JPH083188A - 新規化合物キモスタチノール類及びその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】本発明は、一般式（Ｉ）： 【化１】 （式中、Ｒ¹ はイソプロピル基、セカンダリーブチル基
またはイソブチル基を表し、Ｒ² は水素原子または炭素
数１乃至５個を有するアルキル基を表す。）で示される
キモスタチノール類化合物またはその塩に関する。 【効果】本発明のキモスタチノール類化合物はカテプシ
ンＬを特異的かつ強力に阻害するだけでなくカテプシン
Ｂに対しては阻害活性が弱く安全性も高いことから、骨
粗鬆症治療薬として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、カテプシンＬ阻害活性
を有する３つの新規化合物、キモスタチノールＡ、キモ
スタチノールＢ及びキモスタチノールＣまたはそれらの
塩並びにそれらの製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】高齢化社会が急速に進んでいる今日、老
人性骨粗鬆症は大きな社会問題である。骨は代謝回転し
ており、骨吸収と骨形成とが平衡を保つことより、常に
一定の骨量を維持している。このような平衡状態が破綻
して骨吸収が骨形成を上回ると、次第に骨量は減少し骨
粗鬆症をきたす。高齢者では骨粗鬆症による骨折をきっ
かけに寝たきりを余儀なくされることが多く、社会的に
も重要な問題となっている。

【０００３】骨粗鬆症の基本的な原因の一つは、活性化
された破骨細胞による骨吸収の異常亢進である。破骨細
胞による骨吸収は、骨芽細胞の指令によって引き起こさ
れると報告されている。すなわち活性型ビタミンＤ３、
副甲状腺ホルモン(PTH）、インターロイキンなどほとん
どの骨吸収促進因子の受容体は骨芽細胞上に存在し、そ
の指令を受けた骨芽細胞が活性化され、何らかの形でそ
の情報が破骨細胞に伝達される。これらの情報を伝達さ
れた破骨細胞は活性化され、H⁺ の分泌と共に骨のタン
パク性支持組織であるコラーゲンを分解して、破骨細胞
と骨の間に吸収空間をつくる。この骨コラーゲン分解に
リソゾーム中のカテプシンＬが最も重要な働きをしてお
り、カテプシンＬを阻害することにより骨吸収が抑制で
きることが知られている（勝沼信彦：細胞内タンパク質
分解：東京化学同人、（１９９２年）：Agricultural B
iological Chemistry 42:523, (1978)）。

【０００４】カテプシンＬの阻害物質としては、動物モ
デルで血中カルシウム濃度を顕著に低下させるＥ−６４
（Agricultural Biological Chemistry 42:523, (197
8)）、カテプシン群の内在性阻害剤である分子量１０、
０００のペプチドのシスタチン類（勝沼信彦：細胞内タ
ンパク質分解：東京化学同人、（１９９２）、 73-8
8）、カテプシンＬの特異的阻害物質、カテリン（FEBS-
Lett.（1989）;255 (2): 211-214 ）等が知られてい
る。これらの物質は有望な薬物になる可能性があるが、
いまだ実用には至っていない。

【０００５】なお、本発明のキモスタチノール類化合物
と共通する部分構造を有する化合物としては、キモスタ
ンチン類（ J. Antibiot., 23, 425-427, (1970)）や M
er-N5075A （J. Antibiot., 46, 1622-1624, (1993) ）
等が知られている。

【０００６】

【発明が解決しようとしている課題】本発明者らは、新
たに分離したストレプトマイセス（Streptomyces）属に
属する微生物ストレプトマイセス・ナッシュビレンシス
（Streptomyces nashvillensis）の培養物にカテプシン
Ｌを強力に阻害する物質が存在することを見いだし、新
規な構造を持つ３つの化合物キモスタチノールＡ、キモ
スタチノールＢ、キモスタチノールＣを単離・精製し、
さらにそれらのエステル誘導体を作製し、本発明を完成
した。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、（１）一般式
（Ｉ）：

【０００８】

【化５】

【０００９】（式中、Ｒ¹ はイソプロピル基、セカンダ
リーブチル基またはイソブチル基を表し、Ｒ² は水素原
子または炭素数１乃至５個を有するアルキル基を表
す。）で示されるキモスタチノール類化合物またはその
塩、（２）下記式（ＩＩ）：

【００１０】

【化６】

【００１１】で示されるキモスタチノールＡまたはその
塩、（３）下記式（ＩＩＩ）：

【００１２】

【化７】

【００１３】で示されるキモスタチノールＢまたはその
塩、（４）下記式（ＩＶ）：

【００１４】

【化８】

【００１５】で示されるキモスタチノールＣまたはその
塩、（５）ストレプトマイセス属に属するキモスタチノ
ールＡ、キモスタチノールＢ及び／またはキモスタチノ
ールＣ生産菌を培養し、その培養物からキモスタチノー
ルＡ、キモスタチノールＢ及び／またはキモスタチノー
ルＣを採取することを特徴とする、キモスタチノール
Ａ、キモスタチノールＢ及び／またはキモスタチノール
Ｃまたはそれらの塩の製造法、（６）ストレプトマイセ
ス属に属するキモスタチノールＡ生産菌を培養し、その
培養物からキモスタチノールＡを採取することを特徴と
するキモスタチノールＡまたはその塩の製造法、（７）
ストレプトマイセス属に属するキモスタチノールＢ生産
菌を培養し、その培養物からキモスタチノールＢを採取
することを特徴とするキモスタチノールＢまたはその塩
の製造法、（８）ストレプトマイセス属に属するキモス
タチノールＣ生産菌を培養し、その培養物からキモスタ
チノールＣを採取することを特徴とするキモスタチノー
ルＣまたはその塩の製造法、（９）ストレプトマイセス
・ナッシュビレンシスＳＡＮＫ６３０９３株、に関する
ものである。

【００１６】本発明の前記一般式（Ｉ）で表される化合
物のＲ² が炭素数１乃至５個を有するアルキル基である
場合、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−
ブチル、ペンチルなどの直鎖状もしくは分枝鎖状のアル
キル基があげられる。好適には炭素数１乃至３個を有す
る直鎖状もしくは分枝鎖状のアルキル基であり、最適に
はメチル基である。

【００１７】本発明の前記一般式（Ｉ）で示される化合
物は、常法にしたがって塩とすることができる。

【００１８】そのような塩としてはＲ¹ が水素原子の場
合、例えばリチウム、ナトリウム、カリウムなどのアル
カリ金属の塩；マグネシウム、カルシウム、バリウムな
どのアルカリ土類金属の塩；メチルアミン、エチルアミ
ン、ジメチルアミン、ジプロピルアミン、トリメチルア
ミンなどの脂肪族第１乃至第３アミンの塩；リジン、ア
ルギニンなどのアミノ酸の塩；アンモニウム塩；等の塩
をあげることができる。好適にはナトリウム、カリウム
などのアルカリ金属の塩である。

【００１９】これらの塩において、最適なものは薬理上
許容しうる塩である。

【００２０】なお、前記一般式（Ｉ）を有する化合物
は、種々の異性体を有する。前記一般式（Ｉ）を有する
化合物においてはこれらの異性体がすべて単一の式で示
されている。従って、本発明においてはこれらの異性体
およびこれらの異性体の混合物をもすべて含むものであ
る。

【００２１】更に、本発明の前記一般式（Ｉ）を有する
化合物においては、生体内において前記一般式（Ｉ）を
有する化合物に誘導される、いわゆる「プロドラッグ化
合物」もすべて含まれるものである。

【００２２】前記一般式（Ｉ）を有する化合物におい
て、好適には、Ｒ¹ がイソプロピル基、セカンダリーブ
チル基またはイソブチル基を示し、Ｒ² が水素原子又は
炭素数１乃至３個を有するアルキル基を示す化合物又は
その塩である。

【００２３】最適には、Ｒ¹ がイソプロピル基、セカン
ダリーブチル基またはイソブチル基を示し、Ｒ² が水素
原子を示す化合物又はその塩である。

【００２４】本発明の一般式（Ｉ）を有する化合物の具
体例としては、例えば下記の表１に記載する化合物を挙
げることができる。

【００２５】

【表１】 ──────────────────────────────────── 化合物番号 Ｒ¹ Ｒ² ──────────────────────────────────── １ i-Ｐｒ Ｈ ２ sec-Ｂｕ Ｈ ３ i-Ｂｕ Ｈ ４ i-Ｐｒ Ｍｅ ５ sec-Ｂｕ Ｍｅ ６ i-Ｂｕ Ｍｅ ７ i-Ｐｒ Ｅｔ ８ sec-Ｂｕ Ｅｔ ９ i-Ｂｕ Ｅｔ １０ i-Ｐｒ Ｐｒ １１ sec-Ｂｕ Ｐｒ １２ i-Ｂｕ Ｐｒ ──────────────────────────────────── 但し、表中 Ｈ＝水素原子、 Ｍｅ＝メチル、
Ｅｔ＝エチル、i-Ｐｒ＝イソプロピル、 Ｐｒ＝プロピ
ル、i-Ｂｕ＝イソブチル、sec-Ｂｕ＝セカンダリーブチ
ル、基を示す。

【００２６】上記化合物表中、好適には例示化合物番号
１、２、３またはその塩である。

【００２７】ここで、例示化合物番号１の化合物はキモ
スタチノールＡ、例示化合物番号２の化合物はキモスタ
チノールＢ、例示化合物３の化合物はキモスタチノール
Ｃである。

【００２８】（Ｉ）本発明の前記一般式（Ｉ）を有する
化合物のうち、キモスタチノールＡ、キモスタチノール
Ｂ及びキモスタチノールＣは次の方法で得られる。

【００２９】本発明者らによって単離されたキモスタチ
ノールＡ、キモスタチノールＢ及びキモスタチノールＣ
を生産する放線菌ＳＡＮＫ ６３０９３株の形態学的特
徴、生理学的性質および化学分類学的性質は以下に示す
とおりである。

【００３０】１．形態学的特徴 ＳＡＮＫ６３０９３株はＩＳＰ「インターナショナル・
ストレプトマイセス・プロジェクト（International St
reptomyces Project）」規定の培地上で２８℃、１４日
間の培養により次のような形態学的特徴を示した。光学
顕微鏡による観察ではＳＡＮＫ ６３０９３の基生 菌
糸は良好に伸長、分岐し茶味白ないし暗い茶色を示すが
ノカルディア（ Nocardia ）属菌株様の断裂やジグザグ
伸長は観察されない。気菌糸は単純分岐する。胞子連鎖
の形態は直線ないし曲線状を示し、およそ１０ないし５
０個またはそれ以上の胞子の連鎖を形成する。走査型電
子顕微鏡による観察では胞子は楕円形で、その表面構造
は平滑状（Smooth）を示す。胞子の大きさは 0.7〜0.8
ｘ 0.7〜1.7 μm である。胞子は気菌糸上にのみ形成さ
れる。また、胞子のう、気菌糸の車軸分岐、気菌糸の断
裂、菌核などの特殊器官は認められない。

【００３１】２．各種培養基上での培養性状 ＳＡＮＫ ６３０９３株の２８℃、１４日間培養後の寒
天培地上での培養性状は表２に示すとおりである。

【００３２】

【表２】 培地の種類 項目^*1 ＳＡＮＫ６３０９３株の性状 ──────────────────────────────────── イーストエキス・ Ｇ ：非常に良好、平坦、薄黄味茶(2.5Y 8/3)^*2 麦芽エキス寒天 ＡＭ：豊富に形成、ビロード状、明るい茶味灰(2.5Y 8/1) (ISP 2) Ｒ ：暗い茶(10YR 3/2) ＳＰ：暗い茶(10YR 4/4) オートミール寒天 Ｇ ：非常に良好、平坦、薄黄味橙(2.5Y 9/2) (ISP 3) ＡＭ：豊富に形成、ビロード状、明るい茶味灰(2.5Y 8/1) Ｒ ：灰味黄茶ないし暗い茶味灰(2.5Y 8/3 〜 2.5Y 3/2) ＳＰ：黄味茶(2.5Y 6/4) 澱粉・無機塩寒天 Ｇ ：非常に良好、平坦、黄味灰(5Y 8/2) (ISP 4) ＡＭ：豊富に形成、ビロード状、明るい茶味灰(2.5Y 7/1) Ｒ ：灰味黄茶(2.5Y 6/3) ＳＰ：産生せず グリセリン・ Ｇ ：非常に良好、平坦、黄味灰(7.5Y 9/2) アスパラギン寒天 ＡＭ：豊富に形成、ビロード状、明るい茶味灰(2.5Y 7/1) (ISP 5) Ｒ ：茶味灰(2.5Y 5/2) ＳＰ：産生せず ペプトン・イーストＧ ：良好、平坦、茶味灰(2.5Y 6/2) エキス・鉄寒天 ＡＭ：形成せず (ISP 6) Ｒ ：茶味灰(2.5Y 6/2) ＳＰ：暗い黄味茶(7.5YR 2/2) チロシン寒天 Ｇ ：非常に良好、平坦、暗い茶(10YR 3/2) (ISP 7) ＡＭ：豊富に形成、ビロード状、明るい茶味灰(2.5Y 7/1) Ｒ ：暗い茶(10YR 2/2) ＳＰ：暗い茶(10YR 3/2) シュクロース・ Ｇ ：良くない、平坦、茶味白(2.5Y 9/1) 硝酸塩寒天 ＡＭ：良好、ビロード状、明るい茶味灰(2.5Y 8/1) Ｒ ：薄茶(2.5Y 8/2) ＳＰ：産生せず グルコース・ Ｇ ：あまり良くない、平坦、茶味白(2.5Y 9/1) アスパラギン寒天 ＡＭ：僅かに形成、白 Ｒ ：薄黄味橙(2.5Y 9/2) ＳＰ：産生せず 栄養寒天 Ｇ ：あまり良くない、平坦、薄黄味橙(2.5Y 9/2) (DIFCO) ＡＭ：余り良くない、ビロード状、白 Ｒ ：黄味茶(2.5Y 7/4) ＳＰ：黄味茶(10YR 6/6) ポテトエキス・ Ｇ ：良くない、平坦、茶味白(2.5Y 9/1) 人参エキス寒天 ＡＭ：良好、ビロード状、明るい茶味灰(2.5Y 7/1) Ｒ ：明るい茶味灰(10YR 8/1) ＳＰ：産生せず 水寒天 Ｇ ：良くない、平坦、茶味白(2.5Y 9/1) ＡＭ：あまり良くない、ビロード状、茶味白(10YR 9/2) Ｒ ：茶味白(10YR 9/2) ＳＰ：産生せず ──────────────────────────────────── ＊１：Ｇ：生育、ＡＭ：気菌糸、Ｒ：裏面、ＳＰ：可溶性色素 ＊２：マンセル方式に準拠した色調の表示 ３．生理学的性質 ２８℃で培養後、２ないし２１日間に観察したＳＡＮＫ
６３０９３株の生理学的性質は表３に示すとおりであ
る。

【００３３】

【表３】 また、プリドハム・ゴトリーブ寒天培地(ISP 9) を使用
して、２８℃、１４日間培養後に観察したＳＡＮＫ６３
０９３株の炭素源の資化性は表４に示すとおりである。

【００３４】

【表４】 ─────────────────────── Ｄ−グルコース ＋ Ｌ−アラビノース ＋ Ｄ−キシロース ± イノシトール − Ｄ−マンニトール − Ｄ−フルクトース − Ｌ−ラムノース − シュクロース ± ラフィノース − 対照 − ─────────────────────── ＋：資化する、±：弱く資化する、−：資化しない ４．化学分類学的性質 ＳＡＮＫ６３０９３株の細胞壁は長谷川らの方法「長谷
川ら、ザ・ジャーナルオブ・ジェネラル・アンド・アプ
ライド・マイクロバイオロジー（The Journalof Genera
l and Applied Microbiology ）２９巻、３１９−３２
２頁、１９８３年」に従い検討した結果、ＬＬ−ジアミ
ノピメリン酸が検出された。また、ＳＡＮＫ ６３０９
３株の全細胞中の主要糖成分をエム・ピー・レシェバリ
エの方法「M. P. Lechevalier 、ジャーナル・オブ・ラ
ボラトリー・アンド・クリニカル・メディシン（Journa
l of Laboratory and Clinical Medicine ）７１巻、９
３４−９４４頁、１９６８年」に従い検討した結果特徴
的な成分は検出されなかった。細胞壁ペプチドグリカン
のアシル基については内田らの方法「内田ら、ザ・ジャ
ーナルオブ・ジェネラル・アンド・アプライド・マイク
ロバイオロジー（The Journal of General and Applied
Microbiology ）２５巻、１６９−１８３頁、１９７９
年」に従い検討した結果アセチル型であった。

【００３５】以上の菌学的性質からＳＡＮＫ ６３０９
３株は放線菌の中でもストレプトマイセス （Streptom
yces）属に属することが明らかにされた。シャーリング
とゴトリーブによるＩＳＰ菌株記載［（E. B. Shirling
and D. Gottlieb）、インターナショナル・ジャーナル
・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Intern
ational Journal of Systematic Bacteriology）、 第
１８巻、６８−１８９頁（１９６８年）、第１８巻、２
７９−３９２頁（１９６８年）、第１９巻、３９１−５
１２頁（１９６９年）、第２２巻、２６５−３９４頁
（１９７２年）］、ワックスマン著、ジ・アクチノミセ
テス（S. A. Waksman; The Actinomycetes）第２巻、ブ
キャナンとギボンズ編バージーズマニュアル（R. E. Bu
chanan andN. E. Gibbons; Bergey's Manual of Determ
inative Bacteriology ）第８版（１９７４年）、ウィ
リアムズ、シャープおよびホルト編バージーズ・マニュ
アル（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology）
第４巻（１９８９年）、およびストレプトマイセス（St
reptomyces）属放線菌に関する最近の文献に記載されて
いる菌種と比較したところ、ストレプトマイセス・ナッ
シュビレンシス（Streptomyces nashvillensis）に極め
て近縁であることが判明した。しかしながら、ストレプ
トマイセス・ナッシュビレンシス（Streptomyces nashv
illensis）はミルクの凝固とペプトン化が陽性である点
において差異が認められた。このような菌学的特徴を有
するＳＡＮＫ ６３０９３株は明らかにストレプトマイ
セス・ナッシュビレンシス（Streptomyces nashvillens
is）とは異なる新菌株であると思われるがこれらの差異
をもって種を区別することはできないためストレプトマ
イセス・ナッシュビレンシス（Streptomyces nashville
nsis）と同定された。ＳＡＮＫ ６３０９３株は、平成
６年４月４日に工業技術院生命工学工業技術研究所にＦ
ＥＲＭ ＢＰ−４６２７として寄託されている。

【００３６】本発明の生理活性物質キモスタチノール
Ａ、キモスタチノールＢ及び／または、キモスタチノー
ルＣは、例えばストレプトマイセス（Streptomyces）属
に属するキモスタチノール類化合物生産菌を培養し、そ
の培養物中からキモスタチノールＡ、キモスタチノール
Ｂ、及び／またはキモスタチノールＣを採取することに
より製造される。

【００３７】本発明で使用されるキモスタチノールＡ、
キモスタチノールＢ及び／または、キモスタチノールＣ
生産菌としては、前述のストレプトマイセス属が挙げら
れるが、ストレプトマイセス属に属しキモスタチノール
Ａ、キモスタチノールＢ及び／または、キモスタチノー
ルＣを生産する能力を有する菌株は、他の一般微生物の
菌株の場合に見られるようにその性状が変化しやすく、
例えば、紫外線、高周波、放射線や化学変異剤等の用い
る人工変異手段で容易に変異しうる。このような変異株
であっても、目的の活性を有する菌株は全て本発明の方
法に使用することができる。すなわち、本発明ではキモ
スタチノール類化合物を生産し、ＳＡＮＫ ６３０９３
株およびその変異株と明確に区別されない菌株は、すべ
て ＳＡＮＫ ６３０９３株に包含される。

【００３８】本発明の製造法において、培養は放線菌の
培養に一般に用いられている条件により行うことができ
る。微生物が利用しうる栄養物を含有する培地として
は、一般微生物培養に利用される公知のものを使用する
ことができ、微生物の資化しうる炭素源（通常、培地量
の１乃至１０重量％）、窒素源（通常、培地量の０．２
乃至６重量％）、無機物等を適当に含有する培地であれ
ば、天然培地、合成培地のいずれも使用することができ
る。

【００３９】炭素源としては、菌が炭素源として資化し
うるものであれば特に限定はないが、例えば、グルコー
ス、果糖、麦芽糖、乳糖、庶糖、澱粉、マンニトール、
デキストリン、グリセリン、水飴、糖蜜、廃糖蜜、オー
ト麦粉、ライ麦粉、トウモロコシデンプン、ジャガイ
モ、トウモロコシ粉、大豆粉、マルトエキスのような炭
水化物；大豆油、綿実油、オリーブ油、タラ肝油、ラー
ドのような油脂類；クエン酸、アスコルビン酸ナトリウ
ム、りんご酸、酢酸、フマール酸、酒石酸、コハク酸、
グルコン酸のような有機酸類；メタノ−ル、エタノ−
ル、n-プロパノ−ル、イソプロパノ−ル、n-ブタノ−
ル、イソブタノ−ル、t-ブタノ−ルのようなアルコール
類；及びグルタミン酸のようなアミノ酸を、単独若しく
は併用して使用することができる。

【００４０】窒素源としては、菌が窒素源として資化し
うるものであれば特に限定はないが、例えば、フスマ、
落花生粉、カゼイン加水分解物、魚粉、マルトエキス、
大豆粉、大豆カゼイン、カザミノ酸、ファーマメディ
ア、綿実粉、小麦胚芽、肉エキス、ペプトン、コーンス
チープリカー、自己消化イースト、乾燥酵母、酵母エキ
ス、尿素のような有機窒素化合物；アスパラギン酸、グ
ルタミン、シスチン、アラニンのようなアミノ酸；硫酸
アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、
燐酸アンモニウムのようなアンモニウム塩、硝酸ナトリ
ウム、硝酸カリウムのような硝酸塩等の無機窒素化合物
を、単独若しくは併用して使用することができる。

【００４１】培地中にとり入れる無機塩は、ナトリウ
ム、カリウム、マグネシウム、アンモニウム、カルシウ
ム、フォスフェート、サルフェート、クロライド、カー
ボネート等のイオンを得ることの出来る通常の塩類であ
り、モリブデン、ホウ素、銅、コバルト、マンガン、鉄
等の微量の金属も含み、具体的には、例えば、食塩、塩
化マンガン、塩化コバルト、塩化カリウム、塩化カルシ
ウム、炭酸カルシウム、硫酸アルミニウムカリウム、硫
酸マンガン、硫酸銅、硫酸コバルト、硫酸亜鉛、硫酸第
一鉄、硫酸マグネシウム、燐酸一カリウム、燐酸二カリ
ウム、燐酸二ナトリウム、モリブデン酸アンモニウムを
挙げることができこれらを適宜組合せ使用することがで
きる。

【００４２】また、菌の資化しうる硫黄化合物を培地に
添加すると、目的物の生成量が増大する場合がある。例
えば、硫酸亜鉛、硫酸銅、硫酸第一鉄、硫酸アンモニウ
ムのような硫酸塩、チオ硫酸アンモニウムのようなチオ
硫酸塩、亜硫酸アンモニウムのような亜硫酸塩等の無機
硫黄化合物；シスチン、システィン、Ｌ−チアゾリジン
−４−カルボン酸のような含硫アミノ酸、ヒポタウリ
ン、グルタチオンのような含硫ペプチド等の有機硫黄化
合物 硫酸第一鉄、硫酸銅のような重金属類、ビタミン
Ｂ１、ビオチンのようなビタミン類、サイアミンのよう
な菌体増殖促進物質等も必要に応じて添加される。

【００４３】更に、シリコンオイル、ポリアルキレング
リコールエーテル、植物油、動物油、界面活性剤のよう
な消泡剤を培地に添加しても良い（特に、液体培養に際
しては、好適である。）。

【００４４】生産菌の生育に適した培養方法としては、
特に制限はなく、微生物一般に用いられる培養法であれ
ば用いることが可能であり、例えば、固体培養法、静置
培養法、撹拌培養法、振盪培養法、通気培養法を使用す
ることができるが、好適には、好気的な液体培養法であ
る撹拌培養法、振盪培養法、又は、通気培養法であり、
更に好適には、振盪培養法である。尚、工業的には、通
気撹拌培養法が適している。

【００４５】培地のｐＨは、通常、５．０乃至８．０で
あり、好適には、７．０である。

【００４６】菌の生育に適した培養温度は、通常、１５
℃乃至３０℃であり、好適には、２８℃である。

【００４７】キモスタチノールＡ、キモスタチノールＢ
及び／またはキモスタチノールＣの生産は振とう培養で
通常１−３日で最高値に達する。

【００４８】本発明のキモスタチノール類化合物は、カ
テプシンＬ阻害活性を測定することによりその生産量を
定量することができる。

【００４９】阻害活性は以下の方法により測定した。

【００５０】カテプシンＬ活性測定は 82 mM NaOAc, 15
mM CH₃COOH (pH 5.5), 1 mM EDTA,0.05 ％ Brij 35, 2
mM DTTに、酵素標品及び被検検体を加え全量 1 ml で
行なった。 30 ℃で 5 分間プレンキュベートした後、
基質10 mM Z-Phe-Arg-MCA を添加し 30 ℃で 20 分間イ
ンキュベートした。10 mM ロイペプチンで反応を停止
し、10,000 rpm で 5 分 遠心を行い、上清の蛍光強
度（ Ex 370nm, Em 460nm）を測定した。

【００５１】培養終了後の生成物は培養濾液及び菌体内
に存在する。培養物中の菌体その他の固形部分は、遠心
分離、又は、珪藻土を濾過助剤とする濾過操作などによ
って、除去することができる。ここで得られる上清画分
または濾液中に本発明のキモスタチノールＡ、キモスタ
チノールＢ及び／または、キモスタチノールＣが存在す
る。

【００５２】上清画分または濾液中のキモスタチノール
Ａ、キモスタチノールＢ及び／または、キモスタチノー
ルＣは、その物理化学的性質を利用して抽出精製する事
が出来る。

【００５３】上清画分または濾液を酸性条件とした後、
水と混じらない有機溶媒、例えばブタノールなどで抽出
操作を行い、その抽出物を濃縮することにより粗精製物
としてキモスタチノールＡ、キモスタチノールＢ及び／
または、キモスタチノールＣが得られる。

【００５４】また、最終濃度が５０乃至９０％になるよ
うに、水と混和しうる有機溶媒（例えば、メタノ−ル、
エタノ−ルのようなアルコ−ル類；アセトンのようなケ
トン類；アセトニトリル、イソブチロニトリルのような
ニトリル類；ホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムア
ミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２
−ピロリドン、Ｎ−メチルピロリジノン、ヘキサメチル
ホスホロトリアミドのようなアミド類）を菌体に加えて
抽出操作を行い溶媒を除去した後、上清画分または濾液
と同様の処理をすることにより上清画分または濾液と同
様にキモスタチノールＡ、キモスタチノールＢ及び／ま
たは、キモスタチノールＣを得ることができる。

【００５５】さらに該化合物は、通常、有機化合物の分
離精製に慣用されている方法、例えば、セファデックス
ＬＨ−２０（ファルマシア社製）、アンバーライトＸＡ
Ｄ−１１（ローム・アンド・ハース社製）、ダイヤイオ
ンＨＰ−２０（三菱化成社製）ような合成吸着剤を使用
する分配カラムクロマトグラフィー等の方法、又は、シ
リカゲル若しくはアルキル化シリカゲルによる順相・逆
相カラムクロマトグラフィー法（好適には、高速液体ク
ロマトグラフィーである）を適宜組合せ、適切な溶離剤
で溶出することによって目的化合物を分離、精製するこ
とができる。

【００５６】またアルミナ、マグネシウムーシリカゲル
系のフロリジルのような担体を用いた吸着カラムクロマ
トグラフィー法でも該化合物を精製することができる。

【００５７】使用される溶媒としては、好適には、脂肪
族炭化水素類；ベンゼン、トルエン、キシレンのような
芳香族炭化水素類；メチレンクロリド、クロロホルム、
四塩化炭素、ジクロロエタンのようなハロゲン化炭化水
素類；酢酸ブチル、炭酸ジエチルのようなエステル類；
テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメトキシエタン、
ジエチレングリコールジメチルエーテルのようなエ−テ
ル類を挙げることができる。

【００５８】さらに、次にあげる担体をもちいるカラム
クロマトグラフィーで、本発明の化合物を効率良く精製
することが出来る。ダウエックス５０Ｗ（ダウケミカル
社製）、アンバーライトＩＲＣ−５０（ローム・アンド
・ハース社製）、ダイアイオンＷＸシリーズ、ＳＫシリ
ーズ（三菱化成社製）などの陽イオン交換樹脂や、ＳＰ
セファデックス、ＣＭセファデックス（ファルマシア社
製）などの陽イオン交換セファデックスなどに該化合物
を吸着させ、各種酸、塩基、無機塩、有機塩を用い塩濃
度，ｐＨを適宜調整して目的の化合物を溶出することが
できる。

【００５９】目的化合物の溶出の検定は逆相カラムを用
いたＨＰＬＣ分析、または前述のカテプシンＬ阻害活性
測定によって行うことができる。

【００６０】（ＩＩ）本発明の前記一般式（Ｉ）を有す
る化合物のうち、Ｒ² がアルキル基を示す化合物は次の
ようにして得られる。

【００６１】即ち、キモスタチノールＡ、キモスタチノ
ールＢ及び／または、キモスタチノールＣとメタノー
ル、エタノールのようなアルコール類を用いて、酸でエ
ステル化反応を行なうことによって達成される。反応に
使用される酸としては、特に限定はなく、例えば硫酸、
塩酸、塩素酸、過塩素酸のような鉱酸；ギ酸、トリフル
オロ酢酸のような有機酸；が好ましい。反応温度、反応
時間は使用する試薬、溶剤等で異なるが、通常、0 〜10
0 ℃、1 〜24 時間、でエステル交換反応により他のア
ルキル基に変換できる。

【００６２】反応終了後、目的化合物は反応混合物から
溶剤を留去し、残渣を乾燥することにより得られる。こ
のようにして得られた目的化合物は更に再結晶または通
常のカラムクロマトグラフィーに付して精製することが
できる。

【００６３】あるいはジアゾメタンのようなジアゾアル
カン類と反応させることによっても達成される。反応は
溶剤の存在下で行なわれる。使用される溶剤としては反
応に影響を与えないものであれば特に限定はなく、ジエ
チルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメ
トキシエタンのようなエーテル類；酢酸エチルのような
エステル類；ジメチルホルムアミドのようなアミド類；
ジメチルスルフォキシドのようなスルフォキシド類；が
好ましい。反応温度、反応時間は使用する試薬、溶剤等
で異なるが、通常、0 ℃〜室温、1 〜24時間が好適であ
る。

【００６４】または、Ｒ² が水素原子を示す化合物を、
炭酸カリウム、炭酸ナトリウムのようなアルカリ金属炭
酸塩の存在下、ヨウ化メチル、ヨウ化エチルのようなハ
ロゲン化アルキル化合物と反応させることによっても、
Ｒ² がアルキル基を示す化合物を得ることができる。反
応は溶剤の存在下で行なわれる。使用される溶剤として
は反応に影響を与えないものであれば特に限定はなく、
テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメトキシエタンの
ようなエーテル類；ジメチルホルムアミドのようなアミ
ド類；ジメチルスルフォキシドのようなスルフォキシド
類；が好ましい。反応温度、反応時間は使用する試薬、
溶剤等で異なるが、通常、0 〜100 ℃、1 〜72 時間が
好適である。

【００６５】反応終了後、目的化合物は反応混合物から
溶剤を留去し、残渣に水および酢酸エチルのような有機
溶剤を加えて分液する。有機層を濃縮し、残渣を再結晶
または通常のカラムクロマトグラフィーに付して精製す
ることにより得られる。

【００６６】以上の如くして得られた、キモスタチノー
ル類化合物の物理化学的性状は以下の通りである。

【００６７】１ キモスタチノールＡ １）物質の性状 白色粉末 ２）分子量（FAB-MASS 法により決定） ５９５ＨＲ
ＦＡＢＭＳ ［Ｍ＋Ｈ］⁺ 実測値：596.3198 計算値：596.3197(C₃₀H₄₂O₆N
₇) ３）分子式 Ｃ₃₀Ｈ₄₁Ｎ₇ Ｏ₆ ４）赤外線吸収スペクトル （ＫＢｒ錠剤中 ν max c
m^-1 ）3329,2963,2934,1676,1639,1550,1386,1246,107
7,1046,702 ５） ¹Ｈ−核磁気共鳴スペクトル 重ジメチルスルフォキサイド溶媒中で、テトラメチルシ
ランを内部基準にして測定した時のδ値（多重度）は次
の通りである。

【００６８】0.73(3H,d),0.73(3H,d),1.87(1H,m),4.05
(1H,dd),7.89(1H,brd),3.25(2H,m),3.87(1H,m),2.6(1H,
dd),2.76(1H,dd),7.89(1H,brd),7.02(1H),4.0(1H,m),2.
82(1H,m),2.95(1H,m),7.08(1H),6.15(1H),4.4(1H,dd),
3.5(1H,m),1.6(2H,m),2.84(1H,m),3.0(1H,m),6.8(1H),
7.2(10H,m) ６）¹³Ｃ−核磁気共鳴スペクトル 重ジメチルスルフォキサイド溶媒中で、テトラメチルシ
ランを内部基準にして測定した時のδ値（多重度）は次
の通りである。

【００６９】175.3(s),169.5(s),170.3(s),157.1(s),15
4.4(s),125.5(s),125.8(s),139(d)x2,127.6(d),128(d),
129(d),129.5(d),38.5(t),21.2(t),38.4(t),36.3(t),6
2.2(t),50.6(d),54.9(d),125.5(d),56(d),125.8(d),52.
4(d),57.9(d),30.6(d),17.8(q),19.1(q), ７）高速液体クロマトグラフィー カラム ： ラジアルパックカートリッジ （8NVC184
）ウォーターズ社製 移動相 ： アセトニトリル／トリエチルアミン−リン
酸緩衝液pH3.2 （25:75 ） 流 速 ： 2.0 ml/min 検 出 ： UV 210 nm 保持時間： 7.2分 ８）アミノ酸分析 封管中１００℃、１８時間の６Ｎ塩酸加水分解でバリ
ン、フェニルアラニンを検出 ２ キモスタチノールＢ １）物質の性状 白色粉末 ２）分子量（FAB-MASS 法により決定） ６０９ＨＲ
ＦＡＢＭＳ ［Ｍ＋Ｈ］⁺ 実測値：610.3350 計算値：610.3353(C₃₁H₄₄N₇O
₆) ３）分子式 Ｃ₃₁Ｈ₄₃Ｎ₇ Ｏ₆ ４）赤外線吸収スペクトル （ＫＢｒ錠剤中 ν max c
m-1 ）3324,2964,2935,1640,1551,1498,1454,1386,126
0,701 ５） ¹Ｈ−核磁気共鳴スペクトル 重ジメチルスルフォキサイド溶媒中で、テトラメチルシ
ランを内部基準にして測定した時のδ値（多重度）は次
の通りである。

【００７０】0.73(3H,d),0.73(3H,d),1.87(1H,m),4.05
(1H,dd),7.89(1H,brd),3.25(2H,m),3.87(1H,m),2.6(1H,
dd),2.76(1H,dd),7.89(1H,brd),7.02(1H),4.0(1H,m),2.
82(1H,m),2.95(1H,m),7.08(1H),6.15(1H),4.4(1H,dd),
3.5(1H,m),1.6(2H,m),2.84(1H,m),3.0(1H,m),6.8(1H),
7.2(10H,m) ６）¹³Ｃ−核磁気共鳴スペクトル 重ジメチルスルフォキサイド溶媒中で、テトラメチルシ
ランを内部基準にして測定した時のδ値（多重度）は次
の通りである。

【００７１】175.0(s),169.3(s),170.4(s),157.2(s),15
4.3(s),138.9(d)x2,127.6(d),128(d),129(d),129.4(d),
125.6(s),125.8(s),38.4(t),21.1(t),50.7(d),54.8(d),
125.6(d),38.5(t),58.8(d),125.8(d),36.3(t),52.4(d),
62.2(t),57.2(d),45.4(d),36.7(t),15.2(q),11.0q), ７）高速液体クロマトグラフィー カラム ： ラジアルパックカートリッジ （8NVC184
）ウォーターズ社製 移動相 ： アセトニトリル／トリエチルアミン−リン
酸緩衝液pH 3.2 （25:75 ） 流 速 ： 2.0 ml/min 検 出 ： UV 210 nm 保持時間： 12.9分 ８）アミノ酸分析 封管中１００℃、１８時間の６Ｎ塩酸加水分解でイソロ
イシン、フェニルアラニンを検出 ３ キモスタチノールＣ １）物質の性状 白色粉末 ２）分子量（FAB-MASS 法により決定） ６０９ＨＲ
ＦＡＢＭＳ ［Ｍ＋Ｈ］⁺ 実測値：610.3350 計算値：610.3353(C₃₁H₄₄N₇O
₆) ３）分子式 Ｃ₃₁Ｈ₄₃Ｎ₇ Ｏ₆ ４）赤外線吸収スペクトル （ＫＢｒ錠剤中 ν max c
m-1 ）3325,3085,3030,2961,2875,1642,1551,1497 ５） ¹Ｈ−核磁気共鳴スペクトル 重ジメチルスルフォキサイド溶媒中で、テトラメチルシ
ランを内部基準にして測定した時のδ値（多重度）は次
の通りである。

【００７２】0.78(3H,d),0.8(3H,d),1.35(2H,m),1.5(1
H,m),4.21(1H,dd),8.05(1H,brd),3.25(2H,m),3.8(1H,
m),2.6(1H,dd),2.75(1H,dd),7.85(1H,brd),7.02(1H),3.
98(1H,m),2.92(1H,m),2.75(1H,m),6.15(1H),6.12(1H),
4.31(1H,dd),3.5(1H,m),1.62(2H,m),3.01(1H,m),3.12(1
H,m),6.75(1H),7.1(10H,m) ６）¹³Ｃ−核磁気共鳴スペクトル 重ジメチルスルフォキサイド溶媒中で、テトラメチルシ
ランを内部基準にして測定した時のδ値（多重度）は次
の通りである。

【００７３】175.4(s),169.2(s),171.5(s),157.0(s),15
4.3(s),138.9(d),139.1(d),127.6(d),128(d),129.1(d),
129.4(d),125.6(s),125.8(s),38.0(t),21.3(t),50.8
(d),54.9(d),125.5(d),38.8(t),58.8(d),125.8(d),36.3
(t),52.4(d),62.0(t),57.0(d),21.6,22.9,24.1(q),11.2
q), ７）高速液体クロマトグラフィー カラム ： ラジアルパックカートリッジ （8NVC184
）ウォーターズ社製 移動相 ： アセトニトリル／トリエチルアミン−リン
酸緩衝液pH3.2 （25:75 ） 流 速 ： 2.0 ml/min 検 出 ： UV 210 nm 保持時間： 15.7 分 ８）アミノ酸分析 封管中１００℃、１８時間の６Ｎ塩酸加水分解でロイシ
ン、フェニルアラニンを検出 本発明のキモスタチノールＡ、キモスタチノールＢ及び
／またはキモスタチノールＣおよび／またはそれらの塩
を骨粗鬆症の治療薬として用いる場合、いろいろな形態
で投与される。その投与形態としては例えば錠剤、カプ
セル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等による経口投与ま
たは注射剤（静脈内、筋肉内、皮下）などをあげること
が出来る。これらの各種製剤は、常法に従って主薬に賦
形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤、溶解剤、矯味矯臭、コ
ーティング剤等既知の医薬製剤分野において通常使用し
うる既知の補助剤を用いて製剤化することができる。そ
の使用量は症状、年齢、体重、投与方法および剤形等に
よって異なるが通常は成人に対して一日１０ｍｇ乃至１
０００ｍｇを投与することができる。

【００７４】

【実施例】以下に実施例をあげて本発明を更に具体的に
説明するが、本発明はこれらに限定されない。

【００７５】実施例−１ Ａ） 培養 種培養は次に示した組成のシード培地を用いた。

【００７６】培地組成（シード培地） グルコース １ ％ グリセリン １ ％ オートミール ０．５ ％ シュークロース １ ％ 日清ソーヤフラワー ２ ％ 生イースト １ ％ カザミノ酸 ０．５ ％ 炭酸カルシウム ０．１ ％ 消泡剤 ０．０５％ 水道水に溶かし、ｐＨ７に調整する。

【００７７】種培養のために上記組成のシード培地を 5
00 ml 容バッフル付き三角フラスコに 100 ml 入れ、12
1 ℃で 40 分間滅菌した。種培養をするために、この培
地入り三角フラスコ２本に ストレプトマイセス・ナッ
シュビレンシス（Streptomyces nashvillensis）ＳＡＮ
Ｋ ６３０９３ のスラントから一白金耳ずつ接種し、
２８℃で３日間ロータリーシェーカー(200rpm ,5cm thr
ow) で振とう培養した。第２代種培養のために６０Ｌ容
ジャーファーメンターにシード培地３０Ｌ入れ121 ℃で
40 分間滅菌し、前述の種培養液の全量を移した。２８
℃で２日間培養をした。

【００７８】生産には６００Ｌファーメンターに以下の
組成の培地を３００Ｌ入れ、１２１℃で４０分滅菌し
た。

【００７９】グルコース ０．５ ％ グリセリン ２．５ ％ コーンスティープリカー １ ％ 日清ソーヤフラワー １ ％ 生イースト １ ％ 炭酸カルシウム ０．３ ％ リン酸１カリウム １ ％ 微量金属塩溶液（注） ０．１ ％ 消泡剤 ０．０５％ イオン交換水に溶かし、ｐＨ７．２とする。

【００８０】（注）微量菌属塩： FeSO₄・7H₂O 0.1g、 M
nCl₂・4H₂O 0.1g、 ZnSO₄・7H₂O 0.1gを１００ｍｌの蒸
留水に溶かしたもの。

【００８１】前述の６０Ｌ容ジャーファーメンター種培
養液の全量を生産培地に入れ、２８℃で２４時間通気撹
伴培養した。

【００８２】Ｂ） 単離 培養液３００Ｌをセライト瀘過でろ液と菌体に分けた。
３００Ｌのろ液を塩酸でｐＨ６．３とした後、５０Ｌの
ＨＰ−２０樹脂（三菱化成製）を充填したカラムに吸着
させた。５０Ｌの水、１００Ｌの１５％アセトン／水で
洗浄した後、２００Ｌの６０％アセトン／水で活性物質
を溶出した。減圧下アセトンを溜去し１２０Ｌとした。
塩酸でｐＨ３．５とした後酢酸エチル１００Ｌで２回洗
浄し、水層を集め減圧下酢酸エチルを溜去した。

【００８３】この液を７ＬのＤｏｗｅｘ−５０Ｗ Ｘ４
陽イオン交換樹脂（Ｈ⁺ 型）をつめたカラムに供与し、
吸着させた。３０Ｌの水で洗浄後、０．５Ｎアンモニア
水で溶出した。活性のあるフラクション３０Ｌを得、減
圧下で濃縮しアンモニアを除去した後、２．５ＬのＨＰ
−２０樹脂を充填したカラムに吸着させた。５Ｌの水で
洗浄し、６０％アセトン／水で溶出した。活性のあるフ
ラクションを濃縮後、凍結乾燥して粗粉末１２ｇを得
た。

【００８４】粗粉末を５０ｍｌの水に溶かし、ｐＨ７．
０のリン酸バッファーで膨潤させ平衡化したＣＭ−セフ
ァデックス（ファルマシア社製）５００ｍｌを充填した
カラムに供与した。蒸留水で展開して得られた活性フラ
クションを凍結乾燥して粉末とした後、再度ＣＭ−セフ
ァデックスカラム処理を同じ条件で繰り返した。活性の
ある凍結乾燥粉末８００ｍｇを得た。

【００８５】得られた粉末について以下に示した分取条
件でＨＰＬＣ分取を行いさらに精製した。

【００８６】カラム ：Senshu ODS H-5251 ( 20mm x 2
5cm ：センシュー科学製） 移動相 ：アセトニトリル／0.5%トリエチルアミン−リ
ン酸緩衝液pH3.2 （２８: ７２） 流 速 ： 6 ml/min 検 出 ：示差屈折計 ８ｍｌの移動相に溶解した油状物を１回に１００mgイン
ジェクションした。このＨＰＬＣにおいて、保持時間２
５分のキモスタチノールＡ、４２分のキモスタチノール
Ｂ、４８分のキモスタチノールＣの各ピークをそれぞれ
分取した。これを８回繰り返した後、３種類の画分につ
いて各回の分取液を合わせ、それぞれアセトニトリルを
溜去した。それぞれの画分の濃縮液を１０ｍｌのＨＰ−
２０樹脂を充填したカラムに吸着させた。５０ｍｌの水
で洗浄後６０％アセトン／水で溶出、濃縮後凍結乾燥し
て純粋なキモスタチノールＡを１２ｍｇ、キモスタチノ
ールＢを１０ｍｇ、キモスタチノールＣを９ｍｇ、それ
ぞれ得た。

【００８７】 上記処方の粉末を混合し、３０メッシュのふるいを通し
た後、この粉末３３０ｍｇをゼラチンカプセルに入れ、
カプセル剤とした。

【００８８】

【発明の効果】次に試験例をあげて本発明の効果を説明
する。

【００８９】試験例−１ １−１ 材料、試薬 Z-Phe-Arg-MCA ならびにZ-Arg-Arg-MCA はペプチド研究
所（株）より購入した。カテプシンＢおよびα- キモト
リプシンはシグマ社より購入した。ラット肝臓は五週令
の雄SDラット（日本SLC ）より採取した。

【００９０】１−２ カテプシンＬの精製 ラットから採取した肝臓をPBS で洗浄後、細切し２倍量
(v/w)のホモジネートバッファー（1% NaCl 、 0.1% ED
TA、 2% Butanol ) に加えポリトロンでホモジナイズし
た。ホモジネート画分を 3600 rpmで 30 分遠心し、
上清を2M HClでpH 4.2とした。上清を37℃で４時間、さ
らに 4℃で一昼夜自己分解させた。

【００９１】自己分解させた後5000 rpmで30分遠心し、
その上清について20-80 % 飽和硫安分画を行なった。沈
殿 7 g につき1 ml の緩衝液Ａ（20 mM NaOAc、 1 mM
EDTA）で溶かし、4 ℃で1 時間攪拌後、25,000 rpmで25
分超遠心した。その上清を緩衝液Ａに対して透析した。
透析内液を緩衝液Ａで平衡化したCMーSephadex カラムに
供与し、緩衝液Ａで洗浄後、 0 Mから1 M までのＮａＣ
ｌを含む緩衝液Ａでリニアグラジエント溶出した。フラ
クションごとにカテプシンＬ、カテプシンＢ活性を測定
し、カテプシンＬ活性のみを持つフラクションを集め、
分注し-80 ℃で保存した。

【００９２】１−３ カテプシンＬ活性測定法 カテプシンＬ活性測定は 82 mM NaOAc, 15 mM CH₃COOH
(pH 5.5), 1 mM EDTA,0.05 ％ Brij 35, 2 mM DTTに酵
素標品と被検検体とを加え、全量 1 ml で行なった。 3
0 ℃で 5 分間プレインキュベーション後、カテプシン
Ｌの基質である10 mM Z-Phe-Arg-MCA を添加し、 30 ℃
で 20 分間インキュベートした。10 mMleupeptin で反
応を停止し、10,000 rpm で 5 分遠心操作を行い、上
清の蛍光強度（ Ex 370nm, Em 460nm）を測定した。

【００９３】１−４ カテプシンＢ活性測定法 カテプシンＢ活性測定はカテプシンＬ活性測定法に準じ
て行ない、基質としてZ-Arg-Arg-MCA を用いた。

【００９４】１−５ α- キモトリプシン活性測定法 α- キモトリプシン活性測定は梅沢らの方法に従って行
なった。すなわち0.025 M ホウ酸緩衝液 (pH7.4)に溶解
させた 2 % casein 500 ml に0.1 M CaCl₂ 25 ml及び
被検検体またはネガティブ・コントロールとして 0.025
Mホウ酸緩衝液(pH7.4)を425 ml 加え、37℃で 3 分
間プレインキュベーションした。 0.025Mホウ酸緩衝液
(pH7.4)に溶かしたα- キモトリプシンを 3 mg 添加す
ることにより反応を開始し、 37 ℃で 30 分インキュベ
ートした。1.7 M 過塩素酸 1 mlで反応を停止し、1 時
間室温 で放置した後、10,000 rpm で 5 分遠心した
上清の280 nm の吸光度を測定した。

【００９５】結果 前記アッセイ法における本物質のカテプシンＬに対する
５０％阻害濃度（ＩＣ50）をつぎの表５にまとめた。

【００９６】

【表５】 カテプシンＬ カテプシンＢ キモトリプシン （ｎｇ／ｍｌ） （μｇ／ｍｌ） （μｇ／ｍｌ） キモスタチノールＡ ４６ １２ ８．４ キモスタチノールＢ ３２ ４ １．６ キモスタチノールＣ ４４ １４ ５．０ 以上の如く、本発明の生理活性物質キモスタチノール
Ａ、キモスタチノールＢ、キモスタチノールＣ、カテプ
シンＬを特異的かつ強力に阻害するだけでなくカテプシ
ンＢに対しては阻害活性が弱く安全性も高いことから、
骨粗鬆症治療薬として有用である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｐ 17/10 Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者 榎田 竜三 茨城県つくば市御幸が丘33 三共株式会社 内 (72)発明者 岡崎 尚夫 茨城県つくば市御幸が丘33 三共株式会社 内 (72)発明者 木下 武 東京都品川区広町１丁目２番58号 三共株 式会社内 (72)発明者 高松 安行 福島県いわき市泉町下川字大剱389−４ 三共株式会社内

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】一般式（Ｉ）： 【化１】 （式中、Ｒ¹ はイソプロピル基、セカンダリーブチル基
   またはイソブチル基を表し、Ｒ² は水素原子または炭素
   数１乃至５個を有するアルキル基を表す。）で示される
   キモスタチノール類化合物またはその塩。
2. 【請求項２】下記式（ＩＩ）： 【化２】 で示されるキモスタチノールＡまたはその塩。
3. 【請求項３】下記式（ＩＩＩ）： 【化３】 で示されるキモスタチノールＢまたはその塩。
4. 【請求項４】下記式（ＩＶ）： 【化４】 で示されるキモスタチノールＣまたはその塩。
5. 【請求項５】ストレプトマイセス属に属するキモスタチ
   ノールＡ、キモスタチノールＢ及び／またはキモスタチ
   ノールＣ生産菌を培養し、その培養物からキモスタチノ
   ールＡ、キモスタチノールＢ及び／またはキモスタチノ
   ールＣを採取することを特徴とする、キモスタチノール
   Ａ、キモスタチノールＢ及び／またはキモスタチノール
   Ｃまたはそれらの塩の製造法。
6. 【請求項６】ストレプトマイセス属に属するキモスタチ
   ノールＡ生産菌を培養し、その培養物からキモスタチノ
   ールＡを採取することを特徴とするキモスタチノールＡ
   またはその塩の製造法。
7. 【請求項７】ストレプトマイセス属に属するキモスタチ
   ノールＢ生産菌を培養し、その培養物からキモスタチノ
   ールＢを採取することを特徴とするキモスタチノールＢ
   またはその塩の製造法。
8. 【請求項８】ストレプトマイセス属に属するキモスタチ
   ノールＣ生産菌を培養し、その培養物からキモスタチノ
   ールＣを採取することを特徴とするキモスタチノールＣ
   またはその塩の製造法。
9. 【請求項９】ストレプトマイセス・ナッシュビレンシス
   ＳＡＮＫ６３０９３株。