JPH0933531A - 肺癌細胞の有無判定方法および肺癌診断用検査薬 - Google Patents
肺癌細胞の有無判定方法および肺癌診断用検査薬Info
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- JPH0933531A JPH0933531A JP20665995A JP20665995A JPH0933531A JP H0933531 A JPH0933531 A JP H0933531A JP 20665995 A JP20665995 A JP 20665995A JP 20665995 A JP20665995 A JP 20665995A JP H0933531 A JPH0933531 A JP H0933531A
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Landscapes
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 肺癌細胞の有無判定方法および肺癌診断用検
査薬を提供することを課題とする。 【解決手段】 ヒト血清中に存在する血管透過性因子の
存在量に基づく肺癌細胞の有無判定方法と血管透過性因
子の抗体からなる肺癌診断用検査薬。 【効果】 血清中の肺癌マーカーとして優れる血管透過
性因子は、これを測定することにより、特に化学発光検
出系酵素免疫測定法を用いて高感度で測定することによ
り、肺癌の早期診断、さらには治療効果の判定、経過観
察に非常に有用に用いられる。
査薬を提供することを課題とする。 【解決手段】 ヒト血清中に存在する血管透過性因子の
存在量に基づく肺癌細胞の有無判定方法と血管透過性因
子の抗体からなる肺癌診断用検査薬。 【効果】 血清中の肺癌マーカーとして優れる血管透過
性因子は、これを測定することにより、特に化学発光検
出系酵素免疫測定法を用いて高感度で測定することによ
り、肺癌の早期診断、さらには治療効果の判定、経過観
察に非常に有用に用いられる。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、血清中に存在する
血管透過性因子(vascular permeability factor)または
血管内皮細胞増殖因子(vascular endothelial growth f
actor)と呼称されている因子(以下VPFと略す)の存在
量を測定し、それに基づいて該血清提供者が肺癌細胞を
有するか否かを判定する方法に関するものであり、医者
が肺癌を診断する際に有用となる情報を提供する方法で
あり、また肺癌の診断に有用な肺癌診断用検査薬に関す
るものであり、医薬業界において利用されるものであ
る。
血管透過性因子(vascular permeability factor)または
血管内皮細胞増殖因子(vascular endothelial growth f
actor)と呼称されている因子(以下VPFと略す)の存在
量を測定し、それに基づいて該血清提供者が肺癌細胞を
有するか否かを判定する方法に関するものであり、医者
が肺癌を診断する際に有用となる情報を提供する方法で
あり、また肺癌の診断に有用な肺癌診断用検査薬に関す
るものであり、医薬業界において利用されるものであ
る。
【0002】
【従来の技術】現在、肺癌の早期診断としては一般的に
はX線検査が用いられている。一方、血清腫瘍マーカー
についても検討が進められ、CEA(carcinoembryonic
antigen)、SCC(squamous cell carcinoma-related a
ntigen)、NSE(neurospecific enolase) 、SLX(si
alyl LeX-i antigen)などが報告されているが、それら
の臨床病期I期の陽性率は高いものでも約30%である
(有吉 寛、桑原正喜:腫瘍マーカーの臨床への応用、
肺癌、病理と臨床、8、臨時増刊号 289-299、1990)。
従って、これらのマーカーは早期診断のために適当なも
のであるとは言えないものである。この原因としては、
これらの腫瘍マーカーの多くは、組織型により陽性率が
異なっている、すなわち、SCCは扁平上皮癌、SLX
は腺癌、NSEは小細胞癌において高い陽性率を示す
が、その他の組織型では陽性率は低いという様に、これ
らの腫瘍マーカーの産生は組織型が異なる細胞におい
て、発現量が異なっているということが考えられてい
る。一方、血管新生すなわち毛細血管内皮細胞の増殖、
移動および組織への浸潤という現象は胎児の生長、創傷
治癒、癌細胞の増殖などの生理的または病理的現象にお
いて重要な役割を果たしていることが知られており[(Fo
lkman,J.,Cancer Res.46:467(1986)]、血管新生を誘導
する因子としては、直接的に血管内皮細胞に作用する物
質として塩基性線維芽細胞増殖因子(basic fibroblast
growth factor,bFGF)、酸性線維芽細胞増殖因子(acidic
fibroblast growth factor,aFGF)、血管内皮細胞増殖
因子/血管透過性因子(vascular endothelial growth f
actor/vascular permeability factor,VPF)、血小板
由来内皮細胞増殖因子(platelet-derived endothelial
cell growth factor,PD-ECGF)などが、また間接的に血
管内皮細胞に作用する物質としてtransforming growth
factor-α(TGF-α)、transforming growth factor-β(T
GF-β)、angiogenin、tumor necrosis factor-α(TNF-
α)などが見つけられている[Folkman,J. & Shing,Y.,J.
Biol.Chem.,267:10931(1992)]。
はX線検査が用いられている。一方、血清腫瘍マーカー
についても検討が進められ、CEA(carcinoembryonic
antigen)、SCC(squamous cell carcinoma-related a
ntigen)、NSE(neurospecific enolase) 、SLX(si
alyl LeX-i antigen)などが報告されているが、それら
の臨床病期I期の陽性率は高いものでも約30%である
(有吉 寛、桑原正喜:腫瘍マーカーの臨床への応用、
肺癌、病理と臨床、8、臨時増刊号 289-299、1990)。
従って、これらのマーカーは早期診断のために適当なも
のであるとは言えないものである。この原因としては、
これらの腫瘍マーカーの多くは、組織型により陽性率が
異なっている、すなわち、SCCは扁平上皮癌、SLX
は腺癌、NSEは小細胞癌において高い陽性率を示す
が、その他の組織型では陽性率は低いという様に、これ
らの腫瘍マーカーの産生は組織型が異なる細胞におい
て、発現量が異なっているということが考えられてい
る。一方、血管新生すなわち毛細血管内皮細胞の増殖、
移動および組織への浸潤という現象は胎児の生長、創傷
治癒、癌細胞の増殖などの生理的または病理的現象にお
いて重要な役割を果たしていることが知られており[(Fo
lkman,J.,Cancer Res.46:467(1986)]、血管新生を誘導
する因子としては、直接的に血管内皮細胞に作用する物
質として塩基性線維芽細胞増殖因子(basic fibroblast
growth factor,bFGF)、酸性線維芽細胞増殖因子(acidic
fibroblast growth factor,aFGF)、血管内皮細胞増殖
因子/血管透過性因子(vascular endothelial growth f
actor/vascular permeability factor,VPF)、血小板
由来内皮細胞増殖因子(platelet-derived endothelial
cell growth factor,PD-ECGF)などが、また間接的に血
管内皮細胞に作用する物質としてtransforming growth
factor-α(TGF-α)、transforming growth factor-β(T
GF-β)、angiogenin、tumor necrosis factor-α(TNF-
α)などが見つけられている[Folkman,J. & Shing,Y.,J.
Biol.Chem.,267:10931(1992)]。
【0003】これらの中で、VPFに関しては、マウ
ス、ラット、モルモット、ウシおよびヒトの正常または
腫瘍細胞株で分泌されており、また組織別では脳、下垂
体、腎臓、卵巣に存在することが明らかにされている
[(Ferrara,N., et.al. EndocrineReviews 13:18(199
2)]。またヒトVPFは乳癌の血管新生と転移[Weider,
N, et.al. N.Engl.J.Med. 324:1(1991)] や腎細胞癌の
血管新生[医学のあゆみ,168:231(1994)]、あるいは網膜
疾患における血管新生[Adamis,A.P. et.al., Biochem.B
iophys.Res.Comm.,193:631(1993)]に関与していること
が報告されている。ヒトVPF遺伝子についてはそのc
DNAがすでに単離されて塩基配列が決定され、アミノ
酸配列も推定されている。この遺伝子からアミノ酸残基
数の異なる4種類の蛋白(アミノ酸残基数が121個、
165個、189個、206個の4種類)が作られ、そ
れらの中で121個のアミノ酸残基数のもの(VPF12
1)と165個のアミノ酸残基数のもの(VPF165)が成
熟蛋白であると言われている[(Ferrara,N., et.al. End
ocrine Reviews 13:18(1992)]。VPF121はVPF165
のカルボキシル末端の44個のアミノ酸が欠損したもの
であるが、VPF121とVPF165の間に、血管内皮細胞
に対する作用の違いがあるかどうかについては明らかで
ない。このヒトVPF121に対するモノクローナル抗体
はすでに本発明者らにより取得されており、そのモノク
ローナル抗体およびヒトVPF121に対するポリクロー
ナル抗体を用いた酵素免疫測定法によりVPFが測定で
きることを明らかにしている(日本特許:ペプチドおよ
びモノクローナル抗体、出願日平成6年6月10日)。
また、酵素免疫測定法におけるVPFの検出法について
もすでに本発明者らにより確立されており、数pg/mlの
VPFを検出できることを明らかにしている(特願平7
−141271号)。
ス、ラット、モルモット、ウシおよびヒトの正常または
腫瘍細胞株で分泌されており、また組織別では脳、下垂
体、腎臓、卵巣に存在することが明らかにされている
[(Ferrara,N., et.al. EndocrineReviews 13:18(199
2)]。またヒトVPFは乳癌の血管新生と転移[Weider,
N, et.al. N.Engl.J.Med. 324:1(1991)] や腎細胞癌の
血管新生[医学のあゆみ,168:231(1994)]、あるいは網膜
疾患における血管新生[Adamis,A.P. et.al., Biochem.B
iophys.Res.Comm.,193:631(1993)]に関与していること
が報告されている。ヒトVPF遺伝子についてはそのc
DNAがすでに単離されて塩基配列が決定され、アミノ
酸配列も推定されている。この遺伝子からアミノ酸残基
数の異なる4種類の蛋白(アミノ酸残基数が121個、
165個、189個、206個の4種類)が作られ、そ
れらの中で121個のアミノ酸残基数のもの(VPF12
1)と165個のアミノ酸残基数のもの(VPF165)が成
熟蛋白であると言われている[(Ferrara,N., et.al. End
ocrine Reviews 13:18(1992)]。VPF121はVPF165
のカルボキシル末端の44個のアミノ酸が欠損したもの
であるが、VPF121とVPF165の間に、血管内皮細胞
に対する作用の違いがあるかどうかについては明らかで
ない。このヒトVPF121に対するモノクローナル抗体
はすでに本発明者らにより取得されており、そのモノク
ローナル抗体およびヒトVPF121に対するポリクロー
ナル抗体を用いた酵素免疫測定法によりVPFが測定で
きることを明らかにしている(日本特許:ペプチドおよ
びモノクローナル抗体、出願日平成6年6月10日)。
また、酵素免疫測定法におけるVPFの検出法について
もすでに本発明者らにより確立されており、数pg/mlの
VPFを検出できることを明らかにしている(特願平7
−141271号)。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、以上の
様な知見の基に、腫瘍マーカーとして、特に早期肺癌の
診断のために有用な腫瘍マーカーを見つけるべく鋭意検
討を行ったのである。
様な知見の基に、腫瘍マーカーとして、特に早期肺癌の
診断のために有用な腫瘍マーカーを見つけるべく鋭意検
討を行ったのである。
【0005】
【課題を解決するための手段】本発明者らは種々検討を
行った結果、上記VPFが腫瘍マーカーとして、特に早
期肺癌の診断のために有用な腫瘍マーカーとして有用な
ものであることを見出し本発明を完成したのである。す
なわち、本発明は、ヒト血清中に存在する血管透過性因
子の存在量に基づくことを特徴とする肺癌細胞の有無判
定方法に関する発明と血管透過性因子の抗体からなるこ
とを特徴とする肺癌診断用検査薬に関する発明からなる
ものである。
行った結果、上記VPFが腫瘍マーカーとして、特に早
期肺癌の診断のために有用な腫瘍マーカーとして有用な
ものであることを見出し本発明を完成したのである。す
なわち、本発明は、ヒト血清中に存在する血管透過性因
子の存在量に基づくことを特徴とする肺癌細胞の有無判
定方法に関する発明と血管透過性因子の抗体からなるこ
とを特徴とする肺癌診断用検査薬に関する発明からなる
ものである。
【0006】
【発明の実施の形態】VPFは前記した様にその機能と
ともに公知のものであり、血清中のVPFの存在を確認
する方法としても公知の方法が用いられるが、本発明に
とり好ましい方法は、VPFのポリクローナル抗体また
はモノクローナル抗体を用いる抗原抗体反応、特に標識
免疫測定法、すなわち、赤血球、ラテックス、放射性同
位元素、酵素、発光物質、蛍光物質、金属分子、金属ゲ
ル、バクテリオファージなどを標識として用いる標識免
疫測定法が好ましい。特に、先に本発明者らが特許出願
した化学発光検出系酵素免疫測定法を用いるのが好まし
く、それによれば血清中のVPFを高感度で測定するこ
とが可能になり、肺癌の診断に本発明が特に有用なもの
となる。化学発光検出系酵素免疫測定法は、酵素の基質
として発光基質を用いて発生する光を測定する方法であ
り、VPFに対する抗体を用いるものであり、当該酵素
免疫測定法としては、ヒトVPFに対するモノクローナ
ル抗体やポリクローナル抗体を用いたサンドイッチ法な
どを適用することができる。
ともに公知のものであり、血清中のVPFの存在を確認
する方法としても公知の方法が用いられるが、本発明に
とり好ましい方法は、VPFのポリクローナル抗体また
はモノクローナル抗体を用いる抗原抗体反応、特に標識
免疫測定法、すなわち、赤血球、ラテックス、放射性同
位元素、酵素、発光物質、蛍光物質、金属分子、金属ゲ
ル、バクテリオファージなどを標識として用いる標識免
疫測定法が好ましい。特に、先に本発明者らが特許出願
した化学発光検出系酵素免疫測定法を用いるのが好まし
く、それによれば血清中のVPFを高感度で測定するこ
とが可能になり、肺癌の診断に本発明が特に有用なもの
となる。化学発光検出系酵素免疫測定法は、酵素の基質
として発光基質を用いて発生する光を測定する方法であ
り、VPFに対する抗体を用いるものであり、当該酵素
免疫測定法としては、ヒトVPFに対するモノクローナ
ル抗体やポリクローナル抗体を用いたサンドイッチ法な
どを適用することができる。
【0007】
【作用】本発明者らが明らかにしたところによれば、V
PFは、これまで用いられてきた血清中の肺癌マーカー
とは異なり、癌細胞の増殖・進展に必須のものであるた
め、組織型に関わりなくすべて癌細胞において発現が認
められると考えられ、従来のものと異なり、組織型に影
響されることのない早期診断を目的とした血清腫瘍マー
カーとして有用性の高いものであり、さらに、癌細胞の
増殖・進展と密接に関係していることより、治療効果の
判定、経過観察あるいは予後因子としても用いることが
できるという優れた血清腫瘍マーカーとしての作用を示
すものである。
PFは、これまで用いられてきた血清中の肺癌マーカー
とは異なり、癌細胞の増殖・進展に必須のものであるた
め、組織型に関わりなくすべて癌細胞において発現が認
められると考えられ、従来のものと異なり、組織型に影
響されることのない早期診断を目的とした血清腫瘍マー
カーとして有用性の高いものであり、さらに、癌細胞の
増殖・進展と密接に関係していることより、治療効果の
判定、経過観察あるいは予後因子としても用いることが
できるという優れた血清腫瘍マーカーとしての作用を示
すものである。
【0008】
【実施例】以下実施例に基づいて本発明を説明する。 (1)抗VPF ポリクローナル抗体の作製 単離したヒトVPF cDNA をグルタチオン S-トラ
ンスフェラーゼ(GST)との融合蛋白(GST−VPF)
として大腸菌で産生させ、得られた蛋白を抗原として常
法に従ってウサギ抗VPF ポリクローナル抗体を作製
した。抗体価の上昇したウサギの血清を分離し、陰イオ
ン交換カラムクロマトグラフィーによりウサギ抗VPF
ポリクローナル抗体のIgG画分を得た。
ンスフェラーゼ(GST)との融合蛋白(GST−VPF)
として大腸菌で産生させ、得られた蛋白を抗原として常
法に従ってウサギ抗VPF ポリクローナル抗体を作製
した。抗体価の上昇したウサギの血清を分離し、陰イオ
ン交換カラムクロマトグラフィーによりウサギ抗VPF
ポリクローナル抗体のIgG画分を得た。
【0009】(2)抗VPFポリクローナル抗体の酵素
標識 IgG画分の一部をペプシンで消化してF(ab')2 を調製
後、ヒンジ法によりアルカリフォスファターゼ(ウシ小
腸由来)と結合させ、アルカリフォスファターゼ標識し
たウサギ抗VPFポリクローナル抗体を得た。
標識 IgG画分の一部をペプシンで消化してF(ab')2 を調製
後、ヒンジ法によりアルカリフォスファターゼ(ウシ小
腸由来)と結合させ、アルカリフォスファターゼ標識し
たウサギ抗VPFポリクローナル抗体を得た。
【0010】(3)肺癌患者血清中VPF濃度の測定 肺癌患者血清中のVPF濃度を以下に示すように、化学
発光検出法を用いた酵素免疫測定法により測定した。抗
VPFポリクローナル抗体(5μg/ml)を 100μl/w
ellずつ96穴プレートにまき4℃で一晩放置した後、
0.1%ウシ血清アルブミン(BSA), PBSで4回洗
浄した。1%BSA、0.1M塩化ナトリウム、0.1%
アジ化ナトリウム、0.2M炭酸ナトリウム緩衝液 pH
9.5でブロッキング(室温で1時間)した後、1%ウシ
血清アルブミン、0.4%ゲラチン、1mM塩化マグネシ
ウム、20mMエチレンジアミン四酢酸ナトリウム、0.
1M塩化ナトリウム、0.1%アジ化ナトリウムを含む
50mMリン酸ナトリウム緩衝液 pH7.0(検体希釈液)
で10倍に希釈した血清(肺癌患者または健常者)あるい
は同検体希釈液に溶解した標準VPFを入れ室温で1時
間放置した。0.05%ツイーン20、0.14M塩化ナ
トリウム、5mM塩化カリウムを含むトリス緩衝液 pH
7.4(TBS−T)で4回洗浄後、アルカリフォスファ
ターゼ標識抗VPFポリクローナル抗体を100μl/w
ellずつ入れ室温で1時間反応させた。TBS−Tで4
回、さらに0.14M塩化ナトリウム、5mM塩化カリウ
ムを含むトリス緩衝液 pH7.4で2回洗浄した後、1m
M塩化マグネシウム、0.02%アジ化ナトリウムを含
む0.1Mジエタノールアミン緩衝液 pH10.0で5倍
に希釈したルミフォス530(和光純薬工業(株)製)を1
00μl/wellずつ入れ、37℃で30分間放置後、発
光強度を測定した。28人の肺癌患者の血清中VPF濃
度の測定結果を、散布図として図1に示した。高値検体
で約300pg/mlであり、平均値は84.7pg/mlであっ
た。一方、健常者290人の血清中VPF濃度を同様に
測定した結果、高値検体で約120pg/ml 程度であり、
平均値は24.9pg/mlであった(図2)。以上のことよ
り、肺癌患者では、健常者に比べて、血清中のVPF濃
度が有意に高いと言える。また、健常者血清中のVPF
濃度の平均値+2倍の標準偏差値をカットオフ値とし
て、肺癌患者での陽性率を計算すると61%であり、血
清診断マーカーとして用いることができるものである。
発光検出法を用いた酵素免疫測定法により測定した。抗
VPFポリクローナル抗体(5μg/ml)を 100μl/w
ellずつ96穴プレートにまき4℃で一晩放置した後、
0.1%ウシ血清アルブミン(BSA), PBSで4回洗
浄した。1%BSA、0.1M塩化ナトリウム、0.1%
アジ化ナトリウム、0.2M炭酸ナトリウム緩衝液 pH
9.5でブロッキング(室温で1時間)した後、1%ウシ
血清アルブミン、0.4%ゲラチン、1mM塩化マグネシ
ウム、20mMエチレンジアミン四酢酸ナトリウム、0.
1M塩化ナトリウム、0.1%アジ化ナトリウムを含む
50mMリン酸ナトリウム緩衝液 pH7.0(検体希釈液)
で10倍に希釈した血清(肺癌患者または健常者)あるい
は同検体希釈液に溶解した標準VPFを入れ室温で1時
間放置した。0.05%ツイーン20、0.14M塩化ナ
トリウム、5mM塩化カリウムを含むトリス緩衝液 pH
7.4(TBS−T)で4回洗浄後、アルカリフォスファ
ターゼ標識抗VPFポリクローナル抗体を100μl/w
ellずつ入れ室温で1時間反応させた。TBS−Tで4
回、さらに0.14M塩化ナトリウム、5mM塩化カリウ
ムを含むトリス緩衝液 pH7.4で2回洗浄した後、1m
M塩化マグネシウム、0.02%アジ化ナトリウムを含
む0.1Mジエタノールアミン緩衝液 pH10.0で5倍
に希釈したルミフォス530(和光純薬工業(株)製)を1
00μl/wellずつ入れ、37℃で30分間放置後、発
光強度を測定した。28人の肺癌患者の血清中VPF濃
度の測定結果を、散布図として図1に示した。高値検体
で約300pg/mlであり、平均値は84.7pg/mlであっ
た。一方、健常者290人の血清中VPF濃度を同様に
測定した結果、高値検体で約120pg/ml 程度であり、
平均値は24.9pg/mlであった(図2)。以上のことよ
り、肺癌患者では、健常者に比べて、血清中のVPF濃
度が有意に高いと言える。また、健常者血清中のVPF
濃度の平均値+2倍の標準偏差値をカットオフ値とし
て、肺癌患者での陽性率を計算すると61%であり、血
清診断マーカーとして用いることができるものである。
【0011】
【発明の効果】本発明者らが見出した血清中の肺癌マー
カーとして優れるVPFは、これを測定することによ
り、特に化学発光検出系酵素免疫測定法を用いて高感度
で測定することにより、肺癌の早期診断、さらには治療
効果の判定、経過観察に非常に有用に用いられるもので
ある。
カーとして優れるVPFは、これを測定することによ
り、特に化学発光検出系酵素免疫測定法を用いて高感度
で測定することにより、肺癌の早期診断、さらには治療
効果の判定、経過観察に非常に有用に用いられるもので
ある。
【図1】化学発光検出系を用いた酵素免疫測定法によ
り、肺癌患者血清検体28例の血清中VPF量の測定結
果の散布図である。
り、肺癌患者血清検体28例の血清中VPF量の測定結
果の散布図である。
【図2】化学発光検出系を用いた酵素免疫測定法によ
り、健常者血清検体290例の血清中VPF量の測定結
果の散布図である。
り、健常者血清検体290例の血清中VPF量の測定結
果の散布図である。
Claims (2)
- 【請求項1】ヒト血清中に存在する血管透過性因子の存
在量に基づくことを特徴とする肺癌細胞の有無判定方
法。 - 【請求項2】血管透過性因子の抗体からなることを特徴
とする肺癌診断用検査薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20665995A JPH0933531A (ja) | 1995-07-20 | 1995-07-20 | 肺癌細胞の有無判定方法および肺癌診断用検査薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20665995A JPH0933531A (ja) | 1995-07-20 | 1995-07-20 | 肺癌細胞の有無判定方法および肺癌診断用検査薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0933531A true JPH0933531A (ja) | 1997-02-07 |
Family
ID=16527014
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20665995A Pending JPH0933531A (ja) | 1995-07-20 | 1995-07-20 | 肺癌細胞の有無判定方法および肺癌診断用検査薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0933531A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102937649A (zh) * | 2012-10-18 | 2013-02-20 | 上海交通大学 | 血清肿瘤标志物检测的微型化磁通门生物传感器 |
-
1995
- 1995-07-20 JP JP20665995A patent/JPH0933531A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102937649A (zh) * | 2012-10-18 | 2013-02-20 | 上海交通大学 | 血清肿瘤标志物检测的微型化磁通门生物传感器 |
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