JPH06329694A - ポリヌクレオチド固定化方法 - Google Patents
ポリヌクレオチド固定化方法Info
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- JPH06329694A JPH06329694A JP11861593A JP11861593A JPH06329694A JP H06329694 A JPH06329694 A JP H06329694A JP 11861593 A JP11861593 A JP 11861593A JP 11861593 A JP11861593 A JP 11861593A JP H06329694 A JPH06329694 A JP H06329694A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は、固相担体に遺伝子を固定化する方
法において、標的核酸またはプローブの固定化の効率を
改善することにより、高感度な検出方法を提供するもの
である。 【構成】 固相担体に標的核酸またはプローブを固定化
する方法において、その配列内に下記一般式（Ｉ）で表
されるリンカーアームヌクレオチドを含有させることに
より、高感度な核酸ハイブリダイゼーション法を実現す
る。 一般式（Ｉ）： Ｇ−Ｐ−Ｑ （式中、Ｇはリボースまたはデオキシリボースから還元
末端の１位の炭素原子が外れた残基を示す。Ｐはアデノ
シン、グアノシン、シトシン、チミジン、ウリジンのい
ずれか１つを示す。Ｑは１〜15個の炭素原子を含む１価
の有機基を示す。）
法において、標的核酸またはプローブの固定化の効率を
改善することにより、高感度な検出方法を提供するもの
である。 【構成】 固相担体に標的核酸またはプローブを固定化
する方法において、その配列内に下記一般式（Ｉ）で表
されるリンカーアームヌクレオチドを含有させることに
より、高感度な核酸ハイブリダイゼーション法を実現す
る。 一般式（Ｉ）： Ｇ−Ｐ−Ｑ （式中、Ｇはリボースまたはデオキシリボースから還元
末端の１位の炭素原子が外れた残基を示す。Ｐはアデノ
シン、グアノシン、シトシン、チミジン、ウリジンのい
ずれか１つを示す。Ｑは１〜15個の炭素原子を含む１価
の有機基を示す。）
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は担体にポリヌクレオチド
を固定化する方法に関する。より詳細には、標的核酸ま
たは標的を捕らえるための遺伝子プローブ（ポリヌクレ
オチド）を固相担体に結合させる方法に関する。
を固定化する方法に関する。より詳細には、標的核酸ま
たは標的を捕らえるための遺伝子プローブ（ポリヌクレ
オチド）を固相担体に結合させる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子（ＤＮＡ）にコードされた遺伝情
報はメッセンジャーＲＮＡを介して酵素等のタンパク質
として表現され、これらのタンパク質の働きにより生成
した様々な化合物の集合体として生物が存在する。この
ような遺伝子の総数はヒトで５〜１０万といわれている
が、その中に何らかの異常や変化（例えば、欠損、重複
など）が生じることがある。その場合には、生成するタ
ンパク質の特性、種類、量などが変化し、その結果、生
体系のバランスが崩れて疾病を引き起こす。したがっ
て、逆に、病因となっている遺伝子を検出することによ
り、疾病の同定や予防が可能となる。近年の遺伝子工学
の進歩に伴い、このような遺伝子そのものに基づく診断
（遺伝子診断と呼ばれている）が可能になってきた。
報はメッセンジャーＲＮＡを介して酵素等のタンパク質
として表現され、これらのタンパク質の働きにより生成
した様々な化合物の集合体として生物が存在する。この
ような遺伝子の総数はヒトで５〜１０万といわれている
が、その中に何らかの異常や変化（例えば、欠損、重複
など）が生じることがある。その場合には、生成するタ
ンパク質の特性、種類、量などが変化し、その結果、生
体系のバランスが崩れて疾病を引き起こす。したがっ
て、逆に、病因となっている遺伝子を検出することによ
り、疾病の同定や予防が可能となる。近年の遺伝子工学
の進歩に伴い、このような遺伝子そのものに基づく診断
（遺伝子診断と呼ばれている）が可能になってきた。
【０００３】遺伝子発現の機構を考えると、生化学的レ
ベルでのほとんどの変化に先行して遺伝子での変化が生
じていることが推定される。したがって遺伝子診断によ
り、病気という表現型での変化に先立つ（すなわち、発
症前や病気の潜伏期あるいはきわめて初期の）診断や予
測が可能となる。また、生体内の細胞の遺伝子は全て同
一であるので、遺伝性の疾患に関しては分析しようとす
る臓器や組織は特定されない。特に、胎児に関しては、
妊婦から羊水を採取して羊水中に浮遊している胎児の細
胞を調べるだけで診断することができ、非常に重要な診
断方法である。
ベルでのほとんどの変化に先行して遺伝子での変化が生
じていることが推定される。したがって遺伝子診断によ
り、病気という表現型での変化に先立つ（すなわち、発
症前や病気の潜伏期あるいはきわめて初期の）診断や予
測が可能となる。また、生体内の細胞の遺伝子は全て同
一であるので、遺伝性の疾患に関しては分析しようとす
る臓器や組織は特定されない。特に、胎児に関しては、
妊婦から羊水を採取して羊水中に浮遊している胎児の細
胞を調べるだけで診断することができ、非常に重要な診
断方法である。
【０００４】一般に、遺伝子診断は次のように行なわれ
る。まず、試料から遺伝子を抽出し、必要があれば適当
な制限酵素で切断する。次に、この遺伝子を電気泳動に
かけ、その後サザンブロットを行なう。次いで、目的と
する遺伝子に対応する遺伝子プローブ（通常は、放射性
同位元素、酵素、蛍光物質などで標識されている）をハ
イブリダイズさせた後、そのプローブの標識を検出する
ことで、目的とする遺伝子の有無を判定する。この方法
において遺伝子プローブの標識剤としては、従来は放射
性同位元素が使用されてきたが、放射性同位元素は診断
場所が限定され、かつ試薬の取扱いにも充分な注意が必
要であるため、放射性同位元素に替わる安全な標識剤の
開発が進められている。すでにビオチン−アビジン結合
を利用するもの、酵素や蛍光物質を使用するもの等が開
発されており、使用が簡便でかつ感度の点でも放射性同
位元素に肩を並べるレベルに到達しようとしている。
る。まず、試料から遺伝子を抽出し、必要があれば適当
な制限酵素で切断する。次に、この遺伝子を電気泳動に
かけ、その後サザンブロットを行なう。次いで、目的と
する遺伝子に対応する遺伝子プローブ（通常は、放射性
同位元素、酵素、蛍光物質などで標識されている）をハ
イブリダイズさせた後、そのプローブの標識を検出する
ことで、目的とする遺伝子の有無を判定する。この方法
において遺伝子プローブの標識剤としては、従来は放射
性同位元素が使用されてきたが、放射性同位元素は診断
場所が限定され、かつ試薬の取扱いにも充分な注意が必
要であるため、放射性同位元素に替わる安全な標識剤の
開発が進められている。すでにビオチン−アビジン結合
を利用するもの、酵素や蛍光物質を使用するもの等が開
発されており、使用が簡便でかつ感度の点でも放射性同
位元素に肩を並べるレベルに到達しようとしている。
【０００５】ところで、上記方法では、遺伝子の検出ま
でに少なくとも数日を要し、測定操作もかなり複雑であ
る。そのため、測定操作、特に洗浄過程を簡略化し、測
定時間を短縮するために、いわゆる「サンドイッチハイ
ブリダイゼーション法」が提示された（Ranki et.al.,G
ene. Vol.21, p77-85,1983、特開昭６０−９３３５５号
広報、特開昭６２−５０１０７号広報、および特開昭６
２−２０５８００号広報）。この方法は、固相担体上に
目的とする遺伝子に対して相補的な塩基配列を有する第
一の遺伝子プローブを固定し、試料中の特定の配列を持
った標的核酸とハイブリダイズさせ、さらに、該標的核
酸の別の配列部分とハイブリダイズ可能な、標識剤で標
識した検出用の第二の遺伝子プローブと反応させるもの
である。
でに少なくとも数日を要し、測定操作もかなり複雑であ
る。そのため、測定操作、特に洗浄過程を簡略化し、測
定時間を短縮するために、いわゆる「サンドイッチハイ
ブリダイゼーション法」が提示された（Ranki et.al.,G
ene. Vol.21, p77-85,1983、特開昭６０−９３３５５号
広報、特開昭６２−５０１０７号広報、および特開昭６
２−２０５８００号広報）。この方法は、固相担体上に
目的とする遺伝子に対して相補的な塩基配列を有する第
一の遺伝子プローブを固定し、試料中の特定の配列を持
った標的核酸とハイブリダイズさせ、さらに、該標的核
酸の別の配列部分とハイブリダイズ可能な、標識剤で標
識した検出用の第二の遺伝子プローブと反応させるもの
である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記サ
ンドイッチハイブリダイゼーション法においても、固相
担体への第一の遺伝子プローブの固定化の効率が悪いと
いう問題点があった。また、ハイブリダイゼーションの
際に、目的とする遺伝子以外にも他の遺伝子が固相担体
上に非特異的に吸着されてしまうという問題もある。こ
の非特異的な吸着を防ぐために、従来は、予め牛胸腺や
鮭の精子などのＤＮＡで長時間ブロックする方法がとら
れている。しかし、これは操作の簡便化、および検出時
間短縮の妨げとなっている。本発明は、上記問題点を解
決するためになされたものであり、遺伝子、特に遺伝子
プローブ（ポリヌクレオチド）を、簡便に、かつ短時間
で効率よく担体に固定化することが可能な方法を提供す
ることを目的とする。
ンドイッチハイブリダイゼーション法においても、固相
担体への第一の遺伝子プローブの固定化の効率が悪いと
いう問題点があった。また、ハイブリダイゼーションの
際に、目的とする遺伝子以外にも他の遺伝子が固相担体
上に非特異的に吸着されてしまうという問題もある。こ
の非特異的な吸着を防ぐために、従来は、予め牛胸腺や
鮭の精子などのＤＮＡで長時間ブロックする方法がとら
れている。しかし、これは操作の簡便化、および検出時
間短縮の妨げとなっている。本発明は、上記問題点を解
決するためになされたものであり、遺伝子、特に遺伝子
プローブ（ポリヌクレオチド）を、簡便に、かつ短時間
で効率よく担体に固定化することが可能な方法を提供す
ることを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、これらの
課題を解決すべく鋭意研究をすすめた結果、固相担体へ
のポリヌクレオチドの固定化の効率を上昇させるため
に、リンカーアームヌクレオチドを含むポリヌクレオチ
ドをリンカー部を介して固相担体に結合させることが有
効であることを見い出した。
課題を解決すべく鋭意研究をすすめた結果、固相担体へ
のポリヌクレオチドの固定化の効率を上昇させるため
に、リンカーアームヌクレオチドを含むポリヌクレオチ
ドをリンカー部を介して固相担体に結合させることが有
効であることを見い出した。
【０００８】すなわち本発明は下記一般式（Ｉ）で表さ
れる少なくとも１個のリンカーアームヌクレオチドを含
有するポリヌクレオチドを固相担体に結合させることを
特徴とするポリヌクレオチド固定化方法である。
れる少なくとも１個のリンカーアームヌクレオチドを含
有するポリヌクレオチドを固相担体に結合させることを
特徴とするポリヌクレオチド固定化方法である。
【０００９】一般式（Ｉ）： Ｇ−Ｐ−Ｑ （式中、Ｇはリボースまたはデオキシリボースから還元
末端の１位の炭素原子が外れた残基を示す。Ｐはアデノ
シン、グアノシン、シチジン、チミジン、ウリジンのい
ずれか１つの残基を示す。Ｑは１〜１５個の炭素原子を
含む１価の有機基を示す。）
末端の１位の炭素原子が外れた残基を示す。Ｐはアデノ
シン、グアノシン、シチジン、チミジン、ウリジンのい
ずれか１つの残基を示す。Ｑは１〜１５個の炭素原子を
含む１価の有機基を示す。）
【００１０】また本発明は下記一般式（Ｉ）で表される
少なくとも１個のリンカーアームヌクレオチドを含むポ
リヌクレオチドを固相担体に固定化し、標的核酸を含む
試料をハイブリダイズさせ、さらに標識プローブをハイ
ブリダイズさせて、該標識を検出することを特徴とする
試料中の標的核酸を定量する方法である。
少なくとも１個のリンカーアームヌクレオチドを含むポ
リヌクレオチドを固相担体に固定化し、標的核酸を含む
試料をハイブリダイズさせ、さらに標識プローブをハイ
ブリダイズさせて、該標識を検出することを特徴とする
試料中の標的核酸を定量する方法である。
【００１１】一般式（Ｉ）： Ｇ−Ｐ−Ｑ （式中、Ｇはリボースまたはデオキシリボースから還元
末端の１位の炭素原子が外れた残基を示す。Ｐはアデノ
シン、グアノシン、シチジン、チミジン、ウリジンのい
ずれか１つの残基を示す。Ｑは、１〜１５個の炭素原子
を含む１価の有機基を示す。）
末端の１位の炭素原子が外れた残基を示す。Ｐはアデノ
シン、グアノシン、シチジン、チミジン、ウリジンのい
ずれか１つの残基を示す。Ｑは、１〜１５個の炭素原子
を含む１価の有機基を示す。）
【００１２】さらに本発明は試料中のポリヌクレオチド
に下記一般式（Ｉ）で表される少なくとも１個のリンカ
ーアームヌクレオチドを導入し、固相担体に固定化した
後、標識プローブをハイブリダイズさせ、該標識を検出
することを特徴とする試料中の標的核酸を定量する方
法。
に下記一般式（Ｉ）で表される少なくとも１個のリンカ
ーアームヌクレオチドを導入し、固相担体に固定化した
後、標識プローブをハイブリダイズさせ、該標識を検出
することを特徴とする試料中の標的核酸を定量する方
法。
【００１３】一般式（Ｉ）： Ｇ−Ｐ−Ｑ （式中、Ｇはリボースまたはデオキシリボースから還元
末端の１位の炭素原子が外れた残基を示す。Ｐはアデノ
シン、グアノシン、シチジン、チミジン、ウリジンのい
ずれか１つの残基を示す。Ｑは、１〜１５個の炭素原子
を含む１価の有機基を示す。）
末端の１位の炭素原子が外れた残基を示す。Ｐはアデノ
シン、グアノシン、シチジン、チミジン、ウリジンのい
ずれか１つの残基を示す。Ｑは、１〜１５個の炭素原子
を含む１価の有機基を示す。）
【００１４】本発明における一般式（Ｉ）で表されるリ
ンカーアームヌクレオチドは、リボース残基またはデオ
キシリボース残基（Ｇ）とアデノシン、グアノシン、シ
トシン、チミジン、ウリジンのいずれか１つの残基
（Ｐ）と１〜１５個の炭素原子を含む１価の有機基
（Ｑ）を含む。Ｇは具体的には下記式で示されるリボー
ス残基またはデオキシリボース残基である。
ンカーアームヌクレオチドは、リボース残基またはデオ
キシリボース残基（Ｇ）とアデノシン、グアノシン、シ
トシン、チミジン、ウリジンのいずれか１つの残基
（Ｐ）と１〜１５個の炭素原子を含む１価の有機基
（Ｑ）を含む。Ｇは具体的には下記式で示されるリボー
ス残基またはデオキシリボース残基である。
【００１５】
【化１】
【００１６】Ｐはアデノシン、グアノシン、シトシン、
チミジン、ウリジンのいずれか１つの残基を示す。チミ
ンを次に例示する。
チミジン、ウリジンのいずれか１つの残基を示す。チミ
ンを次に例示する。
【化２】
【００１７】Ｑは１〜１５個の炭素原子を有する１価の
有機基であり、例えば
有機基であり、例えば
【化３】
【００１８】
【化４】
【００１９】
【化５】
【００２０】
【化６】
【００２１】（ここでＲ1は水素原子または炭素原子数
１〜６の低級アルキル基、Ｙは１またはそれ以上のアミ
ノ基（−ＮＨ2）、置換アミノ基（−ＮＨＲ）、アミド
（−ＣＯＮＨ2）、置換アミド（−ＣＯＮＨＲ）、アミ
ノアルキルフェニルまたは置換アミノアルキルフェニル
基であり（Ｒは炭素原子数１〜１２のアルキル基を示
す）、Ｙは１またはそれ以上のアセチルイミド基または
トリハロゲン化アセチルイミド基であってもよい。）な
どがある。具体的には下記の有機基が例示される。
１〜６の低級アルキル基、Ｙは１またはそれ以上のアミ
ノ基（−ＮＨ2）、置換アミノ基（−ＮＨＲ）、アミド
（−ＣＯＮＨ2）、置換アミド（−ＣＯＮＨＲ）、アミ
ノアルキルフェニルまたは置換アミノアルキルフェニル
基であり（Ｒは炭素原子数１〜１２のアルキル基を示
す）、Ｙは１またはそれ以上のアセチルイミド基または
トリハロゲン化アセチルイミド基であってもよい。）な
どがある。具体的には下記の有機基が例示される。
【００２２】
【化７】
【００２３】
【化８】
【００２４】上記一般式（Ｉ）で表される少なくとも１
個のリンカーアームヌクレオチドを含有するポリヌクレ
オチドを固相担体に結合させる手段は物理吸着法による
ことが好ましい。
個のリンカーアームヌクレオチドを含有するポリヌクレ
オチドを固相担体に結合させる手段は物理吸着法による
ことが好ましい。
【００２５】本発明で使用するリンカーアームヌクレオ
チドは、核酸の構成単位であるアデノシン、グアノシ
ン、シチジン、チミジン、またはウリジン（Ｐ）に有機
基（Ｑ）を介してアミノ基を導入したもので、従来、後
述する実施例中の参考例１ならびに参考例２に示したよ
うに、少なくとも１個の酵素などの標識をヌクレオチド
配列中に導入する目的で作成されたものである。
チドは、核酸の構成単位であるアデノシン、グアノシ
ン、シチジン、チミジン、またはウリジン（Ｐ）に有機
基（Ｑ）を介してアミノ基を導入したもので、従来、後
述する実施例中の参考例１ならびに参考例２に示したよ
うに、少なくとも１個の酵素などの標識をヌクレオチド
配列中に導入する目的で作成されたものである。
【００２６】本発明において、そのリンカーアームヌク
レオチドを配列中に含有するポリヌクレオチドは、約２
００塩基単位の長さより短い、定められた配列の１本鎖
ヌクレオチドである。１種またはそれ以上の検出可能な
リポーター・グループとして機能しうるか、あるいはま
た１種またはそれ以上の検出可能なリポーター・グルー
プと結合し得る置換基が、その塩基の立体的に耐容性の
ある部位（例えばピリミジンのＣ−５、プリンのＣ−
８）に結合している様なヌクレオチド単位を少なくとも
１個含んでいる１本鎖オリゴヌクレオチドである。
レオチドを配列中に含有するポリヌクレオチドは、約２
００塩基単位の長さより短い、定められた配列の１本鎖
ヌクレオチドである。１種またはそれ以上の検出可能な
リポーター・グループとして機能しうるか、あるいはま
た１種またはそれ以上の検出可能なリポーター・グルー
プと結合し得る置換基が、その塩基の立体的に耐容性の
ある部位（例えばピリミジンのＣ−５、プリンのＣ−
８）に結合している様なヌクレオチド単位を少なくとも
１個含んでいる１本鎖オリゴヌクレオチドである。
【００２７】さらに具体的には、
【化９】 〔式中、Ｒ’は水素原子またはヒドロキシ基、Ｐはピリ
ミジン塩基またはプリン塩基、Ｑはリンカーアームであ
る。〕で示されるヌクレオチド残基を少なくとも１つ予
め選択された位置に有する基本的に２００ヌクレオチド
を越えない予め選択された配列からなる実質上一本鎖オ
リゴヌクレオチドである。
ミジン塩基またはプリン塩基、Ｑはリンカーアームであ
る。〕で示されるヌクレオチド残基を少なくとも１つ予
め選択された位置に有する基本的に２００ヌクレオチド
を越えない予め選択された配列からなる実質上一本鎖オ
リゴヌクレオチドである。
【００２８】非酵素的合成法は、活性化されたヌクレオ
チドモノマーと伸長しつつあるヌクレオチド鎖の遊離の
水酸基をもつ端末単位とをカップリングさせることから
なり、該モノマーおよび端末単位の少なくとも一方がそ
の塩基の立体的に耐容性のある部位に、１種またはそれ
以上の検出可能なリポーターグループとして機能しう
る、あるいは１種またはそれ以上の検出可能なリポータ
ーグループと結合し得る置換基が結合することによって
修飾されている。
チドモノマーと伸長しつつあるヌクレオチド鎖の遊離の
水酸基をもつ端末単位とをカップリングさせることから
なり、該モノマーおよび端末単位の少なくとも一方がそ
の塩基の立体的に耐容性のある部位に、１種またはそれ
以上の検出可能なリポーターグループとして機能しう
る、あるいは１種またはそれ以上の検出可能なリポータ
ーグループと結合し得る置換基が結合することによって
修飾されている。
【００２９】オルゴヌクレオチドはリボキシヌクレオチ
ドであってもデオキシリボヌクレオチドであってもよ
い。その合成前に、リポーターグループが結合する特定
のヌクレオチド単位と同様、そのリポーターグループも
予め選択される。
ドであってもデオキシリボヌクレオチドであってもよ
い。その合成前に、リポーターグループが結合する特定
のヌクレオチド単位と同様、そのリポーターグループも
予め選択される。
【００３０】本発明に用いたリンカーアームヌクレオチ
ドを取り込ませる方法としては、リンカーアームヌクレ
オチドを配列中に持つプライマーを用いたランダムプラ
イマー法（Feinberg et.al., Analytical Biochemistr
y. Vol.132, P6-13,1983, Vol.137, P266-267,1984 ）
およびリンカーアームヌクレオチドを配列中に持ったプ
ライマーを用いるＰＣＲ法（Saiki et.al.,Science. Vo
l.230, P1350-1354,1985）などがあり、これらの方法で
導入されたリンカー部を介して固相担体に結合し、標識
を持ったプローブを利用することにより検出できる。
ドを取り込ませる方法としては、リンカーアームヌクレ
オチドを配列中に持つプライマーを用いたランダムプラ
イマー法（Feinberg et.al., Analytical Biochemistr
y. Vol.132, P6-13,1983, Vol.137, P266-267,1984 ）
およびリンカーアームヌクレオチドを配列中に持ったプ
ライマーを用いるＰＣＲ法（Saiki et.al.,Science. Vo
l.230, P1350-1354,1985）などがあり、これらの方法で
導入されたリンカー部を介して固相担体に結合し、標識
を持ったプローブを利用することにより検出できる。
【００３１】本発明のポリヌクレオチド固定化方法にお
いて用いられる担体は、ニトロセルロースやナイロンな
どの膜担体、ラテックス粒子、マイクロタイタープレー
ト等、従来からハイブリダイゼーションに使用されてき
たものおよび使用が可能と考えられるものであれば特に
限定されるものではない。
いて用いられる担体は、ニトロセルロースやナイロンな
どの膜担体、ラテックス粒子、マイクロタイタープレー
ト等、従来からハイブリダイゼーションに使用されてき
たものおよび使用が可能と考えられるものであれば特に
限定されるものではない。
【００３２】本発明のポリヌクレオチド固定化方法にお
いては、ポリヌクレオチド中のリンカーアームヌクレオ
チドのリンカー部（Ｑ）が、上記担体に物理吸着または
共有結合することにより、担体に遺伝子が固定化され
る。物理吸着の場合には、通常免疫法で用いられている
のと同様に、リンカーアームヌクレオチドを持つ遺伝子
プローブ（ポリヌクレオチド）を１〜１０００ｎＭ、好
ましくは１０〜１００ｎＭ程度の適当な濃度の反応溶液
とし、担体を浸漬または担体に添加し、適当な時間静置
または懸濁することで実現できる。
いては、ポリヌクレオチド中のリンカーアームヌクレオ
チドのリンカー部（Ｑ）が、上記担体に物理吸着または
共有結合することにより、担体に遺伝子が固定化され
る。物理吸着の場合には、通常免疫法で用いられている
のと同様に、リンカーアームヌクレオチドを持つ遺伝子
プローブ（ポリヌクレオチド）を１〜１０００ｎＭ、好
ましくは１０〜１００ｎＭ程度の適当な濃度の反応溶液
とし、担体を浸漬または担体に添加し、適当な時間静置
または懸濁することで実現できる。
【００３３】また共有結合の場合には、遺伝子プローブ
（ポリヌクレオチド）中のリンカーアームヌクレオチド
のリンカー部（Ｑ）と、担体の表面に存在する官能基と
が反応することで結合する。このとき共有結合を形成す
る反応は、担体表面に存在する官能基によって異なる。
したがって、担体の表面上に存在する官能基と遺伝子中
のリンカーアームヌクレオチドのリンカー部（Ｑ）との
共有結合の形成において、反応方法および条件は特に限
定されるものではない。上記共有結合を形成するための
反応としては、担体にカルボキシル基を有する場合のリ
ンカー部のアミノ基とのアミド結合があげられる。
（ポリヌクレオチド）中のリンカーアームヌクレオチド
のリンカー部（Ｑ）と、担体の表面に存在する官能基と
が反応することで結合する。このとき共有結合を形成す
る反応は、担体表面に存在する官能基によって異なる。
したがって、担体の表面上に存在する官能基と遺伝子中
のリンカーアームヌクレオチドのリンカー部（Ｑ）との
共有結合の形成において、反応方法および条件は特に限
定されるものではない。上記共有結合を形成するための
反応としては、担体にカルボキシル基を有する場合のリ
ンカー部のアミノ基とのアミド結合があげられる。
【００３４】本発明において使用するポリヌクレオチド
は上記リンカーアームヌクレオチドを配列中に含有しな
いポリヌクレオチドと比較して、担体への固定化効率の
上昇をもたらす。
は上記リンカーアームヌクレオチドを配列中に含有しな
いポリヌクレオチドと比較して、担体への固定化効率の
上昇をもたらす。
【００３５】本発明の固定化法により固定された担体
を、サンドイッチハイブリダイゼーションを用いた遺伝
子の検出に好適に使用することができる。また従来から
の遺伝子を試料から抽出し適当な処理の後、担体に固定
する方法においても、上記したランダムプライマー法や
ＰＣＲ法などの処理の際、本発明に用いたリンカーアー
ムヌクレオチドを取り込ませることにより、同様な効果
をあげることができる。
を、サンドイッチハイブリダイゼーションを用いた遺伝
子の検出に好適に使用することができる。また従来から
の遺伝子を試料から抽出し適当な処理の後、担体に固定
する方法においても、上記したランダムプライマー法や
ＰＣＲ法などの処理の際、本発明に用いたリンカーアー
ムヌクレオチドを取り込ませることにより、同様な効果
をあげることができる。
【００３６】具体的な標的核酸を定量する方法として
は、上記一般式（Ｉ）で表される少なくとも１個のリン
カーアームヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを固相
担体に固定化し、標的核酸を含む試料をハイブリダイズ
させ、さらに標識プローブをハイブリダイズさせて、該
標識を検出することを特徴とする試料中の標的核酸を定
量する方法がある。
は、上記一般式（Ｉ）で表される少なくとも１個のリン
カーアームヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを固相
担体に固定化し、標的核酸を含む試料をハイブリダイズ
させ、さらに標識プローブをハイブリダイズさせて、該
標識を検出することを特徴とする試料中の標的核酸を定
量する方法がある。
【００３７】また試料中のポリヌクレオチドに上記一般
式（Ｉ）で表される少なくとも１個のリンカーアームヌ
クレオチドを導入し、固相担体に固定化した後、標識プ
ローブをハイブリダイズさせ、該標識を検出することを
特徴とする試料中の標的核酸を定量する方法がある。
式（Ｉ）で表される少なくとも１個のリンカーアームヌ
クレオチドを導入し、固相担体に固定化した後、標識プ
ローブをハイブリダイズさせ、該標識を検出することを
特徴とする試料中の標的核酸を定量する方法がある。
【００３８】試料としては通常、生体から採取できるサ
ンプルを広く利用でき、具体的には糞便、尿、組織、血
液などを直接あるいは適当な処理を行った後、使用する
ことができる。標識プローブとしては試料中に存在する
可能性を有する標的核酸とハイブリダイズする核酸に標
識を結合させた１０〜数千塩基長のオリゴヌクレオチド
を使用する。望ましくは１０〜１００塩基長程度のもの
がよいが、試料中のポリヌクレオチド中のリンカーアー
ムヌクレオチドを取り込ませる場合には、さらに長いも
のでもよい。標識としては放射性元素、酵素、蛍光物
質、抗原、抗体、ハプテンなど、通常、核酸の標識に用
いられるものであれば使用できる。標識を検出する方法
としては、上記のものを検出する、通常、用いられる検
出方法であれば利用できる。
ンプルを広く利用でき、具体的には糞便、尿、組織、血
液などを直接あるいは適当な処理を行った後、使用する
ことができる。標識プローブとしては試料中に存在する
可能性を有する標的核酸とハイブリダイズする核酸に標
識を結合させた１０〜数千塩基長のオリゴヌクレオチド
を使用する。望ましくは１０〜１００塩基長程度のもの
がよいが、試料中のポリヌクレオチド中のリンカーアー
ムヌクレオチドを取り込ませる場合には、さらに長いも
のでもよい。標識としては放射性元素、酵素、蛍光物
質、抗原、抗体、ハプテンなど、通常、核酸の標識に用
いられるものであれば使用できる。標識を検出する方法
としては、上記のものを検出する、通常、用いられる検
出方法であれば利用できる。
【００３９】
【発明の効果】本発明では上記したリンカーアームヌク
レオチドを持つ遺伝子プローブ（ポリヌクレオチド）を
担体に結合させることにより、ハイブリダイゼーション
法における固相担体への遺伝子プローブ（ポリヌクレオ
チド）の固定化の効率が改善される。このことにより、
ハイブリダイゼーション反応時のシグナル値が上昇し、
その結果最低検出感度を向上させることが可能となる。
レオチドを持つ遺伝子プローブ（ポリヌクレオチド）を
担体に結合させることにより、ハイブリダイゼーション
法における固相担体への遺伝子プローブ（ポリヌクレオ
チド）の固定化の効率が改善される。このことにより、
ハイブリダイゼーション反応時のシグナル値が上昇し、
その結果最低検出感度を向上させることが可能となる。
【００４０】
【実施例】以下に本発明の実施例および参考例を挙げる
ことにより、本発明の効果をより一層明瞭なものとす
る。なお、実施例中、“ｎ×ＳＳＣ”は、0.3Mクエン酸
ナトリウム (pH 7.0), 3.0M NaCl混合液の（20／ｎ）倍
希釈液を示す。
ことにより、本発明の効果をより一層明瞭なものとす
る。なお、実施例中、“ｎ×ＳＳＣ”は、0.3Mクエン酸
ナトリウム (pH 7.0), 3.0M NaCl混合液の（20／ｎ）倍
希釈液を示す。
【００４１】参考例１ 腸炎ビブリオ検出用捕捉プローブおよび標識プローブの
合成 捕捉プローブ及び標識プローブは、ＤＮＡ合成機３９２
型（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、ホスホ
アミダイト法により合成した。捕捉プローブの塩基配列
は5'-CGGTCATTCTGCTGXGTTCGTAAAAT-3'である。標識プロ
ーブの塩基配列は5'-CCCCGGTTCTGAXGAGATATTGTT-3'であ
る。配列中、Ｘは下記のリンカーアームヌクレオチドを
示す。
合成 捕捉プローブ及び標識プローブは、ＤＮＡ合成機３９２
型（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、ホスホ
アミダイト法により合成した。捕捉プローブの塩基配列
は5'-CGGTCATTCTGCTGXGTTCGTAAAAT-3'である。標識プロ
ーブの塩基配列は5'-CCCCGGTTCTGAXGAGATATTGTT-3'であ
る。配列中、Ｘは下記のリンカーアームヌクレオチドを
示す。
【００４２】
【化１０】
【００４３】参考例２ 標識プローブの酵素・アルカリホスファターゼによる標
識 参考例１で合成した標識プローブと、リンアーアームを
介してアルカリホスファターゼとの結合を、文献(Nucle
ic Acids Research, vol.14,P.6155, 1986) に従って行
った。リンカーアームヌクレオチド（標識プローブ）1.
0 A260を0.2M重炭酸ソーダ60μl に溶解し、ここへスベ
リン酸ジスクシニミジル（ＤＳＳ）1.25mgを加えて室
温、２分間反応させた。反応液を1mM 酢酸ナトリウム(p
H5.0)で平衡化した。
識 参考例１で合成した標識プローブと、リンアーアームを
介してアルカリホスファターゼとの結合を、文献(Nucle
ic Acids Research, vol.14,P.6155, 1986) に従って行
った。リンカーアームヌクレオチド（標識プローブ）1.
0 A260を0.2M重炭酸ソーダ60μl に溶解し、ここへスベ
リン酸ジスクシニミジル（ＤＳＳ）1.25mgを加えて室
温、２分間反応させた。反応液を1mM 酢酸ナトリウム(p
H5.0)で平衡化した。
【００４４】次に、Sephadex G-25 （ファルマシア社）
カラム（1cm φ×30cm）でゲル濾過して過剰のＤＳＳを
除去した。末端のアミノ基が活性化されたリンカーアー
ムヌクレオチドを、更にモル比で２倍等量のアルカリホ
スファターゼ（ベーリンガーマンハイム社）と室温、16
時間反応させることでアルカリホスファターゼ標識核酸
プローブを得た。得られた標識プローブは、陰性イオン
交換高速液体クロマトグラフィーMONO-QFPLC（ファルマ
シア社）を用いて精製した。標識プローブを含む画分を
集め、セントリコン30Ｋ（アミコン社）を用いて限外濾
過法により濃縮した。
カラム（1cm φ×30cm）でゲル濾過して過剰のＤＳＳを
除去した。末端のアミノ基が活性化されたリンカーアー
ムヌクレオチドを、更にモル比で２倍等量のアルカリホ
スファターゼ（ベーリンガーマンハイム社）と室温、16
時間反応させることでアルカリホスファターゼ標識核酸
プローブを得た。得られた標識プローブは、陰性イオン
交換高速液体クロマトグラフィーMONO-QFPLC（ファルマ
シア社）を用いて精製した。標識プローブを含む画分を
集め、セントリコン30Ｋ（アミコン社）を用いて限外濾
過法により濃縮した。
【００４５】参考例３ 腸炎ビブリオ遺伝子の調製 腸炎ビブリオの菌株をブレインハートインフュージョン
培地に接種して37℃で一晩培養した。成育したコロニー
をそれぞれ 1.5mlのエッペンドルフチューブにかきと
り、希釈用緩衝液 300μl に懸濁した。さらにここへプ
ロテイナーゼＫ（ナカライテスク社）0.6mg 、溶菌液
（８Ｍ尿素、0.25％ドデシル硫酸ナトリウム、0.25％ラ
ウリルサルコシンナトリウム、50mM EDTA,pH 7.6） 600
μl を加えて撹拌し、60℃で30分間インキュベートし
た。 得られた溶解液を、フェノールで２回、クロロホ
ルムで１回抽出後、エタノール沈澱し、核酸を得た。
培地に接種して37℃で一晩培養した。成育したコロニー
をそれぞれ 1.5mlのエッペンドルフチューブにかきと
り、希釈用緩衝液 300μl に懸濁した。さらにここへプ
ロテイナーゼＫ（ナカライテスク社）0.6mg 、溶菌液
（８Ｍ尿素、0.25％ドデシル硫酸ナトリウム、0.25％ラ
ウリルサルコシンナトリウム、50mM EDTA,pH 7.6） 600
μl を加えて撹拌し、60℃で30分間インキュベートし
た。 得られた溶解液を、フェノールで２回、クロロホ
ルムで１回抽出後、エタノール沈澱し、核酸を得た。
【００４６】実施例１ (1) 捕捉プローブの固相担体への結合法 固相担体として、ポリスチレン製のマイクロタイタープ
レート（マイクロライト２、ダイナテック社）を用い
た。参考例１で得られた捕捉プローブを、50mMホウ酸緩
衝液で10pmole/mlに希釈した。その溶液をマイクロタイ
タ−プレートのウェルに 100μl ずつ分注し室温で一夜
インキュベートした。また比較例１として、リンカーア
ームヌクレオチドを持たない捕捉プローブを調製し、同
様に固相担体に結合させた。
レート（マイクロライト２、ダイナテック社）を用い
た。参考例１で得られた捕捉プローブを、50mMホウ酸緩
衝液で10pmole/mlに希釈した。その溶液をマイクロタイ
タ−プレートのウェルに 100μl ずつ分注し室温で一夜
インキュベートした。また比較例１として、リンカーア
ームヌクレオチドを持たない捕捉プローブを調製し、同
様に固相担体に結合させた。
【００４７】(2) 捕捉プローブ結合プレートのブロック
法 上記方法で得られたプレートから捕捉プローブ溶液をア
スピレーターで除き、ブロックバッファーを各ウェルに
150μl ずつ分注し、室温で２時間放置しブロックし
た。
法 上記方法で得られたプレートから捕捉プローブ溶液をア
スピレーターで除き、ブロックバッファーを各ウェルに
150μl ずつ分注し、室温で２時間放置しブロックし
た。
【００４８】(3) サンドイッチハイブリダイゼーション
法による腸炎ビブリオ遺伝子の検出 参考例２、３の方法で調製した試薬及び試料を用いて、
陽性検体として腸炎ビブリオ遺伝子の検出を以下に述べ
る方法で行った。試料は等量の 0.6N NaOHを加え室温で
15分変性させた。対照（陰性検体）として、ヒト胎盤由
来のＤＮＡ（シグマ社）を、同様の方法で変性させたも
のを用いた。
法による腸炎ビブリオ遺伝子の検出 参考例２、３の方法で調製した試薬及び試料を用いて、
陽性検体として腸炎ビブリオ遺伝子の検出を以下に述べ
る方法で行った。試料は等量の 0.6N NaOHを加え室温で
15分変性させた。対照（陰性検体）として、ヒト胎盤由
来のＤＮＡ（シグマ社）を、同様の方法で変性させたも
のを用いた。
【００４９】捕捉プローブを結合させた後、ブロックし
たプレートよりブロック液を除き、変性させた試料を10
μl 添加した。次にハイブリダイゼーション緩衝液を 1
00μl 加え、50℃で60分間ハイブリダイゼーションを行
った。液をウェルから除き、洗浄液Ｉ（２×ＳＳＣ、1.
0%ラウリル硫酸ナトリウム）を 200μl 加えて、50℃で
５分間洗浄した。続いて洗浄液Ｉを除き、１×ＳＳＣ 2
00μl でウェル内をすすぎ、アルカリ性ホスファターゼ
標識プローブ溶液 100μl を加え、50℃で60分間ハイブ
リダイゼーションを行った。プローブ溶液をウェルから
除き、洗浄液Ｉを 200μl 加えて50℃で10分間洗浄し、
次に洗浄液II（１×ＳＳＣ、0.5% Triton X-100 ）を 2
00μl 加え、室温で10分間洗浄した。最後に１×ＳＳＣ
を 200μl 加えてウェル内を濯いだ後、アルカリ性ホス
ファターゼの基質である化学発光基質、Lumiphos480
（和光純薬社）を 100μl 加え、37℃、暗所で15分間発
光反応を行った。発光量は、マイクロライト1000（ダイ
ナテック社）で測定した。
たプレートよりブロック液を除き、変性させた試料を10
μl 添加した。次にハイブリダイゼーション緩衝液を 1
00μl 加え、50℃で60分間ハイブリダイゼーションを行
った。液をウェルから除き、洗浄液Ｉ（２×ＳＳＣ、1.
0%ラウリル硫酸ナトリウム）を 200μl 加えて、50℃で
５分間洗浄した。続いて洗浄液Ｉを除き、１×ＳＳＣ 2
00μl でウェル内をすすぎ、アルカリ性ホスファターゼ
標識プローブ溶液 100μl を加え、50℃で60分間ハイブ
リダイゼーションを行った。プローブ溶液をウェルから
除き、洗浄液Ｉを 200μl 加えて50℃で10分間洗浄し、
次に洗浄液II（１×ＳＳＣ、0.5% Triton X-100 ）を 2
00μl 加え、室温で10分間洗浄した。最後に１×ＳＳＣ
を 200μl 加えてウェル内を濯いだ後、アルカリ性ホス
ファターゼの基質である化学発光基質、Lumiphos480
（和光純薬社）を 100μl 加え、37℃、暗所で15分間発
光反応を行った。発光量は、マイクロライト1000（ダイ
ナテック社）で測定した。
【００５０】下記の表１から明らかなように、本発明の
リンカーアームヌクレオチドを用いた捕捉プローブを使
用すると、比較例１に対して陽性検体を測定した値が上
昇しており、しかも陰性検体を測定した値が減少してい
るため、感度並びに特異性について優れた結果が得られ
た。
リンカーアームヌクレオチドを用いた捕捉プローブを使
用すると、比較例１に対して陽性検体を測定した値が上
昇しており、しかも陰性検体を測定した値が減少してい
るため、感度並びに特異性について優れた結果が得られ
た。
【００５１】
【表１】
【００５２】実施例２ (1) 腸炎ビブリオ遺伝子へのリンカーアームヌクレオチ
ドの導入 参考例３で調製した腸炎ビブリオ遺伝子を、ランダムプ
ライマー、ｄＮＴＰ、およびリンカーアームヌクレオチ
ドと混合し、95℃で３分間加熱した後氷中で急冷し５分
間おいた。ここにKlenow Fragment を２単位加え、37℃
で３時間反応させた後、95℃で３分間加熱した。これを
氷中で急冷することにより、リンカーアームヌクレオチ
ドを配列中に持つ腸炎ビブリオ遺伝子断片を調製した。
ドの導入 参考例３で調製した腸炎ビブリオ遺伝子を、ランダムプ
ライマー、ｄＮＴＰ、およびリンカーアームヌクレオチ
ドと混合し、95℃で３分間加熱した後氷中で急冷し５分
間おいた。ここにKlenow Fragment を２単位加え、37℃
で３時間反応させた後、95℃で３分間加熱した。これを
氷中で急冷することにより、リンカーアームヌクレオチ
ドを配列中に持つ腸炎ビブリオ遺伝子断片を調製した。
【００５３】(2) 腸炎ビブリオ遺伝子の固相への結合法 固相として、ナイロン膜（ハイボンドＮ＋；アマシャム
社）を用いた。膜は核酸を固定する前に５×ＳＳＣ溶液
で軽くすすいだ。上記 (1)で得られた腸炎ビブリオ核酸
を滅菌水で10μl/50μl の濃度に希釈した。核酸水溶液
に等容量の0.3NNaOH を加え室温で15分間処理し変性し
た。変性後ドットブロッター（ＢＲＬ社）を用いてナイ
ロン膜上に核酸を 100μl ずつ添加しゆっくりと吸引し
た。溶液がすべて吸引された後、５×ＳＳＣを 100μl
ずつ添加、吸引し、膜をブロッターからはずして５×Ｓ
ＳＣで軽くすすぎ、ろ紙で膜の水分をとり乾燥させた。
社）を用いた。膜は核酸を固定する前に５×ＳＳＣ溶液
で軽くすすいだ。上記 (1)で得られた腸炎ビブリオ核酸
を滅菌水で10μl/50μl の濃度に希釈した。核酸水溶液
に等容量の0.3NNaOH を加え室温で15分間処理し変性し
た。変性後ドットブロッター（ＢＲＬ社）を用いてナイ
ロン膜上に核酸を 100μl ずつ添加しゆっくりと吸引し
た。溶液がすべて吸引された後、５×ＳＳＣを 100μl
ずつ添加、吸引し、膜をブロッターからはずして５×Ｓ
ＳＣで軽くすすぎ、ろ紙で膜の水分をとり乾燥させた。
【００５４】(3) 腸炎ビブリオ遺伝子固定化膜のブロッ
クおよび遺伝子検出法 核酸を固定化した膜をハイブリバッグ（ＢＲＬ社）に入
れ、ブロックバッファーを加えてポリシーラーでシール
し、振とうさせながら50℃で15分間ブロックした。ハイ
ブリバッグからブロックバッファーを除き、アルカリホ
スファターゼ標識プローブを含むハイブリダイゼーショ
ン緩衝液 100μl を加え、振とうさせながら50℃で60分
間ハイブリダイゼーションを行った。膜をハイブリバッ
グから出し、洗浄液Ｉ（２×ＳＳＣ、1.0%ラウリル硫酸
ナトリウム）を入れたバットに移し振とうさせながら50
℃で10分間洗浄した。次に、洗浄液II（１×ＳＳＣ、0.
5%Triton X-100）のバットに移し振とうさせながら室温
で10分間洗浄した。洗浄が終了した膜をハイブリバッグ
に入れ、ニトロブルーテトラゾリウムならびに、５−ブ
ロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸を含むアルカ
リホスファターゼの基質溶液を加えシールし37℃、１時
間暗所におくことで反応させた。発色後膜を蒸留水で洗
浄し乾燥させ、発色を色彩色差計ＣＲ−２２１（ミノル
タカメラ社）を用いて測定した。測定には△L*a*b*モー
ドを用いた。
クおよび遺伝子検出法 核酸を固定化した膜をハイブリバッグ（ＢＲＬ社）に入
れ、ブロックバッファーを加えてポリシーラーでシール
し、振とうさせながら50℃で15分間ブロックした。ハイ
ブリバッグからブロックバッファーを除き、アルカリホ
スファターゼ標識プローブを含むハイブリダイゼーショ
ン緩衝液 100μl を加え、振とうさせながら50℃で60分
間ハイブリダイゼーションを行った。膜をハイブリバッ
グから出し、洗浄液Ｉ（２×ＳＳＣ、1.0%ラウリル硫酸
ナトリウム）を入れたバットに移し振とうさせながら50
℃で10分間洗浄した。次に、洗浄液II（１×ＳＳＣ、0.
5%Triton X-100）のバットに移し振とうさせながら室温
で10分間洗浄した。洗浄が終了した膜をハイブリバッグ
に入れ、ニトロブルーテトラゾリウムならびに、５−ブ
ロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸を含むアルカ
リホスファターゼの基質溶液を加えシールし37℃、１時
間暗所におくことで反応させた。発色後膜を蒸留水で洗
浄し乾燥させ、発色を色彩色差計ＣＲ−２２１（ミノル
タカメラ社）を用いて測定した。測定には△L*a*b*モー
ドを用いた。
【００５５】下記の表２から明らかなように、本発明の
リンカーアームヌクレオチドを用いた遺伝子断片を固相
に結合させて使用すると、比較例２に対して陽性検体を
測定した値が上昇しており、しかも陰性検体を測定した
値が減少しているため、感度並びに特異性について優れ
た結果が得られた。
リンカーアームヌクレオチドを用いた遺伝子断片を固相
に結合させて使用すると、比較例２に対して陽性検体を
測定した値が上昇しており、しかも陰性検体を測定した
値が減少しているため、感度並びに特異性について優れ
た結果が得られた。
【００５６】
【表２】
【００５７】
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：26 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：1..26 特徴を決定した方法：Ｓ 他の特徴：腸炎ビブリオＴＤＨ（Thermostable Direct
Haemolysin）遺伝子の339番目から364 番目のヌクレオ
チド配列と相同的な配列を有する。 配列 CGGTCATTCT GCTGTGTTCG TAAAAT 26
Haemolysin）遺伝子の339番目から364 番目のヌクレオ
チド配列と相同的な配列を有する。 配列 CGGTCATTCT GCTGTGTTCG TAAAAT 26
【００５８】配列番号：２ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：1..24 特徴を決定した方法：Ｓ 他の特徴：腸炎ビブリオＴＤＨ（Thermostable Direct
Haemolysin）遺伝子の102 番目から125 番目のヌクレオ
チド配列と相同的な配列を有する。 配列 CCCCGGTTCT GATGAGATAT TGTT 24
Haemolysin）遺伝子の102 番目から125 番目のヌクレオ
チド配列と相同的な配列を有する。 配列 CCCCGGTTCT GATGAGATAT TGTT 24
Claims (3)
- 【請求項１】 下記一般式（Ｉ）で表される少なくとも
１個のリンカーアームヌクレオチドを含有するポリヌク
レオチドを固相担体に結合させることを特徴とするポリ
ヌクレオチド固定化方法。 一般式（Ｉ）： Ｇ−Ｐ−Ｑ （式中、Ｇはリボースまたはデオキシリボースから還元
末端の１位の炭素原子が外れた残基を示す。Ｐはアデノ
シン、グアノシン、シチジン、チミジン、ウリジンのい
ずれか１つの残基を示す。Ｑは１〜１５個の炭素原子を
含む１価の有機基を示す。） - 【請求項２】 下記一般式（Ｉ）で表される少なくとも
１個のリンカーアームヌクレオチドを含むポリヌクレオ
チドを固相担体に固定化し、標的核酸を含む試料をハイ
ブリダイズさせ、さらに標識プローブをハイブリダイズ
させて、該標識を検出することを特徴とする試料中の標
的核酸を検出する方法。 一般式（Ｉ）： Ｇ−Ｐ−Ｑ （式中、Ｇはリボースまたはデオキシリボースから還元
末端の１位の炭素原子が外れた残基を示す。Ｐはアデノ
シン、グアノシン、シチジン、チミジン、ウリジンのい
ずれか１つの残基を示す。Ｑは、１〜１５個の炭素原子
を含む１価の有機基を示す。） - 【請求項３】 試料中のポリヌクレオチドに下記一般式
（Ｉ）で表される少なくとも１個のリンカーアームヌク
レオチドを導入し、固相担体に固定化した後、標識プロ
ーブをハイブリダイズさせ、該標識を検出することを特
徴とする試料中の標的核酸を検出する方法。 一般式（Ｉ）： Ｇ−Ｐ−Ｑ （式中、Ｇはリボースまたはデオキシリボースから還元
末端の１位の炭素原子が外れた残基を示す。Ｐはアデノ
シン、グアノシン、シチジン、チミジン、ウリジンのい
ずれか１つの残基を示す。Ｑは、１〜１５個の炭素原子
を含む１価の有機基を示す。）
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11861593A JP3596620B2 (ja) | 1993-05-20 | 1993-05-20 | ポリヌクレオチド固定化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11861593A JP3596620B2 (ja) | 1993-05-20 | 1993-05-20 | ポリヌクレオチド固定化方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06329694A true JPH06329694A (ja) | 1994-11-29 |
| JP3596620B2 JP3596620B2 (ja) | 2004-12-02 |
Family
ID=14740935
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11861593A Expired - Fee Related JP3596620B2 (ja) | 1993-05-20 | 1993-05-20 | ポリヌクレオチド固定化方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3596620B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5685038A (en) * | 1995-05-18 | 1997-11-11 | U.S. Controls Corporation | Out-of-balance control for washing machine |
| US7381533B2 (en) | 1996-11-05 | 2008-06-03 | Clinical Micro Sensors, Inc. | Electrodes linked via oligomers to nucleic acids |
| US7384749B2 (en) | 1996-11-05 | 2008-06-10 | Clinical Micro Sensors, Inc. | Electrodes linked via conductive oligomers to nucleic acids |
-
1993
- 1993-05-20 JP JP11861593A patent/JP3596620B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5685038A (en) * | 1995-05-18 | 1997-11-11 | U.S. Controls Corporation | Out-of-balance control for washing machine |
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