JPH1048219A - 肝癌の検査方法及び検査薬 - Google Patents
肝癌の検査方法及び検査薬Info
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- JPH1048219A JPH1048219A JP22057496A JP22057496A JPH1048219A JP H1048219 A JPH1048219 A JP H1048219A JP 22057496 A JP22057496 A JP 22057496A JP 22057496 A JP22057496 A JP 22057496A JP H1048219 A JPH1048219 A JP H1048219A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 肝癌の検査方法、特に肝硬変から肝癌への移
行のモニタリングに適した肝癌の検査方法を提供するこ
とを目的とする。 【解決手段】 ヒト血清中の血管内皮細胞増殖因子／血
管透過性因子の量を測定することからなる肝癌の検査方
法及び血管内皮細胞増殖因子／血管透過性因子と特異的
に反応する物質からなる肝癌の検査薬である。
行のモニタリングに適した肝癌の検査方法を提供するこ
とを目的とする。 【解決手段】 ヒト血清中の血管内皮細胞増殖因子／血
管透過性因子の量を測定することからなる肝癌の検査方
法及び血管内皮細胞増殖因子／血管透過性因子と特異的
に反応する物質からなる肝癌の検査薬である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、血清中血管内皮細胞増
殖因子／血管透過性因子(Vascular endothelial growth
factor/vascular permeability factor, 以下ＶＥＧＦ
／ＶＰＦ又はＶＰＦと称する)の量を測定することによ
る肝癌の検査方法及びそれに使用する検査薬に関するも
のである。本発明による肝癌の検査は、前癌病変である
肝硬変から肝癌への移行のモニタリングのための臨床検
査法として用いられるものであり、医療の診断技術及び
検査薬技術に関するものである。
殖因子／血管透過性因子(Vascular endothelial growth
factor/vascular permeability factor, 以下ＶＥＧＦ
／ＶＰＦ又はＶＰＦと称する)の量を測定することによ
る肝癌の検査方法及びそれに使用する検査薬に関するも
のである。本発明による肝癌の検査は、前癌病変である
肝硬変から肝癌への移行のモニタリングのための臨床検
査法として用いられるものであり、医療の診断技術及び
検査薬技術に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】多くの肝疾患は、最終的に肝硬変という
病態になることが知られている。また、肝硬変症例での
死亡時の肝癌合併率は８０％以上であり、肝硬変の予後
は多くの場合発癌の有無に依存していることが明らかに
なっている（熊田博光 「医学のあゆみ」 第171巻 14号
p.1093-1096(1994年)。したがって、肝硬変から肝癌へ
の移行のモニタリングを行うことは、予後の判定および
治療方法の決定などのために臨床上非常に重要である。
現在、肝硬変症例での発癌の危険因子としては、Ｂ型肝
硬変とＣ型肝硬変で多少異なっており、前者では年齢、
血清ビリルビン及び色素排泄試験(ＩＣＧ)１５分値、後
者では年齢、α-フェトプロテイン(ＡＦＰ)値、多飲酒
歴が知られている。しかしながら、これらの因子は実際
には予後因子として用いられるまでには至っていない。
病態になることが知られている。また、肝硬変症例での
死亡時の肝癌合併率は８０％以上であり、肝硬変の予後
は多くの場合発癌の有無に依存していることが明らかに
なっている（熊田博光 「医学のあゆみ」 第171巻 14号
p.1093-1096(1994年)。したがって、肝硬変から肝癌へ
の移行のモニタリングを行うことは、予後の判定および
治療方法の決定などのために臨床上非常に重要である。
現在、肝硬変症例での発癌の危険因子としては、Ｂ型肝
硬変とＣ型肝硬変で多少異なっており、前者では年齢、
血清ビリルビン及び色素排泄試験(ＩＣＧ)１５分値、後
者では年齢、α-フェトプロテイン(ＡＦＰ)値、多飲酒
歴が知られている。しかしながら、これらの因子は実際
には予後因子として用いられるまでには至っていない。
【０００３】一方、血管新生すなわち毛細血管内皮細胞
の増殖、移動および組織への浸潤は胎児の生長、創傷治
癒、癌細胞の増殖などの生理的又は病理的現象において
重要な役割を果たしていることが知られている[(Folkma
n J., Cancer Res. 46:467(1986)]。血管新生を誘導す
る因子としては、直接的に血管内皮細胞に作用する物質
として塩基性線維芽細胞増殖因子(basic fibroblast gr
owth factor, bFGF)、酸性線維芽細胞増殖因子(acidic
fibroblast growth factor, aFGF)、血管内皮細胞増殖
因子／血管透過性因子(vascular endothelial growth f
actor/vascular permeability factor, VEGF/VPF)、血
小板由来内皮細胞増殖因子(platelet-derived endothel
ial cell growth factor, PD-ECGF)などが、また間接的
に血管内皮細胞に作用する物質としてtransforming gro
wth factor-α(TGF-α)、transforminggrowth factor-
β(TGF-β)、angiogenin、tumor necrosis factor-α(T
NF-α)などが見つけられている[Folkman J. & Shing
Y., J. Biol. Chem., 267:10931(1992)]。
の増殖、移動および組織への浸潤は胎児の生長、創傷治
癒、癌細胞の増殖などの生理的又は病理的現象において
重要な役割を果たしていることが知られている[(Folkma
n J., Cancer Res. 46:467(1986)]。血管新生を誘導す
る因子としては、直接的に血管内皮細胞に作用する物質
として塩基性線維芽細胞増殖因子(basic fibroblast gr
owth factor, bFGF)、酸性線維芽細胞増殖因子(acidic
fibroblast growth factor, aFGF)、血管内皮細胞増殖
因子／血管透過性因子(vascular endothelial growth f
actor/vascular permeability factor, VEGF/VPF)、血
小板由来内皮細胞増殖因子(platelet-derived endothel
ial cell growth factor, PD-ECGF)などが、また間接的
に血管内皮細胞に作用する物質としてtransforming gro
wth factor-α(TGF-α)、transforminggrowth factor-
β(TGF-β)、angiogenin、tumor necrosis factor-α(T
NF-α)などが見つけられている[Folkman J. & Shing
Y., J. Biol. Chem., 267:10931(1992)]。
【０００４】ＶＰＦに関しては、マウス、ラット、モル
モット、ウシ及びヒトの正常又は腫瘍細胞株で分泌され
ており、また組織別では脳、下垂体、腎臓、卵巣に存在
することが明らかにされている[(Ferrara N. et. al.,
Endocrine Reviews 13:18(1992)]。またヒトＶＰＦは乳
癌の血管新生と転移[Weider N. et. al., N. Engl. J.
Med. 324:1(1991)]や腎細胞癌の血管新生[医学のあゆ
み,168:231(1994)]、あるいは網膜疾患における血管新
生[Adamis A. P. et. al. Biochem. Biophys. Res. Com
m. 193:631(1993)]に関与していることが報告されてい
る。
モット、ウシ及びヒトの正常又は腫瘍細胞株で分泌され
ており、また組織別では脳、下垂体、腎臓、卵巣に存在
することが明らかにされている[(Ferrara N. et. al.,
Endocrine Reviews 13:18(1992)]。またヒトＶＰＦは乳
癌の血管新生と転移[Weider N. et. al., N. Engl. J.
Med. 324:1(1991)]や腎細胞癌の血管新生[医学のあゆ
み,168:231(1994)]、あるいは網膜疾患における血管新
生[Adamis A. P. et. al. Biochem. Biophys. Res. Com
m. 193:631(1993)]に関与していることが報告されてい
る。
【０００５】ヒトＶＰＦ遺伝子についてはそのcＤＮＡ
がすでに単離されて塩基配列が決定され、アミノ酸配列
も推定されている。この遺伝子は１つの遺伝子からアミ
ノ酸残基数の異なる４種類の蛋白(アミノ酸残基数が１
２１個、１６５個、１８９個、２０６個の４種類)が作
られ、それらの中で１２１個のアミノ酸残基数のもの
(ＶＰＦ121)と１６５個のアミノ酸残基数のもの(ＶＰＦ
165)が分泌蛋白であると言われている[(Ferrara N. et.
al., Endocrine Reviews 13:18(1992)]。ＶＰＦ121は
ＶＰＦ165のカルボキシル末端の４４個のアミノ酸が欠
損したものであるが、ＶＰＦ121とＶＰＦ165の間に、血
管内皮細胞に対する作用の違いがあるかどうかについて
は明らかでない。
がすでに単離されて塩基配列が決定され、アミノ酸配列
も推定されている。この遺伝子は１つの遺伝子からアミ
ノ酸残基数の異なる４種類の蛋白(アミノ酸残基数が１
２１個、１６５個、１８９個、２０６個の４種類)が作
られ、それらの中で１２１個のアミノ酸残基数のもの
(ＶＰＦ121)と１６５個のアミノ酸残基数のもの(ＶＰＦ
165)が分泌蛋白であると言われている[(Ferrara N. et.
al., Endocrine Reviews 13:18(1992)]。ＶＰＦ121は
ＶＰＦ165のカルボキシル末端の４４個のアミノ酸が欠
損したものであるが、ＶＰＦ121とＶＰＦ165の間に、血
管内皮細胞に対する作用の違いがあるかどうかについて
は明らかでない。
【０００６】さらに、ヒトＶＰＦ121に対するモノクロ
ーナル抗体はすでに本発明者らにより取得されている
(特願平６−１５２８０５号「ペプチド及びモノクローナ
ル抗体」)。さらに、そのモノクローナル抗体及びヒトＶ
ＰＦ121に対するポリクローナル抗体を用いた酵素免疫
測定法により、数pg/mlのＶＰＦが測定できることも明
らかにされている(特願平７−１４１２７１号「血管透過
性因子の測定方法」)。
ーナル抗体はすでに本発明者らにより取得されている
(特願平６−１５２８０５号「ペプチド及びモノクローナ
ル抗体」)。さらに、そのモノクローナル抗体及びヒトＶ
ＰＦ121に対するポリクローナル抗体を用いた酵素免疫
測定法により、数pg/mlのＶＰＦが測定できることも明
らかにされている(特願平７−１４１２７１号「血管透過
性因子の測定方法」)。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、以上の
様な状況の中で、肝癌患者の血清中のＶＰＦの量を測定
することにより、肝硬変から肝癌への移行のモニタリン
グが出来ないか検討を行ったのである。すなわち本発明
は肝硬変から肝癌への移行のモニタリングを行う方法を
提供することを目的とする。
様な状況の中で、肝癌患者の血清中のＶＰＦの量を測定
することにより、肝硬変から肝癌への移行のモニタリン
グが出来ないか検討を行ったのである。すなわち本発明
は肝硬変から肝癌への移行のモニタリングを行う方法を
提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決する手段】本発明者らは、肝癌患者の血清
を試料として用い、酵素免疫測定法により血清中のＶＰ
Ｆ量を測定し、肝硬変から肝癌への移行のモニタリング
ができることを見い出し、本発明を完成させたのであ
る。すなわち本発明はヒト血清中の血管内皮細胞増殖因
子／血管透過性因子の量を測定することを特徴とする肝
癌の検査方法に関するものと血管内皮細胞増殖因子／血
管透過性因子と特異的に反応する物質からなることを特
徴とする肝癌検査薬に関するものである。本発明の肝癌
の検査方法は、特に肝硬変から肝癌への移行のモニタリ
ングに適したものである。
を試料として用い、酵素免疫測定法により血清中のＶＰ
Ｆ量を測定し、肝硬変から肝癌への移行のモニタリング
ができることを見い出し、本発明を完成させたのであ
る。すなわち本発明はヒト血清中の血管内皮細胞増殖因
子／血管透過性因子の量を測定することを特徴とする肝
癌の検査方法に関するものと血管内皮細胞増殖因子／血
管透過性因子と特異的に反応する物質からなることを特
徴とする肝癌検査薬に関するものである。本発明の肝癌
の検査方法は、特に肝硬変から肝癌への移行のモニタリ
ングに適したものである。
【０００９】
【実施の形態】以下本発明について詳説する。血清中の
ＶＰＦ濃度の測定には、ＶＰＦと特異的に反応する物
質、例えば抗ＶＰＦ抗体またはＶＰＦ受容体等を用いる
公知の標識免疫測定法が適しており、本発明においても
好ましい方法である。例えば、抗ＶＰＦ抗体を用いる際
には、標識として赤血球、ラテックス、放射性同位元
素、酵素、発光物質、蛍光物質、金属分子、金属ゲル、
バクテリオファージなどを用いる標識免疫測定法が適用
される。特に、臨床で応用される場合は、酵素免疫測定
法が好適であり、また実際に臨床で酵素免疫測定法は広
く用いられている。酵素免疫測定法(ＥＩＡ法)は、酵素
活性を指標として抗原抗体反応を追跡し、これから抗原
又は抗体の量を測定する方法であり、その詳細は、例え
ば北川等による「酵素免疫測定法 No.31 蛋白質核酸酵素
別冊 1987年」に明らかにされている。この測定法は、
測定対象、標識物質、抗原抗体反応の形式、結合体／遊
離体の分離方法(Ｂ/Ｆ分離法)などの違いにより、競合
法、非競合法、ホモジニアス法、ヘテロジニアス法など
の分類が施されている。
ＶＰＦ濃度の測定には、ＶＰＦと特異的に反応する物
質、例えば抗ＶＰＦ抗体またはＶＰＦ受容体等を用いる
公知の標識免疫測定法が適しており、本発明においても
好ましい方法である。例えば、抗ＶＰＦ抗体を用いる際
には、標識として赤血球、ラテックス、放射性同位元
素、酵素、発光物質、蛍光物質、金属分子、金属ゲル、
バクテリオファージなどを用いる標識免疫測定法が適用
される。特に、臨床で応用される場合は、酵素免疫測定
法が好適であり、また実際に臨床で酵素免疫測定法は広
く用いられている。酵素免疫測定法(ＥＩＡ法)は、酵素
活性を指標として抗原抗体反応を追跡し、これから抗原
又は抗体の量を測定する方法であり、その詳細は、例え
ば北川等による「酵素免疫測定法 No.31 蛋白質核酸酵素
別冊 1987年」に明らかにされている。この測定法は、
測定対象、標識物質、抗原抗体反応の形式、結合体／遊
離体の分離方法(Ｂ/Ｆ分離法)などの違いにより、競合
法、非競合法、ホモジニアス法、ヘテロジニアス法など
の分類が施されている。
【００１０】
（１）抗ＶＰＦポリクローナル抗体の作製 単離したヒトＶＰＦcＤＮＡをグルタチオンS-トランス
フェラーゼ(ＧＳＴ)との融合蛋白(ＧＳＴ-ＶＰＦ)とし
て大腸菌で産生させ、得られた蛋白を抗原として常法に
従ってウサギ抗ＶＰＦポリクローナル抗体を作製した。
抗体価の上昇したウサギの血清を分離し、陰イオン交換
カラムクロマトグラフィーによりウサギ抗ＶＰＦポリク
ローナル抗体のＩgＧ画分を得た。
フェラーゼ(ＧＳＴ)との融合蛋白(ＧＳＴ-ＶＰＦ)とし
て大腸菌で産生させ、得られた蛋白を抗原として常法に
従ってウサギ抗ＶＰＦポリクローナル抗体を作製した。
抗体価の上昇したウサギの血清を分離し、陰イオン交換
カラムクロマトグラフィーによりウサギ抗ＶＰＦポリク
ローナル抗体のＩgＧ画分を得た。
【００１１】（２）抗ＶＰＦポリクローナル抗体の酵素
標識 ＩgＧ画分の一部をペプシンで消化してＦ(ab')２を調製
後、ヒンジ法によりペルオキシダーゼ(西洋わさび)と結
合させ、ペルオキシダーゼ標識したウサギ抗ＶＰＦポリ
クローナル抗体を得た。
標識 ＩgＧ画分の一部をペプシンで消化してＦ(ab')２を調製
後、ヒンジ法によりペルオキシダーゼ(西洋わさび)と結
合させ、ペルオキシダーゼ標識したウサギ抗ＶＰＦポリ
クローナル抗体を得た。
【００１２】（３）肝硬変および肝癌患者の血清中ＶＰ
Ｆ濃度の測定 肝硬変患者４０人、肝癌患者５０人の血清中のＶＰＦ濃
度の測定を、以下に示すように、酵素免疫測定法により
行った。すなわち、抗ＶＰＦポリクローナル抗体(５μg
/ml)を１００μl/wellずつ９６穴プレートにまき４℃で
一晩放置した後、０.１％ウシ血清アルブミン(ＢＳ
Ａ)、ＰＢＳで４回洗浄した。１％ＢＳＡ、０.１M塩化
ナトリウム、０.１％アジ化ナトリウム、０.１M炭酸ナ
トリウム緩衝液(pＨ=６.５)１でブロッキング(３７℃で
４時間)した後、１％ＢＳＡ、０.４％ゲラチン、１mM塩
化マグネシウム、２０mMエチレンジアミン四酢酸ナトリ
ウム、０.１M塩化ナトリウム、０.１％アジ化ナトリウ
ムを含む５０mMリン酸ナトリウム緩衝液(pＨ=７.０)(検
体希釈液)で３倍に希釈した血清あるいは同検体希釈液
に溶解した標準ＶＰＦを入れ室温で１時間放置した。
０.１％ＢＳＡ、ＰＢＳで６回洗浄後、ペルオキシダー
ゼ標識抗ＶＰＦポリクローナル抗体を１００μl/wellず
つ入れ室温で１時間反応させた。再度、０.１％ＢＳ
Ａ、ＰＢＳで８回洗浄後、０.１２５％(w/v)オルトフェ
ニレンジアミン、０.０１５％過酸化水素、０.２Mトリ
ス(ヒドロキシメチル(アミノメタン)-クエン酸緩衝液(p
Ｈ=５.２)を１００μl/wellずつ入れ、室温で３０分間
反応させた。２N硫酸を１００μl/wellずつ入れ、反応
を停止させた後、６５０nmの吸光度に対する４９０nmの
吸光度をプレートリーダー（M-Vmax, Molecular Device
s 社製）で測定した。
Ｆ濃度の測定 肝硬変患者４０人、肝癌患者５０人の血清中のＶＰＦ濃
度の測定を、以下に示すように、酵素免疫測定法により
行った。すなわち、抗ＶＰＦポリクローナル抗体(５μg
/ml)を１００μl/wellずつ９６穴プレートにまき４℃で
一晩放置した後、０.１％ウシ血清アルブミン(ＢＳ
Ａ)、ＰＢＳで４回洗浄した。１％ＢＳＡ、０.１M塩化
ナトリウム、０.１％アジ化ナトリウム、０.１M炭酸ナ
トリウム緩衝液(pＨ=６.５)１でブロッキング(３７℃で
４時間)した後、１％ＢＳＡ、０.４％ゲラチン、１mM塩
化マグネシウム、２０mMエチレンジアミン四酢酸ナトリ
ウム、０.１M塩化ナトリウム、０.１％アジ化ナトリウ
ムを含む５０mMリン酸ナトリウム緩衝液(pＨ=７.０)(検
体希釈液)で３倍に希釈した血清あるいは同検体希釈液
に溶解した標準ＶＰＦを入れ室温で１時間放置した。
０.１％ＢＳＡ、ＰＢＳで６回洗浄後、ペルオキシダー
ゼ標識抗ＶＰＦポリクローナル抗体を１００μl/wellず
つ入れ室温で１時間反応させた。再度、０.１％ＢＳ
Ａ、ＰＢＳで８回洗浄後、０.１２５％(w/v)オルトフェ
ニレンジアミン、０.０１５％過酸化水素、０.２Mトリ
ス(ヒドロキシメチル(アミノメタン)-クエン酸緩衝液(p
Ｈ=５.２)を１００μl/wellずつ入れ、室温で３０分間
反応させた。２N硫酸を１００μl/wellずつ入れ、反応
を停止させた後、６５０nmの吸光度に対する４９０nmの
吸光度をプレートリーダー（M-Vmax, Molecular Device
s 社製）で測定した。
【００１３】肝硬変患者４０人、肝癌患者５０人の血清
中ＶＰＦ量の測定結果を表１に示した。肝硬変患者のＶ
ＰＦ量(平均±標準偏差)は４１.４±３８.０pg/mlに対
し、肝癌患者は７０.４±５２.２pg/mlであり、肝硬変
患者と比較して肝癌患者で有意に高値を示した。このこ
とより、血清中のＶＰＦ量を測定することにより肝癌の
検査が可能であることが明らかになった。
中ＶＰＦ量の測定結果を表１に示した。肝硬変患者のＶ
ＰＦ量(平均±標準偏差)は４１.４±３８.０pg/mlに対
し、肝癌患者は７０.４±５２.２pg/mlであり、肝硬変
患者と比較して肝癌患者で有意に高値を示した。このこ
とより、血清中のＶＰＦ量を測定することにより肝癌の
検査が可能であることが明らかになった。
【００１４】
【表１】
【００１５】
【発明の効果】本発明によれば、すなわち、標識免疫測
定法を用いて血清中のＶＰＦ量を測定することにより、
肝癌の検査ができ、さらに、肝硬変から肝癌への移行の
モニタリング(診断)ができ、本発明はこれまで用いられ
てきた検査方法に加えて、新たな検査方法として利用す
ることができる。
定法を用いて血清中のＶＰＦ量を測定することにより、
肝癌の検査ができ、さらに、肝硬変から肝癌への移行の
モニタリング(診断)ができ、本発明はこれまで用いられ
てきた検査方法に加えて、新たな検査方法として利用す
ることができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 松尾 克彦 茨城県つくば市大久保２番 東亞合成株式 会社つくば研究所内
Claims (3)
- 【請求項１】ヒト血清中の血管内皮細胞増殖因子／血管
透過性因子の量を測定することを特徴とする肝癌の検査
方法。 - 【請求項２】血管内皮細胞増殖因子／血管透過性因子と
特異的に反応する物質からなることを特徴とする肝癌検
査薬。 - 【請求項３】血管内皮細胞増殖因子／血管透過性因子と
特異的に反応する物質が、抗血管内皮細胞増殖因子／血
管透過性因子抗体又は血管内皮細胞増殖因子／血管透過
性因子受容体であることを特徴とする請求項２記載の肝
癌検査薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22057496A JPH1048219A (ja) | 1996-08-02 | 1996-08-02 | 肝癌の検査方法及び検査薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22057496A JPH1048219A (ja) | 1996-08-02 | 1996-08-02 | 肝癌の検査方法及び検査薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1048219A true JPH1048219A (ja) | 1998-02-20 |
Family
ID=16753125
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22057496A Pending JPH1048219A (ja) | 1996-08-02 | 1996-08-02 | 肝癌の検査方法及び検査薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1048219A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001032213A1 (en) * | 1999-11-02 | 2001-05-10 | Toagosei Co., Ltd. | Liver generation promoters and remedies for liver failure |
-
1996
- 1996-08-02 JP JP22057496A patent/JPH1048219A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001032213A1 (en) * | 1999-11-02 | 2001-05-10 | Toagosei Co., Ltd. | Liver generation promoters and remedies for liver failure |
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