JPH08313522A - 血管透過性因子の測定方法 - Google Patents
血管透過性因子の測定方法Info
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Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 血管透過性因子の微量の存在量の測定方法
を提供することを目的とする。 【構成】 酵素免疫測定法において検出に化学発光を
用いる血管透過性因子の測定方法。 【効果】 体液中の微量の血管透過性因子の測定が可
能になり、腫瘍や炎症等の診断マーカーや治療効果の判
定あるいは術後のモニタリングなどへの血管透過性因子
の利用を可能にし、診断薬としてあるいは病理学への応
用に幅広く利用される。
を提供することを目的とする。 【構成】 酵素免疫測定法において検出に化学発光を
用いる血管透過性因子の測定方法。 【効果】 体液中の微量の血管透過性因子の測定が可
能になり、腫瘍や炎症等の診断マーカーや治療効果の判
定あるいは術後のモニタリングなどへの血管透過性因子
の利用を可能にし、診断薬としてあるいは病理学への応
用に幅広く利用される。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、血液、尿などの体液中
に存在し、血管新生を誘導する因子として知られてお
り、血管内皮細胞増殖因子あるいは血管透過性因子(vas
cular endothelial growth factor or vascular permea
bility factor, 以下ＶＰＦと略す)と呼ばれている因子
の量を測定する方法に関するものであり、診断あるいは
病理学において有効な手段となり得るものである。
に存在し、血管新生を誘導する因子として知られてお
り、血管内皮細胞増殖因子あるいは血管透過性因子(vas
cular endothelial growth factor or vascular permea
bility factor, 以下ＶＰＦと略す)と呼ばれている因子
の量を測定する方法に関するものであり、診断あるいは
病理学において有効な手段となり得るものである。
【０００２】
【従来の技術】生体内に存在する生理活性物質すなわち
非常に微量で薬理作用を現わす物質などの微量物質を診
断マーカーや治療効果の判定あるいは術後のモニタリン
グなどの指標として用いる場合、高感度な測定系が必要
である。このような測定系の一つとして放射性同位元素
を利用したラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)が古くから用
いられている。この方法は高感度で特異性が高く、分析
操作が簡単であるが、放射性物質を用いるため取り扱い
に制限があり、装置や設備が高価で、使用後の廃棄が面
倒である。そこで最近では非放射性物質を標識に用いる
非放射性イムノアッセイが開発されてきている。特に酵
素の増幅作用を利用する酵素イムノアッセイは高感度で
あるため広く利用されている。この方法は一般に酵素免
疫測定法と言われているが、この方法において用いられ
ている検出法は大きく比色法、蛍光法、化学発光法に分
けることができる。これらの方法の検出感度を比較する
と、比色法、蛍光法、化学発光法の順に高感度であると
言われており、酵素免疫測定法における検出法として、
一般的に比色検出法よりも化学発光検出法の方が検出
能、すなわち、より微量の物質を測定する能力がすぐれ
ていると言われているが、酵素免疫測定法を構築する際
には試料中に含まれる抗原量、使用する抗体の親和性お
よび測定系により有効な検出法が異なるため、測定する
物質により測定方法は様々であり、各々の物質に対して
個々に測定方法を検討しなければならないのが現状であ
る。
非常に微量で薬理作用を現わす物質などの微量物質を診
断マーカーや治療効果の判定あるいは術後のモニタリン
グなどの指標として用いる場合、高感度な測定系が必要
である。このような測定系の一つとして放射性同位元素
を利用したラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)が古くから用
いられている。この方法は高感度で特異性が高く、分析
操作が簡単であるが、放射性物質を用いるため取り扱い
に制限があり、装置や設備が高価で、使用後の廃棄が面
倒である。そこで最近では非放射性物質を標識に用いる
非放射性イムノアッセイが開発されてきている。特に酵
素の増幅作用を利用する酵素イムノアッセイは高感度で
あるため広く利用されている。この方法は一般に酵素免
疫測定法と言われているが、この方法において用いられ
ている検出法は大きく比色法、蛍光法、化学発光法に分
けることができる。これらの方法の検出感度を比較する
と、比色法、蛍光法、化学発光法の順に高感度であると
言われており、酵素免疫測定法における検出法として、
一般的に比色検出法よりも化学発光検出法の方が検出
能、すなわち、より微量の物質を測定する能力がすぐれ
ていると言われているが、酵素免疫測定法を構築する際
には試料中に含まれる抗原量、使用する抗体の親和性お
よび測定系により有効な検出法が異なるため、測定する
物質により測定方法は様々であり、各々の物質に対して
個々に測定方法を検討しなければならないのが現状であ
る。
【０００３】一方、血管新生すなわち毛細血管内皮細胞
の増殖、移動および組織への浸潤という現象は胎児の生
長、創傷治癒、癌細胞の増殖などの生理的または病理的
現象において重要な役割を果たしていることが知られ
[(Folkman,J.,Cancer Res.46:467(1986)]、血管新生を
誘導する因子として、直接的に血管内皮細胞に作用する
塩基性線維芽細胞増殖因子(basic fibroblast growth f
actor,bFGF)、酸性線維芽細胞増殖因子(acidic fibrobl
ast growth factor,aFGF)、血小板由来内皮細胞増殖因
子(platelet-derived endothelial cell growth facto
r,PD-ECGF)などが、また間接的に血管内皮細胞に作用す
る物質としてtransforming growth factor-α(TGF-
α)、transforming growth factor-β(TGF-β)、angiog
enin、tumor necrosis factor-α(TNF-α)などが見つけ
られている[Folkman,J. & Shing,Y.,J.Biol.Chem.,267:
10931(1992)]。
の増殖、移動および組織への浸潤という現象は胎児の生
長、創傷治癒、癌細胞の増殖などの生理的または病理的
現象において重要な役割を果たしていることが知られ
[(Folkman,J.,Cancer Res.46:467(1986)]、血管新生を
誘導する因子として、直接的に血管内皮細胞に作用する
塩基性線維芽細胞増殖因子(basic fibroblast growth f
actor,bFGF)、酸性線維芽細胞増殖因子(acidic fibrobl
ast growth factor,aFGF)、血小板由来内皮細胞増殖因
子(platelet-derived endothelial cell growth facto
r,PD-ECGF)などが、また間接的に血管内皮細胞に作用す
る物質としてtransforming growth factor-α(TGF-
α)、transforming growth factor-β(TGF-β)、angiog
enin、tumor necrosis factor-α(TNF-α)などが見つけ
られている[Folkman,J. & Shing,Y.,J.Biol.Chem.,267:
10931(1992)]。
【０００４】これらのなかでもＶＰＦは、マウス、ラッ
ト、モルモット、ウシおよびヒトの正常または腫瘍細胞
株で分泌されており、また組織別では脳、下垂体、腎
臓、卵巣に存在することが明らかにされており[(Ferrar
a,N., et.al. Endocrine Reviews 13:18(1992)]、ヒト
ＶＰＦは乳癌の血管新生と転移[Weider,N, et.al. N.En
gl.J.Med. 324:1(1991)]や腎細胞癌の血管新生[医学の
あゆみ,168:231(1994)]、あるいは網膜疾患における血
管新生[Adamis,A.P. et.al., Biochem.Biophys.Res.Com
m.,193:631(1993)]に関与していることが報告されてい
る。これらのことより、血清、血漿、尿、唾液、骨髄
液、腹水あるいは組織抽出液などのヒト由来の体液中の
ＶＰＦ量を測定することは、癌の診断や転移の予測ある
いは治療効果の判定などに有用である可能性がある。
ト、モルモット、ウシおよびヒトの正常または腫瘍細胞
株で分泌されており、また組織別では脳、下垂体、腎
臓、卵巣に存在することが明らかにされており[(Ferrar
a,N., et.al. Endocrine Reviews 13:18(1992)]、ヒト
ＶＰＦは乳癌の血管新生と転移[Weider,N, et.al. N.En
gl.J.Med. 324:1(1991)]や腎細胞癌の血管新生[医学の
あゆみ,168:231(1994)]、あるいは網膜疾患における血
管新生[Adamis,A.P. et.al., Biochem.Biophys.Res.Com
m.,193:631(1993)]に関与していることが報告されてい
る。これらのことより、血清、血漿、尿、唾液、骨髄
液、腹水あるいは組織抽出液などのヒト由来の体液中の
ＶＰＦ量を測定することは、癌の診断や転移の予測ある
いは治療効果の判定などに有用である可能性がある。
【０００５】ヒトＶＰＦ遺伝子についてはそのｃＤＮＡ
がすでに単離されて塩基配列が決定され、アミノ酸配列
も推定されている。この遺伝子からアミノ酸残基数の異
なる４種類の蛋白(アミノ酸残基数が１２１個、１６５
個、１８９個、２０６個の４種類)が作られ、それらの
中で１２１個のアミノ酸残基数のもの(ＶＰＦ121)と１
６５個のアミノ酸残基数のもの(ＶＰＦ165)が成熟蛋白
であると言われている[(Ferrara,N., et.al. Endocrine
Reviews 13:18(1992)] 。ＶＰＦ121はＶＰＦ165のカル
ボキシル末端の４４個のアミノ酸が欠損したものである
が、ＶＰＦ121とＶＰＦ165の間に、血管内皮細胞に対す
る作用の違いがあるかどうかについては明らかでない
が、ヒトＶＰＦ121に対するモノクローナル抗体はすで
に本発明者らにより取得されており、そのモノクローナ
ル抗体およびヒトＶＰＦ121に対するポリクローナル抗
体を用いた酵素免疫測定法によりＶＰＦが測定できるこ
とが明らかにされている（日本国特許：ペプチドおよび
モノクローナル抗体、出願日平成６年６月１０日）。し
かしながら、この測定法では血清などのヒト体液中のＶ
ＰＦ量を正確に測定することは困難であり、ＶＰＦ測定
に適した測定法が不明であり、正確に測定できる方法が
求められているのが現状である。
がすでに単離されて塩基配列が決定され、アミノ酸配列
も推定されている。この遺伝子からアミノ酸残基数の異
なる４種類の蛋白(アミノ酸残基数が１２１個、１６５
個、１８９個、２０６個の４種類)が作られ、それらの
中で１２１個のアミノ酸残基数のもの(ＶＰＦ121)と１
６５個のアミノ酸残基数のもの(ＶＰＦ165)が成熟蛋白
であると言われている[(Ferrara,N., et.al. Endocrine
Reviews 13:18(1992)] 。ＶＰＦ121はＶＰＦ165のカル
ボキシル末端の４４個のアミノ酸が欠損したものである
が、ＶＰＦ121とＶＰＦ165の間に、血管内皮細胞に対す
る作用の違いがあるかどうかについては明らかでない
が、ヒトＶＰＦ121に対するモノクローナル抗体はすで
に本発明者らにより取得されており、そのモノクローナ
ル抗体およびヒトＶＰＦ121に対するポリクローナル抗
体を用いた酵素免疫測定法によりＶＰＦが測定できるこ
とが明らかにされている（日本国特許：ペプチドおよび
モノクローナル抗体、出願日平成６年６月１０日）。し
かしながら、この測定法では血清などのヒト体液中のＶ
ＰＦ量を正確に測定することは困難であり、ＶＰＦ測定
に適した測定法が不明であり、正確に測定できる方法が
求められているのが現状である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】そこで本発明者等は、
ヒト由来の体液中のＶＰＦ量を測定する場合に比色検出
法と化学発光検出法のいずれの検出法を、またどの様な
条件で測定するのが適当であるかを検討した。
ヒト由来の体液中のＶＰＦ量を測定する場合に比色検出
法と化学発光検出法のいずれの検出法を、またどの様な
条件で測定するのが適当であるかを検討した。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは健常者血清
検体および健常者尿検体を試料として用い、抗ＶＰＦポ
リクローナル抗体を用いてＶＰＦを測定する酵素免疫測
定法を構築し、検出法として化学発光法を用いることに
より正確にＶＰＦ量の測定が可能であることを見い出
し、本発明を完成させた。
検体および健常者尿検体を試料として用い、抗ＶＰＦポ
リクローナル抗体を用いてＶＰＦを測定する酵素免疫測
定法を構築し、検出法として化学発光法を用いることに
より正確にＶＰＦ量の測定が可能であることを見い出
し、本発明を完成させた。
【０００８】すなわち、本発明は、酵素免疫測定法にお
いて検出に化学発光を用いることを特徴とするＶＰＦの
測定方法に関するものである。
いて検出に化学発光を用いることを特徴とするＶＰＦの
測定方法に関するものである。
【０００９】本発明のＶＰＦの測定方法は、ＶＰＦに対
する抗体を用いた化学発光酵素免疫測定法によるもので
あり、当該酵素免疫測定法としてはヒトＶＰＦに対する
モノクローナル抗体やポリクローナル抗体を用いたサン
ドイッチ法などを適用することができる。化学発光によ
る測定は、酵素の基質として発光基質を用いて発生する
光を測定する方法である。
する抗体を用いた化学発光酵素免疫測定法によるもので
あり、当該酵素免疫測定法としてはヒトＶＰＦに対する
モノクローナル抗体やポリクローナル抗体を用いたサン
ドイッチ法などを適用することができる。化学発光によ
る測定は、酵素の基質として発光基質を用いて発生する
光を測定する方法である。
【００１０】
【作用】本発明によれば、血清、血漿、尿、唾液、骨髄
液、腹水あるいは組織抽出液などのヒト由来の体液中の
ＶＰＦを、これまで測定できなかった微量のものでも高
感度に測定することができる。
液、腹水あるいは組織抽出液などのヒト由来の体液中の
ＶＰＦを、これまで測定できなかった微量のものでも高
感度に測定することができる。
【００１１】
【実施例】以下実施例に基づいて本発明を詳細に説明す
る。 （１）抗ＶＰＦポリクローナル抗体の作製 単離したヒトＶＰＦ cＤＮＡをグルタチオンＳ-トラン
スフェラーゼ(ＧＳＴ)との融合蛋白(ＧＳＴ−ＶＰＦ)と
して大腸菌で産生させ、得られた蛋白を抗原として常法
に従ってウサギ抗ＶＰＦポリクローナル抗体を作製し
た。抗体価の上昇したウサギの血清を分離し、陰イオン
交換カラムクロマトグラフィーによりウサギ抗ＶＰＦポ
リクローナル抗体のＩgＧ画分を得た。
る。 （１）抗ＶＰＦポリクローナル抗体の作製 単離したヒトＶＰＦ cＤＮＡをグルタチオンＳ-トラン
スフェラーゼ(ＧＳＴ)との融合蛋白(ＧＳＴ−ＶＰＦ)と
して大腸菌で産生させ、得られた蛋白を抗原として常法
に従ってウサギ抗ＶＰＦポリクローナル抗体を作製し
た。抗体価の上昇したウサギの血清を分離し、陰イオン
交換カラムクロマトグラフィーによりウサギ抗ＶＰＦポ
リクローナル抗体のＩgＧ画分を得た。
【００１２】（２）抗ＶＰＦポリクローナル抗体の酵素
標識 ＩgＧ画分の一部をペプシンで消化してＦ(ab')2を調製
し、ヒンジ法によりペルオキシダーゼと結合させ、ペル
オキシダーゼ標識したウサギ抗ＶＰＦポリクローナル抗
体を得た。また、同様にＩgＧ画分の一部をペプシンで
消化してＦ(ab')2を調製後、ヒンジ法によりアルカリフ
ォスファターゼ(ウシ小腸由来)と結合させ、アルカリフ
ォスファターゼ標識したウサギ抗ＶＰＦポリクローナル
抗体を得た。
標識 ＩgＧ画分の一部をペプシンで消化してＦ(ab')2を調製
し、ヒンジ法によりペルオキシダーゼと結合させ、ペル
オキシダーゼ標識したウサギ抗ＶＰＦポリクローナル抗
体を得た。また、同様にＩgＧ画分の一部をペプシンで
消化してＦ(ab')2を調製後、ヒンジ法によりアルカリフ
ォスファターゼ(ウシ小腸由来)と結合させ、アルカリフ
ォスファターゼ標識したウサギ抗ＶＰＦポリクローナル
抗体を得た。
【００１３】（３）比色検出法を用いた酵素免疫測定法
の検出能の測定 ウサギ抗ＶＰＦポリクローナル抗体を用いて血清中ＶＰ
Ｆ量を測定する方法を以下の様に構築した。すなわち５
μg／mLの抗ＶＰＦポリクローナル抗体(0.１M塩化ナト
リウムを含む２５mM炭酸ナトリウム緩衝液 pＨ９.０に
溶解したもの)を９６穴の酵素免疫測定用プレートに１
００μLずつ入れ４℃で一晩放置することにより抗ＶＰ
Ｆポリクローナル抗体をプレートに吸着させた。0.１％
ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝化生理的食塩水
(0.１％ＢＳＡ、ＰＢＳ)でプレートの穴を６回洗浄した
後、１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝化生理的
食塩水(１％ＢＳＡ、ＰＢＳ)を穴一杯に入れ室温で１時
間放置した。穴から１％ＢＳＡ、ＰＢＳを除いた後、１
％ウシ血清アルブミン、0.４％ゲラチン、１mM塩化マグ
ネシウム、２０mMエチレンジアミン四酢酸ナトリウム、
0.１M塩化ナトリウム、0.１％アジ化ナトリウムを含む
５０mMリン酸ナトリウム緩衝液 pＨ７.0(検体希釈液)で
１０倍に希釈した血清あるいは同検体希釈液に溶解した
標準ＶＰＦを入れ室温で１時間放置した。0.１％ＢＳ
Ａ、ＰＢＳで６回洗浄後１％ＢＳＡ、ＰＢＳに溶解した
ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ＶＰＦポリクローナル抗
体を１００μLずつ入れ室温で１時間放置した。0.１％
ＢＳＡ、ＰＢＳで６回洗浄後0.２mg／mLオルトフェニレ
ンジアミンおよび0.０１５％過酸化水素を含む0.１５M
クエン酸緩衝液(pＨ５.0)１００μLを入れて発色させ
た。反応は２N硫酸を５０μL加えて停止させた後、吸光
度(ＯＤ４９０／６５０)を測定した。標準物質としては
酵母で発現させたヒトＶＰＦを用いた(日本国特許：血
管透過性因子の製造方法、出願日平成５年７月２１日、
出願番号０５−２００１８１参照)。標準物質を用いて
測定した結果をグラフにプロットして図１を得た。[検
体希釈液の測定値の平均値＋標準偏差の２倍]の値と各
濃度の[標準ＶＰＦの測定値の平均値−標準偏差の２倍]
の値を算出し、両者で差がみられる標準ＶＰＦの値の最
小値を検出能(検出限界値)とすると、比色検出法の検出
能は５０pg／mlとなった。また、この方法により健常者
血清中のＶＰＦ量を測定したがほとんどの検体は検出能
以下であった(実験結果は示さず)。
の検出能の測定 ウサギ抗ＶＰＦポリクローナル抗体を用いて血清中ＶＰ
Ｆ量を測定する方法を以下の様に構築した。すなわち５
μg／mLの抗ＶＰＦポリクローナル抗体(0.１M塩化ナト
リウムを含む２５mM炭酸ナトリウム緩衝液 pＨ９.０に
溶解したもの)を９６穴の酵素免疫測定用プレートに１
００μLずつ入れ４℃で一晩放置することにより抗ＶＰ
Ｆポリクローナル抗体をプレートに吸着させた。0.１％
ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝化生理的食塩水
(0.１％ＢＳＡ、ＰＢＳ)でプレートの穴を６回洗浄した
後、１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝化生理的
食塩水(１％ＢＳＡ、ＰＢＳ)を穴一杯に入れ室温で１時
間放置した。穴から１％ＢＳＡ、ＰＢＳを除いた後、１
％ウシ血清アルブミン、0.４％ゲラチン、１mM塩化マグ
ネシウム、２０mMエチレンジアミン四酢酸ナトリウム、
0.１M塩化ナトリウム、0.１％アジ化ナトリウムを含む
５０mMリン酸ナトリウム緩衝液 pＨ７.0(検体希釈液)で
１０倍に希釈した血清あるいは同検体希釈液に溶解した
標準ＶＰＦを入れ室温で１時間放置した。0.１％ＢＳ
Ａ、ＰＢＳで６回洗浄後１％ＢＳＡ、ＰＢＳに溶解した
ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ＶＰＦポリクローナル抗
体を１００μLずつ入れ室温で１時間放置した。0.１％
ＢＳＡ、ＰＢＳで６回洗浄後0.２mg／mLオルトフェニレ
ンジアミンおよび0.０１５％過酸化水素を含む0.１５M
クエン酸緩衝液(pＨ５.0)１００μLを入れて発色させ
た。反応は２N硫酸を５０μL加えて停止させた後、吸光
度(ＯＤ４９０／６５０)を測定した。標準物質としては
酵母で発現させたヒトＶＰＦを用いた(日本国特許：血
管透過性因子の製造方法、出願日平成５年７月２１日、
出願番号０５−２００１８１参照)。標準物質を用いて
測定した結果をグラフにプロットして図１を得た。[検
体希釈液の測定値の平均値＋標準偏差の２倍]の値と各
濃度の[標準ＶＰＦの測定値の平均値−標準偏差の２倍]
の値を算出し、両者で差がみられる標準ＶＰＦの値の最
小値を検出能(検出限界値)とすると、比色検出法の検出
能は５０pg／mlとなった。また、この方法により健常者
血清中のＶＰＦ量を測定したがほとんどの検体は検出能
以下であった(実験結果は示さず)。
【００１４】（４）化学発光検出法を用いた酵素免疫測
定法の検出能の測定 抗ＶＰＦポリクローナル抗体(５μg／mL)を１００μL／
wellずつ９６穴プレートにまき４℃で一晩放置した後、
0.１％ＢＳＡ、ＰＢＳで４回洗浄した。１％ＢＳＡ、0.
１M塩化ナトリウム、0.１％アジ化ナトリウム、0.２M炭
酸ナトリウム緩衝液 pＨ９.5でブロッキング(室温で１
時間)した後、１％ウシ血清アルブミン、0.４％ゲラチ
ン、１mM塩化マグネシウム、２０mMエチレンジアミン四
酢酸ナトリウム、0.１M塩化ナトリウム、0.１％アジ化
ナトリウムを含む５０mMリン酸ナトリウム緩衝液 pＨ
７.0(検体希釈液)で１０倍に希釈した健常者血清あるい
は同検体希釈液に溶解した標準ＶＰＦを入れ室温で１時
間放置した。0.０５％ツイーン２０、0.１４M塩化ナト
リウム、５mM塩化カリウムを含むトリス緩衝液 pＨ７.4
(ＴＢＳ−Ｔ)で４回洗浄後、アルカリフォスファターゼ
標識抗ＶＰＦポリクローナル抗体を１００μL／wellず
つ入れ室温で１時間反応させた。ＴＢＳ−Ｔで４回、さ
らに0.１４M塩化ナトリウム、５mM塩化カリウムを含む
トリス緩衝液 pＨ７.4で２回洗浄した後、１mM塩化マグ
ネシウム、0.０２％アジ化ナトリウムを含む0.１Mジエ
タノールアミン緩衝液 pＨ１０.0で５倍に希釈したルミ
フォス５３０（和光純薬工業（株）製）を１００μl／w
ellずつ入れ、３７℃で３０分間放置後、発光強度を測
定した。標準物質を用いて測定した結果をグラフにプロ
ットしてと図２を得た。[検体希釈液の測定値の平均値
＋標準偏差の２倍]の値と各濃度の[ 標準ＶＰＦの測定
値の平均値−標準偏差の２倍] の値を算出し、両者で差
がみられる標準ＶＰＦの値の最小値を検出能とすると、
化学発光検出法の検出能は１.0pg／mlとなり、比色検出
法に比べて化学発光検出法では検出能が５０倍向上し
た。
定法の検出能の測定 抗ＶＰＦポリクローナル抗体(５μg／mL)を１００μL／
wellずつ９６穴プレートにまき４℃で一晩放置した後、
0.１％ＢＳＡ、ＰＢＳで４回洗浄した。１％ＢＳＡ、0.
１M塩化ナトリウム、0.１％アジ化ナトリウム、0.２M炭
酸ナトリウム緩衝液 pＨ９.5でブロッキング(室温で１
時間)した後、１％ウシ血清アルブミン、0.４％ゲラチ
ン、１mM塩化マグネシウム、２０mMエチレンジアミン四
酢酸ナトリウム、0.１M塩化ナトリウム、0.１％アジ化
ナトリウムを含む５０mMリン酸ナトリウム緩衝液 pＨ
７.0(検体希釈液)で１０倍に希釈した健常者血清あるい
は同検体希釈液に溶解した標準ＶＰＦを入れ室温で１時
間放置した。0.０５％ツイーン２０、0.１４M塩化ナト
リウム、５mM塩化カリウムを含むトリス緩衝液 pＨ７.4
(ＴＢＳ−Ｔ)で４回洗浄後、アルカリフォスファターゼ
標識抗ＶＰＦポリクローナル抗体を１００μL／wellず
つ入れ室温で１時間反応させた。ＴＢＳ−Ｔで４回、さ
らに0.１４M塩化ナトリウム、５mM塩化カリウムを含む
トリス緩衝液 pＨ７.4で２回洗浄した後、１mM塩化マグ
ネシウム、0.０２％アジ化ナトリウムを含む0.１Mジエ
タノールアミン緩衝液 pＨ１０.0で５倍に希釈したルミ
フォス５３０（和光純薬工業（株）製）を１００μl／w
ellずつ入れ、３７℃で３０分間放置後、発光強度を測
定した。標準物質を用いて測定した結果をグラフにプロ
ットしてと図２を得た。[検体希釈液の測定値の平均値
＋標準偏差の２倍]の値と各濃度の[ 標準ＶＰＦの測定
値の平均値−標準偏差の２倍] の値を算出し、両者で差
がみられる標準ＶＰＦの値の最小値を検出能とすると、
化学発光検出法の検出能は１.0pg／mlとなり、比色検出
法に比べて化学発光検出法では検出能が５０倍向上し
た。
【００１５】（５）化学発光検出法を用いた酵素免疫測
定法による健常者血清中ＶＰＦ量の測定 化学発光検出法を用いた酵素免疫測定法により健常者血
清３０検体(男２３人、女７人)中のＶＰＦ量を測定し、
結果をグラフにプロットすると図３のようになった。健
常者の血清中ＶＰＦ量は８.1〜３５.8pg／mlの範囲にあ
り、平均値は約１９pg／mlであった。以上のことより、
化学発光検出法を用いることにより比色検出法では測定
できなかった血清中ＶＰＦ量の測定が可能になった。
定法による健常者血清中ＶＰＦ量の測定 化学発光検出法を用いた酵素免疫測定法により健常者血
清３０検体(男２３人、女７人)中のＶＰＦ量を測定し、
結果をグラフにプロットすると図３のようになった。健
常者の血清中ＶＰＦ量は８.1〜３５.8pg／mlの範囲にあ
り、平均値は約１９pg／mlであった。以上のことより、
化学発光検出法を用いることにより比色検出法では測定
できなかった血清中ＶＰＦ量の測定が可能になった。
【００１６】（６）化学発光検出法を用いた酵素免疫測
定法による健常者尿検体中ＶＰＦ量の測定 健常者尿１１４検体(男２９人、女８５人)を用い、化学
発光検出法を用いた酵素免疫測定法により尿中ＶＰＦ量
の測定を行った。まず抗ＶＰＦポリクローナル抗体(５
μg／ml)を１００μl／wellずつ９６穴プレートにまき
４℃で一晩放置した後、0.１％ＢＳＡ、ＰＢＳで４回洗
浄した。１％ＢＳＡ、0.１M塩化ナトリウム、0.１％ア
ジ化ナトリウム、0.２M炭酸ナトリウム緩衝液 pＨ９.5
でブロッキング(室温で１時間)した後、１％ウシ血清ア
ルブミン、0.４％ゲラチン、１mM塩化マグネシウム、２
０mMエチレンジアミン四酢酸ナトリウム、0.１M塩化ナ
トリウム、0.１％アジ化ナトリウムを含む５０mMリン酸
ナトリウム緩衝液 pＨ７.0(検体希釈液)で４倍に希釈し
た健常者尿を入れ室温で１時間放置した。ＴＢＳ−Ｔで
４回洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識抗ＶＰＦポ
リクローナル抗体を１００μl／wellずつ入れ室温で１
時間反応させた。ＴＢＳ−Ｔで４回、さらに0.１４M塩
化ナトリウム、５mM塩化カリウムを含むトリス緩衝液 p
Ｈ７.4で２回洗浄した後、１mM塩化マグネシウム、0.０
２％アジ化ナトリウムを含む0.１Mジエタノールアミン
緩衝液 pＨ１０.0で５倍に希釈したルミフォス５３０
（和光純薬工業（株）製）を１００μl／wellずつ入
れ、３７℃で３０分間放置後、発光強度を測定した。こ
の結果をグラフにプロットすると図４のようになった。
尿中ＶＰＦ量は尿の濃縮度を補正するために別に尿中ク
レアチニン濃度を測定し、１００(mg／dl)クレアチニン
当りの濃度(pg／ml)として示した。健常者の尿中ＶＰＦ
量は０〜９１.6(pg／ml)／１００(mg／dl)クレアチニン
の範囲にあり、平均値は約２５(pg／ml)／１００(mg／d
l)クレアチニンであった。以上のとおり化学発光検出法
による尿中のＶＰＦ量の測定は良好に行うことができ
た。
定法による健常者尿検体中ＶＰＦ量の測定 健常者尿１１４検体(男２９人、女８５人)を用い、化学
発光検出法を用いた酵素免疫測定法により尿中ＶＰＦ量
の測定を行った。まず抗ＶＰＦポリクローナル抗体(５
μg／ml)を１００μl／wellずつ９６穴プレートにまき
４℃で一晩放置した後、0.１％ＢＳＡ、ＰＢＳで４回洗
浄した。１％ＢＳＡ、0.１M塩化ナトリウム、0.１％ア
ジ化ナトリウム、0.２M炭酸ナトリウム緩衝液 pＨ９.5
でブロッキング(室温で１時間)した後、１％ウシ血清ア
ルブミン、0.４％ゲラチン、１mM塩化マグネシウム、２
０mMエチレンジアミン四酢酸ナトリウム、0.１M塩化ナ
トリウム、0.１％アジ化ナトリウムを含む５０mMリン酸
ナトリウム緩衝液 pＨ７.0(検体希釈液)で４倍に希釈し
た健常者尿を入れ室温で１時間放置した。ＴＢＳ−Ｔで
４回洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識抗ＶＰＦポ
リクローナル抗体を１００μl／wellずつ入れ室温で１
時間反応させた。ＴＢＳ−Ｔで４回、さらに0.１４M塩
化ナトリウム、５mM塩化カリウムを含むトリス緩衝液 p
Ｈ７.4で２回洗浄した後、１mM塩化マグネシウム、0.０
２％アジ化ナトリウムを含む0.１Mジエタノールアミン
緩衝液 pＨ１０.0で５倍に希釈したルミフォス５３０
（和光純薬工業（株）製）を１００μl／wellずつ入
れ、３７℃で３０分間放置後、発光強度を測定した。こ
の結果をグラフにプロットすると図４のようになった。
尿中ＶＰＦ量は尿の濃縮度を補正するために別に尿中ク
レアチニン濃度を測定し、１００(mg／dl)クレアチニン
当りの濃度(pg／ml)として示した。健常者の尿中ＶＰＦ
量は０〜９１.6(pg／ml)／１００(mg／dl)クレアチニン
の範囲にあり、平均値は約２５(pg／ml)／１００(mg／d
l)クレアチニンであった。以上のとおり化学発光検出法
による尿中のＶＰＦ量の測定は良好に行うことができ
た。
【００１７】
【発明の効果】本発明によれば、血清、血漿、尿、唾
液、骨髄液、腹水あるいは組織抽出液などのヒト由来の
体液中の微量のＶＰＦの測定が可能になり、腫瘍や炎症
等の診断マーカーや治療効果の判定あるいは術後のモニ
タリングなどへのＶＰＦの利用を可能にするという効果
が奏されるため、診断薬としてあるいは病理学への応用
に幅広く利用されるという優れた効果をもたらすもので
ある。
液、骨髄液、腹水あるいは組織抽出液などのヒト由来の
体液中の微量のＶＰＦの測定が可能になり、腫瘍や炎症
等の診断マーカーや治療効果の判定あるいは術後のモニ
タリングなどへのＶＰＦの利用を可能にするという効果
が奏されるため、診断薬としてあるいは病理学への応用
に幅広く利用されるという優れた効果をもたらすもので
ある。
【図１】比色検出法を用いた酵素免疫測定法により標準
ＶＰＦを用いてＶＰＦの検出能を調べた図である。
ＶＰＦを用いてＶＰＦの検出能を調べた図である。
【図２】化学発光検出法を用いた酵素免疫測定法により
標準ＶＰＦを用いてＶＰＦの検出能を調べた図である。
標準ＶＰＦを用いてＶＰＦの検出能を調べた図である。
【図３】化学発光検出法を用いた酵素免疫測定法により
健常者血清中のＶＰＦ量を測定した結果をヒストグラム
で示した図である。
健常者血清中のＶＰＦ量を測定した結果をヒストグラム
で示した図である。
【図４】化学発光検出法を用いた酵素免疫測定法により
健常者尿中ＶＰＦ量の測定を行った結果を示す図であ
る。
健常者尿中ＶＰＦ量の測定を行った結果を示す図であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 近藤 伸一 茨城県つくば市大久保２番 東亞合成株式 会社つくば研究所内 (72)発明者 大森 巌 茨城県つくば市大久保２番 東亞合成株式 会社つくば研究所内
Claims (1)
- 【請求項１】酵素免疫測定法において検出に化学発光を
用いることを特徴とする血管透過性因子の測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14127195A JPH08313522A (ja) | 1995-05-16 | 1995-05-16 | 血管透過性因子の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14127195A JPH08313522A (ja) | 1995-05-16 | 1995-05-16 | 血管透過性因子の測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08313522A true JPH08313522A (ja) | 1996-11-29 |
Family
ID=15288017
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14127195A Pending JPH08313522A (ja) | 1995-05-16 | 1995-05-16 | 血管透過性因子の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08313522A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998005960A1 (fr) * | 1996-08-02 | 1998-02-12 | Toagosei Co. Ltd. | Methode et reactifs pour detecter le cancer du colon |
-
1995
- 1995-05-16 JP JP14127195A patent/JPH08313522A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998005960A1 (fr) * | 1996-08-02 | 1998-02-12 | Toagosei Co. Ltd. | Methode et reactifs pour detecter le cancer du colon |
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