method for identifying HLA allele |
-
1996
- 1996-03-11 JP JP8053480A patent/JPH08308596A/ja active Pending
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000065088A3 (en) * | 1999-04-26 | 2001-08-09 | Amersham Pharm Biotech Ab | Primers for identifying typing or classifying nucleic acids |
| FR2793808A1 (fr) * | 1999-05-20 | 2000-11-24 | Biomerieux Sa | Procede d'analyse de la predisposition genetique d'un patient a au moins une maladie |
| FR2793809A1 (fr) * | 1999-05-20 | 2000-11-24 | Biomerieux Sa | Procede d'analyse de la predisposition genetique d'un patient a au moins une maladie et amplification adaptee a un tel procede |
| WO2000071750A1 (fr) * | 1999-05-20 | 2000-11-30 | Bio Merieux | Procede d'analyse de la predisposition genetique d'un patient a au moins une maladie et amplification adaptee a un tel procede |
| US7060438B1 (en) | 1999-05-20 | 2006-06-13 | Bio Merieux | Method for analyzing a patient's genetic prediposition to at least one disease and amplification adapted to such a method |
| JP2005185171A (ja) * | 2003-12-25 | 2005-07-14 | Canon Inc | Ｈｌａ−ｄｒアレルを同定するためのプローブセット及び特定方法 |
| US8193331B2 (en) | 2003-12-25 | 2012-06-05 | Canon Kabushiki Kaisha | Probe set and method for identifying HLA allele |
| US8624015B2 (en) | 2003-12-25 | 2014-01-07 | Canon Kabushiki Kaisha | Probe set and method for identifying HLA allele |
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